一種穿膜多肽連接拉帕替尼的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明所述的細(xì)胞穿膜肽，由24個(gè)氨基酸組成，而且是親水性和疏水性交替組合的，含有大量的賴氨酸和精氨酸，本發(fā)明通過固相合成的方法得到所需多肽，并且通過化學(xué)合成的方法與拉帕替尼連接，本發(fā)明還提供連接物的通過血腦屏障的作用以及抑瘤作用。
【專利說明】一種穿膜多肽連接拉帕替尼的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤相關(guān)的藥物領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種多肽與拉帕替尼連接形成一種新的藥物，該多肽本身不具有生理活性，但是具有透過血腦屏障的作用，本發(fā)明還涉及該多肽的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由于血腦屏障的存在，腦瘤的治療是腫瘤學(xué)研究的最大挑戰(zhàn)。血腦屏障是機(jī)體參與固有免疫的內(nèi)部屏障之一，由介于血循環(huán)與腦實(shí)質(zhì)間的軟腦膜、脈絡(luò)叢的腦毛細(xì)血管壁和包于壁外的膠質(zhì)膜所組成，能阻擋病原生物和其他大分子物質(zhì)由血循環(huán)進(jìn)入腦組織和腦室。腦瘤快速增殖、滲透影響周圍的正常組織。目前，放射性治療與化學(xué)療法只能延長患者生命4個(gè)月，現(xiàn)在化學(xué)療法等效果差的原因一部分是由于血腦屏，因此，本發(fā)明致力于研究使現(xiàn)有藥物更好的透過血腦屏障。[0003]拉帕替尼(Iapatinib)是近年開發(fā)的針對EGFR和HER的雙靶點(diǎn)抗腫瘤新藥，是英國葛蘭素史克(GlaxOSmithKline)公司開發(fā)的，于2007年3月13日經(jīng)優(yōu)先審批程序獲得FDA批準(zhǔn)在美國上市，后相繼在澳大利亞、印度、韓國、印度尼西亞、新加坡、中國香港等國家和地區(qū)獲批銷售和使用。目前，拉帕替尼用于聯(lián)合卡培他濱治療HER2過度表達(dá)的，既往接受過包括蒽環(huán)類、紫杉醇、曲妥珠單抗(赫賽汀)治療的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。在對拉帕替尼的I期臨床研究中，研究者發(fā)現(xiàn)對晚期難治性實(shí)體瘤患者表現(xiàn)出較好療效或可使疾病趨于穩(wěn)定，同時(shí)證實(shí)藥物毒性較??；在對拉帕替尼的II期試驗(yàn)的結(jié)果初步表明拉帕替尼對HER2陽性炎性乳腺癌的療效突出；在對拉帕替尼的III期試驗(yàn)的結(jié)果顯示，拉帕替尼可使中位腫瘤延遲，并且腦瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生也減少，但是這部分的機(jī)理還沒有明確的報(bào)道，本發(fā)明主要針對拉帕替尼透過血腦屏障之后可能會對腦瘤起到較好的抑制作用。
[0004]多肽由于其具有極性末端和非極性末端，因此在體內(nèi)有較高的利用度，由于本身是內(nèi)源性物質(zhì)所以毒性小，但是多肽直接作為藥物受到較大的限制，例如其穩(wěn)定性差，不能口服。近年來，多肽作為藥物輔助功能的應(yīng)用逐漸成為了新藥研制的熱點(diǎn)之一。細(xì)胞穿膜肽(CPPS)通常由5~30個(gè)氨基酸組成，典型的一般由8~16個(gè)氨基酸。
[0005]近些年來多肽和藥物通過共價(jià)方式形成組合物的例子很多，例如:多肽Penetratin和阿霉素共價(jià)耦合用于治療乳腺癌；多肽TAT和藥物P53共價(jià)耦合用于治療眼癌轉(zhuǎn)移；多肽YTA4與甲氨蝶呤共價(jià)耦合治療乳腺癌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述:
[0007](I)本發(fā)明所述的穿膜肽
[0008]本發(fā)明所述的細(xì)胞穿膜肽，由24個(gè)氨基酸組成，而且是親水性和疏水性交替組合的，含有大量的賴氨酸和精氨酸，所述的穿膜肽序列為下述SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列:[0009]SEQ ID NO:1 =X1X2WffK X3WffKX4 WffKSX5 WffRKR KRKX6
[0010]通式I
[0011]其中X1為:甘氨酸或丙氨酸；
[0012]其中X2為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
[0013]其中X3為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
[0014]其中X4為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
[0015]其中X5為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；
[0016]其中X6為:甘氨酸或者丙氨酸。
[0017]所述具有通式I的序列:
[0018]SEQ ID NO:2:GLffffK GffffKV WffKSG WffRKR KRKG ；
[0019]SEQ ID NO:3:GLffffK AffffKG WffKSG WffRKR KRKG ；
[0020]SEQ ID NO:4:GLffffK GffffKA WffKSG WffRKR KRKG ；
[0021]SEQ ID NO:5:GLffffK GffffKV WffKSG WffRKR KRKA ；
[0022]SEQ ID NO:6:ALffffK GffffKP WffKSG WffRKR KRKG ；
[0023]SEQ ID NO:7:ALffffK VffffKP WffKSV WffRKR KRKV。
[0024]優(yōu)選地:X3=X4，所述穿膜肽序列具有通式II
[0025]X1X2WffK X3WffKX3 WffKSX4 WffRKR KRKX5
[0026]通式II
[0027]所述具有通式II的序列:
[0028]SEQ ID NO:8:GLffffK GffffKG WffKSG WffRKR KRKG ；
[0029]SEQ ID NO:9:GLffffK AffffKA WffKSG WffRKR KRKG ；
[0030]SEQ ID NO:10:GLffffK AffffKA WffKSG WffRKR KRKG ；
[0031]SEQ ID NO:1liGLffffK VffffKV WffKSG WffRKR KRKA ；
[0032]SEQ ID NO:12:ALffffK PffffKP WffKSG WffRKR KRKG ；
[0033]SEQ ID NO:13:ALffffK PffffKP WffKSV WffRKR KRKV。
[0034]更優(yōu)選地=X3=X4=X6,所述穿膜肽序列具有通式III
[0035]X1X2WffK X3WffKX3 WffKSX4 WffRKR KRKX3
[0036]通式III
[0037]所述具有通式III的序列:
