專利名稱：一種特異抗人肺特異x蛋白的單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株特異性抗人肺特異X蛋白(LunX蛋白)的單克隆抗體。具體地說，本發(fā)明涉及一株特異性針對(duì)人LunX蛋白第103至256位的氨基酸序列的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以及所述單克隆抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在全球范圍內(nèi)，肺癌是近年來發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率上升速度是最快的。肺癌5年存活率為13 % ;80 %的患者在診斷后I年內(nèi)死亡；肺癌早期診斷率為15%，但這些患者5年存活率達(dá)到60% 90%。由此可見，亟待尋找肺癌的早期診斷和治療的祀點(diǎn)。目前國際上傾向于將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的85%以上。肺特異X 蛋白(簡(jiǎn)稱 LunX 蛋白)，又稱PLUNC ；NASG ；SPURT ；LPLUNC3 ；SPLUNCI。其基因是日本學(xué)者Iwao等通過對(duì)人體13種不同組織中分離出來的RNA運(yùn)用差異顯示技術(shù)，于2001年發(fā)現(xiàn)的一種人肺組織特異性X蛋白?；蚨ㄎ挥?0pll.1ql2，全長(zhǎng)1015bp，包括一個(gè)編碼256個(gè)氨基酸的768個(gè)核苷酸的開放式讀碼框。其含有和LPS結(jié)合的BPI樣結(jié)構(gòu)域，所以認(rèn)為L(zhǎng)unX蛋白是一個(gè)參與天然免疫的天然免疫分子。目前其主要研究集中于上呼吸道，當(dāng)感染時(shí)上皮細(xì)胞等LunX蛋白表達(dá)升高，而正常肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)LunX蛋白，但伴隨癌變開始高表達(dá)。由于LunX蛋白在肺癌病人中表達(dá)的特異性，因此，準(zhǔn)確快速檢測(cè)組織局部LunX蛋白表達(dá)以及探討以LunX作為靶標(biāo)的生物治療具有重要的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)人LunX蛋白有特異性的單克隆抗體。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株LunX-mAb-S-35-8。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供本發(fā)明的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是驗(yàn)證本發(fā)明的單克隆抗體在體外能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且在體內(nèi)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供本發(fā)明的單克隆抗體在免疫組織化學(xué)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的肺組織中LunX蛋白表達(dá)試驗(yàn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供本發(fā)明的單克隆抗體在細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NSCLC患者的鎖骨下淋巴結(jié)中LunX蛋白表達(dá)試驗(yàn)中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明提供了一株特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體、其制備方法、鑒定及應(yīng)用，所述單克隆抗體特異性好，靈敏度高，能夠應(yīng)用于檢測(cè)人肺臟組織和淋巴結(jié)LunX蛋白的表達(dá)，可以作為肺癌的早期或轉(zhuǎn)移的診斷指標(biāo)之一，另外，本發(fā)明的單克隆抗體可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。因此，本發(fā)明對(duì)肺癌的診斷及治療具有重大的臨床意義。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面涉及一種特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體，該抗體的類型為IgG2b, K，其特異性針對(duì)的是人LunX蛋白的第103-256位的氨基酸序列。本發(fā)明的第二方面涉及穩(wěn)定分泌所述抗人LunX蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株LunX-mAb-S-35-8，該細(xì)胞株已于2012年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :C2012187。本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體在本文中也可以稱為單克隆抗體S-35-8。 本發(fā)明的第三方面涉及所述單克隆抗體的制備方法，所述制備方法包括重組人LunX蛋白的表達(dá)、復(fù)性與純化，用純化后的人LunX蛋白免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞融合，篩選出能夠穩(wěn)定分泌對(duì)重組人LunX有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中或者從用該雜交瘤細(xì)胞免疫的小鼠腹水中獲取單克隆抗體。