治療癌的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供治療卵巢癌的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及施用具有α-葉酸受體(FRα)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和4-1BB(CD137)共刺激結(jié)構(gòu)域的基因修飾的T細胞以治療卵巢癌。
【專利說明】治療癌的組合物和方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年I月18日提交的美國臨時申請?zhí)?1/433，731的優(yōu)先權(quán)，其通過參考以其整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003]卵巢癌是大部分婦產(chǎn)科癌死亡的原因。2004年，在美國，診斷出25，580例新的病例，并且16，090名婦女死于卵巢癌。
[0004]該疾病在工業(yè)化國家中更加常見，日本除外。在美國，女性具有1.4%至
2.5%(40-60個女人中I個)的生命機會發(fā)展卵巢癌。年長女人處在最高的風險下。
[0005]盡管腹膜內(nèi)化療已經(jīng)推薦為卵巢癌一線治療的護理標準，但該推薦的基礎(chǔ)已經(jīng)受到了挑戰(zhàn)。放射療法對于晚期階段是無效的，因為當關(guān)鍵器官在放射區(qū)域中時，不能安全遞送高劑量。外科療法也是無效的。
[0006]盡管初始成功的多科性治療一細胞減數(shù)外科和隨后組合化療，但大部分晚期疾病患者最終復(fù)發(fā)并且不能治愈。由于該原因，急切需要治療該惡性腫瘤的新治療方法。
[0007]基于卵巢腫瘤是相對免疫原性的，誘導(dǎo)內(nèi)源性T細胞應(yīng)答的事實，卵巢癌尤其看起來適合過繼性轉(zhuǎn)移方法。
[0008]所以，需要改善的治療形態(tài)以提供抗腫瘤免疫性，并且從而治療卵巢癌和其他癌。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中分離的核酸序列包括α-葉酸受體(FRa)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4_1BB(CD137)共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
[0010]在一種實施方式中，核酸序列進一步包括⑶3 ζ結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
[0011]在一種實施方式中，CAR包括SEQ ID Ν0:13或SEQ ID Ν0:22的氨基酸序列。
[0012]在一種實施方式中，編碼CAR的分離的核酸序列包括SEQ ID Ν0:1或SEQ ID NO:20的核酸序列。
[0013]在一種實施方式中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其FR a -結(jié)合片段。優(yōu)選地，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域是Fab或scFV。
[0014]在一種實施方式中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原，其中腫瘤抗原是FR α。在一種實施方式中，腫瘤抗原與上皮惡性腫瘤相關(guān)。在另一實施方式中，腫瘤抗原是與實體瘤相關(guān)。
[0015]在一種實施方式中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:15或SEQ ID N0:23的氨基酸序列。
[0016]在一種實施方式中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:21的核酸序列編碼。
[0017]在一種實施方式中，4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。[0018]在一種實施方式中，4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO:6的核酸序列編碼。
[0019]在一種實施方式中，⑶3 ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
[0020]在一種實施方式中，⑶3 ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO:7的核酸序列編碼。
[0021]在一種實施方式中，分離的核酸序列進一步包括跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
[0022]本發(fā)明也提供分離的CAR，其包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域和4-1ΒΒ共刺激結(jié)構(gòu)域。
[0023]本發(fā)明也提供包括編碼CAR的分離的核酸序列的基因修飾的T細胞，其中分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
[0024]本發(fā)明也提供包括編碼CAR的分離的核酸序列的載體，其中分離的核酸序列包括FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
[0025]本發(fā)明也提供用于在對象中提供抗腫瘤免疫性的方法。在一種實施方式中，包括向?qū)ο笫┯糜行Я康陌ň幋aCAR的分離的核酸序列的基因修飾的T細胞，其中分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而在對象中提供抗腫瘤免疫性。在一種實施方式中，分離的核酸序列進一步包括CD3(信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
[0026]在一種實施方式中，共刺激結(jié)構(gòu)域的存在提高T細胞存活。在另一實施方式中，共刺激結(jié)構(gòu)域的存在增加對象中抗腫瘤免疫性的效能。
[0027]在一種實施方式中，對象是哺乳動物。優(yōu)選地，對象是人。
[0028]本發(fā)明也提供 用于在對象中刺激對細胞群或組織的T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。在一種實施方式中，方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康陌ň幋aCAR的分離的核酸序列的基因修飾的T細胞，其中分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而刺激對象中T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
[0029]本發(fā)明也提供治療對象中卵巢癌的方法。在一種實施方式中，方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康陌ň幋aCAR的分離的核酸序列的基因修飾的T細胞，其中分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而治療對象中的卵巢癌。
[0030]本發(fā)明也提供治療對象中癌癥的方法。在一種實施方式中，方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康陌ň幋aCAR的分離的核酸序列的基因修飾的T細胞，其中分離的核酸序列包括FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而治療對象中的癌癥。
[0031]本發(fā)明也提供在診斷患有卵巢癌的對象中產(chǎn)生持續(xù)的基因工程化T細胞群的方法。在一種實施方式中，方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康陌ň幋aCAR的分離的核酸序列的基因修飾的T細胞，其中分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，其中持續(xù)的基因工程化T細胞群在施用后在對象中持續(xù)至少一個月。在一種實施方式中，持續(xù)的基因工程化T細胞群在施用后持續(xù)至少三個月。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]當與附圖結(jié)合閱讀時，將更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的以下詳細描述。為了說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示了目前優(yōu)選的實施方式。然而，應(yīng)當理解本發(fā)明不限于附圖顯示的實施方式的精確布置和手段。
[0033]圖1是顯示a FR CAR的構(gòu)建和慢病毒基因轉(zhuǎn)移至人T細胞的圖像。[0034]圖2是表明CAR+T細胞優(yōu)先分泌Thl細胞因子的圖像。
[0035]圖3是顯示直接的和特異性的腫瘤識別和殺死α FR+人卵巢癌的圖像。
[0036]圖4是顯示在Winn試驗中并入4-1ΒΒ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可增強抗腫瘤活性的圖像。
[0037]圖5是顯示使用CAR基因療法治療大的、確定的人卵巢癌的圖像:4-1ΒΒ共刺激介導(dǎo)增強的T細胞存活。
[0038]圖6是顯示表示嵌合抗α葉酸受體免疫受體a -FR4-1BB:⑶3 ζ轉(zhuǎn)基因和載體構(gòu)建體的附圖的圖像。將構(gòu)建體克隆入PELNS骨架載體(底部)，其包含包裝信號(Ψ)、中心聚嘌呤區(qū)/中心終止序列(cppt/CTS)和延伸因子1-α啟動子(ef-la)。包裝期間轉(zhuǎn)移載體離開(driven off) 5’ LTR,并且當反轉(zhuǎn)錄時3’ SIN LTR復(fù)制至5’端。
[0039]圖7是顯示PELNS — M0vl9-4_1BB-CD3 ζ的質(zhì)粒圖的圖像。
[0040]圖8，包括圖8Α和8Β，是顯示抗a FR慢病毒載體工程化的T細胞產(chǎn)生和溶細胞活性的一系列圖像。圖8A顯示a FR-結(jié)合嵌合受體的示意性圖示。也構(gòu)建具有截短的TCRC結(jié)構(gòu)域的結(jié)合-對照嵌合受體和具有抗CD19scFv的特異性對照受體。圖SB是顯示在人初級⑶4T細胞上檢測a FR-CAR蛋白質(zhì)表達的圖像。通過流式細胞術(shù)確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0041]圖9是顯示通過流式細胞術(shù)確定AE17、AE17.FR、SK0V3上的FR的細胞表面表達(頂部)的圖像。用小鼠抗人抗體皿18(淺灰色柱狀圖)或同種型對照(深灰色柱狀圖)溫育細胞，隨后用綴合FITC的山羊抗小鼠Ig染色。使用4h51Cr釋放試驗測定初級人T細胞上嵌合受體靶向表達a FR的細胞系的溶細胞活性(中間)。FRa+腫瘤靶可直接誘導(dǎo)T細胞細胞因子分泌。結(jié)果表示為來自至少3個分開實驗的I個的三重孔的平均數(shù)和SD (底部)。
[0042]圖10是顯示體外有效的aFR-特異性殺死AE17.FR腫瘤細胞的圖像。AE17和AE17.FR細胞以指示比用GFP溫育的CAR+T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)約20h，其后細胞在熒光顯微法下拍照。每組T細胞的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是?40%-50%。
[0043]圖11是顯示體內(nèi)aFR嵌合受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞的抗腫瘤活性的圖像。NOD/scid/IL2r Y + (NOG)小鼠皮下注入混合有表達CAR的T細胞(IX IO6個細胞/小鼠)的SK0V3LUC (I X IO6個細胞/小鼠)。就在注入之前進行細胞的混合，以使T細胞和標靶的相互作用最小化。在接種之后每10天對動物照相，以評估腫瘤生長，并且使用“Living Image”軟件量化來自表達熒光素酶的細胞的光子發(fā)射。
[0044]圖12，包括圖12A至12D，是一系列圖像，其顯示α FR重新靶向的T細胞體內(nèi)根除大的預(yù)先建立的腫瘤:共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的效果和施用的途徑。圖12Α和12C表明監(jiān)測皮下注入3 X IO6個SK0V3細胞的小鼠的腫瘤生長直到腫瘤體積達到200?300mm3。在第40和45天，用腫瘤內(nèi)注入20 X IO6個T細胞(?40% - 50%轉(zhuǎn)基因陽性)治療負載腫瘤的小鼠。圖12B和12D表明經(jīng)IT、IP和IV途徑用表達BBz嵌合受體的T淋巴細胞治療負載SK0V3的NOG小鼠，并且評估對腫瘤生長的影響。
[0045]圖13是顯示4-1BB信號體內(nèi)增強人T淋巴細胞的持久性的圖像。在第74天，從眼框后出血獲得外周血，并且對其為人⑶45、⑶4和⑶8T細胞的存在染色。在對人⑶45+群設(shè)門之后，使用TruCount管(BD Biosciences)量化CD4+和CD8+子集。獨立于注入的途徑，在BBz組中的持久性最大。
[0046]圖14，包括圖14A至14C，是 顯示α FR CAR BBz根除SK0V3腫瘤是抗原-特異性的一系列圖像。圖14A和14B顯示在第40和45天用表達BBz CAR(抗α FR或⑶19)和GFP的淋巴細胞治療的負載SKOV3的小鼠。圖14C顯示，二次T細胞注入之后3周獲得來自負載SKOV3的NOG小鼠的外周血，并且通過FACS Trucount試驗對⑶4和⑶8Τ細胞的存在量化。
[0047]圖15，包括圖15Α至15C，是顯示α FR CAR BBz特異性T細胞抑制腹膜癌病的SK0V3鼠模型中腫瘤生長和腹水形成的一系列圖像。圖15A是顯示⑶19CAR T細胞治療之后，NOG小鼠中腹膜內(nèi)注入SK0V3腫瘤導(dǎo)致腹部膨脹和結(jié)節(jié)性腹膜腫瘤的圖像。當與用FRCAR BBz T細胞治療的小鼠(左)比較時，小鼠發(fā)展腹水，如通過膨脹的腹部表明的(中間)，腹膜的尸檢觀察顯示腹腔(右)內(nèi)的結(jié)節(jié)性腫瘤塊(箭頭)。圖15B和15C顯示腹膜內(nèi)/靜脈注入aFR CAR BBz T細胞延遲腫瘤進展和腹水形成，并且提高存活率。用⑶19CAR或a FR CART細胞治療的NOG小鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線。
[0048]圖16是顯示a FR CAR BBz-特異性T細胞的過繼性轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)卵巢癌肺轉(zhuǎn)移退行的圖像。盡管腫瘤響應(yīng)a FR-特異性T細胞的注入而退行，但⑶19-特異性T細胞治療的小鼠中腫瘤逐漸生長。
[0049]圖17是顯示從健康供體分離的⑶4T細胞在20的MOI下用表達GFP的HIV源的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)并且培養(yǎng)29天的圖像。X軸表示倍數(shù)擴大(圓形)或GFP表達百分數(shù)(三角形)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞是開符號和模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞是閉符號。
[0050]圖18，包括圖18A至圖18E，描繪體外FRa CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的人T細胞的產(chǎn)生和特異性免疫識別。圖18A顯示基于M0vl9的CAR構(gòu)建體的示意性圖示,所述構(gòu)建體包含單獨⑶3 ζ胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Μ0ν19- ζ )或組合⑶137共刺激模塊(Μ0ν19-ΒΒ ζ )。顯示具有截短的⑶3 ζ結(jié)構(gòu)域(MOv19- Δ ζ )和抗CD19-BB ζ CAR的FR a -特異性CAR。VL，可變L鏈；L,連接體；VH,可變H鏈；TM，跨膜區(qū)域。圖18B描繪在用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)之后在人⑶3-設(shè)門細胞上M0vl9CAR表達(實體黑線)與平行的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞(填充的灰色柱狀圖)的比較。顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)百分數(shù)。圖18C描繪通過流式細胞術(shù)確定的各種人卵巢癌細胞系進行的表面FR α表達(實體黑線)；同種型抗體對照(填充的灰色柱狀圖)。圖18D描繪用FR α +癌細胞系溫育過夜之后，Μ0ν19-ζ和Μ0ν19-ΒΒζ CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞而不是Μ0ν19_ Λ ζ抗CD19-BB ζ T細胞的抗原-特異性IFN- 分泌。顯示來自三重培養(yǎng)物的平均IFN-Y濃度土 SEM (pg/mL)。圖18E描繪在18-小時生物發(fā)光試驗中，以指示的E/T比，通過FRa CAR+⑶8+T細胞抗原-特異性殺死FRa +腫瘤細胞。未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞(UNT)或gfp-轉(zhuǎn)導(dǎo)的人⑶8+T細胞用作對照。
