專利名稱：糖化白蛋白質控品的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學檢驗技術領域，具體講是一種糖化白蛋白質控品的制備方法。
背景技術：
糖尿病是危及人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病晚期帶來的并發(fā)癥(如腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等)具有致死性，已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病，被醫(yī)學界稱為"沉默的殺手"，嚴重威脅著人類健康；傳統(tǒng)糖化白蛋白質控品都是用血清制成，可能帶來HIV或者HPV等污染，另外，由于血清中葡萄糖與白蛋白的并存，在放置的過程中會不斷的生成糖化白蛋白，從而也造成樣本不穩(wěn)定。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，克服以上現(xiàn)有技術的缺點:提供一種無污染、穩(wěn)定性好的糖化白蛋白質控品的制備方法。本發(fā)明的技術解決方案如下:
一種糖化白蛋白質控品的制備方法，它包括以下制備步驟:
1)先在反應液中加入白蛋白，使每分升反應液中白蛋白含量為1-10克，在15-45°c下糖基化反應ι- ο天后，離心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反應液成分為:
緩沖液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化鈉:9g/L葡萄糖:50_200m M金屬螯合劑:0.1-1OmM防腐劑質量百分含量:0.1-5%
其中上述溶劑為水；
2)將步驟I)中制備的上清液裝入透析袋，置于4°C透析液中透析至完全除去葡萄糖，離心取上清液，其中所述透析液成分為:
緩沖液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化鈉:9g/L金屬螯合劑:0.1-1OmM防腐劑質量百分含量:0.1-5%
其中上述溶劑為水；
3)將步驟2)中制備的上清液用白蛋白稀釋液稀釋至所需質控品濃度，加入賦形劑，然后進行低溫預凍、冷凍干燥，制成凍干粉，最后將凍干粉復溶、分裝即可使用；其中所述白蛋白稀釋液中的白蛋白濃度等于步驟I)中糖基化反應前溶液中白蛋白濃度，且成分區(qū)別在于白蛋白稀釋液中不含葡萄糖。所述白蛋白為重組人白蛋白。所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、Good’ s緩沖液中的一種。所述金屬螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一種。所述防腐劑為苯甲酸鈉、疊氮鈉、山梨酸鉀、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、proclin300 中的一種。所述賦形劑由凍干保護劑，填充劑，酸堿調整劑組成，其中各組分以它們加入溶液后的含量計為:凍干保護劑質量百分含量0.5-10%,填充劑質量百分含量0.5-15%,酸堿調整劑摩爾濃度0.05-20mM。所述凍干保護劑為甘油、二甲基亞砜(DMS0)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一種；所述填充劑為甘露醇、山梨醇、PEG4000、明膠中的一種；所述酸堿調整劑為乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸鈉中的一種。所述低溫預凍為在-50°c至-90°c的條件下，預凍3小時以上將溶液冷凍成型。所述冷凍干燥的條件為第一次干燥階段的升溫速度采用3-10°C每小時，持續(xù)20-35小時，第二次干燥階段的升溫速度采用20-25°C每小時，持續(xù)5_10h。本發(fā)明的有益效果是:按本發(fā)明制備的糖化白蛋白質控品，具有無污染、穩(wěn)定性好、成本低、安全、利于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。
具體實施例方式下面用具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但本發(fā)明不僅局限于以下具體實施例。實施例一
糖化白蛋白質控品(250 μ mol/L)的制備:
1)稱取重組人白蛋白lg，溶于20mL反應液中，37°C反應7天后，18000rpmX30min離心去除沉淀，其中反應液成分如下:
三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液:50mM，pH 8.0 葡萄糖:100mM 氯化鈉:9g/L EDTA:2mM
疊氮鈉的質量百分含量:1%
其中上述溶劑為水；
