人造油體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人造油體，該人造油體包含油質(zhì)蛋白（如上文定義的，該油質(zhì)蛋白還涵蓋鈣油質(zhì)蛋白、固醇油質(zhì)蛋白以及聚油質(zhì)蛋白），一種表面活性劑（例如磷脂），以及一種包含脂肪酸（例如具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸）的油。本發(fā)明還涉及制備所述人造油體的方法。這些AOB可以進(jìn)一步包含其他分子，例如生物活性分子，被用于多種多樣的產(chǎn)品，并且對(duì)于在不存在添加的抗氧化劑的情況下生產(chǎn)氧化穩(wěn)定的水包油乳液特別有用。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋一種用于部分地純化來自植物提取物的油質(zhì)蛋白的方法。
【專利說明】人造油體
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及包含脂肪酸的人造油體，以及制備所述人造油體的方法。這些人造油體可以用于多種多樣的產(chǎn)品，并且具體地對(duì)于在不存在抗氧化劑的情況下生產(chǎn)氧化穩(wěn)定的水包油乳液有用。
[0002]發(fā)明背景
[0003]脂肪具有高熱量的內(nèi)容物，并且對(duì)人類的膳食能量的攝入作出了主要貢獻(xiàn)。脂肪的某些類型，例如飽和脂肪和反式脂肪已經(jīng)牽涉到包括心血管疾病的疾病病癥的范圍內(nèi)。然而，脂肪還在人類健康和營(yíng)養(yǎng)中起著積極作用，并且國(guó)際膳食指南允許某一比例的膳食能量來自脂肪，只要該脂肪是‘有益脂肪’?！幸嬷尽菃尾伙柡偷暮投嗖伙柡偷挠?，并且在食物產(chǎn)品中存在著對(duì)用更加健康的不飽和油替代飽和脂肪的日益增加的興趣。此外，很多年來，多不飽和油的一個(gè)具體類，稱為長(zhǎng)鏈ω-3油，由于眾多的健康益處，包括保護(hù)對(duì)抗已經(jīng)歸因于它們的心血管疾病，已經(jīng)受到了相當(dāng)大的關(guān)注。受到ω-3油日益增長(zhǎng)的健康益處清單的鞭策，全世界的食品工業(yè)努力生產(chǎn)用ω-3油加強(qiáng)的食物產(chǎn)品。
[0004]ω-3油加強(qiáng)的食物以及含有高度不飽和油的類似健康食物擴(kuò)張的主要障礙之一是這些油在儲(chǔ)存期間對(duì)氧化變質(zhì)的極度易感性。氧化產(chǎn)生多種產(chǎn)物，其中一些可能具有令人非常討厭的氣味特征，由此降低該產(chǎn)品的適口性和保質(zhì)期。因此充分地保護(hù)這些油不被氧化很重要。雖然微型包封和抗氧化劑的添加已經(jīng)成功地用作控制食物產(chǎn)品中高度不飽和油氧化的策略，但是這些技術(shù)具有與成本、天然性以及普遍適用性相關(guān)的若干缺陷。
[0005]植物和油料種子中的油以離散的沉積物，稱作油體(OB)的形式發(fā)生，不考慮它們存在于其中的植物物種，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上類似。天然OB值得注意的特征是它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)以及在分離的制劑兩者中的出色的物理穩(wěn)定性。在這兩種情況下，OB發(fā)生為個(gè)體實(shí)體，并且甚至是在長(zhǎng)期儲(chǔ)存后，當(dāng)它們彼此加壓時(shí)，不發(fā)生聚集或聚結(jié)；體內(nèi)歸因于干燥，并且體外在浮選離心之后(曾(Tzen)以及黃(Huang)，1992)。已經(jīng)將OB的出色的物理穩(wěn)定性歸因于獨(dú)特的、稱作油質(zhì)蛋白的兩親性蛋白，該蛋白發(fā)生于油體表面(黃，1994)。已經(jīng)提示，油體的整個(gè)表面上被油質(zhì)蛋白覆蓋，使得濃縮的OB在成熟種子的細(xì)胞中從不聚結(jié)或聚集(曾以及黃，1992)。油質(zhì)蛋白的含量范圍是總油體的從1%_4% ;最大量發(fā)生于其中Os最小的種中，例如，油菜/卡諾拉(canola)(黃,1992 ;曾，1993)。
[0006]除良好的物理穩(wěn)定性之外，油料種子植物中的OB具有抗氧化的天然防護(hù)。最近的研究已經(jīng)示出，這種氧化穩(wěn)定性延伸到水分散的油體分離物中。菲斯克(Fisk)及其同事(2008)示出，提取自向日葵種子且分散在連續(xù)水相中的完整的OB比制備自向日葵種子和乳化劑的等效物乳液 具有更高的抗氧化性。更近地是，已經(jīng)針對(duì)包含高度不飽和十八碳四烯酸的藍(lán)薊屬油體分離物獲得了類似的結(jié)果(格雷(Gray)等人，2010)。還已經(jīng)報(bào)道了完整的卡諾拉OB水性分散體優(yōu)于使用吐溫40作為乳化劑制備的等效物卡諾拉水包油乳液的氧化穩(wěn)定性(Shen 和 Wi jesundera, 2009)。
[0007]已經(jīng)進(jìn)行了將OB從它們的組分中重新裝配的有限的努力。墨菲(Murphy)和康明斯(Cummins)(1989)報(bào)告了提取自菜籽油或純化的油酸甘油酯的TAG與菜籽油體膜材料的孵育導(dǎo)致類似于天然油體尺寸的油穩(wěn)定小滴的出現(xiàn)。隨后，通過將油酸甘油酯與三亞麻油酸甘油酯(1:2摩爾)的TAG混合物與二油酰磷酸卵磷酯和分離自小麥、水稻、油菜籽、大豆或希蒙得木的油質(zhì)蛋白進(jìn)行組合，曾以及黃(1992)成功地制備出了物理上穩(wěn)定的人工(再造)油體(AOB)。然而，似乎尚未對(duì)此類人造OB的氧化穩(wěn)定性進(jìn)行研究。
[0008]存在著對(duì)不依賴于添加的抗氧化劑的使用的、保護(hù)脂肪酸不受氧化的手段的需求。
[0009]發(fā)明概沭
[0010]包含具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的、高水平多不飽和脂肪酸的油，如富含ω3脂肪酸的海產(chǎn)品的油，與植物(例如油料種子植物)中生產(chǎn)的油化學(xué)上不同。然而，本發(fā)明的諸位發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)提取自植物餅粉(如商用卡諾拉餅粉)的油質(zhì)蛋白可用于與高度多不飽和油(如富含ω 3脂肪酸的海產(chǎn)的和/或魚油)構(gòu)建人造油體。在此本發(fā)明的諸位發(fā)明人還出人意料地發(fā)現(xiàn)，油體的磷脂組分可以被多種多樣的表面活性劑替代，而不會(huì)不利地影響氧化穩(wěn)定性。
[0011]因此，在一個(gè)第一方面中，本發(fā)明提供了一種人造油體，該人造油體包括油質(zhì)蛋白、表面活性劑、以及包含多不飽和脂肪酸的油，該脂肪酸具有三個(gè)或更多個(gè)雙鍵，優(yōu)選四個(gè)或更多個(gè)雙鍵。
[0012]在一個(gè)實(shí)施例中,表面活性劑是磷脂。
[0013]在一個(gè)實(shí)施例中，該多不飽和脂肪酸的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少25%具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵。
[0014]在另一個(gè)方面中 ，本發(fā)明提供了一種人造油體，該人造油體包括油質(zhì)蛋白、表面活性劑、以及包含脂肪酸的油，其中表面活性劑的至少一些不是磷脂。
[0015]雖然該油質(zhì)蛋白可以獲得自任何來源，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該油質(zhì)蛋白是一種油料種子植物的油質(zhì)蛋白。
[0016]該油也可以獲得自任何來源。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該油是海產(chǎn)品的油和/或魚油。
[0017]在另一個(gè)實(shí)施例中，這些脂肪酸的至少50%、至少75%、或至少90%處于甘油酯的形式。
[0018]在一個(gè)實(shí)施例中，人造油體干重的至少80%、至少90%、或至少95%是油。
[0019]本發(fā)明的油體可以用作其他分子的載體，并且因此可以進(jìn)一步包括，一種或多種其他分子。此類其他分子的實(shí)例包括但不局限于，益生菌、防腐劑、治療劑、診斷劑、遞送劑或食物著色劑。
[0020]通過操縱油與油質(zhì)蛋白的相對(duì)濃度可以改變?cè)撚腕w的尺寸，其中油質(zhì)蛋白的更低相對(duì)量促進(jìn)更大的尺寸。在一個(gè)實(shí)施例中，該油體具有約0.1至約100 μ m之間、或至少約
0.5至約50 μ m之間、或至少約0.5至約10 μ m之間、或至少約0.5至約2 μ m之間的尺寸。[0021 ] 仍在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包括本發(fā)明的一種或多種人造油體以及一種載體。在一個(gè)實(shí)施例中，載體是去離子水。
[0022]在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物是一種水包油乳液。具體地，本發(fā)明的水包油乳液比在不存在油質(zhì)蛋白的情況下使用一種乳化劑(例如如吐溫40)生產(chǎn)的、包含脂肪酸的水包油乳液更加抗氧化。[0023]本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人造油體通常是抗氧化的。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，該人造油體和/或組合物不包括合成的抗氧化劑。此外，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的人造油體是氧化穩(wěn)定的。
[0024]在一個(gè)實(shí)施例中，該人造油體由油質(zhì)蛋白、表面活性劑、以及包含脂肪酸(例如多不飽和脂肪酸)的油組成，該脂肪酸具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵。
[0025]除了在治療劑的遞送中有用之外，由于這些油體的脂肪酸，特別是多不飽和脂肪酸的熟知的益處，本發(fā)明的人造油體可以用于治療或預(yù)防疾病。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防將從脂肪酸獲益的病癥的方法，該方法包括向患有該病癥的受試者給予本發(fā)明的一種或多種油體和/或本發(fā)明的組合物。
[0026]還提供了本發(fā)明的一種或多種油體和/或本發(fā)明的組合物用于制造治療或預(yù)防將從脂肪酸獲益的病癥的藥物的用途。
[0027]此外，提供了本發(fā)明的一種或多種油體和/或本發(fā)明的組合物作為用于治療或預(yù)防將從脂肪酸獲益的病癥的藥物的用途。
[0028]在上述方法和用途的一個(gè)實(shí)施例中，該病癥可能從具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸中獲益。
[0029]這些油體可以用于多種多樣的產(chǎn)品中。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品包括本發(fā)明的一種或多種人造油體，和/或一種組合物。此類產(chǎn)品的實(shí)例包括但不局限于，食物或飼料產(chǎn)品、飲品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品。
[0030]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該產(chǎn)品是，或包括一種水包油乳液。
[0031]還提供了本發(fā)明的一種或多種人造油體，和/或本發(fā)明的一種組合物用于制備一種產(chǎn)品的用途。
[0032]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種制備飼料、食物或飲品的方法，該方法包括將本發(fā)明的一種或多種人造油體，和/或本發(fā)明的組合物與一種或多種可食用成分進(jìn)行混
八
口 ο
[0033]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)人造油體的方法，該方法包括
[0034]i)獲得油質(zhì)蛋白、表面活性劑以及包含具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸的油，并且
[0035]ii)混合該油質(zhì)蛋白、表面活性劑和油來生產(chǎn)這些人造油體。
[0036]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)人造油體的方法，該方法包括
[0037]i)獲得油質(zhì)蛋白、表面活性劑以及包含脂肪酸的油，其中該表面活性劑的至少一些不是磷脂，并且
[0038]ii)混合該油質(zhì)蛋白、表面活性劑和油來生產(chǎn)這些人造油體。
[0039]在一個(gè)實(shí)施例中，在混合到該油質(zhì)蛋白中之前，將該表面活性劑混合并溶解于該油中。