本發(fā)明的第四發(fā)明涉及本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體的功能鑒定S-35-8單克隆抗體能夠在體外抑制NC1-H292細(xì)胞的增殖，將本發(fā)明的S_35_8單克隆抗體加入NC1-H292細(xì)胞培養(yǎng)上清中，細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示S-35-8單克隆抗體能夠抑制NC1-H292細(xì)胞的增殖；S-35-8單克隆抗體能夠在體內(nèi)抑制移植性腫瘤(移植性腫瘤人肺癌細(xì)胞系NC1-H292細(xì)胞接種于裸鼠皮下)的生長(zhǎng)，腫瘤大小測(cè)量結(jié)果顯示S-35-8單克隆抗體能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)；S-35-8單克隆抗體能夠在體內(nèi)抑制移植性腫瘤(移植性腫瘤人肺癌細(xì)胞系NC1-H292細(xì)胞通過尾靜脈接種于裸鼠體內(nèi))的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，小鼠熒光成像結(jié)果顯示S-35-8單克隆抗體能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的第五方面涉及本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體在制備用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的組織中的LunX蛋白的試劑中的應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述非小細(xì)胞肺癌患者的組織選自肺組織或鎖骨下淋巴結(jié)。具體地，本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體可以用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)NSCLC患者肺組織中的LunX蛋白。用本發(fā)明的S-35-8單克隆抗體鑒定LunX蛋白的表達(dá)，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示S-35-8單克隆抗體能在免疫組織化學(xué)水平用于檢測(cè)NSCLC患者肺組織中的LunX蛋白。本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體還可以用于細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NSCLC患者鎖骨下淋巴結(jié)中的LunX蛋白。用本發(fā)明的S-35-8單克隆抗體鑒定LunX蛋白的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示S-35-8單克隆抗體能在細(xì)胞免疫熒光水平用于檢測(cè)NSCLC患者鎖骨下淋巴結(jié)LunX蛋白。本發(fā)明的第六方面涉及本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體的制藥用途。具體地，涉及本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用，或本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體在制備用于抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第七方面涉及一種用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的診斷劑，所述診斷劑包含本發(fā)明所述的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明的第八方面涉及一種用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的藥物，所述藥物包含治療有效量的本發(fā)明所述的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體。優(yōu)選地，所述腫瘤為非小細(xì)胞肺癌。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種用于治療受試者中的非小細(xì)胞肺癌的藥物，所述藥物包含治療有效量的本發(fā)明所述的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體。其中所述受試者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，盡管在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的特異 性抗人LunX蛋白的單克隆抗體為一株鼠來源的抗人Lunx蛋白的單克隆抗體(由鼠源雜交瘤細(xì)胞表達(dá))，其結(jié)構(gòu)可劃分為可變區(qū)、恒定區(qū)和絞鏈區(qū)，可變區(qū)識(shí)別及結(jié)合Lunx蛋白，而恒定區(qū)具有小鼠種屬特異性，但是，本發(fā)明的單克隆抗體可以進(jìn)行人源化處理，即，通過分子克隆等技術(shù)將其恒定區(qū)替換為人種屬的IgG2b, K亞型的恒定區(qū)，人源化后的抗體可以用于治療人受試者中的非小細(xì)胞肺癌。因此，本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體的人源化形式也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明中，術(shù)語“單克隆抗體的特異性”是指單克隆抗體識(shí)別抗原上的特定表位或者抗原決定簇并與之結(jié)合的性質(zhì)。