2)將步驟I)中制備的上清液裝入透析袋，置于4°C透析液中透析，其中所述透析液成分為:
三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液:50mM，pH 8.0 氯化鈉:9g/L EDTA:2mM
疊氮鈉的質量百分含量:1%
其中上述溶劑為水；
透析時間為48h，中間更換透析液4次，采用葡萄糖試劑測定葡萄糖含量，檢測不到葡萄糖含量時，透析結束，離心取上清液，用HPLC測定糖化白蛋白的含量，濃度為8000 μ mol/L, 50g/L白蛋白溶液稀釋32倍得到250 μ mol/L的質控品，并用HPLC準確定值。3)往步驟2)中稀釋好的質控品中加入海藻糖:1%，甘露醇:3%、聚維酮1%、甘氨酸:
0.5mM,于_65°C低溫預凍5h，再放入冷凍干燥機中冷凍干燥，第一次冷凍干燥采用升溫速度5°C /h，持續(xù)28h，第二次冷凍干燥采用25°C /h，持續(xù)IOh后制得凍干粉。4)將步驟3)中所制凍干粉用水復溶后分裝，置于2°C環(huán)境中冷藏，每月測定一次糖化白蛋白含量，每次重復3次，取平均值，數(shù)據(jù)如下:
權利要求
1.一種糖化白蛋白質控品的制備方法，其特征在于:它包括以下制備步驟: 1)先在反應液中加入白蛋白，使每分升反應液中白蛋白含量為1-10克，在15-45°c下糖基化反應ι- ο天后，離心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反應液成分為:緩沖液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化鈉:9g/L葡萄糖:50_200mM金屬螯合劑:0.1-1OmM防腐劑質量百分含量:0.1-5% 其中上述溶劑為水； 2)將步驟I)中制備的上清液裝入透析袋，置于4°C透析液中透析至完全除去葡萄糖，離心取上清液，其中所述透析液成分為:緩沖液:20-200mM, pH 7.5-8.5氯化鈉:9g/L金屬螯合劑:0.1-1OmM防腐劑質量百分含量:0.1-5% 其中上述溶劑為水； 3)將步驟2)中制備的上清液用白蛋白稀釋液稀釋至所需質控品濃度，加入賦形劑，然后進行低溫預凍、冷凍干燥，制成凍干粉，最后將凍干粉復溶、分裝即可使用。
2.根據(jù)權利要求1所述的糖化白蛋白質控品的制備方法，其特征在于:所述白蛋白為重組人白蛋白。
3.根據(jù)權利要求1所述的糖化白蛋白質控品的制備方法，其特征在于:所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、Good’ s緩沖液中的一種。
4.根據(jù)權利要求1所述的糖化白蛋白質控品的制備方法，其特征在于:所述金屬螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)中的一種。
5.根據(jù)權利要求1所述的糖化白蛋白質控品的制備方法，其特征在于:所述防腐劑為苯甲酸鈉、疊氮鈉、山梨酸鉀、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、proclin300中的一種。
6.根據(jù)權利要求1所述的糖化白蛋白質控品的制備方法，其特征在于:所述賦形劑由凍干保護劑，填充劑，酸堿調整劑組成，其中各組分以它們加入溶液后的含量計為:凍干保護劑質量百分含量0.5-10%,填充劑質量百分含量0.5-15%，酸堿調整劑摩爾濃度0.05_20mM。
7.根據(jù)權利要求6所述的糖化白蛋白質控品的制備方法，其特征在于:所述凍干保護劑為甘油、二甲基亞砜(DMS0)、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一種；所述填充劑為甘露醇、山 梨醇、PEG4000、明膠中的一種；所述酸堿調整劑為乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、甘氨酸、谷氨酸鈉中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種糖化白蛋白質控品的制備方法，它包括以下制備步驟1)將白蛋白糖基化；2)透析除去白蛋白溶液中葡萄糖防止白蛋白進一步糖基化；3)稀釋至所需質控品濃度，冷凍干燥，最后將凍干粉復溶、分裝。按本發(fā)明制作出來的糖化白蛋白質控品具有具有無污染、穩(wěn)定性好、成本低、安全、利于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。
文檔編號A61P3/10GK103076213SQ20121057292
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權日2012年12月26日
發(fā)明者鄒炳德, 鄒繼華, 賈江花, 謝蒙 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司