[0040]在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括，
[0041]iii)選擇人造油體。
[0042]本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)對(duì)獲得用于在本發(fā)明人造油體中使用的油質(zhì)蛋白的方法進(jìn)行了鑒定。本發(fā)明的諸位發(fā)明人特別出人意料地發(fā)現(xiàn)，可以使用具有相對(duì)少量的油質(zhì)蛋白(例如，總蛋白的約10%)的、包含高度異源的蛋白群體的蛋白提取物，其中該油、表面活性劑和油質(zhì)蛋白的自然親和力在形成這些人造油體時(shí)貌似是高效的。這是特別有利地，因?yàn)樗苊饬诉M(jìn)行大量純化程序的需要并且提供了油質(zhì)蛋白的相對(duì)廉價(jià)的來源。因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，步驟i)包括
[0043]a)獲得包含油質(zhì)蛋白的植物的提取物，并且
[0044]b)從該提取物中至少部分地純化蛋白，其中該蛋白包括油質(zhì)蛋白。
[0045]優(yōu)選地，步驟b)包括
[0046]I)調(diào)節(jié)該提取物的pH到至少約11.5的pH，
[0047]2)分離I)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇液相，
[0048]3)降低該液相的pH以沉淀出這些蛋白，
[0049]4)分離3)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇固相，并且
[0050]5)將該固相分散在一種載體中。
[0051 ] 本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的人造油體。
[0052]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種部分純化來自植物提取物的油質(zhì)蛋白的方法，該方法包括
[0053]I)調(diào)節(jié)該提取物的pH到至少約11.5的pH，
[0054]2)分離I)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇液相，
[0055]3)降低該液相的pH以沉淀出這些蛋白，
[0056]4)分離3)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇固相，并且
[0057]5)將該固相分散在一種載體中。
[0058]在一個(gè)實(shí)施例中，步驟3)包括將該液相的pH降低為低于約7，至約pH4至約7，或約pH5.5至約7。
[0059]優(yōu)選地，上述兩個(gè)方面的方法不使用有機(jī)溶劑。
[0060]該提取物可以來自任何植物，如植物餅粉。然而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該植物是油料種子植物。
[0061]本發(fā)明的諸位發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從植物材料(例如，油料種子植物的種子)的油的提取物獲得的餅粉可以用作油質(zhì)蛋白的來源。作為所要求的發(fā)明的一個(gè)添加的益處，在該油質(zhì)蛋白進(jìn)行部分純化之后，剩余的植物提取物可以用作動(dòng)物飼料。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該提取物是油提取之后產(chǎn)生的餅粉。
[0062]本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的、至少部分純化的油質(zhì)蛋白。
[0063]除非確切地陳述是其他情況，在此的任何實(shí)施例都可以拿來加以必要修改適用于任何其他實(shí)施例。
[0064]本發(fā)明不局限于在此描述的特定實(shí)施例的范圍內(nèi)，這些實(shí)施例僅意在出于示例性的目的。如在此描述，功能等效物產(chǎn)品、組合物以及方法清楚地在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0065]貫穿本說明書，除非另外確切地陳述或上下文要求是其他情況，參考一個(gè)單一的步驟、物質(zhì)的組合物、步驟的組或物質(zhì)的組合物的組將被視為涵蓋那些步驟、物質(zhì)的組合物、步驟的組或物質(zhì)的組合物的組中的一個(gè)和多個(gè)(即一個(gè)或多個(gè))。
[0066]在下文中通過以下非限制性實(shí)例和參考附圖的方式描述本發(fā)明。
_7]附圖簡(jiǎn)要說明
[0068]圖1:用于從卡諾拉餅粉中提取油質(zhì)蛋白的程序。[0069]圖2:提取自卡諾拉餅粉的油質(zhì)蛋白的電泳分析。
[0070]圖3:提取介質(zhì)的pH對(duì)來自卡諾拉餅粉的油質(zhì)蛋白的恢復(fù)的影響。
[0071]圖4:在不同pH值提取的油質(zhì)蛋白的電泳分析。泳道2和3-ρΗΙΟ.5;泳道4和5-pHll.0 ;泳道 6 和 7-pHll.5 ;泳道 8 和 9_pH12.0。 [0072]圖5:針對(duì)經(jīng)受加速自氧化(60°C)的吐溫40和油質(zhì)蛋白乳液，D[3，2}和d (0.5)的顆粒尺寸(μπΟ的變化。平均數(shù)據(jù)來自重復(fù)測(cè)量。
[0073]圖6:人造金槍魚油體的表面蛋白的電泳分析。泳道:M-標(biāo)記，未經(jīng)加工的ΡΗ12-提取自卡諾拉餅粉的、ρΗ12可溶性粗蛋白，CPl -提取自制作自卡諾拉油的人造卡諾拉油體的蛋白以及重新溶解的ΡΗ6.5-沉淀的卡諾拉餅粉蛋白，CPl+PLs-提取自制作自卡諾拉油的人造卡諾拉油體的蛋白，重新溶解的PH6.5-沉淀的卡諾拉餅粉蛋白，以及磷脂。
[0074]圖7:在分別用吐溫40與油質(zhì)蛋白提取物制備的金槍魚油乳液的加速氧化過程中的反式，反式，2，4，庚二烯醛的發(fā)展。平均數(shù)據(jù)來自重復(fù)測(cè)量。7A-在60°C下的氧化；7B-在40°C下的氧化。
[0075]圖8:在60°C下的儲(chǔ)存過程中，在(分別)用吐溫40與油質(zhì)蛋白提取物制作的金槍魚油乳液中的EPA和DHA的損耗。平均數(shù)據(jù)來自重復(fù)測(cè)量。8A-在60°C下的氧化；8B-在40°C下的氧化。
[0076]圖9:提取自金槍魚油人造油體乳液和等效的吐溫40乳液的油在40°C下經(jīng)受加速氧化的過氧化值(PV)。
[0077]圖10:在分別通過油質(zhì)蛋白、Isolexx、和酪蛋白鈉穩(wěn)定化的金槍魚油乳液的加速儲(chǔ)存(40°C，空氣)過程中的反式，，反式，2，4，庚二烯醛的發(fā)展。
[0078]圖11:在使用油質(zhì)蛋白與分別作為次級(jí)表面活性劑的單酰甘油(MAG)、吐溫40(吐溫)、以及硬脂酰乳酸鈉(SSL)組合制備的金槍魚油乳液的加速儲(chǔ)存(40°C，空氣)過程中的反式，反式，2，4，庚二烯醛的發(fā)展。
[0079]序列表的關(guān)鍵
[0080]SEQ ID NOl:歐洲油菜(Brassica napus)油質(zhì)蛋白(CAA57545.1)
[0081]SEQ ID N02:歐洲油菜油質(zhì)蛋白 Sl-1 (ACG69504.1)
[0082]SEQ ID N03:歐洲油菜油質(zhì)蛋白 S2-1 (ACG69503.1)
[0083]SEQ ID N04:歐洲油菜油質(zhì)蛋白 S3-1 (ACG69513.1)
[0084]SEQ ID N05:歐洲油菜油質(zhì)蛋白 S4-1 (ACG69507.1)
[0085]SEQ ID N06:歐洲油菜油質(zhì)蛋白 S5-1 (ACG69511.1)
[0086]SEQ ID N07:花生(Arachis hypogaea)油質(zhì)蛋白 I (AAZ20276.1)
[0087]SEQ ID N08:花生油質(zhì)蛋白 2 (AAU21500.1)
[0088]SEQ ID N09:花生油質(zhì)蛋白 3 (AAU21501.1)
[0089]SEQ ID NOlO:花生油質(zhì)蛋白 5 (ABC96763.1)
[0090]SEQ ID NOll:蓖麻(Ricinus communis)油質(zhì)蛋白 I (EEF40948.1)
[0091]SEQ ID N012:蓖麻油質(zhì)蛋白 2 (EEF51616.1)
[0092]SEQ ID N013:大豆(Glycine max)油質(zhì)蛋白異構(gòu)體 a (P29530.2)
[0093]SEQ ID N014:大豆油質(zhì)蛋白異構(gòu)體b (P29531.1)
[0094]SEQ ID N015:亞麻(Linum usitatissimum)油質(zhì)蛋白低分子量異構(gòu)體(ABB01622.1)
[0095]SEQ ID N016:亞麻油質(zhì)蛋白高分子量異構(gòu)體(ABB01624.1)
[0096]SEQ ID N017:向日葵(Helianthus annuus)油質(zhì)蛋白(CAA44224.1)
[0097]SEQ ID N018:玉蜀黍(Zea mays)油質(zhì)蛋白(ΝΡ_001105338.I)
[0098]SEQ ID Ν019:歐洲油菜固醇油質(zhì)蛋白(ΑΒΜ30178.1)
[0099]SEQ ID Ν020:歐洲油菜固醇油質(zhì)蛋白 SL01-1 (ACG69522.1)
[0100]SEQ ID Ν021:歐洲油菜固醇油質(zhì)蛋白 SL02-1 (ACG69525.1)
[0101]SEQ ID Ν022:芝麻(Sesamum indicum)固醇油質(zhì)蛋白(AAL13315.1)
[0102]SEQ ID N023:玉蜀黍固醇油質(zhì)蛋白(NP_001152614.1)
[0103]SEQ ID N024:歐洲油菜鈣油質(zhì)蛋白 CL0-1 (ACG69529.1)
[0104]SEQ ID N025:歐洲油菜鈣油質(zhì)蛋白 CL0-3 (ACG69527.1)
[0105]SEQ ID N026:芝麻鈣油質(zhì)蛋白(AAF13743.1)
[0106]SEQ ID N027:玉蜀黍鈣油質(zhì)蛋白(ΝΡ_001151906.I)
[0107]發(fā)明詳細(xì)說明
[0108]通用技術(shù)和定義
[0109]除非確切地另外定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語應(yīng)視為對(duì)于本領(lǐng)域(例如，脂質(zhì)化學(xué)、分子遺傳學(xué)、化學(xué)、以及生物化學(xué))普通技術(shù)人員的共同理解具有相同的意思。
[0110]除非另外指明，在本發(fā)明中利用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)、以及免疫技術(shù)都是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序。此類技術(shù)描述并解釋于以下來源的全部文獻(xiàn)中，如帕柏(J.Perbal),《分子克隆使用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning),約翰威利父子出版社(John Wiley and Sons) (1984),薩姆布魯克(J.Sambrook)等人，《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press) (1989),布朗(T.A.Brown)(編者)，《基礎(chǔ)分子生物學(xué):實(shí)用方法》(Essential Molecular Biology:A Practical Approach),第 I 卷和第2卷，IRL出版社(1991)，格洛夫(D.M.Glover)和哈姆斯(B.D.Hames)(編者)，〈〈DNA克隆:實(shí)用方法》(DNA Cloning:A Practical Approach), 1-4 卷，IRL 出版社(1995 和 1996),以及奧蘇貝爾(F.M.Ausubel)等人(編者)，《分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)》(Current Protocolsin Molecular Biology),格林出版社聯(lián)合威利出版社(Greene Pub.Associates andffiley-1nterscience) (1988,包括直至現(xiàn)在的所有更新)。
[0111]術(shù)語“和/或”，例如，“X和/或Y”應(yīng)當(dāng)被理解為意指“X和Y”或“X或Y”，并且應(yīng)當(dāng)被視為對(duì)兩種含義或任一種含義提供明確支持。
[0112]如在此使用的，除非相反地陳述，術(shù)語約是指定值的+/_20%、更優(yōu)選+/-10%，甚至更優(yōu)選+/-5%。