術(shù)語“單克隆抗體的反應(yīng)性”是指在合適的反應(yīng)條件下，單克隆抗體與抗原結(jié)合的能力。術(shù)語“細(xì)胞株”是指通過篩選或者有限稀釋方法，從原代培養(yǎng)物或者細(xì)胞系獲得的單細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，選擇LunX蛋白的C端(第103個(gè)氨基酸-第256個(gè)氨基酸)，按照本文描述的方法制備有特異性的單克隆抗體對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，應(yīng)該視為包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖1，原核重組表達(dá)載體pET22b_LunX的構(gòu)建流程圖。圖2，LunX重組蛋白表達(dá)、復(fù)性、純化和鑒定。A，重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；B，重組蛋白以包涵體形式存在結(jié)果；C，重組蛋白免疫印跡鑒定結(jié)果；D，重組蛋白復(fù)性后結(jié)果；E，復(fù)性蛋白純化后結(jié)果，F(xiàn)，純化后LunX蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。箭頭表示LunX重組蛋白的條帶。圖3，本發(fā)明的單克隆抗體純度鑒定結(jié)果。圖4，免疫印記檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體特異性的結(jié)果。圖5，S-35-8單克隆抗體應(yīng)用于肺癌的治療。A，S_35_8單克隆抗體在體外抑制NC1-H292細(xì)胞的增殖；B，S-35-8單克隆抗體抑制移植皮下腫瘤的生長(zhǎng)；C，S-35-8單克隆抗體抑制移植肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
圖6，S-35-8單克隆抗體應(yīng)用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)NSCLC患者肺組織LunX蛋白表達(dá)的結(jié)果。圖7，S-35-8單克隆抗體應(yīng)用于細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NSCLC患者鎖骨下淋巴結(jié)LunX蛋白表達(dá)的結(jié)果。生物材料保藏說明本發(fā)明篩選得到的表達(dá)本發(fā)明的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為L(zhǎng)unX-mAb-S-35-8，該細(xì)胞株已于2012年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :C2012187。序列表說明 SEQ ID No:1 入 LunX 蛋白的 cDNA 序列(NCBI Reference Sequence:
_ NM^016583.3)__
SEQ ID No:2 人 LunX 蛋丨 的貧坫酸序列(uniprot/Q9NP55 ,
_UNQ787/PRQ1606)_
SEQIDNo:3 原核重組表達(dá)的LunX蛋白的氨基酸序列，為人UmX
蛋廣丨笫103至256位氨基酸.序列，其中第--位的M為 存:原核細(xì)胞中表達(dá)引入的起始中硫氨酸，C端的6個(gè) His為純化標(biāo)簽
具體實(shí)施例方式下面參照具體的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不限于這些具體的實(shí)施例。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)試劑均為市售
女口
廣叩ο實(shí)施例1 :原核重組表達(dá)載體pET22b_LunX的構(gòu)建人工合成LunX 全長(zhǎng)基因(NCBI Reference Sequence :ΝΜ_016583· 3)，并克隆到pBluescriptll SK(+)載體(購自上海生工)中構(gòu)建 pBluescriptll SK(+)-LunX 重組載體。通過http: //expasy. otr/tools/在線軟件對(duì)LunX的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),截取LunX的C端(第103至256位氨基酸)進(jìn)行重組表達(dá)，在目的序列的C端依次引入6His-Tag和終止密碼子。設(shè)計(jì)上游引物5’ -GGAATTCCATATGAACAACATCATTGACAT-3’ 和下游引物 5’ -CCGCTCGAGGACCTTGATGACAAAC-3’。以pBluescriptll SK (+)-LunX為模板PCR擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)過NdeI和XhoI酶切之后克隆到pET_22b (+)載體(購自Novagen)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明重組表達(dá)載體pET22b-LunX構(gòu)建成功。原核重組表達(dá)載體pET22b-LunX的構(gòu)建流程如圖1所示。實(shí)施例2 :重組LunX蛋白的表達(dá)，復(fù)性，純化及鑒定。I，重組LunX蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將pET22b_LunX轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(購自Novagen公司，貨號(hào)70954-3)中，挑選單克隆菌落接種于含有50μ g/ml氨芐青霉素和34 μ g/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中，置于37°C搖床中，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)至OD6tltol = O. 6-0.8時(shí)，加入ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。