[0051]圖19，包括圖19A至圖19D，顯示人Μ0ν19-ΒΒζ CAR T細胞體內(nèi)根除大的預(yù)先建立的腫瘤，并且顯示CD137共刺激信號`傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的效果和施用的途徑。在第O和5天，用腫瘤內(nèi)注入8X IO6個CAR+T細胞治療負載建立的皮下腫瘤的NSG小`鼠，并且每2周成像。圖19A描繪腫瘤生長，如通過測徑器測量[V=l/2(長度X寬度2)]評估的。圖19B顯示最后T細胞劑量之后2周和4周與Μ0ν19- ζ和對照治療組相比，在MCM`9-BB ζ CAR治療的小鼠中，SK0V3fLuc+生物發(fā)光信號減少。經(jīng)腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑用8 X IO6個MOv 19-BB ζT細胞治療負載SK0V3fLuc的NSG小鼠。圖19C描繪腫瘤生長，如通過測徑器測量評估的。圖19D顯示在第73天(最后T細胞劑量之后4周)，⑶137信號傳導(dǎo)體內(nèi)提高在外周血中人⑶4+和⑶8+T細胞的存活率。使用TruCount方法量化來自血液的⑶4和⑶8T細胞。顯示每個治療組中所有評估的小鼠的平均細胞濃度(細胞/μ L) 土SD。[0052]圖20，包括圖20A至圖20D，顯示CAR T細胞的腫瘤根除是抗原-特異性的。在第O和5天，用表達Μ0ν19-ΒΒζ、抗CD19-BB ζ或gfp的8X IO6個T細胞(40%轉(zhuǎn)導(dǎo)效率)經(jīng)腫瘤內(nèi)注入治療具有皮下SK0V3fLuc+腫瘤的NSG小鼠。圖20A描繪通過測徑器每2至3天測量腫瘤體積。在最后T細胞注入之后，收集外周血3周。圖20B描繪血液的人⑶4+和⑶8+T細胞/ μ I的絕對數(shù)。顯示平均細胞計數(shù)土SD。圖20C描繪通過使用山羊抗小鼠IgGF (ab' ) 2，在由流式細胞術(shù)測量的來自治療小鼠外周血的人⑶3+T細胞上FR α -和⑶19-特異性CAR的表達。顯示每組的平均CAR+表達頻率土SD。圖20D描繪絕對CAR+T細胞計數(shù)，其計算為每μ L血液人⑶3+Τ細胞的數(shù)量乘以CAR+百分數(shù)。測定平均計數(shù)土SD。
[0053]圖21是表明對腫瘤的體內(nèi)CAR T細胞定位是抗原-特異性的一系列圖像。在第O和5天，用靜脈內(nèi)注入表達Μ0ν19-ΒΒζ (頂部)、抗CD19-BB ζ (中間)或gfp (底部)的8X IO6個T細胞治療具有皮下SK0V3fLuc+腫瘤的NSG小鼠。從安樂死的小鼠收集生長大約另外40天的SK0V3腫瘤，并且對其染色用于人CD3表示(褐色)。代表性切片以X 100放大顯示。
[0054]圖22，包括圖22A至圖22D，顯示Μον19-ΒΒζ T細胞在腹膜癌病的SK0V3鼠模型中抑制腫瘤生長和腹水形成。圖22Α描繪接收腹膜內(nèi)注入的5 X IO6個SK0V3fLuc+腫瘤細胞的NSG小鼠，并且將其隨機分成4組，然后開始在腫瘤接種后第30和35天經(jīng)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注入表達Μ0ν19-ΒΒζ或抗CD19-BB4的9 X IO6個T細胞的療法。圖22Β描繪用Μ0ν19_ΒΒ ζT細胞(左)經(jīng)靜脈內(nèi)(頂部)或腹膜內(nèi)(底部)注入治療的代表性NSG小鼠。如通過膨脹的腹部表明的(中間)，用抗CD19-BB4 T細胞(右)治療的小鼠發(fā)展腹水。腹膜的尸檢觀察顯示結(jié)節(jié)性腫瘤塊(箭頭；極右)。圖22C描繪用Μ0ν19-ΒΒ ζ或抗⑶19-ΒΒ ζ T細胞經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注入治療的負載腫瘤的NSG小鼠的卡普蘭-邁耶腫瘤-相關(guān)的存活曲線。圖22D描繪負載腫瘤的NSG小鼠的卡普蘭-邁耶總存活率。
[0055]圖23，包括圖23Α和圖23Β，顯示FR α -特異性T細胞的過繼性轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)卵巢癌肺轉(zhuǎn)移的退行。具有3天建立的SK0V3fLuc+腫瘤的NSG小鼠在肺中、在第3天和第8天接收表達Μ0ν19-ΒΒζ或抗⑶19-Β Βζ的6X IO6個T細胞的尾靜脈注入。圖23Α描繪腫瘤，如通過BLI監(jiān)測的。圖23Β描繪量化的來自fLuc+腫瘤細胞的平均值土SD生物發(fā)光信號光子發(fā)身寸。
[0056]圖24顯示用Μ0ν19-ΒΒ ζ或Μ0ν19_ζ轉(zhuǎn)導(dǎo)的初級人T細胞在用FR α +癌細胞系刺激之后優(yōu)先產(chǎn)生Thl細胞因子。轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞(I X IO5個CAR+T細胞)單獨培養(yǎng)(沒有其他)或用等數(shù)量的人FRa+SK0V3或抗原陰性ΡΕ0-1卵巢癌細胞刺激過夜。收獲來自3個獨立培養(yǎng)物的無細胞上清液，并且在溫育?20小時后合并，并且使用細胞計量珠陣列技術(shù)(cytometric bead array technology)量化指不的人Thl/Th2細胞因子。值表不指不的細胞因子的IFN-Y濃度(pg/ml)。
[0057]圖25，包括圖25A至圖25C，顯示工程化表達FR α -特異性CAR的初級人T細胞體外裂解FRa+細胞系。圖25Α描繪轉(zhuǎn)導(dǎo)不表達人FR α的天然小鼠惡性間皮瘤細胞系A(chǔ)E17，以表達高表面水平的人FRa (AE17.FRa)，如流式細胞術(shù)顯示的。轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達Μ0ν19_ ζ、MOv 19-ΒΒ ζ、MOv19-Δ ζ或抗CD19-BB ζ CAR,或綠色熒光蛋白(gfp)的初級人T細胞與Cr51標記的天然AE17或AE17.FRa細胞系以指定的效應(yīng)子與標靶比共同培養(yǎng)4小時。圖25B描繪特異性靶細胞溶胞作用的百分數(shù)，計算為(實驗的釋放-自發(fā)的釋放)+ (最大的釋放-自發(fā)的釋放)X100。結(jié)果表示為三重孔的平均數(shù)，誤差條表示標準偏差。轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達ΜΟν19- ζ、MOv 19-ΒΒ ζ、MOv19- Δ ζ或抗CD19-BB ζ CAR的人T細胞在各種效應(yīng)子與標靶比下與表達gfp的ΑΕ17或AE17.FR α細胞共同培養(yǎng)24小時。圖25C描繪轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在熒光顯微方法下照相。通過gfp標記的粘附腫瘤細胞的成像減少指示靶細胞溶胞作用。
[0058]圖26，包括圖26A至圖26D，顯示腫瘤退行與體內(nèi)工程化的人T細胞的穩(wěn)定持久性相關(guān)，并且取決于提供CD137共刺激信號傳導(dǎo)。圖26A描繪腫瘤負荷，如通過T細胞注入之后4周每個治療組的平均生物發(fā)光信號測量的。圖26B描繪體內(nèi)T淋巴細胞的持久性，其通過Trucount方法在轉(zhuǎn)移經(jīng)靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑遞送的表達Μ0ν9_ΒΒ ζ的T細胞或腫瘤內(nèi)施用表達Μ0ν19- ζ的T細胞或?qū)φ蛰d體(Μ0ν19-Λ ζ或gfp ;對照)之后4周評估。圖26C顯示T細胞療法之后4周，工程化的人T細胞的穩(wěn)定持久性(X軸)與生物發(fā)光信號負相關(guān)(y軸；r=-0.78)。單獨在培養(yǎng)基中(未顯示)或與SK0V3 —起培養(yǎng)3天之后，檢測通過FR-特異性CAR CD8T細胞的Bc1-Xl表達。與MOv19- ζ CAR+T細胞(6.7%)相比，在用FRa +腫瘤細胞刺激之后，Bcl-XL表達優(yōu)先在Μ0ν19-ΒΒ ζ CAR T細胞群中增加(15.4%)。單獨在培養(yǎng)基中培養(yǎng)不誘導(dǎo)在CAR T細胞中的Bcl-XL表達。圖26D描繪3個獨立的共同培養(yǎng)之一的代表性FACS分析。
[0059]圖27是描繪T細胞療法之后切除的腫瘤樣本的肉眼評估的一系列圖像。從NSG小鼠收獲腫瘤，所述NSG小鼠腫瘤內(nèi)(1.t.)注入鹽水或負載gfp、Μ0ν19-Λ ζ、Μ0ν19_ ζ、MOv 19-ΒΒ ζ CAR的T細胞；或靜脈內(nèi)α.ν.)或腹膜內(nèi)α.ρ.)注入Μ0ν19-ΒΒζ T細胞?！皼]有腫瘤”表示其中沒有檢測到腫瘤的小鼠。在第一次T細胞注入后大概40天安樂死時從小鼠收獲腫瘤。
[0060]圖28是描繪本文其他地方詳述的臨床試驗的研究方案計劃的圖像。
[0061]圖29是顯示被工程化以表達包含人源化的C4scFv的全人抗FRCAR的初級人T細胞體外識別并且應(yīng)答表達FR的癌細胞系。scFv有效地在被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達第一(-Z)或第二(-28z)CAR(上部；對于gfp共同表達使用雙順反子載體)的T細胞表面上表達。當與表達FR的卵巢癌或乳腺癌細胞共同培養(yǎng)過夜時，CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的而不是未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(UNT)T細胞分泌IFN-g。很少表達至不表達FR的細胞系(A2780和C30)未被識別(下部)。
[0062]圖30是總結(jié)SEQ ID NO同一性的圖像。
[0063]發(fā)明詳述
[0064]本發(fā)明涉及治療癌癥的組合物和方法，所述癌癥包括但不限于上皮癌。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達嵌合抗原受體(CAR)的T細胞過繼細胞轉(zhuǎn)移的策略。CAR是聯(lián)合對期望抗原(例如，腫瘤抗原)的基于抗體的特異性和T細胞受體-活化細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生顯示特異性抗腫瘤細胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0065]本發(fā)明一般地涉及被基因修飾以穩(wěn)定表達期望的CAR的T細胞的應(yīng)用。表達CAR的T細胞在本文中被稱為CAR T細胞或CAR修飾T細胞。優(yōu)選地，該細胞可被基因修飾，以在它表面上穩(wěn)定表達抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，給予MHC非依賴性的新型抗原特異性。在一些例子中，T細胞被基因修飾，以穩(wěn)定表達CAR，所述CAR將特異性抗體的抗原識別結(jié)構(gòu)域與CD3- ζ鏈或FcyRI蛋白的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域聯(lián)合成為單一嵌合蛋白。
[0066]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括具有抗原識別結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方式中，可選擇跨膜結(jié)構(gòu)域，或可由氨基酸置換修飾，以避免這樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，以最小化與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用。優(yōu)選地，跨膜結(jié)構(gòu)域為CDSa鉸合結(jié)構(gòu)域。
[0067]相對于胞漿結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明的CAR可被設(shè)計以由其本身包括⑶28和/或4-lBB(CD137)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或與在本發(fā)明的CAR的內(nèi)容下有用的任何其他期望的胞漿結(jié)構(gòu)域(一個或多個)聯(lián)合。在一個實施方式中，CAR的胞楽；結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計以進一步包括⑶3-ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。例如，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可包括但不限于⑶3-ζ、4-1ΒΒ和CD28信號傳導(dǎo)模塊和其組合。因此，本發(fā)明提供了 CAR T細胞和它們用于過繼療法的方法。
[0068]在一種實施方式中，本發(fā)明的CAR T細胞可通過將包括靶向α-葉酸受體(aFR或FRa)的期望CAR的慢病毒載體引入細胞產(chǎn)生。例如，慢病毒載體包括進入細胞的包含抗FRa、⑶8 α鉸合和跨膜結(jié)構(gòu)域，和人4-1BB和⑶3 ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR。本發(fā)明CAR的抗FRa結(jié)構(gòu)域可為結(jié)合FRa的任何結(jié)構(gòu)域，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段和人源化的抗體。因此，如本文使用，抗FRa (或抗aFR)表示靶向FRa的任何組合物。本發(fā)明的CAR T細胞能夠體內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生可導(dǎo)致持續(xù)腫瘤控制的長期持久性。
[0069]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及利用淋巴細胞注入施用表達CAR的基因修飾T細胞，以治療具有癌癥或處于具有癌癥風險下的患者。優(yōu)選地，自體淋巴細胞注入用于治療。自體PBMC從需要治療的患者收集，和T細胞利用本文描述和本領(lǐng)域已知的方法進行活化和擴展，并且隨后注入返回患者。
[0070]本發(fā)明包括利用表達包括⑶3-ζ和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域兩者的抗-FR a CAR的T細胞(也被稱為FR a -特異性CAR T細胞)。本發(fā)明的FR a -特異性CAR T細胞可承受穩(wěn)固的體內(nèi)T細胞擴展，并可建立FR a -特異性記憶細胞，其在血液和骨髓中以高水平持續(xù)延長的時間量。在一些例子中，本發(fā)明的注入患者的FRa-特異性CAR T細胞可消除患有上皮卵巢癌的患者體內(nèi)的癌細胞。然而，本發(fā)明不限于FRa-特異性CART細胞。更確切地，本發(fā)明包括與選自CD137(4-1BB)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD3 ζ信號結(jié)構(gòu)域和其任何組合的一種或 多種細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的任何抗原結(jié)合部分。
[0071]定義
[0072]除非另有定義，本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管可在測試本發(fā)明的實踐中使用類似于或等于本文描述的那些的任何方法和材料，但優(yōu)選的材料和方法在本文中進行描述。在描述和要求保護本發(fā)明中，將使用以下術(shù)語。
[0073]也應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅是為了描述【具體實施方式】的目的，并不意欲是限制性的。
[0074]本文使用冠詞“一個(a) ”和“一個(an) ”，指的是該冠詞語法對象的一個或多于一個(即，指的是至少一個)。以例子說明，“一個元件”表示一個元件或多于一個的元件。
[0075]如本文使用的“大約”，當指的是可測量的值諸如量、時間期間等時，表示包括從給定值±20%或土 10%的變化，更優(yōu)選±5%，甚至更優(yōu)選土 1%，和還要更優(yōu)選±0.1%的變化，只要這種變化適于實施公開的方法。
[0076]如本文使用，術(shù)語“FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域”可指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何FR α特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一種實例中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括單鏈可變片段(scFv)，其包括特異性結(jié)合FRa的抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')?？笷Ra抗體、抗體片段和它們的變體在本領(lǐng)域是熟知的，并且在下列美國專利公開中充分描述:U.S20100055034 ；U.S.20090324594 ；U.S.20090274697 ；U.S.20080260812 ；U.S.20060239910 ；U.S.20050232919 ；U.S.20040235108，其所有通過引用以它們的整體并入本文。在一種實施方式中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗FRa抗體的同系物、變體、異構(gòu)體或功能片段。每個可能性表示本發(fā)明單獨的實施方式。
[0077]如本文使用，術(shù)語“4-1BB (⑶137)共刺激結(jié)構(gòu)域”可指4-1BB的任何序列，其包括，例如，4-1BB的刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域已知4-1BB的刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和它們的變體，并且充分描述在美國專利公開20050113564中，其通過參考以其整體并入本文。本領(lǐng)域已知4-1BB的核酸和氨基酸序列和它們的變體，并且充分描述在下列美國專利公開中:U.S.20060063923 ；U.S.20060029595 ；U.S.20030082157 ；U.S.20020168719 ；U.S.20040091476 ；U.S.20050113564 ;和 U.S.20060002904，其所有通過引用以它們的整體并入本文。在一種實施方式中，4-1BB (⑶137)共刺激結(jié)構(gòu)域是4-1BB (⑶137)的同系物、變體、異構(gòu)體或功能片段。每個可能性表示本發(fā)明分開的實施方式。