[0113]貫穿本說明書，“包含(或包括)(compri se ) ” 一詞或其變化形式(例如“包含了(或包括了)(comprises)”或“包含著(或包括著)(comprising)”)應(yīng)被理解為意指包括所陳述的要素、完整的事物或步驟、或者多個(gè)要素、多個(gè)完整的事物或多個(gè)步驟的群組，但不排除任何其他要素、完整的事物或步驟、或者多個(gè)要素、多個(gè)完整的事物或多個(gè)步驟的群組。
[0114]油和脂肪酸
[0115]如在此使用的，術(shù)語“脂肪酸”是指長(zhǎng)度上具有至少8個(gè)碳原子的長(zhǎng)脂肪族尾部的、飽和亦或不飽和的羧酸。典型地，脂肪酸在長(zhǎng)度上具有至少12個(gè)碳的一個(gè)碳-碳鍵鏈。大部分天然發(fā)生的脂肪酸具有偶數(shù)個(gè)碳原子，因?yàn)樗鼈兊纳锖铣缮婕熬哂袃蓚€(gè)碳原子的乙酸酯。這些脂肪酸可以處于游離狀態(tài)(未酯化的)或處于酯化形式，例如TAG、DAG、MAG、?；?CoA (硫代酯)結(jié)合、或其他共價(jià)結(jié)合形式的一部分。當(dāng)共價(jià)結(jié)合處于酯化形式時(shí)，該脂肪酸在此稱為“?；被鶊F(tuán)。飽和脂肪酸不包含任何雙鍵或沿著該鏈的其他官能團(tuán)。術(shù)語“飽和的”是指氫，其中在所有碳中(除羧酸[-C00H]基團(tuán)之外)包含盡可能多的氫。換言之，omega ( ω )端包含3個(gè)氫(CH3-)并且該鏈中的每個(gè)碳包含2個(gè)氫(CH2-)。不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸具有類似的形式，除了沿著該鏈存在一個(gè)或多個(gè)亞烷基官能團(tuán)之外，其中，每個(gè)亞烷基用雙鍵的“-CH=CH_”部分取代該鏈的單鍵“-CH2-CH2-”部分(B卩，一個(gè)碳雙鍵合到另一個(gè)碳上)。在該鏈中的、鍵合至該雙鍵的另一側(cè)的這兩個(gè)鄰近的碳原子能以順式或反式構(gòu)型存在。除了雙鍵之外，脂肪酸的?；溈梢跃哂腥I，?；鶄?cè)鏈，例如甲基或乙基，羥基或本領(lǐng)域中已知的其他改性。本發(fā)明的人造油體可以包括脂肪酸，例如但不局限于，硬脂酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸、-亞麻酸、或其兩個(gè)或更多個(gè)的組合。
[0116]如在此使用的，術(shù)語“多不飽和脂肪酸”或“PUFA”是指在其碳鏈中包含至少18個(gè)碳原子以及至少三個(gè)、更優(yōu)選地至少四個(gè)亞烷基(碳-碳雙鍵)的脂肪酸。本發(fā)明一方面涉及包含具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸(PUFA)的人造油體。此類PUFA的實(shí)例包括但不局限于，十八碳四烯酸(SDA、18:4A6、9、12、15、ω 3)，花生四烯酸(ARA、20:4 Λ 5、8、
11、14;(0 6)，二十碳四烯酸化丁八、20:4八8、11、14、17、ω 3)，二十碳五烯酸(ΕΡΑ、20:5 Λ 5、
8、11、14、17 ;ω3)，二十二碳五烯酸(DPA、22:5 Λ 7、10、13、16、19、ω3)，二十二碳六烯酸(DHA、22:6 Λ 4、7、10、13、16、19、ω 3)，及其兩個(gè)或更多個(gè)的混合物。這些人造油體可以進(jìn)一步包括其他脂肪酸，例如上文描述的那些，具有，例如，兩個(gè)或更少的雙鍵、三鍵、側(cè)鏈，例如甲基、羥基、和/或環(huán)氧化 物基團(tuán)。
[0117]脂肪酸可以處于游離狀態(tài)(未酯化的)或處于酯化形式，如甘油三酸酯、二酰基甘油酯、單酰甘油、?；?CoA結(jié)合或其他結(jié)合形式的一部分，或其兩個(gè)或更多個(gè)的混合物。該脂肪酸可以被酯化為一種磷脂，例如卵磷脂、腦磷脂、絲氨酸磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或雙磷脂酰甘油形式。
[0118]如在此使用的，術(shù)語“甘油酯”包括選自下組的脂質(zhì)，該組由以下各項(xiàng)組成:甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷酸甘油酯及其組合。更優(yōu)選地，該甘油酯選自甘油三酯和甘油二酯組成的組。最優(yōu)選地，該甘油酯是甘油三酯油。
[0119]“三酰甘油”或(TAG)是其中甘油被三個(gè)脂肪酸酯化了的甘油酯。在TAG合成的肯尼迪途徑中，前體sn-甘油-3-磷酸鹽在sn-Ι位置處在由甘油_3_磷酸?；D(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)中通過脂肪酸輔酶A酯被酯化以形成溶血磷脂酸(LPA)，并且其進(jìn)一步在sn-2位置處通過?；视土姿狨；D(zhuǎn)移酶?；孕纬闪字帷Ａ姿峄ㄟ^酶磷脂磷酸水解酶去除并且生成的1，2- 二酰基-sn-甘油被?；孕纬扇；?sn-甘油。
[0120]在一個(gè)實(shí)施例中，該油的甘油酯(優(yōu)選地，TAG)內(nèi)容物基本上包括這些脂肪酸的全部(例如，至少75%、或至少90%、或至少95%)。
[0121]包含多種脂肪酸的油可以獲得自多種多樣的來源，包括微生物(包括酵母)、甲殼動(dòng)物、魚、動(dòng)物以及植物。該有機(jī)體可以是或不是遺傳改性的。
[0122]在一個(gè)實(shí)施例中，在這些人造油體中存在種子油。如在此使用，術(shù)語“種子油”是指獲得自包含至少60% (w/w)脂質(zhì)的植物的種子/谷物的，或如果種子油仍然存在于該種子/谷物中，從種子/谷物可獲得的組合物。也就是說，種子油包括存在于該種子/谷物或其部分中的種子油，連同已經(jīng)從該種子/谷物中提取出的種子油。該種子油優(yōu)選地是提取的種子油。種子油在室溫下典型地是液體。優(yōu)選地，種子油中的總脂肪酸(TFA)內(nèi)容物主要包括(>50%)長(zhǎng)度上至少16個(gè)碳的脂肪酸。更優(yōu)選地，種子油中的總脂肪酸的至少50%是C18脂肪酸，例如，油酸。這些脂肪酸典型地處于酯化的形式，例如像，TAG、DAG、?；?CoA或磷脂。這些脂肪酸可以是游離脂肪酸和/或處于酯化的形式。在一個(gè)實(shí)施例中，在這些人造油體中的種子油是“基本上純凈的”或“純凈的”油，這些油已經(jīng)與該種子或粗提取物中相關(guān)的一種或多種其他脂質(zhì)(除磷脂之外)、核酸、多肽(除油質(zhì)蛋白之外)、或其他污染分子分離。優(yōu)選地，該基本上純凈的種子油至少60%不含、更優(yōu)選地至少75%不含、并且更優(yōu)選地至少90%不含與該種子或提取物中相關(guān)的其他組分。種子油可以進(jìn)一步包括非脂肪酸分子，例如但不局限于，固醇類和酚類。在一個(gè)實(shí)施例中，種子油是卡諾拉油(歐洲油菜、蕪青類物種(Brassica rapa ssp.)),芥菜油(芥菜(Brassica juncea)),其他芥屬植物油(Brassica oil)(例如，完菁甘藍(lán)(Brassica napobrassica)、芥屬亞麻芥屬(Brassicacamelina)),向日葵油(向日葵),亞麻籽油(亞麻),大豆油(大豆),紅花油(紅花(Carthamustinctorius)),玉米油(玉蜀黍)，煙草油(普通煙草(Nicotiana tabacum)),花生油(Arachis hypogaea),棕櫚油(棕櫚(Elaeis guineensis)),棉籽油(陸地棉(Gossypiumhirsutum)),椰子油(椰子(Cocos nucifera)),鱷梨油(油梨(Persea americana)),撤欖油(橄欖(Olea europaea)),腰果油(腰果(Anacardium occidentale)),澳洲堅(jiān)果油(Macadamia intergrifolia),扁桃仁油(扁桃(Prunus amygdalus)),燕麥種子油(燕麥(Avena sativa)),米糠油(稻(Oryza sativa)或非洲栽培稻(Oryza glaberrima)),或擬南芥屬種子油(擬南芥(Arabidopsis thaliana))?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法從種子/谷物中提取種子油。這典型地涉及通常與這些種子的第一次破碎相關(guān)聯(lián)的、用非極性溶劑(例如二乙醚、石油醚、氯仿/甲醇或丁醇混合物)進(jìn)行的提取。與谷物中淀粉相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)可以用水飽和的丁醇進(jìn)行提取。該種子油可以通過本領(lǐng)域中已知的方法“脫膠”，以去除多糖類或以其他方式進(jìn)行處理，以去除污染或改進(jìn)純度、穩(wěn)定性、或顏色。可以將該種子油中的TAG以及其他酯類水解以釋放游離脂肪酸，或如本領(lǐng)域中已知的進(jìn)行化學(xué)或酶處理將該種子油氫化。
[0123]如在此使用，“海產(chǎn)品的油”是獲得自生活在鹽水中的有機(jī)體，特別是海洋微藻、魚或甲殼動(dòng)物的油。因此，用于在本發(fā)明中使用的油可以是海洋油或衍生自咸水魚的魚油。
[0124]包含具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸的油可以從任何來源獲得，例如提取自海洋微生物、甲殼動(dòng)物、魚或轉(zhuǎn)基因有機(jī)體(例如轉(zhuǎn)基因植物或酵母)的油，這些轉(zhuǎn)基因有機(jī)體包含外源多核苷酸，這些外源多核苷酸能夠使得這些有機(jī)體合成具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸。PUFA可以從其中獲得的海洋微生物的實(shí)例包括但不局限于，前溝藻屬(Amphidinium)、雙眉藻屬(Amphora)、星桿藻屬(Asterionella)、盒形藻屬(Biddulphia)、角藻屬(Ceratium)、角毛藻屬(Chaetoceros)、小球藻屬(Chlorella)、藍(lán)隱藻屬(Chroomonas)、旋溝藻屬(Cochlodinium)、Crisphaera、隱甲藻屬(Crypthecodinium)、隱藻屬(Cryptomonas)、小環(huán)藻屬(Cyclotella)、筒柱藻屬(Cylindrotheca)、Duniella、圓石藻屬(Emiliania)、脆桿藻屬(Fragilaria)、光甲藻屬(Glenodinium)、膝溝藻屬(Gonyaulax)、Gyrodinium、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)、異毛藻屬(Heteromastix)、等邊金藻屬(Isochrysis)、婁氏藻屬(Lauderia)、單鞭金藻屬(Monochrysis)、蒜頭藻屬(Monodus)、Moritella、被孢霉屬(Mortierella)、微綠球藻屬(Nannochloris)、Nannochloropis、舟形藻屬(Navicula)、菱形藻屬(Nitzschia)、齒狀藻屬(Odontella)、滑盤藻屬(Olisthodiscus)、巴夫藻屬(Pavlova)、多甲藻屬(Peridinium)、褐指藻屬(Phaeodactylum)、紫球藻屬(Porphyridium)、原甲藻屬(Prorocentrum)、假柄鐘藻屬(Pseudopedinella)、Rhodella、Rhododomas> 裂殖壺菌(Schizochytrium)、Skelentonema、福節(jié)藻屬(Stauroneis)、四爿藻屬(Tetraselmis)、海鏈藻屬(Thalassiosira)、Thrautochytrium、或Ulkenia的物種。對(duì)本發(fā)明有用的魚油的實(shí)例包括但不局限于，金槍魚油(tuna oil)、鰹魚油(bonito oil)、海S盧魚油(seabass oil)、大比目魚油(halibut oil)、旗魚油(spearfish oil)、梭魚油(barracudaoil)、鍾魚油(cod oil)、步魚油(menhaden oil)、沙丁魚油(sardine oil)、沙腦沙丁魚油(pilchard oil)、餅魚油(anchovy oil)、 毛鱗魚油(capelin oil)、大西洋鍾魚油(Atlantic cod oil)、大西洋鯡魚油(Atlantic herring oil)、大西洋鯖魚油(Atlanticmackerel oil)、大西洋步魚油(Atlantic menhaden oil)、鮭魚油(salmonids oil)、藍(lán)魚油(shark oil )、魷魚油(squid oil )、章魚油(octopus oil )、憐奸油(krill oil)、海豹油(seal oil)、鯨油(whale oil)等等,包括它們的混合物和組合。生產(chǎn)具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體的實(shí)例描述于，例如，W02005/103253、W02007/106905, W02010/023202, W02010/057246 和 W02012/000026 中。