4°C、6000g離心10分鐘收菌，沉淀用裂菌緩沖液(50mM TrisUOOmM NaCl pH8. 5)洗滌之后，用高壓破碎方法裂菌。裂菌后的混合體進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，如圖2A結(jié)果顯示，和對(duì)照相比，IPTG誘導(dǎo) 后菌裂解液在ISkDa處有一條明顯的條帶。裂菌后的上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示重組蛋白主要以包涵體形式存在，如圖2B所示。對(duì)目的條帶進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，即小鼠抗His-tag抗體(購自Abmart公司，貨號(hào)M20001)l 1000稀釋作為一抗，辣根過氧化物酶(酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自Boster公司，貨號(hào)BA1050)1: 5000稀釋作為二抗,化學(xué)發(fā)光顯色(顯色試劑盒購自Thermoscientific公司，貨號(hào)34080)檢測(cè),在18kDa處有一條特異的條帶，圖2C顯示,表明誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為重組LunX蛋白。2，重組LunX蛋白的復(fù)性及純化。采用稀釋復(fù)性的方法對(duì)重組LunX蛋白進(jìn)行復(fù)性。具體方法大量誘導(dǎo)Rosetta (DE3)/pET22b_LunX菌,通過高壓破碎，4°C、6000g離心10分鐘，棄上清，沉淀用包涵體洗滌緩沖液(50mM TrisUOOmM NaCl、2M尿素、ImM 二硫蘇糖醇PH8. 5)洗滌3次，每次4°C、6000g離心10分鐘，棄上清。包涵體沉淀用包涵體裂解液(50mM TrisUOOmM NaCl、8M尿素、ImM 二硫蘇糖醇pH8. 5)溶解，室溫?cái)嚢鐸小時(shí)。4°C、12000g離心10分鐘，取上清，以I 500比例緩慢加入到復(fù)性緩沖液(50mM TrisUOOmMNaCUO. 5M L-精氨酸、3mM還原型谷胱甘肽、O. 3mM氧化性谷胱甘肽pH9. 5)中，4°C靜置48小時(shí)，復(fù)性蛋白用Millpore公司的LabScale TEF system(5kDa濃縮膜)進(jìn)行濃縮，蛋白濃縮液在透析緩沖液(50mM TrisUOOmM NaCl pH9. O)中透析過夜，如圖2D所示。濃縮后的復(fù)性蛋白用鎳柱親和層析純化，不同濃度的咪唑洗脫目的蛋白，在IOOmM咪唑洗脫液(50mMTrisUOOmM NaCl、200mM咪唑pH9. O)中得到純度一般的重組LunX蛋白。進(jìn)一步用分子篩層析(S-200)純化，洗脫緩沖液(Tris 50mM、NaCl IOOmM PH9. 2)洗脫到90ml時(shí)，得到純度較高復(fù)性效果較好的重組LunX蛋白洗脫液，將含有目的蛋白的洗脫液用Millipore濃縮管進(jìn)行濃縮和Bio-Rad蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，最后可以得到純度大于90%、濃度為Img/ml的LunX重組蛋白。結(jié)果如圖2E所示。3，重組LunX蛋白的鑒定。將純化后的LunX重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色。將含有目的條帶的膠進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示，有13個(gè)不同的肽段和LunX序列相匹配，結(jié)果如圖2F所示，劃線部分為13個(gè)肽段所覆蓋的序列，幾乎覆蓋整個(gè)LunX蛋白的C端，證明該重組蛋白即為重組LunX蛋白。實(shí)施例3 :抗人LunX蛋白單克隆抗體的制備1.細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
(I)小鼠免疫及脾細(xì)胞的制備抗原免疫小鼠的方法純化后終濃度為100 μ g/ml的LunX蛋白與等體積完全弗氏佐劑(CFA)混合，充分混勻形成油包水狀，取8-10周齡的BALB/c雌鼠(購自上海斯萊克，體重20g左右，8周齡)進(jìn)行初次免疫，每只小鼠腹腔注射40-60 μ g LunX蛋白(劑量為2. 5mg/kg小鼠體重)。以后間隔2周免疫一次,使用相同劑量的LunX蛋白與等體積不完全弗氏佐劑混合。免疫5次后，ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)不低于1: 105時(shí)，小鼠腹腔注射40-60 μ g LunX蛋白，三天后取小鼠脾細(xì)胞。脾細(xì)胞的制備方法將上述免疫后小鼠眼眶采血后脫白處死，無菌取脾臟，過200目細(xì)胞篩，收集脾細(xì)胞懸液，冰浴中自然放置10分鐘后棄沉降物，4°c 750g離心10分鐘，收集細(xì)胞，加入 Iml 紅細(xì)胞裂解液(O. 155M NH4Cl, IOmM KHCO3,0.1mMNa2EDTA pH7. 4)作用 5 分鐘，加入20ml不完全RPM1-1640培養(yǎng)基(購自賽默飛，貨號(hào)SH30809. 01B)中止反應(yīng)。4°C 750g離心10分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用20ml不完全RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌2次，每次4V750g離心10分鐘。