[0078]“活化”，如本文所用的，指的是已經(jīng)被充分刺激以誘導(dǎo)可檢測的細胞增殖的T細胞的狀態(tài)。活化也可與誘導(dǎo)的細胞因子產(chǎn)生和可檢測的效應(yīng)子功能相關(guān)。術(shù)語“活化的T細胞”等指的是經(jīng)歷細胞分裂的T細胞。
[0079]術(shù)語“抗體”，如本 文所用的，指的是與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子?？贵w可為源于自然源或源于重組源的完整的免疫球蛋白，并可為完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)部分?？贵w通常為免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存在，包括例如，多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)2,以及單鏈抗體和人源化抗體(Harlow 等，1999，In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY ；Harlow 等，1989，In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor, New York ;Houston 等，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 ；Bird等，1988，Science242:423-426)。
[0080]術(shù)語“抗體片段”指的是完整抗體的一部分，并指的是完整抗體的抗原決定可變區(qū)。抗體片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，由抗體片段形成的線性抗體、scFv抗體和多特異性抗體。
[0081]“抗體重鏈”，如本文所用的，指的是以它們自然發(fā)生構(gòu)象存在于所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。
[0082]“抗體輕鏈”，如本文所用的，指的是以它們自然發(fā)生構(gòu)象存在于所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較小的鏈，K和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。
[0083]如本文所用的術(shù)語“合成抗體”，指利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，諸如例如，由如本文所述的噬菌體表達的抗體。該術(shù)語也應(yīng)當被解釋為指已經(jīng)由DNA分子的合成產(chǎn)生的抗體，所述DNA分子編碼抗體并且該DNA分子表達抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已經(jīng)利用本領(lǐng)域可用和廣泛公知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得。
[0084]如本文所用的術(shù)語“抗原”或“Ag”被定義為激發(fā)免疫應(yīng)答的分子，該免疫應(yīng)答可涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細胞的活化，或兩者。技術(shù)人員將理解任何大分子——實際上包括所有的蛋白質(zhì)或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因組DNA。技術(shù)人員將理解任何DNA—其包括編碼引起免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此編碼如本文使用的術(shù)語“抗原”。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解抗原不必單獨地由基因的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發(fā)明包括但不限于，多于一個的基因的部分核苷酸序列的用途，并且這些核苷酸序列以不同的組合進行布置，以引起期望的免疫應(yīng)答。此夕卜，技術(shù)人員將理解抗原根本不必由“基因”進行編碼。容易顯而易見的是抗原可被產(chǎn)生、合成或可源自生物學(xué)樣本。這種生物學(xué)樣本可包括但不限于組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生物學(xué)流體。
[0085]如本文所用的術(shù)語“抗腫瘤效應(yīng)”，指的是生物學(xué)效應(yīng)，其可由腫瘤體積的減少、腫瘤細胞數(shù)的減少、轉(zhuǎn)移數(shù)的減少、預(yù)期壽命的增加或與癌性病癥相關(guān)的各種生理癥狀的改善清楚表示?！翱鼓[瘤效應(yīng)”也可由本發(fā)明的肽、多核苷酸、細胞和抗體在預(yù)防腫瘤在第一位置發(fā)生的能力清楚表示。
[0086]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“自體抗原”指由免疫系統(tǒng)錯誤識別為外源(foreign)的任何自身抗原。自體抗原包括但不限于細胞蛋白、磷蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質(zhì)、核酸、糖蛋白，包括細胞表面受體。
[0087]如本文所用的術(shù)語“自身免疫疾病”被定義為由自身免疫應(yīng)答產(chǎn)生的紊亂。自體免疫疾病是對自身抗原的不適當和過度應(yīng)答的結(jié)果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑禿、強直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克羅恩氏疾病、糖尿病(I型)、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯氏疾病、吉蘭-巴雷綜合征、橋本氏疾病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、尋常型天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、斯耶格倫氏綜合征、脊椎關(guān)節(jié)病變、甲狀腺炎、血管炎、白癜風、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎等等。
[0088]如本文所用的，術(shù)語“自體”指關(guān)于源自相同個體的任何物質(zhì)，它隨后被再次引入該個體。
[0089]“同種異基因的(allogeneic) ”指的是源自相同物種的不同動物的移植物。
[0090]“異種的(xenogeneic) ”指的是源自不同物種的動物的移植物。
[0091]如本文所用的術(shù)語“癌癥”被定義為以畸變細胞的快速和失控生長為特征的疾病。癌癥細胞可局部蔓延或通過血流和淋巴系統(tǒng)蔓延至身體的其他部分。各種癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0092]如本文使用的術(shù)語“共刺激配體”包括特異性結(jié)合T細胞上的關(guān)聯(lián)(cognate)共刺激分子的抗原呈遞細胞(例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等等)上的分子，由此除了通過例如將TCR/CD3復(fù)合物與用肽負載的MHC分子結(jié)合提供的初級信號之外，還提供介導(dǎo)T細胞應(yīng)答的信號，所述T細胞應(yīng)答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配體可包括但不限于 CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-Ll、PD_L2、4_1BBL、0X40L、可誘導(dǎo)的共刺激配體(ICOS-L)、細胞間粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結(jié)合Toll配體受體的激動劑或抗體和與B7-H3特異性結(jié)合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在于T細胞上的共刺激分子特異性結(jié)合的抗體，諸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3 和與 CD83 特異性結(jié)合的配體。[0093]“共刺激分子”指的是與共刺激配體特異性結(jié)合的T細胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合伴侶，由此介導(dǎo)T細胞的共刺激應(yīng)答，諸如但不限于增殖，共刺激分子包括但不限于MHC I類分子、BTLA和Toll配體受體。
[0094]如本文所用的，“共刺激信號”指的是與初級信號結(jié)合，諸如TCR/CD3連接作用，導(dǎo)致T細胞增殖和/或關(guān)鍵分子的上調(diào)或下調(diào)的信號。
[0095]“疾病”是動物的一種健康狀態(tài)，其中動物不能保持穩(wěn)態(tài)，和其中如果不改善該疾病，則動物的健康繼續(xù)惡化。與之相比，動物中的“紊亂”是一種健康狀態(tài)，其中動物能夠保持穩(wěn)態(tài)，但其中動物的健康狀態(tài)與它沒有處于該紊亂相比不太有利。保持不治療，紊亂不必定引起動物健康狀態(tài)的進一步降低。
[0096]如本文所用的“有效量”，指提供治療性或預(yù)防性益處的量。
[0097]“編碼”指的是多核苷酸諸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特異性序列用作模板合成在生物學(xué)過程中的其他多聚體和大分子的固有性質(zhì)，所述多聚體和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一個和由其產(chǎn)生的生物學(xué)性質(zhì)。因此，如果相應(yīng)于那個基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細胞或其他生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，則基因編碼蛋白質(zhì)。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的編碼鏈，和用作轉(zhuǎn)錄基因或cDNA的模板的非·編碼鏈兩者，都可被稱為編碼那個基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物。
[0098]如本文所用的“內(nèi)源的”指的是來自有機體、細胞、組織或系統(tǒng)的或在有機體、細胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的任何物質(zhì)。
[0099]如本文所用的，術(shù)語“外源的”指的是任何從有機體、細胞、組織或系統(tǒng)引入的或在有機體、細胞、組織或系統(tǒng)外產(chǎn)生的物質(zhì)。
[0100]如本文所用的術(shù)語“表達”被定義為由它的啟動子驅(qū)動的特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0101]“表達載體”指的是包括重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連接至待表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包括足夠的用于表達的順式作用元件；用于表達的其他元件可由宿主細胞供應(yīng)或在體外表達系統(tǒng)中供應(yīng)。表達載體包括所有本領(lǐng)域已知的那些，諸如并入重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(例如，裸露或包含在脂質(zhì)體中)和病毒(例如，慢病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
[0102]“同源的”指的是兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。當兩個比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時，例如，如果兩個DNA分子的每一個中的位置被腺嘌呤占據(jù)，則所述分子在那個位置上是同源的。兩個序列之間的同源性百分比為由兩個序列共有的匹配或同源的位置數(shù)除以比較的位置數(shù)XlOO的函數(shù)。例如,如果兩個序列中10個位置中的6個是匹配或同源的，則兩個序列是60%同源的。以例子說明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50%的同源性。通常，當比對兩個序列以給出最大同源性時，進行比較。
[0103]如本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白”或“Ig”被定義為起到抗體作用的一類蛋白質(zhì)。由B細胞表達的抗體有時被稱為BCR(B細胞受體)或抗原受體。包括在該類蛋白質(zhì)中的五個成員為IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA為存在于身體分泌物諸如唾液、淚液、母乳、胃腸分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初級抗體。IgG是最常見的循環(huán)抗體。IgM是在多數(shù)對象的初級免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它在凝集反應(yīng)、補體結(jié)合和其他抗體應(yīng)答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御細菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗體功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受體。IgE是在暴露于過敏原后，通過引起從肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介體，介導(dǎo)速發(fā)過敏性的免疫球蛋白。
[0104]如本文所用的，“指導(dǎo)材料”包括出版物、記錄、圖表或任何其他可用于傳達本發(fā)明組合物和方法的有用性的表達媒介。本發(fā)明的試劑盒的指導(dǎo)材料可例如被附加在包含本發(fā)明的核酸、肽和/或組合物的容器上，或與包含核酸、肽和/或組合物的容器一起運送。可選地，指導(dǎo)材料可與容器分開地運送，目的是指導(dǎo)材料和化合物由接受者配合使用。
[0105]“分離的”指從自然狀態(tài)改變或移出。例如，天然存在于活動物中的核酸或肽不是“分離的”，但部分或完全與它的自然狀態(tài)的共存物質(zhì)分離的同一核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白可以以基本上純化的形式存在，或例如，可存在于非自然環(huán)境，諸如宿主細胞。
[0106]在本發(fā)明的內(nèi)容中，對于通常發(fā)生的核酸堿基使用以下縮寫?！癆”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鳥苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
[0107]除非另有規(guī)定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此簡并版本并編碼相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短語編碼蛋白質(zhì)或RNA的核苷酸序列也可包括內(nèi)含子，其程度為編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列可在某一版本中包含內(nèi)含子(一個或多個)。
[0108]如本文所用的“慢病毒”指的是反轉(zhuǎn)錄病毒科的屬。在反轉(zhuǎn)錄病毒中慢病毒是唯一能夠感染非分裂細胞的；它們可傳遞顯著量的遺傳信息進入宿主細胞的DNA，以便它們是基因傳遞載體的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是所有慢病毒的例子。源自慢病毒的載體提供了完成顯著水平基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移的工具。
[0109]如本文所用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”指與缺少治療或化合物的對象中的應(yīng)答水平相比，和/或與以其他方式相同但未治療的對象中的應(yīng)答水平相比，介導(dǎo)對象中應(yīng)答水平的可檢測的增加或減少。該術(shù)語包括擾亂和/或影響天然信號或應(yīng)答，由此介導(dǎo)對象優(yōu)選人的有益的治療性應(yīng)答。
[0110]除非另有規(guī)定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此簡并版本并編碼相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。