[0125]如上文指出，在本領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)踐的技術(shù)可以用于提取并加工由細(xì)胞、植物、種子等生產(chǎn)的油。例如，油提取可以包括脫膠(或酸處理)、中和(或堿處理)、水洗、脫色、過濾、除臭、精制(polishing)和/或冷卻(或冬化)。優(yōu)選地純化包括酸處理和/或堿處理(脫膠和中和)?？商娲?，純化方法可以包括脫色和/或除臭。然而，優(yōu)選地，純化通常將包括脫色和/或除臭，并且此外可任選地包括酸和堿處理。
[0126]油質(zhì)蛋白
[0127]油質(zhì)蛋白是存在于種子貯藏組織內(nèi)的油體膜中的疏水蛋白(參見，例如，黃，1996 ；林(Lin)等人，2005 ;卡普阿諾(Capuano)等人，2007 ;呂(Lui )等人，2009 ；島田(Shimada)以及哈如阿-西村由紀(jì)江(Hara-Nishimura)，2010)。它們具有低MW (15-26，000),并且在油料種子植物中豐富。在每一物種的種子中，通常存在兩種或更多種不同MW的油質(zhì)蛋白。每個(gè)油質(zhì)蛋白分子包含一個(gè)相對(duì)親水的N-端結(jié)構(gòu)域(例如，約48個(gè)氨基酸殘基)、一個(gè)中心完全疏水的結(jié)構(gòu)域(例如，具有約70-80個(gè)氨基酸殘基)以及在C-端處或靠近C-端的一個(gè)兩親-螺旋結(jié)構(gòu)域(例如，約具有約33個(gè)氨基酸殘基)，特別地，該完全疏水的結(jié)構(gòu)域富含脂肪族氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸以及纈氨酸。通常地，這些疏水殘基的中心延伸被插入到脂質(zhì)核中并且該兩親N-端和/或兩親C-端位于這些油體的表面上，其中帶正電荷的殘基包埋在表面活性劑單層中并且?guī)ж?fù)電荷的殘基暴露于外部。
[0128]如在此使用，術(shù)語“油質(zhì)蛋白”涵蓋結(jié)合鈣的鈣油質(zhì)蛋白，以及結(jié)合固醇的固醇油質(zhì)蛋白，連同聚油質(zhì)蛋白(斯科特(Scott)等人，2010)。然而，如果不是全部，通常大部分的本發(fā)明的人造油體的油質(zhì)蛋白將是鈣油質(zhì)蛋白和/或固醇油質(zhì)蛋白。此外，如在此使用，術(shù)語“油質(zhì)蛋白”是指同源種群的相同油質(zhì)蛋白蛋白，亦或更加典型地，異源種群的不同油質(zhì)蛋白蛋白。
[0129]已知來自大量不同植物物種的油質(zhì)蛋白蛋白序列以及用于對(duì)其進(jìn)行編碼的核苷酸序列的基本數(shù)量。實(shí)例包括但不局限于，來自以下的油質(zhì)蛋白:擬南芥屬、卡諾拉、玉米、稻、花生、蓖麻、大豆、亞麻、葡萄、卷心菜、棉花、向日葵、高粱以及大麥。在序列表中提供了這些油質(zhì)蛋白的一些的實(shí)例。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，該油質(zhì)蛋白包括選自以下的一個(gè)序列:
[0130]a)如在SEQ ID NOl至27的任一個(gè)中提供的一個(gè)氨基酸序列，
[0131]b)與SEQ ID NOl至27的任意一個(gè)或多個(gè)具有至少50%同一性，更優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少96%、更優(yōu)選地至少97%、更優(yōu)選地至少98%、更優(yōu)選地至少99%同一性的一個(gè)氨基酸序列，以及 [0132]c)a)或b)的一個(gè)生物活性片段。
[0133]在另一個(gè)實(shí)施例中，該油質(zhì)蛋白包括選自以下的一個(gè)序列:
[0134]a)如在SEQ ID NOl至18的任一個(gè)中提供的一個(gè)氨基酸序列，
[0135]b)與SEQ ID NOl至18的任意一個(gè)或多個(gè)具有至少50%同一性，更優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選地至少95%、更優(yōu)選地至少96%、更優(yōu)選地至少97%、更優(yōu)選地至少98%、更優(yōu)選地至少99%同一性的一個(gè)氨基酸序列，以及
[0136]c)a)或b)的一個(gè)生物活性片段。
[0137]通過GAP (尼德曼(Needleman)以及翁施(Wunsch)，1970)分析(GCG程序)確定蛋白的同一性％，其中缺口產(chǎn)生罰分=5，并且缺口延伸罰分=0.3。查詢序列在長(zhǎng)度上具有至少50個(gè)氨基酸，并且GAP分析在至少50個(gè)氨基酸區(qū)域上比對(duì)這兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，該查詢序列在長(zhǎng)度上具有至少100個(gè)氨基酸，并且GAP分析在至少100個(gè)氨基酸區(qū)域上比對(duì)這兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，該查詢序列在長(zhǎng)度上具有至少250個(gè)氨基酸，并且GAP分析在至少250個(gè)氨基酸區(qū)域上比對(duì)這兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，該GAP分析在其全長(zhǎng)上比對(duì)這兩個(gè)序列。
[0138]如在此使用，“生物活性的”片段是可以用于制備本發(fā)明人造油體的油質(zhì)蛋白的一部分。生物活性片段可以是任意尺寸，只要它們維持所定義的活性。
[0139]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該油質(zhì)蛋白獲得自一種油料種子植物，例如但不局限于卡諾拉(芥屬物種(Brassica spp.))、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)、油棕(Elaeis guineeis)、棉籽(棉屬物種(Gossypium spp.))、花生(Arachis hypogaea)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Ricinus communis)、紅花(Carthamus tinctorius)、芥子(芥屬物種以及白芥子(Sinapis alba))、芫荽(Coriandrum sativum)、笑瓜(Cucurbitamaxima)、亞麻桿 / 亞麻(Linum usitatissimum)、巴西堅(jiān)果(Bertholletia excelsa)、希蒙得木(霍霍巴(Simmondsia chinensis))或玉蜀黍(Zea mays)。
[0140]該油質(zhì)蛋白可以獲得自天然、合成或重組體來源。有利地，該油質(zhì)蛋白可以獲得自天然來源，例如植物提取物，特別是油提取之后的油料種子植物的餅粉。圖1示出為一個(gè)用于從植物餅粉(例如卡諾拉餅粉)中提取油質(zhì)蛋白的程序的實(shí)例。約50%的卡諾拉餅粉蛋白已經(jīng)被報(bào)道為在PH6.0-7.0沉淀出(馬納姆皮瑞(Manamperi)等人，2010)。卡諾拉餅粉典型地包含高達(dá)40%的、主要來自于種子細(xì)胞蛋白的蛋白。機(jī)械壓榨的商用的油提取方法之后是溶劑提取，破壞了卡諾拉油體結(jié)構(gòu)，由此將油質(zhì)蛋白釋放到相對(duì)更加豐富的細(xì)胞蛋白的混合物中。由于卡諾拉油質(zhì)蛋白的等電點(diǎn)是6.5，因此在pH6.0-7.0范圍內(nèi)的沉淀出的蛋白包含除細(xì)胞蛋白外的油質(zhì)蛋白。
[0141]該油質(zhì)蛋白還可以獲得自重組體來源，具有導(dǎo)致增強(qiáng)的油質(zhì)蛋白生產(chǎn)水平的、編碼油質(zhì)蛋白的一個(gè)或多個(gè)外源基因的植物，亦或包含一個(gè)或多個(gè)外源基因但不天然生產(chǎn)油質(zhì)蛋白的重組有機(jī)體，例如重組酵母。生產(chǎn)油質(zhì)蛋白和/或具有增強(qiáng)的油質(zhì)蛋白水平的重組有機(jī)體的生產(chǎn)很好地在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)(參見，例如，洛克斯(Roux)等人，2004 ;阿貝尼斯(Abenes)等人，1997 ;巴哈塔拉(Bhatla)等人，2010)。 [0142]可以通過將適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓瘜?dǎo)入到編碼油質(zhì)蛋白的核酸中，或者通過體外合成所希望的蛋白來制備天然發(fā)生的油質(zhì)蛋白的氨基酸序列突變體。此類突變體包括，例如，殘基在該氨基酸序列之內(nèi)的缺失、插入或置換?？梢宰龀鋈笔А⒉迦牒椭脫Q的組合以達(dá)到最終構(gòu)建體，條件是該最終蛋白產(chǎn)物具有所希望的特征。天然發(fā)生的油質(zhì)蛋白的功能突變體的產(chǎn)生和鑒別也很好地在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
[0143]還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是在合成過程中或合成后區(qū)別修飾的蛋白，例如，通過生物素化、芐基化、糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白酶剪切、連接到抗體分子或其他細(xì)胞配體上、等。
[0144]可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)或使用本發(fā)明的方法來制備油質(zhì)蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，通過以下方法制備呈粗提取物的油質(zhì)蛋白
[0145]I)調(diào)節(jié)該提取物的pH到至少約11.5的pH,
[0146]2)分離I)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇液相，
[0147]3)降低該液相的pH以沉淀出這些蛋白，
[0148]4)分離3)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇固相，并且
[0149]5)將該固相分散在一種載體中。
[0150]在一個(gè)替代的實(shí)施例中，使用過濾法至少部分地純化來自植物材料的油質(zhì)蛋白。
[0151]表面活性劑
[0152]本發(fā)明的人造油體包括一種或多種表面活性劑。
[0153]該表面活性劑可以是非離子的或陰離子表面活性劑或其兩者或更多者的組合。更具體地，該表面活性劑可以是陰離子的、陽離子的、兼性離子的或其兩者或更多者的一個(gè)組合。例如該表面活性劑可以選自但不局限于下組，該組由以下各項(xiàng)組成:磷脂、甘油單酯、全氟辛酸酯(PF0A或PF0)、全氟辛烷磺酸酯(PF0S)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸銨、以及其他烷基硫酸鹽、月桂基醚硫酸鈉、也稱作十二烷基醚硫酸鈉(SLES)、烷基苯磺酸鹽、肥皂、或脂肪酸鹽、鯨蠟基三甲基溴化銨(CTAB )、十六烷基三甲基溴化銨、以及其他烷基三甲基銨鹽、氯化十六烷基嘧啶(CPC)、聚乙氧基化牛油胺(Ρ0ΕΑ)、氯化芐烷銨(BAC)、芐索氯銨(BZT)、十二烷基甜菜堿、椰油酰胺丙基甜菜堿、Coco ampho glycinate、烷基聚(氧化乙烯)、烷基酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)與聚(氧化丙烯)的共聚物(商業(yè)上稱作泊洛沙姆或Poloxamines)、烷基多聚葡糖苷，包括辛基葡糖苷、癸基麥芽糖苷、脂肪醇、鯨蠟醇CA)、聚(乙烯醇)(PVA)、油醇、椰子油酰胺MEA、椰子油酰胺DEA、聚山梨醇酯如吐溫20、吐溫40、吐溫80、以及十二烷基二甲基氧化胺。[0154]在一個(gè)實(shí)施例中，該表面活性劑是一種磷脂。然而，當(dāng)該脂肪酸不是具有至少四個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸時(shí)，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是，該人造油體不包含磷脂或與至少一種其他表面活性劑一起存在的磷脂(例如，在該人造油體中，該至少一種其他表面活性劑包括總表面活性劑的至少5%、或至少25%、或至少50%、或至少75%、或至少90%)。
[0155]磷脂是一類脂質(zhì)并且是所有細(xì)胞膜的主要組分，因?yàn)樗鼈兛梢孕纬芍p層。大多數(shù)磷脂含有一個(gè)甘油二酯、一個(gè)磷酸基以及一個(gè)簡(jiǎn)單的有機(jī)分子，例如膽堿。這個(gè)規(guī)則的一個(gè)例外是鞘磷脂，其衍生自鞘氨醇而不是甘油。
[0156]對(duì)本發(fā)明有用的磷脂的實(shí)例包括但不局限于，磷脂酰乙醇胺、磷酸卵磷酯、卵磷月旨、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇以及它們的兩個(gè)或更多個(gè)的混合物。