棄上清，細(xì)胞沉淀用不完全RPM1-1640培養(yǎng)基重懸。ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)的方法用包被液(O.1M碳酸鹽緩沖液pH 9.6)稀釋純化的LunX蛋白至10 μ g/ml，100 μ I每孔包被96孔ELISA板，4 °C過夜，用PBST (O. 05 %Tween20-PBS pH 7· 4)清洗3遍，I % BSA封閉，37°C孵育2小時(shí)。PBST清洗3遍，加入待測(cè)倍比稀釋的小鼠血清(實(shí)驗(yàn)組)，設(shè)置6-7個(gè)梯度，未免疫小鼠做陰性對(duì)照，100 μ I每孔，37°C孵育I小時(shí)。PBST清洗3遍，每孔加入100 μ I辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購自博士德1: 10000稀釋)，37°C孵育I小時(shí)。PBST清洗3遍后加入TMB(購自eBioscience公司，貨號(hào)00-4201-56)底物，100 μ I每孔，避光顯色10-15分鐘，加入終止液(1Μ HCl) 100 μ I每孔，終止后立即用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，讀取波長(zhǎng)450nm的吸光值(OD45tl)及630nm的吸光值(OD63tl)，計(jì)算Λ OD450 = OD45tl-OD63tl。與PBS孔相比，實(shí)驗(yàn)組Λ OD450與陰性對(duì)照組AOD45tl的比值大于2.1為陽性。(2)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備在細(xì)胞融合的前一天，制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。將8周BALB/c小鼠脫臼處死，無菌操作下，剪開腹部，吸取5ml RPM1-1640不完全培養(yǎng)基注入腹腔，反復(fù)沖洗腹腔，吸回沖洗液并用RPM1-1640不完全培養(yǎng)基洗滌2次，每次4°C 300g離心10分鐘，收集細(xì)胞用含10%小牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使?jié)舛葹?xl05/ml，加入96孔板中，每孔IOOul，37 0C 5% CO2條件下培養(yǎng)。(3)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培養(yǎng)，復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞SP2/0(購自ATCC，ATCC編號(hào)CRL-1581)，用8_氮鳥嘌呤篩選HGPRT缺陷株，細(xì)胞融合時(shí)細(xì)胞要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融合前用不完全的RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌，每次4°C 300g離心10分鐘，收集細(xì)胞并用不完全的RPM1-1640培養(yǎng)基重懸。2，細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的制備取制備好的免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0于離心管中，分別取IO8和
2.5X107，用不完全的RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌一次。離心后棄上清，輕輕彈散細(xì)胞，加入O. 7ml 40°C的PEG(分子量1，000-6, 000)溶液，PEG的終濃度為50 % (W/V),60秒之后開始加入40°C預(yù)熱的不完全RPM1-1640培養(yǎng)基(5分鐘加完)，首先加1ml，I分鐘后加4ml，二分鐘后加入20ml。4°C 300g離心10分鐘收集細(xì)胞，用2XHAT培養(yǎng)基輕輕懸起細(xì)胞，使?jié)舛葹?xl06/ml。IOOul每孔加到含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。每?jī)商煳錾锨?IOOul,加入等體積的 HAT 培養(yǎng)基(20 % FCS、IOmM sodium hypoxanthine>40mMaminopterinU. 6mM thymidine 的 DMEM 培養(yǎng)基)。一周后，用 HT 培養(yǎng)基(包含 20% FCS、IOmM sodiumhypoxanthine、1. 6mM thymidine 的 DMEM 培養(yǎng)基)培養(yǎng) 2-3 周。當(dāng)觀察到雜交瘤細(xì)胞克隆長(zhǎng)出時(shí)，用含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用ELISA法檢測(cè)是否有抗體分泌。接著用有限稀釋法篩選陽性克隆，多次篩選后獲得雜交瘤細(xì)胞株。連續(xù)體外培養(yǎng)2個(gè)月以上或者凍存6個(gè)月之后，細(xì)胞株仍能穩(wěn)定和大量分泌抗人LunX蛋白抗體，從而獲取雜交瘤細(xì)胞株命名為L(zhǎng)unX-mAb-S-35-8。該雜交瘤細(xì)胞株已于2012年11月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏編號(hào)為CCTCCN0 :C2012187。3，單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備一般有兩種方法，方法一，增殖培養(yǎng)法，雜交瘤細(xì)胞體外低血清培養(yǎng)2-3天后大量收培養(yǎng)上清，上清中含有較高濃度的單克隆抗體。