[0111]術(shù)語“可操作地連接”指的是調(diào)節(jié)序列和異源核酸序列之間的功能連接，其產(chǎn)生后者的表達。例如，當?shù)谝缓怂嵝蛄形挥谂c第二核酸序列的功能關(guān)系中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達，則啟動子被可操作地連接至編碼序列。通常地，可操作地連接的DNA序列是鄰近的，其中在相同的閱讀框中必須連接兩個蛋白編碼區(qū)。
[0112]術(shù)語“過表達的”腫瘤抗原或腫瘤抗原的“過表達”意欲指示相對于來自組織或器官的正常細胞的表達水平，來自疾病區(qū)如患者的特定組織或器官內(nèi)的實體瘤的細胞中腫瘤抗原表達的異常水平。具有以腫瘤抗原過表達為特征的實體瘤或血液學(xué)惡性腫瘤的患者可由本領(lǐng)域已知的標準測定確定。
[0113]免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括例如皮下(s.c)、靜脈內(nèi)(1.v.)、肌肉內(nèi)(1.m.)或胸骨內(nèi)注射，或注入技術(shù)。
[0114]術(shù)語“患者”、“對象”、“個體”等等在本文中可交換使用，并指的是服從本文描述方法的任何動物或其細胞，不論是體外或原位。在一些非限制性實施方式中，患者、對象或個體為人。
[0115]如本文所用的術(shù)語“多核苷酸”被定義為核苷酸鏈。此外，核酸為核苷酸的多聚體。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸為可被水解成單體“核苷酸”的多核苷酸的一般常識。單體核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域可用的任何手段獲得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重組手段，即，從重組文庫或細胞基因組，利用普通克隆技術(shù)和PCR?等等克隆核酸序列，和通過合成手段。
[0116]如本文所用的，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可交換使用，并指的是由肽鍵共價連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個氨基酸，和對可包括蛋白質(zhì)或肽的序列的最大數(shù)目的氨基酸沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質(zhì)，所述肽或蛋白質(zhì)包括通過肽鍵相互連接的兩個或多個氨基酸。如本文所用的，該術(shù)語指的是短鏈，其在本領(lǐng)域中也例如通常被稱為肽、寡肽和寡聚體；和較長鏈，其在本領(lǐng)域中通常被稱為蛋白質(zhì)，其具有很多類型?！岸嚯摹卑ɡ缟飳W(xué)活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
[0117]如本文所用的術(shù)語“啟動子”被定義為開始多核苷酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄需要的，由細胞的合成機器識別，或引導(dǎo)合成機器的DNA序列。
[0118]如本文所用的，術(shù)語“啟動子/調(diào)節(jié)序列”指可操作地連接至啟動子/調(diào)節(jié)序列的基因產(chǎn)物表達所需的核酸序列。在一些例子中，該序列可為核心啟動子序列，并且在其他例子中，該序列也可包括基因產(chǎn)物表達所需的增強子序列和其他調(diào)節(jié)元件。啟動子/調(diào)節(jié)序列可例如為以組織特異方式表達基因產(chǎn)物的序列。
[0119]“組成型”啟動子為核苷酸序列，其當與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，使得在細胞的多數(shù)或所有生理學(xué)條件下在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。
[0120]“誘導(dǎo)型”啟動子為核苷酸序列，其當與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，使得在基本上僅當相應(yīng)于啟動子的誘導(dǎo)物存在于細胞中時，在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。
[0121]“組織-特異性”啟動子為核苷酸序列，其當與編碼基因或由基因規(guī)定的多核苷酸可操作地連接時，使得基本上只要細胞為相應(yīng)于啟動子的組織類型的細胞，則在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。
[0122]如本文所用的關(guān)于抗體的術(shù)語“特異性結(jié)合”指識別特異性抗原但基本上不識別或結(jié)合樣本中的其他分子的抗體。例如，特異性結(jié)合來自一個物種的抗原的抗體也可結(jié)合來自一個或多個物種的抗原。但是，這種跨種反應(yīng)性本身不改變抗體的類別成為特異性的。在另一個實例中，特異性結(jié)合抗原的抗體也可結(jié)合抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反應(yīng)性本身不改變抗體的類別成為特異性的。在一些例子中，術(shù)語“特異性的結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”可關(guān)于抗體、蛋白質(zhì)或肽與第二化學(xué)種類的相互作用使用，用于指該相互作用依賴化學(xué)種類上特定結(jié)構(gòu)(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體通常識別和結(jié)合特異性蛋白結(jié)構(gòu)而不是一般地識別和結(jié)合蛋白質(zhì)。如果抗體對表位“A”是特異性的，則在包含標記的“A”和抗體的反應(yīng)中存在包含表位A(或游離的、未標記的A)的分子，將降低結(jié)合至抗體的標記的A的量。
[0123]通過術(shù)語“刺激”指通過結(jié)合刺激分子(例如，TCR/⑶3復(fù)合物)與它的關(guān)聯(lián)配體，由此介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件——諸如但不限于經(jīng)TCR/CD3復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)——誘導(dǎo)的初級應(yīng)答。刺激可介導(dǎo)一些分子的改變的表達，諸如TGF-β的下調(diào)和/或細胞骨架結(jié)構(gòu)的再組織
[0124]“刺激分子”，作為本文使用的術(shù)語，指與存在于抗原呈遞細胞上的關(guān)聯(lián)刺激配體特異性結(jié)合的T細胞上的分子。
[0125]如本文所用的“刺激配體”指如此配體，其當存在于抗原呈遞細胞(例如，aAPC、樹突細胞、B-細胞等等)上時，可與T細胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合伴侶(在本文中被稱為“刺激分子”)特異性結(jié)合，由此介導(dǎo)T細胞的初級應(yīng)答，其包括但不限于，活化、免疫應(yīng)答的開始、增殖等等。刺激配體在本領(lǐng)域中是公知的，并包括，特別是利用肽、抗-CD3抗體、超激動劑抗-CD28抗體和超激動劑抗-CD2抗體負載的MHC I類分子。
[0126]術(shù)語“對象”意欲包括在其內(nèi)可引起免疫應(yīng)答的活有機體(例如，哺乳動物)。對象的例子包括人、狗、貓、小鼠、大鼠和其轉(zhuǎn)基因物種。
[0127]如本文所用的“基本上純化的”細胞為基本上不含其他細胞類型的細胞?；旧霞兓募毎仓傅氖且呀?jīng)與在其天然發(fā)生狀態(tài)中與其正常相關(guān)聯(lián)的其他細胞類型分離的細胞。在一些例子中，基本上純化的細胞群指的是均質(zhì)細胞群。在其他例子中，該術(shù)語簡單地指的是已經(jīng)與在其天然狀 態(tài)中與其正常相關(guān)聯(lián)的細胞分離的細胞。在一些實施方式中，體外培養(yǎng)細胞。在其他實施方式中，不在體外培養(yǎng)細胞細胞。
[0128]如本文所用的術(shù)語“治療性的”表示治療和/或預(yù)防。治療性效應(yīng)通過疾病狀態(tài)的抑制、緩和或根除獲得。
[0129]術(shù)語“治療有效量”指的是將引起由研究者、獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)醫(yī)生或其他臨床醫(yī)生正在尋找的組織、系統(tǒng)或?qū)ο蟮纳飳W(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的對象化合物的量。術(shù)語“治療有效量”包括以下的化合物的量:當被施用時，其足以預(yù)防治療的紊亂或疾病的跡象或癥狀中的一個或多個的發(fā)展，或以一定程度減輕治療的紊亂或疾病的跡象或癥狀中的一個或多個。治療有效量將根據(jù)化合物、疾病和其嚴重性、和待治療的對象的年齡、重量等而變化。
[0130]“治療”疾病，作為本文使用的術(shù)語，指降低對象經(jīng)歷的疾病或紊亂的至少一種跡象或癥狀的頻率或嚴重性。
[0131]如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指的是如此過程，通過該過程外源的核酸被轉(zhuǎn)移或引入宿主細胞?！稗D(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細胞是已經(jīng)由外源核酸轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。該細胞包括原代對象細胞和它的子代。
[0132]如本文所用的短語“轉(zhuǎn)錄控制下”或“可操作地連接”指啟動子處于與多核苷酸有關(guān)的正確的位置和朝向，以控制通過RNA聚合酶進行的轉(zhuǎn)錄的開始和多核苷酸的表達。
[0133]“載體”為物質(zhì)組合物，其包括分離的核酸，并且其可用于傳遞分離的核酸至細胞內(nèi)部。很多載體在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于線性多核苷酸、與離子或兩性分子化合物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《尽Ｔ撔g(shù)語也應(yīng)被解釋為包括便于將核酸轉(zhuǎn)移入細胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物，諸如例如聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等等。病毒載體的例子包括但不限于，腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等等。[0134]范圍:在該公開中，本發(fā)明的多個方面可以以范圍形式中示出。應(yīng)當理解范圍形式中的描述僅是為了方便和簡潔，并不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明范圍不可動搖的限制。因此，范圍的描述應(yīng)被考慮為具有具體公開的所有可能的子范圍以及處于那個范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例如，范圍諸如從I至6的描述應(yīng)被考慮為具有具體公開的子范圍諸如從I至3、從I至4、從I至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及那個范圍內(nèi)的單個數(shù)字，例如，1、2、2.7、3、4、5、
5.3和6。不管范圍的寬度如何，這一點是適用的。
[0135]說里
[0136]本發(fā)明提供了治療癌癥等疾病的組合物和方法。該癌癥可為血液學(xué)惡性腫瘤、實體瘤、原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤。優(yōu)選地，該癌癥為上皮癌，或換言之為癌。更優(yōu)選地，該癌癥為上皮卵巢癌。利用本發(fā)明的組合物和方法可治療的其他疾病包括病毒、細菌和寄生蟲感染以及自身免疫疾病。
[0137]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了工程化以表達CAR的細胞(例如，T細胞)，其中CAR T細胞顯示抗腫瘤性質(zhì)。本發(fā)明的CAR可被工程化以包括胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域具有融合至T細胞抗原受體復(fù)合物ζ鏈(例如，CD3()的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的CAR當在T細胞中表達時,能夠基于抗原結(jié)合特異性改變(redirect)抗原識別。示例性抗原為FRa，因為該抗原在惡性上皮細胞上表達。然而，本發(fā)明不限于靶向FRa。相反地，本發(fā)明包括任何抗原結(jié)合部分，當其結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原時，影響腫瘤細胞，以便腫瘤細胞不生長、被促使死亡或以其他方式被影響，以便患者的腫瘤負荷(tumorburden)縮小或消除?？乖Y(jié)合部分優(yōu)選與來自共刺激分子和ζ鏈中的一個或多個的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選地，抗原結(jié)合部分與選自CD137 (4-1ΒΒ)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD3 ζ信號結(jié)構(gòu)域和其任 何組合的一個或多個細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。
[0138]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括⑶137 (4-1ΒΒ)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。這是因為本發(fā)明部分地基于CAR-介導(dǎo)的T-細胞應(yīng)答可利用共刺激結(jié)構(gòu)域的添加而進一步提高的發(fā)現(xiàn)。例如，與沒有被工程化以表達⑶137 (4-1ΒΒ)的其他方式相同的CAR T細胞相比，包括CD137(4-1BB)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域顯著增加了抗腫瘤活性和CAR T細胞的體內(nèi)持久性。
[0139]鉬合物
[0140]本發(fā)明提供了包括細胞外結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(CAR)。胞外結(jié)構(gòu)域包括靶-特異性結(jié)合元件，其另外被稱為抗原結(jié)合部分。細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或另外的胞漿結(jié)構(gòu)域包括共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子為淋巴細胞對抗原的有效應(yīng)答所需要的細胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。
[0141]在CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，或在CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可并入間隔結(jié)構(gòu)域。如本文所用的，術(shù)語“間隔結(jié)構(gòu)域”通常指起到將跨膜結(jié)構(gòu)域連接至多肽鏈的胞外結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域作用的任何寡肽或多肽。間隔結(jié)構(gòu)域可包括上至300個氨基酸，優(yōu)選地10至100個氨基酸和最優(yōu)選地25至50個氨基酸。
[0142]抗原結(jié)合部分
[0143]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括另外被稱為抗原結(jié)合部分的靶-特異性結(jié)合元件。部分的選擇取決于限定靶細胞表面的配體的類型和數(shù)目。例如，可選擇抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以識別用作與具體疾病狀態(tài)相關(guān)的靶細胞上的細胞表面標記的配體。因此，可用作本發(fā)明的CAR的抗原部分結(jié)構(gòu)域的配體的細胞表面標記的例子包括與病毒、細菌和寄生蟲感染，自身免疫疾病和癌細胞相關(guān)的那些標記。
[0144]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR可經(jīng)由工程化特異性結(jié)合至腫瘤細胞上抗原的期望抗原結(jié)合部分而被工程化，以便靶向興趣腫瘤抗原。在本發(fā)明的內(nèi)容中，“腫瘤抗原”或“過度增生性紊亂(hyperproliferative disorder)抗原”或“與過度增生性紊亂相關(guān)的抗原”指的是對于特定過度增生性紊亂諸如癌癥共同的抗原。本文討論的抗原僅以實例的方式被包括。該列舉不意欲是窮盡的，并且更多的實例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是容易顯而易見的。