[0157]用于本發(fā)明油體生產(chǎn)的磷脂可以來自不同的來源，例如，來自種子，并且更加典型地，來自油料種子植物。這些包括卵磷脂以及溶血卵磷脂。例如，該卵磷脂可以獲得自大豆(大豆卵磷脂)或向日葵(向日葵卵磷脂)。額外地，可以使用具有改性的脂肪酸組合物的磷脂。此類磷脂可以是,例如,酶改性的大豆磷脂。例如,可以從大豆磷脂(SLP ;True Lecithin公司，日本三重縣)，通過用磷脂酶A2 (Novo Industry公司，丹麥，Bagsvaerd)進(jìn)行處理制備酶改性的大豆磷脂。額外地，可以從已經(jīng)被遺傳改性以生產(chǎn)具有改性的脂肪酸組合物的磷脂的植物或植物種子中獲得具有改性的脂肪酸組合物的磷脂。具有改性的脂肪酸組合物的磷脂的一個(gè)實(shí)例是具有改 性的脂肪酸組合物的卵磷脂。本領(lǐng)域中熟知的其他方法也可用于改性磷脂的脂肪酸組合物。
[0158]圍繞該油體的脂質(zhì)核的表面活性劑層通常是一個(gè)單層。
[0159]可以使用允許這些人造油體形成的表面活性劑的任何濃度。
[0160]人誥油體
[0161]如在此使用的，術(shù)語“人造油體”是指典型地在約0.1至約100 μ m尺寸之間的一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括由一個(gè)表面活性劑層圍繞的一種油，其中油質(zhì)蛋白包埋在該表面活性劑層中。它們被稱作人造的是因?yàn)闆]有證據(jù)表明本發(fā)明的這些油體是自然界中存在的。雖然如此，本發(fā)明的“人造油體”還可以稱作“油體”。
[0162]典型地，本發(fā)明的人造油體包括約90%至約98.5%的甘油酯，約0.2%至約5%的表面活性劑以及約0.5%至約5%的蛋白。例如，本發(fā)明的一種典型的人造油體包括約97.5/1.0/1.5的比率的油/表面活性劑/油質(zhì)蛋白。如在此示出，降低油質(zhì)蛋白的濃度導(dǎo)致該油體尺寸增加。
[0163]在一個(gè)實(shí)施例中，這些脂肪酸的至少10%、更優(yōu)選地至少20%、更優(yōu)選地至少30%是具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸。例如，由Numega公司生產(chǎn)的H1-DHA金槍魚油具有約37%的PUFA，而由馬泰克(Martek)公司生產(chǎn)的海藻油DHASCO具有約61%的PUFA。
[0164]在另一個(gè)實(shí)施例中，這些脂肪酸的至少10%、更優(yōu)選地至少20%是DHA。例如，由Numega公司生產(chǎn)的H1-DNA金槍魚油具有約26%的DHA，而由馬泰克公司生產(chǎn)的海藻油DHASCO 具有約 40% 的 DHA。
[0165]使用自動(dòng)攪拌器在SOOrpm操作30分鐘，通過將油、表面活性劑以及油質(zhì)蛋白與水(例如)混合制備一種預(yù)乳液可以獲得這些油體。有利地，這些油質(zhì)蛋白可以被提供為使用本發(fā)明方法獲得的提取自植物的一種蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，在本發(fā)明的這些方法中使用之前，將該油質(zhì)蛋白儲(chǔ)存為，例如像，通過冷凍干燥生產(chǎn)的一種粉末。[0166]本發(fā)明的人造油體是氧化穩(wěn)定的。例如，當(dāng)這些油體在40°C儲(chǔ)存15天時(shí)，在這些人造油體中的這些脂肪酸，例如EPA和DHA的總濃度減少小于40%、更優(yōu)選地小于30%、更優(yōu)選地小于20%、并且甚至更優(yōu)選地小于15%。在另一個(gè)實(shí)例中，在40°C儲(chǔ)存15天之后，這些油體包含小于6、更優(yōu)選地小于5、并且甚至更優(yōu)選地小于4 μ g/ml的反式，反式-2，4-庚二烯醒。仍在另一個(gè)實(shí)例中，在40°C 5天之后,產(chǎn)生了小于90meq/kg油、更優(yōu)選地小于50meq/kg油、更優(yōu)選地小于25meq/kg油的氫過氧化物。
[0167]包含人造油體的產(chǎn)品及其用途
[0168]這些油體可以在多種多樣的產(chǎn)品中使用。此類產(chǎn)品的實(shí)例包括但不局限于，食物或飼料產(chǎn)品、飲品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品。這些產(chǎn)品的生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域中所熟知的。
[0169]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本主題發(fā)明針對(duì)可以被動(dòng)物和/或人類攝取的產(chǎn)品。由于這些組合物可以被攝取，它們必須具有食物級(jí)質(zhì)量。然而，具體的產(chǎn)品以及這些油體應(yīng)用的具體形式并非至關(guān)重要的并且可以是如所希望的。食物、飼料或飲品的實(shí)例包括但不局限于，非乳制的替代物、非乳制的乳酪、非乳制的酸牛乳、人造黃油、蛋黃醬、油醋汁(vinaigrette)、糖霜(icing)、乳膏、湯、冰淇淋(例如，作為一種穩(wěn)定劑)、色拉調(diào)味汁、芥子、糖果、白色調(diào)味醬、口香糖、布丁、烘焙產(chǎn)品、調(diào)味品、榨汁(例如，作為一種天然的渾濁劑)、嬰兒配方奶粉(baby formula)、香料載體(flavour carrier)、紋理劑、魚食、寵物食品以及牲畜飼料。
[0170]個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的實(shí)例包括但不局限于，肥皂、美容產(chǎn)品、護(hù)膚膏、面霜、牙膏、唇膏、香水、化妝品、粉底、腮紅、睫毛膏、眼影、防曬露以及護(hù)發(fā)產(chǎn)品。
[0171]藥物產(chǎn)品的實(shí)例包括但不局限于，治療劑、診斷劑和遞送劑。
[0172]該治療劑或診斷劑可以是希望遞送到宿主的分子。在一個(gè)實(shí)施例中，該活性成分可以是具有治療或診斷價(jià)值的蛋白或肽。此類肽包括抗原(用于疫苗制劑)、抗體或抗體相關(guān)分子、細(xì)胞因子、凝血因子以及生長(zhǎng)激素。
[0173]工業(yè)產(chǎn)品的實(shí)例包括但不局限于，油漆、涂料、潤(rùn)滑劑、膜、凝膠、鉆井液、黏紙膠料、膠乳、建筑物或馬路建筑材料、墨水、染料、蠟、拋光劑和農(nóng)用化學(xué)品制劑。
[0174]由于本發(fā)明油體中的這些脂肪酸的熟知的益處，本發(fā)明的人造油體可以被用于治療或預(yù)防疾病。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防將從脂肪酸獲益的病癥，特別是從具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸獲益的方法，該方法包括向患有該病癥的受試者給予本發(fā)明的一種或多種油體和/或本發(fā)明的組合物。此類病癥的實(shí)例包括但不局限于，心律失常、血管成形術(shù)、炎癥、哮喘、銀屑病、骨質(zhì)疏松癥、腎結(jié)石、AIDS、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、精神分裂癥、癌癥、胎兒酒精綜合癥、注意力不足過動(dòng)癥、囊性纖維病、苯酮尿癥、單相抑郁、攻擊性敵對(duì)傾向(aggressive hostility)、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、冠心病、高血壓(hypertension)、糖尿病、肥胖癥、阿爾茨海默氏癥、慢性阻塞性肺病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管成形術(shù)后狹窄、濕疫、高血壓(high blood pressure)、血小板聚集、胃腸出血、子宮內(nèi)膜組織異位、經(jīng)前期綜合征、肌痛性腦脊髓炎、病毒感染后的慢性疲勞或眼病。
[0175]在一個(gè)實(shí)施例中，這些油體或組合物通過口服給予提供。典型地，這些油體以每次給予事件足以遞送至少IOmg脂肪酸(如co-3PUFA)的量進(jìn)行給予。更優(yōu)選地，每次給予事件遞送至少30mg,甚至更優(yōu)選地至少50mg并且最優(yōu)選地在IOOmg的脂肪酸(如co-3PUFA)。
[0176]將理解，本發(fā)明可以適用于治療動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物。最優(yōu)選地，本發(fā)明用于治療人類。
[0177]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該產(chǎn)品是，或包含，一種水包油乳液。本發(fā)明的此類乳液是物理和氧化穩(wěn)定的，并且靜置時(shí)不發(fā)生聚結(jié)。
[0178]可以使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將這些油體配制成一種乳液。優(yōu)選地，向該油體制劑中添加至少一種額外的成分。該額外的成分可以作為溶液、懸浮液、凝膠或固體進(jìn)行添加，并且該額外的成分的數(shù)量將取決于制劑。該額外的成分可以根據(jù)制劑變得與這些油體相關(guān)聯(lián)，依然懸浮于溶液中，或形成一種這些油體在其中分散的懸浮液。該成分還可以滲透圍繞該油體的表面活性劑層?？梢詽B透該油體的成分包括油、蠟以及染料尼羅紅。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該額外的成分是一種液相。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該液相是水。
[0179]可以直接地亦或通過與另一種成分相關(guān)的濕度添加水。水的最終的量不是關(guān)鍵性的，只要這些成分混合時(shí)形成一種穩(wěn)定的乳液。通常，這些組合物將包含至少1%的水以及高達(dá)99%的水。通常將需要進(jìn)行混合以提供一種適當(dāng)?shù)娜橐翰⑶铱赡苄枰訜峄蚴┘訅毫Α?[0180]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該額外的成分是一種油或蠟。油或蠟可以在這些油體中分隔并且以此方式脂質(zhì)可溶性成分，例如脂質(zhì)可溶性維生素可以被遞送到該油體。在油或蠟包含添加的成分的情 況下，這些油體可以依然懸浮于親脂相中或可以形成復(fù)乳液。
[0181]該最終的組合物可以處于固體或處于液體形式或具有任何其他希望的黏度。可以使用典型地以按重量計(jì)小于2%的濃度存在的膠凝劑，例如纖維素及衍生物、聚羧乙烯及衍生物、角豆膠、角叉菜膠及衍生物、蒼耳烷膠質(zhì)、長(zhǎng)鏈鏈烷醇酰胺、以及膨潤(rùn)土及衍生物將該乳液增稠。
[0182]該乳液可以進(jìn)一步包括表面活性劑，從而潤(rùn)濕、起泡、滲透、乳化、穩(wěn)定和或分散所選擇的材料。例如，如需要，陰離子表面活性劑，例如椰子甘油單酯磺酸鈉，陽離子表面活性劑，例如氯化月桂基三甲基銨、氯化十六烷基吡啶和三甲基溴化銨，非離子型表面活性劑，包括普朗尼克和烷基酚的聚氧化乙烯縮合物，以及兼性離子表面活性劑，例如脂肪族季銨的衍生物、phosmomium和锍化合物,這些可以全部被添加。
[0183]如希望，能夠結(jié)合金屬離子的螫合劑，例如酒石酸、EDTA、檸檬酸、堿金屬檸檬酸鹽、焦磷酸鹽或陰離子型聚合物聚羧酸酯也可以包含在該乳液制劑中。
[0184]通常，將對(duì)這些乳液制劑進(jìn)行處理，使得由細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等等或不希望的化學(xué)反應(yīng)(例如氧化反應(yīng))造成的污染得以預(yù)防。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這可以通過防腐劑，例如，焦亞硫酸鈉或其他化學(xué)添加物的添加或通過輻射，例如，通過電離輻射，例如鈷-60或銫-137輻射或通過紫外線輻射來完成。
[0185]此外，可以添加活化劑。例如，可以使用本發(fā)明的乳液制劑將美容組合物配制為穩(wěn)定的懸浮液，并且在護(hù)膚膏中可以包含維生素以及增濕劑。其中活性成分可以包含在本主題發(fā)明乳液中的一個(gè)特別有利的方式是如W096/21029中詳述的、通過油質(zhì)蛋白基因融合的構(gòu)建。通過將該編碼油質(zhì)蛋白的基因遺傳上連接到編碼感興趣肽或蛋白的基因上來創(chuàng)建這些融合蛋白。例如，在一種油料種子植物中，融合基因的表達(dá)導(dǎo)致然后用于生產(chǎn)本發(fā)明人造油體的融合蛋白的合成。原則上，使用這個(gè)技術(shù)可以生產(chǎn)任何希望的蛋白或肽，包括極性魚抗凍多肽，或可以生產(chǎn)一種為油質(zhì)蛋白融合物的治療蛋白。
[0186]還可以配制具有成膜性能的乳液。當(dāng)應(yīng)用于一個(gè)表面且干燥時(shí)，這樣一種乳液形成一層包衣。其中應(yīng)用一種包衣的油體膜的乳液的一個(gè)實(shí)例是在魚食中，其中可以對(duì)該魚食應(yīng)用多種油體(例如，生產(chǎn)自微藻油)以增強(qiáng)膳食值。在希望的是活性成分控釋的情況下(例如在藥物或揮發(fā)物，例如芳香劑的遞送中)，成膜乳液是本發(fā)明的實(shí)施例中是特別有用的。除其他因素之外，在干燥過程中發(fā)生的、來自乳液膜的活化劑的釋放時(shí)間取決于該膜的厚度。當(dāng)使用一個(gè)更厚的包衣時(shí)，更長(zhǎng)的干燥時(shí)間將導(dǎo)致該活化劑的更慢釋放。在多種考慮的制劑中，僅當(dāng)該膜干燥時(shí)發(fā)生試劑的釋放。