方法二，小鼠腹腔 接種法，首先500 μ I無菌的液體石蠟通過腹腔免疫8-10周齡的BALB/C鼠，一周之后腹腔注射I X 106雜交瘤細(xì)胞，7-10天左右收集腹水，高速離心收集上清。通過上述方法獲得的抗體，用Protein A親和層析方法純化并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定抗體純度,如圖3所示。經(jīng)過純化的單克隆抗體純度高于95%，抗體的重鏈約為45kDa，輕鏈約為25kDa。實(shí)施例4 :單克隆抗體的鑒定1，間接ELISA測(cè)定單克隆抗體效價(jià)ELISA檢測(cè)單克隆抗體效價(jià)的方法如下用包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液pH 9. 6)稀釋LunX重組蛋白至10 μ g/ml, 100 μ I/孔，包被 96 孔 ELISA 板，4°C過夜，用 PBST (0. 05 % Tween20-PBSpH 7. 4)清洗 3 遍，I % BSA 封閉，37°C孵育2小時(shí)。PBST清洗3遍，分別加入經(jīng)過倍比稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水，設(shè)置12個(gè)梯度，用無關(guān)的雜交瘤細(xì)胞(例如，無關(guān)的雜交瘤細(xì)胞可為分泌NKp30的3G5雜交瘤細(xì)胞株(CGMCC NO :4244)，關(guān)于該無關(guān)的雜交瘤細(xì)胞可參見申請(qǐng)?zhí)枮?01010531489. 7的專利申請(qǐng)，其申請(qǐng)日為2010年10月29日，
公開日為2011年3月16日)培養(yǎng)上清和腹水作為陰性對(duì)照，設(shè)PBS為調(diào)零孔，100 μ I/孔，37°C孵育I小時(shí)。PBST清洗3遍，每孔加Λ 100 μ I辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購自博士德，I 10000稀釋)，37°C孵育I小時(shí)。清洗后每孔加入100 μ I TMB底物液，避光顯色10-15分鐘，加入終止液(1ΜHCl) 100 μ I/孔，終止后立即用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，讀取波長(zhǎng)450nm的吸光值(OD45tl)及630nm的吸光值(OD63tl)，計(jì)算Λ OD450 = OD450-OD6300與PBS孔相比，實(shí)驗(yàn)組Λ OD450與陰性對(duì)照組AOD45tl的比值大于2.1為陽性。2，競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定單克隆抗體的親和常數(shù)。用包被液稀釋LunX抗原至2 μ g/ml, 100 μ I/孔，包被96孔ELISA板，4°C過夜。制備抗原競(jìng)爭(zhēng)的單克隆抗體混合液，將抗原對(duì)倍稀釋成2μ g/ml、l μ g/ml、0. 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml,0. 125 μ g/ml 0. 0625 μ g/ml,0. 03125 μ g/ml、0 μ g/ml，各取 50 μ I 與 50 μ I 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞上清4°C孵育過夜。用PBST(0. 05% Tween20-PBS pH 7. 4)清洗ELISA板3遍，I % BSA封閉，37°C孵育2小時(shí)。PBST清洗3遍，將各濃度抗原與雜交瘤上清的孵育液100 μ I加入每孔，設(shè)PBS為調(diào)零孔，37°C孵育I小時(shí)。PBST清洗3遍，每孔加入100 μ I辣根過氧化物酶(HR)標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購自博士德，I 10000稀釋)，37°C孵育I小時(shí)。清洗后加入TMB底物液，100 μ I/孔，避光顯色10-15分鐘，加入終止液(1Μ HCl) 100 μ I/孔，酶標(biāo)儀終止后立即檢測(cè)OD450和0D630?？贵w親和常數(shù)計(jì)算公式為AO/ (AO-A) = Ι+Kd/aO，其中AO為競(jìng)爭(zhēng)抗原為O時(shí)的OD值，A為各抗原濃度的OD值，a0為抗原總量，Kd為解離常數(shù)。根據(jù)K= 1/1((1求出1(，1(為親和常數(shù)，單位L/M。3，單克隆抗體的Ig亞類測(cè)定采用Sigma-Aldrich提供的小鼠單克隆類型鑒定快速檢測(cè)試劑盒IsoQuickTM Kitfor Mouse Monoclonal Isotyping IS0Q5中的亞類檢測(cè)試紙進(jìn)行測(cè)定。單克隆抗體的亞類、培養(yǎng)上清效價(jià)、腹水抗體效價(jià)和親和常數(shù)的結(jié)果見表I。 表I
抗體名稱|S-35-8單克隆抗體
亞類_IgG油，K_
培養(yǎng)上清抗體效價(jià) 10_4_
腹水抗體效價(jià)_10_^_