[0038]SEQ ID NO: 14 =GLffffK AffffKA WffKSL WffRKR KRKA ；
[0039]SEQ ID NO:15 =ALffffK GffffKG WffKSL WffRKR KRKG ；
[0040]SEQ ID NO: 16 =ALffffK PffffKP WffKSL WffRKR KRKP ；
[0041]SEQ ID NO:17 =ALffffK VffffKV WffKSL WffRKR KRKV ；
[0042]SEQ ID NO:18 =GLffffK VffffKV WffKSL WffRKR KRKV。
[0043](2)本發(fā)明所述的穿膜肽的制備方法
[0044]本發(fā)明所需多肽是采用固相的方法制備的，固相合成是以固相載體樹脂為載體，從C端即羧基端向N端即氨基端逐漸添加氨基酸的過程。
[0045]本發(fā)明中優(yōu)選樹脂:Fmoc-wang樹脂、2_cl_trt樹脂，樹脂取代度0.24、.4。
[0046]本發(fā)明所使用的保護(hù)氨基酸為:Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-1le-OH Fmoc-1eu(tBu)-OH， Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg (pbf)-OH, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Cys(Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Asn (trt) -OH, Fmoc-Trp (tBu) -OH, Fmoc-Asp-OH,Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Gly-OH,反應(yīng)過程中保護(hù)氨基酸3~5倍過量。
[0047]本發(fā)明所使用的脫保護(hù)試劑為:哌啶/N，N-二甲基甲酰胺，比例為10:90-30:70。
[0048]本發(fā)明所使用的偶聯(lián)試劑為:①苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽/1-羥基苯并三唑(HOBT)。②2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基苯并三唑(HOBT)。③N，N’ - 二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(HOBT)。
[0049]本發(fā)明中，若使用第①或者第②種偶聯(lián)試劑，那么反應(yīng)中過程中應(yīng)添加縛酸劑:DIEA/NMP。
[0050]本發(fā)明中所使用的切割試劑為:TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1，2-乙二硫醇，比例為:82.5:5:5:5:2.5。
[0051]本發(fā)明中所使用MS-1T-TOF確定分子量，使用HPLC純化粗肽。
[0052](3)本發(fā)明所需的多肽與拉帕替尼的連接方法
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞穿膜肽，由24個(gè)氨基酸組成，而且是親水性和疏水性交替組合的，含有大量的賴氨酸和精氨酸，所述的穿膜肽序列為下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:
SEQ ID NO:1:X1X2WWK X3WWKX4 WWKSX5 WffRKR KRKX6 通式I 其中Xl為:甘氨酸或丙氨酸； 其中X2為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸； 其中X3為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸； 其中X4為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸； 其中X5為:甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸； 其中X6為:甘氨酸或丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，穿膜肽選自具有通式I的序列:SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，通式I中優(yōu)選地:X3=X4，得到通式II即X1X2WffKX3WffKX3WffKSX4 WffRKR KRKX5 。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述，穿膜肽選自具有通式II的序列:SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12, SEQID NO:13。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，通式I中更優(yōu)選地:X3=X4=X6，得到通式III，即X1X2WffKX3WffKX3 WffKSX4 WffRKR KRKX3。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述，穿膜肽選自具有通式III的序列:SEQID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:180
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的穿膜多肽，其特征在于，所述多肽含有大量精氨酸和賴氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的穿膜多肽，其特征在于，其制備方法是采用Fmoc固相多肽合成法合成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的穿膜多肽，其特征在于，其制備方法優(yōu)選全保護(hù)Fmoc固相合成法。
10.一種穿膜多肽與拉帕替尼通過化學(xué)鍵形成的連接物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的連接物，其特征在于用于連接穿膜多肽與拉帕替尼的物質(zhì)優(yōu)選丁二酸酐。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的連接物，其特征在于連接物具有通過血腦屏障的作用。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的連接物，其特征在于連接物在制備治療腦瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK103897043SQ201210580890
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】黃長江, 鄭學(xué)敏, 袁靜, 龔珉, 孔維苓, 徐為人, 湯立達(dá) 申請人:天津藥物研究院