[0187]其他因素，例如該乳液的構(gòu)成以及該活性成分的類型和濃度也決定著釋放特征。例如，共溶劑，例如乙醇可以包含在該制劑中并影響釋放時(shí)間。在食品應(yīng)用中也希望活性成分的釋放，其中在消耗過程中，釋放乳液中包裹的(entrapped)香料。取決于該乳液的精確配制，香料的釋放可以引起突然強(qiáng)烈的感覺或香味與香精的更加精細(xì)的共混物。 [0188]該乳液制劑還可以用于噴霧和氣溶膠中。在這些噴霧中還可以包括揮發(fā)物，如醇和芳香劑。還可以將這種類型的乳液噴霧在干燥的食物制品(例如馬鈴薯片以及湯粉)的表面上。這種乳液可以包含香料并添加防腐值(preservative value)或幫助維持該食物的適當(dāng)濕度水平。
[0189]在酸性乳液制劑中可以利用本乳液制劑的穩(wěn)定性。例如，該乳液制劑可以用于蛋黃醬類食物產(chǎn)品的制備中，如果需要的話，該產(chǎn)品除油體制品之外包含植物油、芥子、醋以及蛋黃。可灌注的乳液，如色拉調(diào)味汁可以通過增加醋的相對(duì)量和/或通過添加水來制備。
[0190]在可以加熱而無明顯有害作用的情況下，應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例是在開胃醬，例如白色調(diào)味醫(yī)的制備中或在甜醫(yī)，例如巧克力醫(yī)中。在這些應(yīng)用中，油體制品被用作油?Η替代品。為了制備白色調(diào)味醬，向1份加熱的油體制品中添加1份(w/w)面粉并且進(jìn)行攪拌直到形成一種濃稠的懸浮液。在適度加熱下逐步地添加奶，直到獲得一種具有希望黏度的調(diào)味汁。
[0191]該乳液制劑還可以用作黃油替代品。在這個(gè)應(yīng)用中，向該油體制品中添加少量例如，小于10%的水，直到獲得希望的黏度。如果希望的話，可以添加天然的黃油香料以及增稠劑。該黃油替代品可以被用于甜玉米、面包上，蛋糕粉或面包制作中?？梢蕴砑拥湫偷丶s2.5% (wt/vol)水平的鹽，鹽有助于香味并且充當(dāng)防腐劑。如希望，可以添加著色劑，例如，胭脂樹種子的提取物或胡蘿卜素，以加深顏色。這個(gè)應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)是基于油體的黃油不包含氫化脂肪酸，氫化脂肪酸在人造黃油以及類似物的制劑中使用以達(dá)到希望稠度，但是也與心血管疾病相關(guān)。
[0192]可以將起酥油制備為從泡沫至可灌注的起酥油的不同硬度。在這個(gè)應(yīng)用中，將空氣灌輸?shù)皆撊橐褐苿┲胁⑶以撊橐褐苿┛梢员灰暈榉稚⒃谶B續(xù)相，空氣中。在希望乳油化和蓬松的情況下，可以將起酥油用于調(diào)拌料。這些調(diào)拌料包括糖霜、合成奶油、冰淇淋以及蛋糕糊。
[0193]可以從人造的或天然的香料以及營(yíng)養(yǎng)素制備仿真果汁(imitation fruitjuice)。此類仿真果汁不具有正確的外觀并且由于透明性看起來是稀薄的或經(jīng)稀釋的。通過添加少量的，例如，0.1%至1%(ν/ν)的該油體制品或其乳液，可以出現(xiàn)渾濁從而賦予該果汁濃厚的外觀。因此本油體制品可以用作渾濁劑。在包含果汁的另一個(gè)應(yīng)用中，該油體制品或其乳液可以被添加到具有可沉固體的果汁如，番茄汁中。[0194]添加少量的，例如，0.1%至1% (v/v)的該油體制品可以降低果汁中這些固體的沉降速率并且?guī)椭S持濃厚的外觀。
[0195]還想到了本發(fā)明油體制品的局部應(yīng)用。在這個(gè)實(shí)施例中，該乳液被配制成一種皮膚學(xué)上可接受的乳液，該乳液可以用于，例如，濕潤(rùn)面部和/或身體皮膚，包括指甲和嘴唇或可以具有抗皮膚老化、抗痤瘡、抗色素形成、抗脫發(fā)或促進(jìn)脫毛或有助于傷口愈合和/或皮膚組織重建的特性。按重量計(jì)，優(yōu)選該油體制品占據(jù)該最終組合物的1%_99%。 [0196]本發(fā)明的美容組合物可以包含額外的碳?xì)浠衔?，例如植物的、?dòng)物的、礦物的或合成的油或蠟或其混合物。它們包括石蠟、凡士林、全氫化角鯊烯、arara油、扁桃仁油、calphyllum油、鱷梨油、芝麻油、蓖麻油、希蒙得木油、橄欖油、或谷物胚芽油。
[0197]可以包含酯，例如羊毛脂酸(lanolic acid)、油酸、月桂酸(lauric acid)、硬脂酸、肉豆蘧酸的酯。還可能包含醇，例如，油酰醇、亞油基(Iinoleyl)醇或亞油烯基(Iinolenyl)醇、異硬脂基醇或辛基十二烷醇、乙醇或多元醇。
[0198]可以包含的另外碳?xì)浠衔锸切了狨ァ⒐锼狨?、蓖麻油酸酯、辛酸甘油?甘油三酸酯或ClO至C22脂肪酸甘油三酯。這些試劑的添加可以導(dǎo)致復(fù)乳液的形成。
[0199]在25 °C下為固體的氫化油，例如氫化蓖麻油、棕櫚油或椰子油，或氫化脂；單-、二 _、三-或蔗糖甘油酯；羊毛脂；以及在25°C下為固體的脂肪酸也可以包含在本發(fā)明的美容品制劑中。在可以包含的這些蠟中，是動(dòng)物蠟,例如蜂蠟；植物蠟,例如巴西棕櫚蠟、小燭樹臘、ouricurry蠟、日本蠟或來自軟木纖維或甘蔗的蠟；礦蠟，例如石蠟、褐煤蠟、微晶蠟或地臘以及合成臘。
[0200]可以包含色素并且可以是白色或彩色的、無機(jī)或有機(jī)的和/或珠光的。這些色素包括二氧化鈦、氧化鋅、二氧化錯(cuò)、黑色、黃色、紅色和棕色的氧化鐵、二氧化鋪、三氧化二鉻、鐵藍(lán)(ferric blue)、炭黑、鋇、鍶、鈣以及鋁色淀以及用氧化鈦或氧化鉍包衣的云母。
[0201]在美容品和/或皮膚學(xué)組合物中可以包含在護(hù)膚膏中常用的活性成分，例如維生素，例如，維生素A或C以及α-羥基酸，例如檸檬酸、乙醇酸、乳酸以及酒石酸。例如，US5, 602，183傳授維生素C或抗壞血酸促進(jìn)結(jié)締組織的生長(zhǎng)，特別是在皮膚中加強(qiáng)皮膚對(duì)抗外部攻擊了，例如煙霧以及UV輻射?？梢园谧o(hù)膚膏和美容品中的濕潤(rùn)劑是例如礦物油和脲。還可以添加的是抗氧化劑，例如天然發(fā)生的生育酚類以及多酚類，或丁羥甲苯以及羥基苯甲醚。可以采用防曬劑，例如甲氧基肉桂酸辛酯(Parsol MCX)、3-二苯甲酮(Uvinul M40)以及丁基甲氧基二苯甲?；谉?Parsoll789)來制備防曬霜(sun tanninglotion)?？梢杂糜谂渲泼廊萁M合物的藥物活性成分包括例如抗生素、殺真菌劑、以及消炎劑。
[0202]最終的美容產(chǎn)品可以處于一個(gè)游離的、傾倒的或粉餅(粉底、腮紅或眼影)、一種相對(duì)多脂的產(chǎn)品，例如唇膏、睫毛膏或一種用于身體或面部的油或洗劑的形式。
[0203]該油體制品還可以用作牙膏中的口可接受的載體，其可進(jìn)一步包括二氧化硅、表面活性劑、螫合劑、氟化物、增稠劑、增甜劑、調(diào)味劑，例如像薄荷油、酶以及殺生物劑。
[0204]可以配制的工業(yè)產(chǎn)品的一個(gè)實(shí)例是油漆，其中主要的樹脂，例如基于硅酮類型的化合物、丙烯酸化合物、聚酯、氟、環(huán)氧樹脂、聚氨酯的那些可以部分地或完全地由本發(fā)明的油體制品代替。如需要，可以將另外添加劑，例如色素、染料、玻璃鱗片、以及鋁鱗片、色素分散劑、增稠劑、均化劑、硬化催化劑、硬化劑例如dioisocyanates、硬化催化劑、凝膠抑制劑、紫外線吸收劑、自由基淬滅劑等配制在油漆組合物中。
[0205]該油體制品還可以用來配制潤(rùn)滑劑。例如，該油體制品可以用于部分地或完全地替代潤(rùn)滑油，例如動(dòng)物油、植物油、石油潤(rùn)滑油、合成潤(rùn)滑油或潤(rùn)滑脂如鋰基潤(rùn)滑脂、脲基潤(rùn)滑脂和鈣基潤(rùn)滑脂。在潤(rùn)滑劑制劑中采用的其他組合物包括抗氧化劑、洗滌分散劑、油性劑(oilness agent)、摩擦改良劑、黏性指數(shù)改進(jìn)劑、降凝劑、固體潤(rùn)滑劑材料、防銹劑以及消泡劑。
[0206]使用本發(fā)明的油體制品還可以制備多種蠟。這些包括沖洗蠟(rinse-wax)類型，例如在汽車和其他防護(hù)層上提供穩(wěn)定的疏水膜-修整(finish)的那些。在蠟的制備中使用的其他組合物包括如需要，可以按兼容量添加的表面活性劑、礦物油(例如混合的石蠟族的以及芳香族的/naphtenic油)、香水、殺生物劑、著色劑。 [0207]SM
[0208]實(shí)例1-材料和方法
[0209]材料
[0210]卡諾拉(歐洲油菜)種子、油、以及餅粉是由嘉吉澳大利亞公司贈(zèng)與的。該餅粉是通過機(jī)械壓榨的常用工業(yè)方法之后進(jìn)行溶劑提取，進(jìn)行卡諾拉油提取之后的殘余物。一旦到達(dá)，篩選這些種子以去除草桿及其他非種子材料并且在4°C儲(chǔ)存直到需要時(shí)。這些種子包含38.0%的油(由嘉吉公司(Cargill，Ltd)提供的信息)以及如通過LECO? FP-2000分析確定的，25.2%的蛋白。將卡諾拉油進(jìn)行精煉、脫色、和除臭分級(jí)，并且添加TBHQ (200ppm)抗氧化劑。從LYSI HF (冰島，雷基亞比克)獲得冬化處理的金槍魚油(HT303-4)。
[0211]卡諾拉油體的提取
[0212]根據(jù)曾(1993)描述的方法(除省略最終的己烷洗滌步驟之外)，從卡諾拉種子提取天然油體。簡(jiǎn)言之，將這些種子浸泡在磷酸鈉緩沖液(PH7.5)中過夜并且使用廚房攪拌機(jī)(Sunbeam Multiblender, 650W),與研磨介質(zhì)(每50mll0g干種子)均質(zhì)化，持續(xù)40秒。研磨介質(zhì)包含0.6M的蔗糖以及IOmM的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)。將勻漿通過三層粗棉布進(jìn)行過濾。將濾液放置在離心管中，等量的浮選介質(zhì)(包含0.4M而非0.6M蔗糖的研磨介質(zhì))在頂部成層，并且將這些管在吊桶式轉(zhuǎn)頭(Beckman J6-HC)中于10°C下在5，OOOg進(jìn)行離心60mino
[0213]將在頂部收集的這些油體重懸于兩倍于它們體積的清潔洗滌溶液中，該溶液包含
0.1%吐溫-20、0.2M蔗糖、以及5mM磷酸鈉緩沖液pH7.5。將重懸液置于離心管的底部并且1:1比率的IOmM磷酸鈉緩沖液PH7.5在頂部成層，并且將這些管離心。收集頂部的這些油體并且重懸于兩倍于它們體積的離子洗脫緩沖液中(此外包含2M NaCl的研磨介質(zhì))。將懸浮液置于離心管的底部，流動(dòng)介質(zhì)(包含2M NaCl以及0.25M而非0.6M蔗糖的研磨介質(zhì))在頂部成層(比率1:1)，并且將這些管離心。收集頂部的這些油體并且重懸于它們體積的9M脲中。將重懸液在室溫下用力搖晃IOmin,然后置于離心管的底部，IOmM磷酸鈉緩沖液pH7.5在頂部成層(比率1:1);并且將這些管離心。收集頂部的這些油體并且重懸于它們體積的研磨介質(zhì)中。將重懸液置于離心管的底部，浮選介質(zhì)在頂部成層(比率1:1)，并且將這些管離心。收集頂部的這些油體并且用研磨介質(zhì)進(jìn)行重懸以給出約100mg/ml的濃度。
[0214]從卡諾拉油體中分離油質(zhì)蛋白
[0215]從干燥至14% (w/w)濕含量的、純化的卡諾拉OB中提取油質(zhì)蛋白。將該油體制品重分散于去離子水與乙醇(60%乙醇)的溶液里并且攪拌lh，并且使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Bi)CHIRotavapor R-124)去除乙醇。然后將該乳液在吊桶式轉(zhuǎn)頭中于20°C (Beckman J6-HC)下在5，OOOg離心30min。去除包含水以及痕量乙醇的頂層并且將這些蛋白按100g/L的濃度重分散于去離子水中。將這個(gè)水性蛋白分散體在_18°C儲(chǔ)存，直到需要時(shí)。
[0216]蛋白表征
[0217]通過電泳根據(jù)它們的分子量對(duì)分離自卡諾拉油體(COB)的這些蛋白進(jìn)行表征。根據(jù)供應(yīng)商的推薦，使用NuPAGE?凝膠4%-12%BT 1.0凝膠(NuPAGE?英杰公司(invitrogen))進(jìn)行這些電泳。簡(jiǎn)言之,將蛋白樣品的濃度調(diào)節(jié)至lmg/ml并且將25 μ I置于埃彭道夫管(eppendorf tube)中。然后，分別添加10 μ I的NllPAGE? LDS樣品緩沖液(4X)以及5μ I的NuPAGE?還原劑(10χ)，并且在加熱至70°C持續(xù)10分鐘之前，將這些管在室溫下于14，OOOrpm離心3秒(微量離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge)5415C)。除了未對(duì)它們的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)之外，以同樣的方式制備標(biāo)記(Markl2?無污染標(biāo)準(zhǔn)品)。最終，將10 μ I量的標(biāo)記和樣品兩者添加到已經(jīng)放置在電泳槽(Novex Min1-Cell，英杰公司)中的凝