親和常數(shù)(L/M)|8. 56 X IO84，單克隆抗體的特異性鑒定采用免疫印跡法鑒定三株單克隆抗體的特異性。分別取Iug融合蛋白6His_LunX和6His-NKP46 (陰性對(duì)照，帶6個(gè)His的NKP46原核重組蛋白)進(jìn)行檢測(cè)，首先SDS-PAGE電泳，接著通過濕轉(zhuǎn)的方法將目的蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉I小時(shí)，用5%脫脂牛奶稀釋單克隆抗體至2ug/ml，室溫孵育2小時(shí)，TBST洗去非特異結(jié)合的抗體，最后孵育二抗(HR標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自博士德)I小時(shí)，孵育溫度為37攝氏度，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光顯色。如圖4所示,經(jīng)Western blot鑒定,在相對(duì)分子質(zhì)量18kDa(6His_LunX處有一特異條帶，而在30kDa(6His-NKp30)處沒有特異性條帶。說明該單克隆抗體是特異結(jié)合LunX,而對(duì)6Hi s-Tag沒反應(yīng)。實(shí)施例5 :抗人LunX蛋白單克隆抗體的應(yīng)用1.應(yīng)用于肺癌的治療(I) S-35-8單克隆抗體能夠在體外抑制肺癌細(xì)胞的增殖當(dāng)NC1-H292細(xì)胞(購自上海中科院細(xì)胞庫)生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，鋪3xl05個(gè)細(xì)胞于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，總共鋪三瓶，第一瓶加終濃度為80ug/ml的S-35-8單克隆抗體，第二瓶加終濃度為160ug/ml的S-35-8單克隆抗體，第三瓶加等體積的PBS(作為陰性對(duì)照)。370C 5% CO2條件下培養(yǎng)3天，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)后的結(jié)果如圖5A所示?？梢钥闯黾尤雴慰寺】贵w刺激NC1-H292細(xì)胞三天后，細(xì)胞增殖能力降低并且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明本單克隆抗體能夠在體外抑制NC1-H292細(xì)胞的增殖。(2)在體內(nèi)S-35-8抑制腫瘤的生長(zhǎng)皮下瘤模型體外擴(kuò)增培養(yǎng)NC1-H292細(xì)胞(購自上海中科院細(xì)胞庫)，收集細(xì)胞并用不完全RPM1-1640培養(yǎng)基洗滌一次，800rpm，10分鐘離心收集細(xì)胞，用不完全RPM1-1640培養(yǎng)基重懸，濃度為2xl07個(gè)/ml，接種200ul細(xì)胞于5周齡裸鼠(購自上海斯萊克，體重為15g作用)腋窩皮下，總共接種10只。一周后隨機(jī)分成兩組實(shí)驗(yàn)組和PBS組，每組5只，實(shí)驗(yàn)組每周一和周五通過尾靜脈注射20mg/kg(每千克小鼠體重注射20毫克抗體)并測(cè)量皮下腫瘤的長(zhǎng)邊和短邊，對(duì)照組每周一和周五通過尾靜脈注射等體積的PBS并測(cè)量皮下腫瘤的長(zhǎng)邊和短邊，總共處理32天。按經(jīng)驗(yàn)公式(腫瘤大小=長(zhǎng)邊X短邊X短邊/2)計(jì)算出腫瘤大小，從圖5B可以看出實(shí)驗(yàn)組腫瘤大小明顯小于PBS組，說明單克隆抗體能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)移模型體外擴(kuò)增培養(yǎng)A549 (通過p⑶NA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因)細(xì)胞(購自上海中科院細(xì)胞庫)，收集細(xì)胞并用不完全F12k培養(yǎng)基(購自賽默飛)洗滌一次，800rpm, 10分鐘離心收集細(xì)胞，用不完全F12k培養(yǎng)基重懸，濃度為1. 5xl07個(gè)/ml，200ul細(xì)胞通過尾靜脈接種5周齡裸鼠(購自上海斯萊克，體重為15g作用)，總共接種14只。兩天后隨機(jī)分成兩組實(shí)驗(yàn)組和PBS組，每組7只，實(shí)驗(yàn)組每周一和周五通過尾靜脈注射20mg/kg(每千克小鼠注射20毫克抗體)抗體，對(duì)照組每周一和周五通過尾靜脈注射等體積的PBS，在第三周和第五周時(shí)，兩組中的每只裸鼠均注射10mg/kg(每千克小鼠注射10毫克)熒光素酶底物，并在小動(dòng)物成像儀上進(jìn)行拍照，熒光強(qiáng)度和腫瘤病理情況稱正比，結(jié)果如圖5C所示，從圖中可以看出3周后和5周后實(shí)驗(yàn)組腫瘤結(jié)節(jié)陽性區(qū)域大小明顯少于PBS組，并且熒光強(qiáng)度也弱于PBS組，說明單克隆抗體可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。2.應(yīng)用于免疫組化檢測(cè)人肺癌組織取三例人肺組織標(biāo)本作為切片，一例肺炎病灶，一例肺結(jié)核病灶，一例非小細(xì)胞肺癌的癌組織和癌旁組織，檢測(cè)其中LunX蛋白表達(dá)情況。免疫組化流程固定，用福爾馬林(12%甲醛)固定組織，固定時(shí)間需超過12小時(shí)；脫水，依次經(jīng)過十二缸溶液(50%乙醇、70 %乙醇、70 %乙醇、80 %乙醇、95 %乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯、石臘、石臘、石臘,時(shí)間依次為15min、15min、15min、30min、30min、15min、lh、lh、lh、lh、30min，石蠟缸溫度為62 °C );包埋，快速取脫水浸蠟的組織于預(yù)熱的包埋機(jī)石蠟(62°C )中，用BM-1l型病理組織包埋機(jī)進(jìn)行包埋；切片，用YD-1508輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(購自益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)切片，厚度為6um ;攤片，YD-A型攤片機(jī)(購自益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)，45°C水中使組織攤平；烤片，YD-B型烤片機(jī)(購自益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)，40°C烤6h ;65°C烘箱烘2h，使蠟融化；脫蠟，二甲苯I脫蠟15min，二甲苯II脫蠟15min ;水化，依次經(jīng)過四缸溶液(100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、70%乙醇，時(shí)間都為3min)，最后浸入水中5min ;抗體標(biāo)記和染色，95°C檸檬酸鈉(O. OlM檸檬酸鈉)中抗原修復(fù) 15min，待其自然冷卻后用 TBST(50Mm Tris, O. 9% NaCl, O.1 % Tween 20ρΗ7· 4)洗滌3次，8ug/ml單克隆抗體室溫孵育2h，TBST洗滌3次，接著按照中杉金橋提供的免疫組化試劑盒(SP-9002)進(jìn)行操作，最后蘇木精染15s并用大量自來水沖洗反藍(lán)；脫水透明，依次經(jīng)過五缸溶液(80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯，時(shí)間依次為lmin、lmin、lmin、15min、15min);中性樹脂封片；顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果如圖6所示，可以看出LunX只在肺癌組織中表達(dá)，浸潤(rùn)癌旁組織中的腫瘤細(xì)胞也呈LunX陽性。3.應(yīng)用于免疫熒光檢測(cè)淋巴結(jié)穿刺標(biāo)本取五例腫瘤患者(獲得患者的書面同意)陽性轉(zhuǎn)移的鎖骨下淋巴結(jié)穿刺標(biāo)本，一例淋巴瘤，一例肝癌，三例非小細(xì)胞肺癌，檢測(cè)其中LunX蛋白的表達(dá)情況。 免疫熒光流程涂片，抽出的淋巴結(jié)組織用少量PBS重懸并吹散，涂于防脫載玻片上，靜止30min使細(xì)胞充分貼壁；固定，3. 7%甲醛固定min，PBS洗滌3次；穿膜，穿膜液(O. 05% Triton X-100)室溫穿孔 10min，PBS 洗滌 3 次；封閉，1% BSA 阻斷 30min，PBS 洗滌3次；8ug/ml單克隆抗體室溫孵育lh，PBS洗滌3次；二抗驢抗鼠IgG-Alexa Four 488 (購自Invitrogen公司，貨號(hào)A-21202) I 200稀釋，室溫孵育lh，PBS洗滌3次；DAPl (細(xì)胞核染色)按1: 10000稀釋，室溫孵育3min，PBS洗滌3次。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明LunX蛋白只在肺癌轉(zhuǎn)移的陽性淋巴結(jié)中表達(dá)。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。
權(quán)利要求
1.一種特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體,所述單克隆抗體特異性針對(duì)人LunX蛋白第103至256位的氨基酸序列。
2.一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CCTCC N0:C2012187，所述雜交瘤細(xì)胞株分泌權(quán)利要求I所述的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1所述的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體在制備用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的組織中的LunX蛋白的試劑中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述非小細(xì)胞肺癌患者的組織選自肺組織或鎖骨下淋巴結(jié)。
5.權(quán)利要求1所述的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌。
7.權(quán)利要求1所述的特異性抗人LunX蛋白的單克隆抗體在制備用于抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為非小細(xì)胞肺癌。
9.一種用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的診斷劑，所述診斷劑包含有效量的權(quán)利要求1所述的特異性抗人LunX的單克隆抗體。
10.一種用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的藥物，所述藥物包含治療有效量的權(quán)利要求1所述的特異性抗人LunX的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗人LunX蛋白的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及該單克隆抗體的應(yīng)用。本發(fā)明的抗人LunX蛋白的單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株LunX-mAb-S-35-8(保藏編號(hào)CCTCC NOC2012187)分泌。本發(fā)明的單克隆抗體可以用于免疫組化和免疫熒光檢測(cè)肺癌標(biāo)本中的LunX蛋白的表達(dá)，還可以用于體外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及對(duì)體內(nèi)腫瘤的治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103012587SQ20121059039
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者魏海明, 鄭小虎, 田志剛, 孫汭 申請(qǐng)人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)