[0145]腫瘤抗原是由引起免疫應(yīng)答特別是T-細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的腫瘤細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗原結(jié)合部分的選擇將取決于待治療癌癥的具體類型。腫瘤抗原在本領(lǐng)域中是公知的，并包括例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的抗原、癌胚抗原(CEA)、β_人絨毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反應(yīng)的AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-UMN-CA IX、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、RU1、RU2 (AS)、腸羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ES0-l、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌腫瘤抗原-1 (PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白細胞彈性蛋白酶、印hrinB2、CD22、胰島素生長因子(IGF)-1、IGF-11、IGF-1 受體和間皮素。
[0146]在一個實施方式中，腫瘤抗原包括與惡性腫瘤相關(guān)的一個或多個抗原癌癥表位。惡性腫瘤表達可用作免疫攻擊的靶抗原的許多蛋白。這些分子包括但不限于組織-特異性抗原諸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特異性抗原(PSA)。其他靶分子屬于轉(zhuǎn)化相關(guān)分子諸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的組。而另一組的靶抗原為胎性癌抗原諸如癌胚抗原(CEA)。在B-細胞淋巴瘤中，腫瘤-特異性個體基因型免疫球蛋白構(gòu)成對個體腫瘤唯一的真正的腫瘤-特異性免疫球蛋白抗原。B-細胞分化抗原諸如CD19、CD20和CD37是B-細胞淋巴瘤中靶抗原的其他候選物。這些抗原中的一些(CEA、HER-2、⑶19、⑶20、個體基因型)已經(jīng)有限成功地用作利用單克隆抗體的被動免疫療法的標靶。
[0147]本發(fā)明中提及的該類型腫瘤抗原也可為腫瘤-特異性抗原(TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。TSA為對腫瘤細胞唯一的，并不發(fā)生在身體的其他細胞上。TAA相關(guān)的抗原不是對腫瘤細胞唯一的，并且相反，其在不能誘導(dǎo)對抗原的免疫耐受狀態(tài)的病癥下，也在正常細胞上進行表達。腫瘤上的抗原表達可在使免疫系統(tǒng)能夠響應(yīng)抗原的病癥下發(fā)生。TAA可為在胚胎發(fā)育期間，當免疫系統(tǒng)不成熟并且不能響應(yīng)時，在正常細胞上表達的抗原，或它們可為在正常細胞上以極低的水平正常存在的抗原，但其在腫瘤細胞上以高得多的水平進行表達。
[0148]TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下:分化抗原諸如MART-1/MelanA(MART-1)、gpl00 (Pmell7)、酪氨酸酶、TRP_1、TRP_2和腫瘤-特異性多譜系抗原諸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE, GAGE-1、GAGE-2、pl5 ;過表達的胚胎抗原諸如CEA ;過表達的致癌基因和突變的腫瘤-抑制基因諸如p53、Ras, HER-2/neu ；由染色體易位產(chǎn)生的獨特的腫瘤抗原諸如 BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-1GK、MYL-RAR ;和病毒抗原，諸如 Epstein Barr 病毒抗原EBVA和人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO, pl85erbB2、pl80erbB_3、c_met、nm_23Hl、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K_ras、β -聯(lián)蛋白、CDK4、Mum-1、pl5、pl6、43_9F、5T4、791Tgp72、α -胎蛋白、β -HCG, BCA225、BTAA, CA125、CA15_3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、C0-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、M0V18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2 結(jié)合蛋白 \ 親環(huán)蛋白 C 相關(guān)蛋白、TAAL6、TAG72、TLP 和 TPS。
[0149]在優(yōu)選的實施方式中，CAR的抗原結(jié)合部部分靶向如此抗原，所述抗原包括但不限于 FRa、CD24、CD44、CD133、CD166、印CAM、CA-125、HE4、0val、雌激素受體、孕酮受體、HER-2/neu、uPA、PA1-1 等等。
[0150]取決于待靶向的期望抗原，本發(fā)明的CAR可被工程化以包括對期望抗原靶特異性的適當?shù)目乖Y(jié)合部分。例如，如果FRa是待靶向的期望抗原，則FRa的抗體可用作抗原結(jié)合部分，并入本發(fā)明的CAR。
[0151]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR的抗原結(jié)合部部分靶向FRa。優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的抗原結(jié)合部部分為抗-FRa scFV，其中抗-FRa scFV的核酸序列包括SEQ ID:3中提出的序列。在一個實施方式中，抗-FRa scFV包括編碼SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的核酸序列。在另一個實施方式中，本發(fā)明的CAR的抗-FR a scFV部分包括SEQ ID NO: 15中提出的氨基酸序列。
[0152]在一種實施方式中，本發(fā)明的CAR中抗原結(jié)合部部分是人源化的抗FRa SCFV，其中人源化的抗FRa scFV的核酸序列包括SEQ ID:21中提出的序列。在一種實施方式中，人源化的抗FRa scFV包括編碼SEQ ID N0:23的氨基酸序列的核酸序列。在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR的人源化的抗FR a scFV部分包括SEQ ID NO: 23中提出的氨基酸序列。
·[0153]跨膜結(jié)構(gòu)域
[0154]對于跨膜結(jié)構(gòu)域，CAR可被設(shè)計以包括融合至CAR的胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些例子中，可選擇跨膜結(jié)構(gòu)域，或通過氨基酸置換進行修飾，以避免將這樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，從而最小化與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用。
[0155]跨膜結(jié)構(gòu)域可源于天然來源或合成來源。在天然來源中，該結(jié)構(gòu)域可源于任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白。具體用于本發(fā)明的跨膜區(qū)可源于T-細胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、⑶137、⑶154(即至少包括上述中的跨膜區(qū)(一個或多個))?？蛇x地，跨膜結(jié)構(gòu)域可為合成的，在該情況下，它將包括占主導(dǎo)的疏水殘基諸如亮氨酸和纈氨酸。優(yōu)選地，將在合成跨膜結(jié)構(gòu)域的每一端上發(fā)現(xiàn)苯基丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯(lián)體。任選地，短的寡肽或多肽連接體，優(yōu)選長度在2和10個氨基酸之間，可在CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域之間形成連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。
[0156]優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的跨膜結(jié)構(gòu)域為CD8跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中,CD8跨膜結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:5的核酸序列。在一個實施方式中，⑶8跨膜結(jié)構(gòu)域包括編碼SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的核酸序列。在另一個實施方式中，⑶8跨膜結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO: 17的氨基酸序列。
[0157]在一些例子中，本發(fā)明的CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域包括CD8鉸合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，⑶8鉸合結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:4的核酸序列。在一個實施方式中，⑶8鉸合結(jié)構(gòu)域包括編碼SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的核酸序列。在另一個實施方式中，⑶8鉸合結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。
[0158]胞漿結(jié)構(gòu)域
[0159]本發(fā)明的CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域或另外的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是造成其中已放置CAR的免疫細胞的至少一種正常效應(yīng)子功能的活化的原因。術(shù)語“效應(yīng)子功能”指的是細胞的專有功能。例如，T細胞的效應(yīng)子功能可為包括細胞因子分泌的細胞溶解活性或輔助活性。因此術(shù)語“細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指的是轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號并指導(dǎo)細胞實施專有功能的蛋白部分。盡管通常可使用整個細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但在很多例子中，不必使用整個鏈。就使用細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，這種截短部分可用于代替完整的鏈，只要它轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號。術(shù)語細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域因此指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。
[0160]用于本發(fā)明的CAR的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選例子包括T細胞受體(TCR)的胞漿序列和協(xié)同行動以在抗原受體結(jié)合后開始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共受體，以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。
[0161]已知通過TCR單獨產(chǎn)生的信號不足以完全活化T細胞，并且也需要次級或共刺激信號。因此，T細胞活化可由兩個不同類的胞漿信號傳導(dǎo)序列介導(dǎo):通過TCR(初級胞漿信號傳導(dǎo)序列)開始抗原-依賴性初級活化的那些和以抗原-非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號(次級胞漿信號傳導(dǎo)序列)的那些。
[0162]初級胞漿信號傳導(dǎo)序列以刺激方式或以抑制方式調(diào)節(jié)TCR復(fù)合物的初級活化。以刺激方式起作用的初級胞漿信號傳導(dǎo)序列可包含信號傳導(dǎo)基序，其已知為基于免疫受體酪氨酸的活化基序或ITAM。
[0163]包含在本發(fā)明中具有具體用途的初級胞漿信號傳導(dǎo)序列的ITAM的例子包括源于TCR ζ、FcR Y、FcRP、CD3 Y、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的那些。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的胞 漿信號傳導(dǎo)分子包括源于CD3 ζ的胞漿信號傳導(dǎo)序列。
[0164]在優(yōu)選的實施方式中，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計以本身包括CD3- ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或可與在本發(fā)明的CAR的內(nèi)容中有用的任何其他期望的胞漿結(jié)構(gòu)域(一個或多個)聯(lián)合。例如，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可包括CD3(鏈部分和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴細胞對抗原的有效應(yīng)答所需的細胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。這種分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和與⑶83特異性結(jié)合的配體等等。因此，盡管本發(fā)明主要以4-1BB作為共刺激信號傳導(dǎo)元件的例子，但其他共刺激元件也位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0165]本發(fā)明的CAR的胞漿信號傳導(dǎo)部分內(nèi)的胞漿信號傳導(dǎo)序列可以隨機或以規(guī)定的順序相互連接。任選地，短的寡肽或多肽連接體，優(yōu)選長度在2和10個氨基酸，可形成該連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。
[0166]在一個實施方式中，胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括CD3_(的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD28的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方式中，胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括CD3-(的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和4-1BB的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。還在另一個實施方式中，胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括⑶3- ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和⑶28和4-1ΒΒ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0167]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR中的胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括4-1ΒΒ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和⑶3- ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中4-1ΒΒ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO:6中提出的核酸序列和⑶3-ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID Ν0:7中提出的核酸序列。
[0168]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR中的胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括4-1ΒΒ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和⑶3- ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中4-1ΒΒ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括編碼SEQ IDNO: 18的氨基酸序列的核酸序列，和⑶3- ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括編碼SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的核酸序列。