膠中，該電泳槽包含NuPAGE?電泳緩沖液以及抗氧化劑。將該槽連接到設(shè)置為200伏特以及 400 毫安的發(fā)電機(jī)(B10RAD Power Pac300)上 35min。
[0218]一旦完成電泳，將凝膠在去離子水中洗滌3次并且在緩慢攪拌，42rpm(RATEK平臺(tái)混合器模式(Platform Mixer model)0M6)下，置于具有 SimplyBlue? SafeStain (英杰公司)的塑料容器2h。之后，將該凝膠再用去離子水洗滌兩次并且置于去離子水中2小時(shí)以去除非蛋白結(jié)合染色，并且用G:B0X (SYNGENE)以及GeneSnap7.07軟件(SYNGENE)拍照。
[0219]從卡諾拉餅粉中提取油質(zhì)蛋白
[0220]根據(jù)戈登思維里(Ghodsvali)等人(2005)的程序的一個(gè)改良，從卡諾拉餅粉中提取油質(zhì)蛋白。簡(jiǎn)言之，將卡諾拉餅粉(1.0kg)浸泡在去離子水(10.0L)中并且用水性氫氧化鈉(5%, w/w)將pH調(diào)節(jié)至12.0,并且使用Ultraturax混合器混合10分鐘。靜置10分鐘后，將這些內(nèi)容物再混合10分鐘。將所得的漿料在吊桶式轉(zhuǎn)頭中于20°C (Beckman J6-HC)下在4，OOOg離心30min。當(dāng)?shù)鞍壮恋戆l(fā)生時(shí),將包含粗蛋白的上清液的pH調(diào)節(jié)至pH6.5 (油質(zhì)蛋白的等電點(diǎn))。當(dāng)恢復(fù)上清液和沉淀時(shí)，在4，OOOg下離心之前,攪拌再持續(xù)30min。使用Ultraturax將沉淀用pH6.5的水洗漆并且在4，OOOg下再次離心30min。經(jīng)洗漆的沉淀恢復(fù)為糊狀并且以濕形式在_18°C下儲(chǔ)存直到需要時(shí)。
[0221]人造油體的構(gòu)建
[0222]在初始實(shí)驗(yàn)中，在磷脂存在或不存在兩種情況下，使用從卡諾拉餅粉各自獲得的油質(zhì)蛋白提取物制備分別包含卡諾拉油與金槍魚油的人造油體分散體。首先，使用在800rpm運(yùn)行30分鐘的自動(dòng)攪拌器(來自海道爾夫公司(Heidolph)的RZR2051控制器)，通過將油以及包含這些蛋白的水混合來制備預(yù)-乳液。當(dāng)包含磷脂時(shí)，在乳化之前，將它們?nèi)芙庥谟椭小Ｋ玫倪@些成分的重量比類似于它們?cè)谔烊豢ㄖZ拉OB中的比率。因此，該預(yù)-乳液包含1.5%蛋白、1%磷脂(如果需要的話)以及10%油，從而達(dá)到0.5與2 μ m之間的顆粒尺寸并且油滴很好地被蛋白和磷脂包被。將該預(yù)-乳液在500巴下均質(zhì)化(RATEKPilot Lab均質(zhì)器)三次。
[0223]在隨后的實(shí)驗(yàn)中，使用表面活性劑和從卡諾拉餅粉各自獲得的油質(zhì)蛋白提取物制備分別包含卡諾拉油與金槍魚油的人造油體分散體。當(dāng)包含磷脂或其他表面活性劑時(shí)，在乳化之前，將它們與油混合。首先，通過滴加40%的水性氫氧化鈉同時(shí)經(jīng)受Ultraturax混合將該油質(zhì)蛋白提取物的pH調(diào)節(jié)至約8.0。在使用Silverson混合器在最小化氧化的氮?dú)鈱酉禄旌?min之前，將油(10g)、油質(zhì)蛋白提取物(1.5g)、表面活性劑(多種)以及去離子水(87.5g)置于玻璃燒杯中并且在水浴(60°C)中加熱。將該混合物在氮?dú)庀略?000巴處均質(zhì)化(EmulsiFlex C5)兩次。所用的這些成分的重量比類似于它們?cè)谔烊豢ㄖZ拉OB中的比率。因此，這些預(yù)-乳液包含1.5%的蛋白、1%的表面活性劑(如果需要的話)以及10%的油。
[0224]在如下乳液制備之前，將提取自卡諾拉餅粉的油質(zhì)蛋白“激發(fā)”。允許儲(chǔ)存的提取物融化并使用Ultraturax混合器40% (w/ff)混合，同時(shí)滴加氫氧化鈉直到pH達(dá)到8.0。
[0225]使用吐溫40乳化劑制備對(duì)照乳液
[0226]emulsions were prepared with canola and tuna oils 使用吐溫 40 (6%, w/w)作為乳化劑，用卡諾拉以及金槍魚油制備10% (w/w)o/w乳液。如上所述進(jìn)行乳化。
[0227]人誥油體的物理表征
[0228]分別在4°C、環(huán)境溫度(約20°C)、45°C以及60°C下，經(jīng)12天，對(duì)AOB的物理穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。使用與Hydro2000g模塊結(jié)合的Malvern小容量送樣單位(Malvern SmallVolume Sample Presentation Unit),用 MASTERSIZER2000 (馬爾文公司(Malvern))測(cè)量這些乳液的顆粒尺寸。(顆粒R1: 1，456/吸收:0,001/分散體R1: 1，330水)。用與ColorView IIIu攝像機(jī)連接的光學(xué)顯微鏡Olympus BH-2獲得光學(xué)顯微照片并且使用AnalySISgetIT5.0軟件對(duì)這些照片進(jìn)行處理。通過用十二烷基硫酸鈉(SDS)進(jìn)行處理來檢查這些顆粒的聚集。這是在室溫下使用磁力攪拌器將三體積的乳液與一體積的10% (w/w) SDS溶液混合lOmin，隨后重新分析來進(jìn)行的。
[0229]制備自油體的水包油乳液的氧化穩(wěn)定性
[0230]在加速氧化條件下的儲(chǔ)存過程中，從EPA/DHA的損耗連同產(chǎn)生的反式，反式-2，4-庚二烯醛的量來評(píng)估AOB分散體的氧化穩(wěn)定性。出于隨后的目的，將這些乳液的樣品(2g)放置在頂空小瓶(IOml)中并用硅酮-內(nèi)襯的鋁帽進(jìn)行密封，且在黑暗烘箱內(nèi)于40°C或60°C下加熱15天。每天取出樣品并且立即通過如下的固相微萃取以及氣相層析-質(zhì)譜法對(duì)2，4-庚二烯醛進(jìn)行分析。
[0231]使用DVB/CAR/PDMS纖維(50/30 μ m，Supelco公司，澳大利亞，悉尼)，通過頂空固相微萃取(SPME )確定在AOB乳液的加速氧化過程中產(chǎn)生的氧化的揮發(fā)性化合物。將該纖維插入到樣品頂空中并且將該小瓶在60°C孵育15min，并且然后取出并轉(zhuǎn)移到GC注射器(在無分流模式中運(yùn)行)并且保持7min以解吸附所萃取的揮發(fā)性化合物到GC柱中。使用CombiPAL自動(dòng)注射器(CTC Analytics公司，瑞士,Zwingen)進(jìn)行整個(gè)系列的事件。使用裝有VOC熔融石英毛細(xì)管柱(60mm, 0.32mm 1.d.,0.18mm膜厚度,安捷倫公司(Agilent),澳大利亞，維多利亞，墨爾本)的安捷倫型號(hào)6890GC和型號(hào)5973MSD (加利福尼亞州，帕洛阿爾托)進(jìn)行GC-MS。將GC烘箱程序設(shè)計(jì)為從40°C以22°C.min-1的速度增加到220°C，并且在每個(gè)溫度另保持14分鐘。以2.0mL min-1的恒流速度將氦用作載氣。注射試樣2min后，將該注射器初始在無分流模式下并且然后轉(zhuǎn)換到分流模式(I: 20)下運(yùn)行。注射器和MS檢測(cè)器兩者的溫度都保持在230°C。在掃描模式(29-350amu)下運(yùn)行MS。使用Chemstation軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并且通過標(biāo)準(zhǔn)品連同參照光譜文庫(Wiley275)對(duì)化合物進(jìn)行識(shí)別。通過使用校準(zhǔn)曲線量化這些乳液中的揮發(fā)性化合物，這些曲線是從它們相對(duì)應(yīng)的添加有不同水平的揮發(fā)性化合物2，4-庚二烯醛(反式，反式)標(biāo)準(zhǔn)品的新鮮乳液建立的。
[0232]使用毛細(xì)管氣相色譜法，通過脂肪酸分析來確定儲(chǔ)存過程中的ALA (卡諾拉)EPA和DHA (金槍魚)的損耗。出于這個(gè)目的，使用異丙醇/己烷從儲(chǔ)存的乳液中提取脂質(zhì)并且預(yù)先通過氫氧化鉀催化的酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化為甲酯。在BPX-70毛細(xì)管柱上分析這些酯并且通過火焰離子化檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)。
[0233]實(shí)例2-從卡諾拉餅粉中提取油質(zhì)蛋白
[0234]圖2示出針對(duì)該蛋白的電泳結(jié)果,該蛋白通過堿性提取(pH12)、隨后在pH6.5沉淀并且進(jìn)行水洗滌從卡諾拉餅粉中分離出。油質(zhì)蛋白的分子量已經(jīng)被報(bào)道為在18-20kDa的范圍內(nèi)，并且上述分離物包含在這個(gè)分子范圍內(nèi)的蛋白的顯著量，證實(shí)了油質(zhì)蛋白的存在。在范圍3.0-12.0中的不同pH值處的蛋白沉淀，以及隨后的電泳示出，在pH6.5獲得了最大油質(zhì)蛋白恢復(fù)。其他工作者的先前研究已經(jīng)集中于從預(yù)-提取的油體(在它們已經(jīng)通過乙醇或氯仿與甲醇的混合物的處理而脫穩(wěn)定化之后)中分離油質(zhì)蛋白。據(jù)我們所知，以前尚未作出通過水性提取從油料種子或餅粉中分離油質(zhì)蛋白的努力。這可能是因?yàn)橛唾|(zhì)蛋白被認(rèn)為是無論何種PH均是水不溶性的(貝松(Bei sson )等人，2001)。表面上的水不溶性可能是由于油質(zhì)蛋白在干燥時(shí)附聚的趨勢(shì)；并且一旦發(fā)生這種情況，則很難將油質(zhì)蛋白溶解或分散于水中。
[0235]初始實(shí)驗(yàn)之后，進(jìn)行從卡諾拉餅粉提取油質(zhì)蛋白的優(yōu)化。在PH12.0處獲得的最高油質(zhì)蛋白產(chǎn)量，隨著pH的降低獲得的恢復(fù)顯著下降(圖3)。如通過SDS-PAGE所示，pHl2.0還提供了最純凈的油質(zhì)蛋白提取物(圖4)。更低的pH值傾向于提取增加的量的約12和5kDa的兩種更低分子量組分。
[0236]實(shí)例3-人造油體的顆粒尺寸
[0237]為了消除顆粒尺寸對(duì)氧化速率的任何影響，將兩種乳液(吐溫40和油質(zhì)蛋白)的顆粒尺寸盡可能遠(yuǎn)地相配(圖5)。針對(duì)加速氧化研究還重要的是，在儲(chǔ)存過程中確保未發(fā)生分離并且顆粒尺寸保持相對(duì)恒定。用油質(zhì)蛋白制作的AOB連同用吐溫40乳液制作的AOB的粒徑在60°C下經(jīng)12天的儲(chǔ)存過程中保持未變。在升高的溫度下的儲(chǔ)存過程中，粒徑的均一性使得加速氧化研究能夠基于頂空分析法。
[0238]清楚地，pH12-可溶性提取物主要由細(xì)胞蛋白組成。沉淀的部分還將包含相對(duì)大量的非油質(zhì)蛋白蛋白。然而，有趣地是，當(dāng)使用pH12-可溶性提取物亦或pH6.5-沉淀的、在pH12重溶解的蛋白，制備AOB時(shí)，似乎存在油質(zhì)蛋白的天然選擇以形成油體表面(圖6)。這將具有以下優(yōu)點(diǎn)，在制備AOB之前不需要進(jìn)一步純化所沉淀的蛋白以增強(qiáng)油質(zhì)蛋白含量。
[0239]實(shí)例4-氧化穩(wěn)定性
[0240]將在PL不存在或存在兩種情況下，用重溶解的pH6.5沉淀的蛋白制備的卡諾拉和金槍魚油AOB的水性分散體的氧化穩(wěn)定性與用相對(duì)應(yīng)的油和吐溫40乳化劑制備的等效乳液進(jìn)行比較。出于這個(gè)目的，將這些乳液儲(chǔ)存在升高的溫度(60°C )下，并且通過三種不同的方法測(cè)量氧化水平，即，初級(jí)氧化產(chǎn)物(氫過氧化物)、次級(jí)氧化產(chǎn)物(反式，反式_2，4-庚二烯醛)、以及不飽和脂肪酸(對(duì)于卡諾拉是亞麻酸并且對(duì)于金槍魚油是DHA)的損耗。在測(cè)試的整個(gè)儲(chǔ)存期間，AOB乳液的氫過氧化物水平顯著低于相對(duì)應(yīng)的吐溫40乳液的氫過氧化物水平，示出AOB乳液的更大氧化穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)未示出)。
[0241]在用油質(zhì)蛋白提取物制作的金槍魚油乳液中的2，4-庚二烯醛的濃度顯著低于用吐溫40制作的濃度，示出油質(zhì)蛋白乳液的更大氧化穩(wěn)定性(圖7)。這示出卡諾拉油質(zhì)蛋白的抗氧化效應(yīng)不局限于卡諾拉油而是延伸到了魚油，例如金槍魚油。支持此結(jié)論的額外的證據(jù)由脂肪酸數(shù)據(jù)提供。用提取自卡諾拉餅粉的油質(zhì)蛋白制作的金槍魚油乳液的EPA和DHA含量損耗比吐溫40乳液的損耗更慢(圖8)，在60°C下5天之后，與針對(duì)吐溫40乳液低于70%相比，剩余大于90%的DHA。