[0169]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR中的胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括4-1ΒΒ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和⑶3-ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中4-1ΒΒ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 18中提出的氨基酸序列，和CD3-(的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 19中提出的氨基酸序列。
[0170]載述
[0171]本發(fā)明包括包含CAR序列的DNA構(gòu)建體，其中該序列包括可操作地連接至細胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)域的核酸序列的抗原結(jié)合部分的核酸序列?？捎糜诒景l(fā)明的CAR的示例性細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括但不限于⑶3-ζ、⑶28、4-1ΒΒ等等的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些例子中，CAR可包括CD3- ζ、CD28、4-1BB等等的任何組合。
[0172]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括抗-FRa scFv、人⑶8鉸合和跨膜結(jié)構(gòu)域、和人4-1BB和⑶3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括SEQ ID NO:1中提出的核酸序列。在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR包括編碼SEQ ID Ν0:13的氨基酸序列的核酸序列。在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR包括SEQ ID NO: 13中提出的氨基酸序列。
[0173]在一種實施方式中，本發(fā)明的CAR包括人源化的抗FR a scFv、人⑶8鉸合和跨膜結(jié)構(gòu)域，和人4-1BB和⑶3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一種實施方式中，本發(fā)明的CAR包括SEQID NO:20中提出的核酸序列。在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR包括編碼SEQ ID Ν0:22的氨基酸序列的核酸序列。在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR包括SEQ ID Ν0:22中提出的氨基酸序列。
[0174]編碼期望分子的核酸序列可利用在本領(lǐng)域中已知的重組方法獲得，諸如例如通過從表達基因的細胞中篩選文庫，通過從已知包括該基因的載體中得到該基因，或通過利用標準的技術(shù)，從包含該基因的細胞和組織中直接分離?？蛇x地，感興趣的基因可被合成生產(chǎn)，而不被克隆。
[0175]本發(fā)明也提供了其中插入本發(fā)明的DNA的載體。源于反轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒的載體是實現(xiàn)長期基因轉(zhuǎn)移的合適工具，因為它們允許轉(zhuǎn)基因長期、穩(wěn)定的整合并且其在子細胞中增殖(propagation)。慢病毒載體具有超過源自致癌反轉(zhuǎn)錄病毒諸如鼠科白血病病毒的載體的額外優(yōu)點，因為它們可轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖的細胞，諸如肝細胞。它們也具有低免疫原性的額外優(yōu)點。
[0176]簡單概括，通常通過可操作地連接編碼CAR多肽或其部分的核酸至啟動子，并將構(gòu)建體并入表達載體，實現(xiàn)編碼CAR的天然或合成核酸的表達。該載體對于復(fù)制和整合真核細胞可為合適的。典型的克隆載體包含可用于調(diào)節(jié)期望核酸序列表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、初始序列和啟動子。
[0177]本發(fā)明的表達構(gòu)建體也可利用標準的基因傳遞方案，用于核酸免疫和基因療法?；騻鬟f的方法在本領(lǐng)域中是已知的。見例如美國專利號5，399，346、5，580，859、5，589，466，在此通過引用全文并入。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了基因療法載體。
[0178]該核酸可被克隆入許多類型的載體。例如，該核酸可被克隆入如此載體，其包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測序載體。
[0179]進一步地，表達載體可以以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的并在例如 Sambrook 等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊中進行了描述?？捎米鬏d體的病毒包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機體中起作用的復(fù)制起點、啟動子序列、方便的限制酶位點和一個或多個可選擇的標記(例如，W001/96584 ；W001/29058 ;和美國專利號6，326，193)。
[0180]已經(jīng)開發(fā)許多基于病毒的系統(tǒng)，用于將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動物細胞。例如，反轉(zhuǎn)錄病毒提供了用于基因傳遞系統(tǒng)的方便的平臺?？衫迷诒绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)將選擇的基因插入載體并包裝入反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。該重組病毒可隨后被分離和傳遞至體內(nèi)或離體的對象細胞。許多反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領(lǐng)域中是已知的。在一個實施方式中，使用慢病毒載體。
[0181]額外的啟動子元件，例如增強子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄開始的頻率。通常地，這些位于起始位點上游的30-110bp區(qū)域中，盡管近來已經(jīng)顯示許多啟動子也包含起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔經(jīng)常是柔性的，以便當元件相對于另一個被倒置或移動時，保持啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可被增加隔開50bp，活性才開始下降。取決于啟動子，表現(xiàn)出單個元件可合作或獨立地起作用，以起動轉(zhuǎn)錄。
[0182]合適的啟動子的一個例子為即時早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列為能夠驅(qū)動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達的強組成型啟動子序列。合適的啟動子的另一個例子為延伸生長因子-1 a (EF-1 α )。然而，也可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限于類人猿病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV) 長末端重復(fù)(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒即時早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基因啟動子，諸如但不限于肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動子。進一步地，本發(fā)明不應(yīng)被限于組成型啟動子的應(yīng)用。誘導(dǎo)型啟動子也被考慮為本發(fā)明的一部分。誘導(dǎo)型啟動子的使用提供了分子開關(guān)，其能夠當這樣的表達是期望的時，打開可操作地連接誘導(dǎo)型啟動子的多核苷酸序列的表達，或當表達是不期望的時關(guān)閉表達。誘導(dǎo)型啟動子的例子包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán)素啟動子。
[0183]為了評估CAR多肽或其部分的表達，被引入細胞的表達載體也可包含可選擇的標記基因或報道基因中的任一個或兩者，以便于從通過病毒載體尋求被轉(zhuǎn)染或感染的細胞群中鑒定和選擇表達細胞。在其他方面，可選擇的標記可被攜帶在單獨一段DNA上并用于共轉(zhuǎn)染程序?？蛇x擇的標記和報道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列，以便能夠在宿主細胞中表達。有用的可選擇標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。
[0184]報道基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細胞并用于評價調(diào)節(jié)序列的功能性。通常地，報道基因為以下基因:其不存在于受體有機體或組織或由受體有機體或組織進行表達，并且其編碼多肽，該多肽的表達由一些可容易檢測的性質(zhì)例如酶活性清楚表示。在DNA已經(jīng)被引入受體細胞后，報道基因的表達在合適的時間下進行測定。合適的報道基因可包括編碼熒光素酶、β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因的基因(例如，U1-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合適的表達系統(tǒng)是公知的并可利用已知技術(shù)制備或從商業(yè)上獲得。通常，顯示最高水平的報道基因表達的具有最少5個側(cè)翼區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動子。這樣的啟動子區(qū)可被連接至報道基因并用于評價試劑調(diào)節(jié)啟動子-驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的能力。
[0185]將基因引入細胞和將基因表達入細胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在表達載體的內(nèi)容中，載體可通過在本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如，表達載體可通過物理、化學(xué)或生物學(xué)手段轉(zhuǎn)移入宿主細胞。
[0186]將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、微注射、電穿孔等等。生產(chǎn)包括載體和/或外源核酸的細胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的。見例如 Sambrook 等(2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, New York)。將多核苷酸引入宿主細胞的優(yōu)選方法為磷酸I丐轉(zhuǎn)染。
[0187]將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學(xué)方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是反轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細胞的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒1、腺病毒和腺伴隨病毒等等。見例如美國專利號5，350，674和5，585，362。
[0188]將多核苷酸引入宿主細胞的化學(xué)手段包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠；和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)遞送工具(delivery vehicle)的示例性膠體系統(tǒng)為脂質(zhì)體(例如，人造膜囊)。
[0189]在使用非病毒傳遞系統(tǒng)的情況下，示例性傳遞工具為脂質(zhì)體?？紤]使用脂質(zhì)制劑，以將核酸引入宿主細胞(體外、離體(ex vivo)或體內(nèi))。在另一方面，該核酸可與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的核酸 可被封裝入脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中，散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)，經(jīng)與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者都相關(guān)聯(lián)的連接分子附接至脂質(zhì)體，陷入脂質(zhì)體，與脂質(zhì)體復(fù)合，分散在包含脂質(zhì)的溶液中，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)聯(lián)合，作為懸浮液包含在脂質(zhì)中，包含在膠束中或與膠束復(fù)合，或以其他方式與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與組合物相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)、脂質(zhì)/DNA或脂質(zhì)/表達載體不限于溶液中的任何具體結(jié)構(gòu)。例如，它們可存在于雙分子層結(jié)構(gòu)中，作為膠束或具有“坍縮的(collapsed)”結(jié)構(gòu)。它們也可簡單地被散布在溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質(zhì)為脂肪物質(zhì)，其可為天然發(fā)生或合成的脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括脂肪小滴，其天然發(fā)生在細胞質(zhì)以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺類、氨基醇類和醛類的該類化合物中。
[0190]適于使用的脂質(zhì)可從商業(yè)來源中獲得。例如，二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(“DMPC”)可從Sigma, St.Louis, MO 中獲得；憐酸二嫁臘酯(“DCP”)可從K&K Laboratories (Plainview,NY)中獲得；膽固醇(“Choi”)可從Calbiochem-Behring中獲得；二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂質(zhì)可從 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)中獲得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂質(zhì)原液可被保存在大約-20°C下。氯仿用作唯一的溶劑，因為它比甲醇更容易蒸發(fā)?！爸|(zhì)體”為通用術(shù)語，其包括通過產(chǎn)生封閉的脂雙層或聚集體而形成的多種單一和多層脂質(zhì)工具。脂質(zhì)體可以以具有含有磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊泡結(jié)構(gòu)為特征。多層脂質(zhì)體具有由水性介質(zhì)分開的多個脂質(zhì)層。當磷脂懸浮在過量的水性溶液中時，它們自發(fā)形成。在形成封閉的結(jié)構(gòu)和使水和溶解的溶質(zhì)陷入脂雙層之間前，該脂質(zhì)成分經(jīng)歷自身重排(Ghosh等，191Glycobiology5:505-10)。然而,也包括與正常的囊泡結(jié)構(gòu)相比具有溶液中的不同結(jié)構(gòu)的組合物。例如，脂質(zhì)可呈現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)或僅作為脂質(zhì)分子的非均一聚集體而存在。同樣考慮的是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-核酸復(fù)合物。
[0191]不管用于將外源核酸引入宿主細胞的方法，或以其他方式將細胞暴露于本發(fā)明的抑制劑，以便證實在宿主細胞中存在重組DNA序列，可實施多種測定。這樣的測定包括例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的“分子生物學(xué)”測定，諸如DNA印跡法和RNA印跡法、RT-PCR和PCR ；“生物化學(xué)”測定，諸如例如通過免疫學(xué)手段(EL1SA和蛋白質(zhì)印跡)或通過本文描述的鑒定落入本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑的測定，檢測特定肽的存在或不存在。
_2] T細胞的活化和擴展
[0193]不論在T細胞遺傳修飾以表達期望的CAR之前或之后，T細胞都可通常使用以下所述的方法活化和擴展:例如美國專利6，352，694 ;6，534，055 ;6，905，680 ;6，692，964 ；5，858，358 ;6，887，466 ;6，905，681 ;7，144，575 ;7，067，318 ;7，172，869 ;7，232，566 ；7，175，843 ;5，883，223 ;6，905，874 ;6，797，514 ;6，867，041 ;和美國專利申請公布號20060121005。
[0194]通常地，本發(fā)明的T細胞通過與表面的接觸進行擴展，所述表面具有附著于其的刺激CD3/TCR復(fù)合物相關(guān)信·號的試劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配體。特別地，T細胞群可如本文所述的諸如通過與固定在表面上的抗-CD3抗體、或其抗原-結(jié)合片段或抗-⑶2抗體接觸，或通過和與鈣離子載體組合的蛋白激酶C激活劑(例如，苔蘚抑制素)接觸進行刺激。對于T細胞表面上的輔助分子的共刺激，使用結(jié)合輔助分子的配體。例如，T細胞群可在適于刺激T細胞增殖的條件下與抗-CD3抗體和抗-CD28抗體接觸。為了刺激CD4+T細胞或CD8+T細胞的增殖，使用抗-CD3抗體和抗-CD28抗體?？膳c在本領(lǐng)域中公知的其他方法一樣，可使用包括9.3、B-T3、XR-Q)28 (Diacione, Besancon, France)的抗-CD28 抗體的例子(Berg 等，Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998;Haanen 等，J.Exp.Med.190 (9): 13191328，1999; Garland 等，J.1mmunolMeth.227 (1-2): 53-63，1999)。
[0195]在一些實施方式中，T細胞的初級刺激信號和共刺激信號可通過不同的方案提供。例如，提供每個信號的試劑可在溶液中或連接至表面。當連接至表面時，試劑可被連接至同一表面(即，以“cis”形式)或分開的表面(即，以“trans”形式)?？蛇x地，一種試劑可被連接至表面和另一種試劑處于溶液中。在一個實施方式中，提供共刺激信號的試劑被結(jié)合至細胞表面，并且提供初級活化信號的試劑在溶液中或被連接至表面。在一些實施方式中，兩種試劑可都在溶液中。在另一個實施方式中，試劑可處于可溶形式，隨后被交聯(lián)至表面，諸如表達Fe受體或抗體的細胞或?qū)⒔Y(jié)合該試劑的其他結(jié)合劑。在這點上,見例如用于人造抗原呈遞細胞(aAPC)的美國專利申請公布號20040101519和20060034810，其被考慮用于活化和擴展本發(fā)明的T細胞。
[0196]在一個實施方式中，兩種試劑被固定在珠上，在同一珠即“cis”上或分開的珠即“trans”上。作為例子，提供初級活化信號的試劑為抗-CD3抗體或其抗原-結(jié)合片段，和提供共刺激信號的試劑為抗-CD28抗體或其抗原-結(jié)合片段；并且兩種試劑都以相等的分子數(shù)量被共固定至同一珠。在一個實施方式中，使用結(jié)合至用于⑶4+T細胞擴展和T細胞生長的珠的1:1比率的每種抗體。在本發(fā)明的一些方面中，使用結(jié)合至珠的抗CD3:CD28抗體的比率，以便與利用1:1比率觀察到的擴展相比，觀察到T細胞擴展的增加。在一個具體的實施方式中，與利用1:1比率觀察到的擴展相比，觀察到從大約I至大約3倍的增加。在一個實施方式中，結(jié)合至珠的⑶3:⑶28抗體的比率處于100:1至1:100的范圍中和其間的所有整數(shù)值。在本發(fā)明的一個方面中，比抗-CD3抗體更多的抗-CD28抗體被結(jié)合至顆粒，即⑶3:⑶28的比率小于I。在本發(fā)明的一些實施方式中，結(jié)合至珠的抗⑶28抗體與抗⑶3抗體的比率大于2:1。在一個具體的實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:100的⑶3:⑶28比率。在另一個實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:75的⑶3:⑶28比率。在進一步的實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:50的CD3:CD28比率。在另一個實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:30的⑶3:⑶28比率。在一個優(yōu)選實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:10的⑶3:⑶28比率。在另一個實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:3的⑶3:⑶28比率。還在另一個實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的3:1的⑶3:⑶28比率。
[0197]從1:500至500:1和其間任何整數(shù)值的顆粒與細胞的比率可用于刺激T細胞或其他靶細胞。因為在本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地領(lǐng)會到，顆粒與細胞的比率可取決于相對于靶細胞的顆粒大小。例如，小尺寸的珠僅可結(jié)合一些細胞，而較大的珠能結(jié)合很多。在一些實施方式中，細胞與顆粒的比率在從1:100至100:1的范圍內(nèi)和其間任何整數(shù)值，和在進一步的實施方式中，該比率包括1:9至9:1和其間任何整數(shù)值，也可用于刺激T細胞?？?⑶3-和抗-⑶28-結(jié)合的顆粒與產(chǎn)生T細胞刺激的T細胞的比率可如以上記錄的變化，然而一些優(yōu)選的值包括 1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1: 1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1 和 15:1，一個優(yōu)選的比率為至少 1:1 顆粒每 T 細胞。在一個實施方式中，使用1:1或更小的顆粒與細胞的比率。在一個具體的實施方式中，優(yōu)選的顆粒:細胞比率為1:5。在進一步的實施方式中，顆粒與細胞的比率可根據(jù)刺激天數(shù)而改變。例如，在一個實施方式中，顆粒與細胞的比率在第一天為從1:1至10:1，和額外的顆粒每天或此后每隔一天直至10天，以從1:1至1:10的最終比率(基于添加日的細胞計數(shù))被添加至細胞。在一個具體的實施方式中，顆粒與細胞的比率在刺激的第一天為1:1并在刺激的第三和第五天被調(diào)節(jié)至1: 5。在另一個實施方式中，顆粒在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添加，以在第一天最終比率為1:1，并在刺激的第三和第五天最終比率為1:5。在另一個實施方式中，顆粒與 細胞的比率在刺激的第一天為2:1并在刺激的第三和第五天被調(diào)節(jié)至1:10。在另一個實施方式中，顆粒在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添加，以在第一天最終比率為1:1，和在刺激的第三和第五天最終比率為1:10。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解多種其他比率可適于用于本發(fā)明。特別地，比率將根據(jù)顆粒大小和細胞大小和類型而變化。
[0198]在本發(fā)明的進一步的實施方式中，細胞諸如T細胞，與包被試劑的珠組合，隨后分離該珠和細胞，并且隨后培養(yǎng)該細胞。在一個可選實施方式中，在培養(yǎng)前，不分離包被試劑的珠和細胞，而是在一起進行培養(yǎng)。在進一步的實施方式中，珠和細胞首先通過施加力諸如磁力被聚集，產(chǎn)生增加的細胞表面標記的連接作用，由此誘導(dǎo)細胞刺激。
[0199]作為例子，可通過允許附接抗-⑶3和抗-⑶28的順磁珠(3X28個珠)接觸T細胞，來連接細胞表面蛋白。在一個實施方式中，細胞(例如，IO4至IO9個T細胞)和珠(例如，以1:1比率的DYNABEADS? M-450⑶3/⑶28T順磁珠)在緩沖液優(yōu)選PBS (沒有二價陽離子諸如，鈣和鎂)中進行聯(lián)組合。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易理解可使用任何細胞濃度。例如，靶細胞可在樣本中非常稀少并僅占0.01%的樣本，或整個樣本(即，100%)可包括感興趣的靶細胞。因此，任何細胞數(shù)量都在本發(fā)明的內(nèi)容內(nèi)。在一些實施方式中，可期望顯著降低其中顆粒和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞濃度)，以確保細胞和顆粒的最大接觸。例如，在一個實施方式中，使用大約20億細胞/ml的濃度，在另一個實施方式中，使用多于I億細胞/ml。在進一步的實施方式中，使用細胞濃度10、15、20、25、30、35、40、45或50X IO6細胞/ml。還在另一個實施方式中，使用細胞濃度75、80、85、90、95或100X IO6細胞/ml，在進一步的實施方式中，可使用125或150X IO6細胞/ml的濃度。利用高濃度可產(chǎn)生增加的細胞產(chǎn)量、細胞活化和細胞擴展。進一步地，使用高細胞濃度允許更有效地捕獲可微弱表達感興趣的靶抗原的細胞，諸如CD28-陰性T細胞。這樣的細胞群可具有治療價值并將在一些實施方式中期望獲得。例如，利用高濃度的細胞允許更有效選擇正常具有更弱⑶28表達的⑶8+T細胞。
[0200]在本發(fā)明的一個實施方式中，混合物可被培養(yǎng)數(shù)個小時(大約3個小時)至大約14天或其間任何個小時的整數(shù)值。在另一個實施方式中，混合物可被培養(yǎng)21天。在本發(fā)明的一個實施方式中，珠和T細胞在一起培養(yǎng)大約八天。在另一個實施方式中，珠和T細胞在一起培養(yǎng)2-3天。也可期望數(shù)個周期的刺激，以便T細胞的培養(yǎng)時間可為60天或更多天。適于T細胞培養(yǎng)的條件包括適當?shù)呐囵B(yǎng)基(例如，最小必需培養(yǎng)基或RPMl培養(yǎng)基1640或X-vivol5, (Lonza))，其可包含增殖和存活必須的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白細胞介素-2 (IL-2)、胰島素、IFN- Y、IL-4、IL-7、GM-CSF, IL-10、IL-12、IL-15、TGFp 和TNF-α或技術(shù)人員已知的用于細胞生長的任何其他添加劑。用于細胞生長的其他添加劑包括但不限于表面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)和還原劑諸如N-乙?；?半胱氨酸和 2-巰基乙醇。培養(yǎng)基可包括 RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、a -MEM、F_12、X_Vivol5 和X-Vivo20、優(yōu)選的(Optimizer),具有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素、無血清或補充適當量的血清(或血漿)或限定的激素組，和/或足夠T細胞的生長和擴展量的細胞因子(一個或多個)?？股兀缜嗝顾睾玩溍顾?，僅被包括在實驗培養(yǎng)物中，而不包括在注入對象的細胞培養(yǎng)物中。靶細胞被保持在支持生長必須的條件下，例如，適當?shù)臏囟?例如，37°C )和氣氛(例如，空氣加5%C02)。
[0201]已經(jīng)暴露于變化刺激時間的T細胞可顯示不同的特性。例如，典型的血液或單采的(apheresed)外周血單 核細胞產(chǎn)物具有比細胞毒性或抑制T細胞群(T。，CD8+)更多的輔助T細胞群(TH，⑶4+)。T細胞通過刺激⑶3和⑶28受體的離體擴展在大約8-9天前產(chǎn)生主要由Th細胞組成的T細胞群，而在大約8-9天后，T細胞群包括漸增的更多的T。細胞群。因此，取決于治療目的，用主要包括Th細胞的T細胞群注入對象可為有利的。類似地，如果已經(jīng)分離了 T。細胞的抗原-特異性亞型，則它可有益于以更大的程度擴展該亞型。
[0202]進一步地，除了⑶4和⑶8標記，其他表型標記在細胞擴展過程的進程期間，也顯著地但以大部分可重復(fù)地變化。因此，這種重復(fù)性使針對具體目的調(diào)節(jié)活化的T細胞產(chǎn)物的能力能夠?qū)崿F(xiàn)。
[0203]治療性應(yīng)用
[0204]本發(fā)明包括用慢病毒載體(LV)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞(例如，T細胞)。例如，LV編碼將特異性抗體的抗原識別結(jié)構(gòu)域與CD3- ζ、CD28、4-1BB或任何其組合的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域聯(lián)合的CAR。因此，在一些例子中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞可引起CAR-介導(dǎo)的T-細胞應(yīng)答。[0205]本發(fā)明提供了 CAR改變初級T細胞對腫瘤抗原的特異性的用途。因此，本發(fā)明也提供了刺激對哺乳動物的靶細胞群或組織的T細胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括以下步驟:施用給哺乳動物表達CAR的T細胞，其中CAR包括特異性地與預(yù)定標靶相互作用的結(jié)合部分，包括例如人CD3(的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的ζ鏈部分，和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。
[0206]在一個實施方式中，本發(fā)明包括一類細胞療法，其中T細胞被基因修飾以表達CAR，和CAR T細胞被注入需要其的接受者中。注入的細胞能夠殺死接受者的腫瘤細胞。不像抗體療法，CAR T細胞能夠體內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生可導(dǎo)致持續(xù)腫瘤控制的長期持久性。
[0207]在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR T細胞可經(jīng)歷穩(wěn)固的體內(nèi)T細胞擴展并可持續(xù)延長的時間量。在另一個實施方式中，本發(fā)明的CAR T細胞發(fā)展成可被重新活化以抑制任何額外腫瘤形式或生長的特異性記憶T細胞。例如，不期望地，本發(fā)明的FRa-特異性CART細胞可經(jīng)歷穩(wěn)固的體內(nèi)T細胞擴展并在血液和骨髓中以高水平持續(xù)延長的時間量，并形成特異性記憶T細胞。不希望被任何具體的理論所束縛，在遇到并隨后消除表達替代抗原的靶細胞后，CAR T細胞可體內(nèi)分化成中心記憶樣狀態(tài)。
[0208]不希望被任何具體的理論所束縛，由CAR-修飾T細胞引起的抗腫瘤免疫應(yīng)答可為主動或被動免疫應(yīng)答。另外，CAR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可為過繼免疫療法步驟的一部分，其中CAR-修飾T細胞誘導(dǎo)對CAR中的抗原結(jié)合部分特異性的免疫應(yīng)答。例如，F(xiàn)R α -特異性CART細胞引起對表達FRa的細·胞特異性的免疫應(yīng)答。
[0209]盡管本文公開的數(shù)據(jù)具體公開了包括抗-FRa scFV、Ara8a鉸合和跨膜結(jié)構(gòu)域、和人4-1BB和CD3 ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的慢病毒載體，但本發(fā)明應(yīng)被解釋為包括對構(gòu)建體組成部分中的每一個的任何數(shù)量的變化，如本文其他地方所述的。S卩,本發(fā)明包括CAR中任何抗原結(jié)合部分產(chǎn)生對抗原結(jié)合部分特異性的CAR-介導(dǎo)的T-細胞應(yīng)答的用途。例如，本發(fā)明的CAR中的抗原結(jié)合部分可出于治療癌癥的目的靶向腫瘤抗原。
[0210]可治療的癌癥包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤。癌癥可包括非實體瘤(諸如血液學(xué)腫瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括實體瘤。用本發(fā)明的CAR治療的癌癥類型包括但不限于癌、胚細胞瘤和肉瘤，和一些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤,和惡性瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌癥和兒童腫瘤/癌癥。
[0211]在一種實施方式中，本發(fā)明的CAR的抗原結(jié)合部部分設(shè)計為治療具體的癌癥。FRa是糖基磷脂酰肌醇-錨定的蛋白質(zhì)，其在上皮惡性腫瘤譜中的癌細胞的表面上過表達，但是在正常組織中受限。因此，設(shè)計為靶向FRa的CAR可用于治療特征為展示FRa過表達的細胞和/或組織的任何疾病或紊亂，其包括但不限于上皮癌。例如，設(shè)計為靶向FR a的CAR可用于治療癌癥和紊亂，其包括但不限于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌、其他實體癌等等。
[0212]然而，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為僅限于本文公開的抗原標靶和疾病。相反地，本發(fā)明應(yīng)被解釋為包括任何與可使用CAR治療的疾病相關(guān)的抗原標靶。
[0213]本發(fā)明的CAR-修飾T細胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內(nèi)療法的疫苗類型。優(yōu)選地，哺乳動物為人。
[0214]對于離體免疫，以下中的至少一項在將細胞施用進入哺乳動物前在體外發(fā)生:i)擴展細胞，?)將編碼CAR的核酸引入細胞，和/或iii)冷凍保存細胞。[0215]離體程序在本領(lǐng)域中是公知的，并在以下更完全地進行討論。簡單地說，細胞從哺乳動物(優(yōu)選人)中分離并用表達本文公開的CAR的載體進行基因修飾(即，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。CAR-修飾的細胞可被施用給哺乳動物接受者，以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人，和CAR-修飾的細胞可相對于接受者為自體的?？蛇x地，細胞可相對于接受者為同種異基因的、同基因的(syngeneic)或異種的。