[0242]圖9示出在油質(zhì)蛋白-和吐溫40穩(wěn)定化的乳液的加速氧化(40°C，暴露于空氣中)過程中，氫過氧化物(如由PV表示的)的發(fā)展速率。當(dāng)經(jīng)受加速氧化時(shí)，吐溫40-穩(wěn)定化的乳液的PV急劇上升，不具有明顯的誘導(dǎo)期，10天后達(dá)到120meq/kg油的一個(gè)值；超過這個(gè)點(diǎn)，PV逐漸下降，這可以被解釋為歸因于氫過氧化物的形成速率下降低于它們的降解為次級(jí)氧化產(chǎn)物(例如醛和酮)的速率。油質(zhì)蛋白-穩(wěn)定化的乳液的PV值甚至在30天加速后仍不接近吐溫40-穩(wěn)定化的乳液的最大PV (120meq/kg)，并且在這個(gè)點(diǎn)處終止該實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明油質(zhì)蛋白-穩(wěn)定化的乳液的優(yōu)越的氧化穩(wěn)定性高于吐溫40-穩(wěn)定化的乳液。
[0243]從金槍魚油以及油質(zhì)蛋白生產(chǎn)的人造油體(AOB)很容易地分散在水中以形成金槍魚水包油乳液。不考慮次級(jí)表面活性劑的使用(磷脂、甘油單酯或硬脂酰乳酸鈉，SSL)，當(dāng)在4°C儲(chǔ)存I周時(shí),這些乳液不分離。相比之下，生產(chǎn)自金槍魚油和Isolexx (卡諾拉蛋白分離物)的乳液在具有或 不具有磷脂的情況下是不穩(wěn)定的并且在制備的幾小時(shí)內(nèi)分離。在40°C，酪蛋白鈉乳液是最穩(wěn)定的，在I周之后未示出分離。在40°C下I周之后，包含磷脂或SSL的油質(zhì)蛋白-穩(wěn)定的乳液實(shí)際上未分離。
[0244]實(shí)例5-相對(duì)于其他蛋白成分，油質(zhì)蛋白的乳化作用和抗氧化效力
[0245]將廣泛用作乳化劑的酪蛋白鈉與卡諾拉中生產(chǎn)的且晉升為食品級(jí)乳化劑的卡諾拉蛋白分離物“Isolexx”進(jìn)行比較。針對(duì)物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性，對(duì)以下制劑進(jìn)行了試驗(yàn)。
[0246]1.金槍魚油+油質(zhì)蛋白+磷脂
[0247]2.金槍魚油+Isolexx (基于卡諾拉的蛋白乳化劑，由BioExx,加拿大銷售)
[0248]3.金槍魚油+Isolexx+憐脂
[0249]4.金槍魚油+酪蛋白鈉
[0250]使用加速氧化條件(在40°C下，暴露于空氣中儲(chǔ)存)對(duì)使用反式，反式，2，4-庚二烯醛作為金槍魚油ω-3脂肪酸的氧化降解標(biāo)記的氧化穩(wěn)定性進(jìn)行比較。圖10示出反式，反式，2，4-庚二烯醛在乳液儲(chǔ)存過程中的發(fā)展。除了油質(zhì)蛋白(加有磷脂)乳液之外，所有的乳液在18天之內(nèi)達(dá)到最大氧化。在9-10天之內(nèi)，酪蛋白鈉以及Isolexx乳液達(dá)到3.0ppm的庚二烯醛濃度，而直到24天之后油質(zhì)蛋白乳液仍未達(dá)到相同的氧化水平，證明與酪蛋白鈉以及Isolexx相比,油質(zhì)蛋白具有優(yōu)越的抗氧化特性。
[0251]實(shí)例6-次級(jí)表面活性劑對(duì)人造油體穩(wěn)定性的作用
[0252]基于前述工作，除了油質(zhì)蛋白外需要磷脂的存在以產(chǎn)生在儲(chǔ)存期間不發(fā)生聚結(jié)的乳液。通過制備其中磷脂被如下吐溫40、甘油單酯以及SSL替代的乳液，本發(fā)明的諸位發(fā)明人研究了磷脂對(duì)人造乳液穩(wěn)定性的重要性。在相同水平下使用磷脂、吐溫40、MAG以及SSL (按油的重量計(jì)，l%w/w)。[0253]a.金槍魚油+油質(zhì)蛋白以及磷脂
[0254]b.金槍魚油+油質(zhì)蛋白以及吐溫40
[0255]c.金槍魚油+油質(zhì)蛋白以及甘油單酯
[0256]d.金槍魚油+油質(zhì)蛋白以及硬脂酰乳酸鈉(SSL)
[0257]使用加速氧化條件(在40°C下，暴露于空氣中儲(chǔ)存)對(duì)使用反式，反式，2，4-庚二烯醛作為金槍魚油ω-3脂肪酸的氧化降解標(biāo)記的氧化穩(wěn)定性進(jìn)行比較。圖11示出反式，反式，2，4-庚二烯醛在乳液儲(chǔ)存過程中的發(fā)展。不同乳液之間的庚二烯醛的發(fā)展速率不存在顯著差異，示出用吐溫40、甘油單酯或SSL替代磷脂不會(huì)不利地影響基于油質(zhì)蛋白的人造油體的氧化穩(wěn)定性。
[0258]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，在不脫離如廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對(duì)這些具體實(shí)施方案中所示的
【發(fā)明內(nèi)容】
作出眾多的變化和/或改性。因此，將這些現(xiàn)有實(shí)施方案在所有方面都被視為是說明性的而不是限制性的。
[0259]本申請(qǐng)要求于2011年2月7日提交的AU2011900383的優(yōu)先權(quán)，將其全部?jī)?nèi)容通過引用結(jié)合在此。
[0260]將所有在此披露和/或提及的出版物通過引用以其全文結(jié)合在此。
[0261]已包括在本說明書中的對(duì)于多個(gè)文獻(xiàn)、行為、材料、裝置、物品等的任何討論僅出于為本發(fā)明提供一個(gè)背景的目的。它不應(yīng)被視為承認(rèn)任何或所有這些內(nèi)容構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域中的常見一般知識(shí)，因?yàn)樗诒旧暾?qǐng)的各項(xiàng)權(quán)利要求的 優(yōu)先權(quán)日:之前就存在。
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【權(quán)利要求】
1.一種人造油體，該人造油體包含油質(zhì)蛋白、表面活性劑、和油，該油包含具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸。
2.如權(quán)利要求1所述的油體，其中該表面活性劑是磷脂。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的油體，其中至少5%的該多不飽和脂肪酸具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵。
4.一種人造油體，該人造油體包含油質(zhì)蛋白、表面活性劑和包含脂肪酸的油，其中該表面活性劑的至少一些不是磷脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的油體，其中該油質(zhì)蛋白是一種油料種子油質(zhì)蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的油體，其中該油是海產(chǎn)品的油和/或魚油。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的油體，其中這些脂肪酸的至少50%處于甘油酯的形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的油體，其中人造油體干重的至少80%是油。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的油體，進(jìn)一步包含一種或多種其他分子。
10.如權(quán)利要求9所述的油體，它其中該其他分子是一種生物活性分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的油體，它具有約0.1至約100 μ m之間的尺·寸。
12.—種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的一種或多種人造油體，以及一種載體。
13.一種治療或預(yù)防將從脂肪酸獲益的病癥的方法，該方法包括向患有該病癥的受試者給予根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的一種或多種人造油體和/或權(quán)利要求12所述的組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的一種或多種人造油體和/或權(quán)利要求12所述的組合物用于制造治療或預(yù)防將從脂肪酸獲益的病癥的藥物的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的一種或多種人造油體和/或權(quán)利要求12所述的組合物作為用于治療或預(yù)防將從脂肪酸獲益的病癥的藥物的用途。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，或權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的用途，其中這些脂肪酸是具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸。
17.—種產(chǎn)品，包括根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的一種或多種人造油體和/或權(quán)利要求12所述的組合物。
18.如權(quán)利要求17所述的產(chǎn)品，該產(chǎn)品是一種食物或飼料產(chǎn)品、飲品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品。
19.如權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的產(chǎn)品，該產(chǎn)品是，或包含，一種水包油乳液。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的一種或多種人造油體，和/或權(quán)利要求12所述的組合物用于制備一種產(chǎn)品的用途。
21.一種制備飼料、食物或飲品的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的一種或多種人造油體，和/或權(quán)利要求12所述的組合物與一種或多種可食用成分進(jìn)行混合。
22.—種生產(chǎn)人造油體的方法，該方法包括i)獲得油質(zhì)蛋白、表面活性劑以及包含具有四個(gè)或更多個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸的油，并且 ?)混合該油質(zhì)蛋白、表面活性劑和油來生產(chǎn)這些人造油體。
23.一種生產(chǎn)人造油體的方法，該方法包括 i)獲得油質(zhì)蛋白、表面活性劑以及包含脂肪酸的油，其中該表面活性劑的至少一些不是磷脂，并且 ?)混合該油質(zhì)蛋白、表面活性劑和油來生產(chǎn)這些人造油體。
24.如權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包括， iii)選擇人造油體。
25.根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟i)包括 a)獲得包含油質(zhì)蛋白的植物的提取物，并且 b)從該提取物中至少部分地純化蛋白，其中該蛋白包含油質(zhì)蛋白。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中步驟b)包括 1)調(diào)節(jié)該提取物的pH到至少約11.5的pH， 2)分離I)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇該液相， 3)降低該液相的pH以沉淀出這些蛋白， 4)分離3)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇該固相，并且 5)將該固相分散在一種載體中。
27.—種部分地純化來自植物提取物的油質(zhì)蛋白的方法，該方法包括 1)調(diào)節(jié)該提取物的pH到至少約11.5的pH， 2)分離I)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇該液相， 3)降低該液相的pH以沉淀出這些蛋白， 4)分離3)以產(chǎn)生固相和液相并且選擇該固相，并且 5)將該固相分散在一種載體中。
28.如權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的方法，其中步驟3)包括將該液相的pH降低至低于約7。
29.根據(jù)權(quán)利要求22至28中任一項(xiàng)所述的方法，該方法不使用有機(jī)溶劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求25至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中該植物是一種油料種子植物。
31.根據(jù)權(quán)利要求25至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中該提取物是油提取之后產(chǎn)生的餅粉。
【文檔編號(hào)】A61K8/06GK103547252SQ201280012108
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月7日
【發(fā)明者】拉詹德拉納薩·查克拉帕尼·維杰遜黛拉, 志平·沈, 托馬斯·博伊特奧, 新青·徐, 列夫·倫丁 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織