[0216]在此通過引用并入的在美國專利號5，199，942中描述的造血干細胞和祖細胞的離體擴展程序，可被應(yīng)用至本發(fā)明的細胞。其他合適的方法在本領(lǐng)域中是已知的，因此本發(fā)明不限于細胞離體擴展的任何具體方法。簡單地說，T細胞的離體培養(yǎng)和擴展包括:(I)從外周血收獲物或骨髓外植體收集來自哺乳動物的CD34+造血干細胞和祖細胞；和(2)離體擴展這樣的細胞。除了美國專利號5，199，942中描述的細胞生長因子，其他因子諸如flt3-L、IL-U IL-3和c_kit配體，也可用于培養(yǎng)和擴展細胞。
[0217]除了就離體免疫而言使用基于細胞的疫苗之外，本發(fā)明也提供了體內(nèi)免疫以引起針對患者中抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。
[0218]通常地，如本文所述活化和擴展的細胞可用于治療和預(yù)防無免疫應(yīng)答的個體中產(chǎn)生的疾病。特別地，本發(fā)明的CAR-修飾的T細胞用于治療卵巢癌。在一些實施方式中，本發(fā)明的細胞用于治療處于形成卵巢癌風險中的患者。因此，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防卵巢癌的方法，其包括施用給需要其的對象治療有效量的本發(fā)明的CAR-修飾的T細胞。
[0219]本發(fā)明的CAR-修飾的T細胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組分諸如IL-2或其他細胞因子或細胞群結(jié)合施用。簡單地說，本發(fā)明的藥物組合物可包括如本文所述的靶細胞群，與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結(jié)合。這樣的組合物可包括緩沖液諸如中性緩沖鹽水、硫酸鹽緩沖鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸諸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑諸如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制用于靜脈內(nèi)施用。
[0220]本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病癥、和患者疾病的類型和嚴重度——盡管適當?shù)膭┝靠捎膳R床試驗確定。
[0221]當指出“免疫學(xué)上有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤-抑制有效量”或“治療量”時，待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師確定，其考慮患者(對象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移程度和病癥的個體差異?？赏ǔＶ赋?包括本文描述的T細胞的藥物組合物可以以IO4至IO9個細胞/kg體重的劑量，優(yōu)選IO5至IO6個細胞/kg體重的劑量——包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值——施用。T細胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細胞可通過使用免疫療法中公知的注入技術(shù)(見例如Rosenberg等，New Eng.J.0f Med.319:1676,1988)施用。對于具體患者的最佳劑量和治療方案可通過監(jiān)測患者的疾病跡象并因此調(diào)節(jié)治療由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
[0222]在一些實施方式中，可期望向?qū)ο笫┯没罨腡細胞，并隨后重新抽取(redraw)血液(或?qū)嵤﹩尾裳撼煞中g(shù))，根據(jù)本發(fā)明活化來自其中的T細胞，和用這些活化和擴展的T細胞再注入該患者。該過程可每幾個周進行多次。在一些實施方式中，T細胞可從IOcc至400cc的血液抽取中進行活化。在一些實施方式中，T細胞從20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或IOOcc的血液抽取中進行活化。不被理論所束縛，利用多份血液抽
取/多個再輸注方案可用于選出一些T細胞群。
[0223]對象組合物的施用可以以任何方便的方式進行，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈內(nèi)(1.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個實施方式中，本發(fā)明的T細胞組合物通過皮內(nèi)或皮下注射被施用給患者。在另一個實施方式中，本發(fā)明的T細胞組合物優(yōu)選通過1.v.注射施用。T細胞的組合物可被直接注入腫瘤、淋巴結(jié)或感染位置。
[0224]在本發(fā)明的一些實施方式中，利用本文描述的方法或本領(lǐng)域已知的其他將T細胞擴展至治療性水平的方法活化和擴展的細胞，與任何數(shù)量的有關(guān)治療形式結(jié)合(例如，之前、同時或之后)施用給患者，所述治療形式包括但不限于用以下試劑進行治療:所述試劑諸如抗病毒療法、西多福韋和白細胞介素-2、阿糖胞苷(也已知為ARA-C)或?qū)S患者的那他珠單抗治療或?qū)εＦぐ_患者的厄法珠單抗治療或?qū)ML患者的其他治療。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的T細胞可與以下結(jié)合使用:化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和FK506，抗體或其他免疫燒蝕劑諸如CAM PATH、抗-CD3抗體或其他抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱、環(huán)孢菌素、FK506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、FR901228、細胞因子和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶——韓調(diào)磷酸酶(環(huán)孢菌素和FK506)或抑制對生長因子誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)(雷帕霉素)重要的P70S6激酶(Liu 等，Cell66:807-815，1991;Henderson 等，Tmmun.73:316-321，1991;Bierer 等，Curr.0pin, Tmmun.5:763-773, 1993)。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的細胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達拉濱、外部光束放射療法(XRT)、環(huán)磷酰胺或抗體諸如0KT3或CAMPATH的T細胞燒蝕療法結(jié)合(例如，之前、同時或之后)而施用給患者。在另一個實施方式中，本發(fā)明的細胞組合 物在B-細胞燒蝕療法諸如與CD20反應(yīng)的試劑例如Rituxan后進行施用。例如，在一個實施方式中，對象可經(jīng)歷高劑量化療的標準治療，之后進行外周血干細胞移植。在一些實施方式中，在移植后，對象接受本發(fā)明的擴展的免疫細胞的注入。在一個額外的實施方式中，擴展的細胞在外科手術(shù)前或外科手術(shù)后施用。
[0225]施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病癥的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實踐實施。例如，CAMPATH的劑量對于成人患者將通常在I至大約IOOmg的范圍中，通常每天施用，持續(xù)I和30天之間的時期。盡管在一些例子中可使用上至40mg每天的較大劑量(美國專利號6，120，766中描述)，但優(yōu)選的日劑量為I至IOmg每天。
[0226]實驗實施例
[0227]本發(fā)明通過參考以下實驗實施例進一步詳細地進行描述。這些實施例僅出于說明性的目的提供，并不意欲為限制性的，除非另有規(guī)定。因此，本發(fā)明決不應(yīng)被解釋為限于以下實施例，而是應(yīng)被解 釋為包括由于本文提供的教導(dǎo)變得顯而易見的任何和全部的變化。
[0228]沒有進一步的描述，相信利用先前的描述和以下的說明性實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可制造和利用本發(fā)明的化合物，并實踐請求保護的方法。以下工作實施例因此具體指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不解釋為以任何方式限制本公開背景的剩余部分。
[0229]現(xiàn)在描述在這些實驗中使用的材料和方法。
[0230]產(chǎn)牛.抗.-α -葉酸受體(α FR) Τ 體分子(body molecule)[0231]抗-aFR scFv (M0vl9)用作模板，用于使用下列引物PCR擴增780-bp M0vl9片段:
[0232]
【權(quán)利要求】
1.編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括α-葉酸受體(FRa)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4_1BB(CD137)共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，進一步包括CD3(信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中CAR包括SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，包括SEQID NO:1或SEQ ID N0:20的核酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其FRa -結(jié)合片段。
6.權(quán)利要求5所述的分離的核酸序列,其中所述FRa-結(jié)合片段是Fab或scFv。
7.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原，其中所述腫瘤抗原是FR a。
8.權(quán)利要求7所述的分離的核酸序列，其中所述腫瘤抗原與上皮惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)。
9.權(quán)利要求7所述的分離的核酸序列，其中所述腫瘤抗原與實體瘤相關(guān)聯(lián)。
10.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO: 15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQID NO:3或SEQ ID NO:21的核酸序列 編碼。
12.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO: 18的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域由SEQID NO:6的核酸序列編碼。
14.權(quán)利要求2所述的分離的核酸序列，其中所述CD3(信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO: 19的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求2所述的分離的核酸序列，其中所述CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域由SEQ IDNO:7的核酸序列編碼。
16.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，進一步包括跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
17.分離的嵌合抗原受體(CAR)，其包括FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域。
18.權(quán)利要求17所述的分離的CAR，進一步包括⑶3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求17所述的分離的CAR，其中所述CAR包括SEQID NO: 13或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求17所述的分離的CAR，其中所述FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其FR a -結(jié)合片段。
21.權(quán)利要求20所述的分離的CAR，其中所述FRa-結(jié)合片段是Fab或scFv。
22.權(quán)利要求17所述的分離的CAR，其中所述FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原，其中所述腫瘤抗原是FRa。
23.權(quán)利要求22所述的分離的CAR，其中所述腫瘤抗原與上皮惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)。
24.權(quán)利要求22所述的分離的CAR，其中所述腫瘤抗原是與實體瘤相關(guān)聯(lián)。
25.權(quán)利要求17所述的分離的CAR，其中所述FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求17所述的分離的CAR，其中所述4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO: 18的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求18所述的分離的CAR，其中所述⑶3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求17所述的分離的CAR，進一步包括跨膜結(jié)構(gòu)域。
29.基因修飾的T細胞，包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
30.載體，包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
31.用于在對象中提供抗腫瘤免疫性的方法，所述方法包括:向所述對象施用有效量的基因修飾的T細胞，其包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而在所述對象中提供抗腫瘤免疫性。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述分離的核酸序列進一步包括CD3(信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
33.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述共刺激結(jié)構(gòu)域的存在提高T細胞存活率。
34.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述共刺激結(jié)構(gòu)域的存在增加所述對象中的抗腫瘤免疫性的效能。
35.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述對象是哺乳動物。
36.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述對象是人。
37.用于在對象中刺激對細胞群或組織的T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括:向所述對象施用有效量的基因修飾的T細胞，其包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1ΒΒ共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而刺激所述對象中T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
38.治療對象中卵巢癌的方法，所述方法包括:向所述對象施用有效量的基因修飾的T細胞，其包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而治療所述對象中的卵巢癌。
39.治療對象中癌癥的方法，所述方法包括:向所述對象施用有效量的基因修飾的T細胞，其包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，從而治療所述對象中的癌癥。
40.在診斷具有卵巢癌的對象中產(chǎn)生持續(xù)的基因工程化T細胞群的方法，所述方法包括:向所述對象施用有效量的基因修飾的T細胞，其包括編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列，其中所述分離的核酸序列包括FR α結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的核酸序列，其中所述持續(xù)的基因工程化T細胞群在施用后在所述對象中持續(xù)至少一個月。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述持續(xù)的基因工程化T細胞群在施用后在人中持續(xù)至少3個月 。
【文檔編號】A61P35/00GK103442768SQ201280013888
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月18日
【發(fā)明者】D·J·鮑威爾, G·聰孔斯 申請人:賓夕法尼亞大學(xué)董事會