凝血因子抑制劑的結(jié)合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在體外和/或體內(nèi)中和抗凝血?jiǎng)┑目鼓饔玫目乖Y(jié)合區(qū)、抗體、抗原結(jié)合抗體片段和抗體模擬物的鑒別和用途。本發(fā)明的抗體和功能片段以及抗體模擬物可用于特異性地逆轉(zhuǎn)抗凝血?jiǎng)├鏔Xa抑制劑的藥理作用，用于治療（解毒劑）和/或診斷目的。本發(fā)明還提供了編碼上述分子的核酸序列、含所述核酸序列的載體、藥物組合物和帶有使用說明的試劑盒。
【專利說明】凝血因子抑制劑的結(jié)合蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及與凝血因子的治療性抑制劑相互作用并且中和所述凝血因子的治療性抑制劑的抗原結(jié)合區(qū)、抗體、抗原結(jié)合抗體片段和抗體模擬物的鑒別和用途。
[0002]本發(fā)明的抗體模擬物、抗體和功能片段可用于特異性地逆轉(zhuǎn)(reverse)例如FXa抑制劑的藥理作用，用于治療(解毒劑)和/或診斷目的。本發(fā)明還提供了編碼上述分子的核酸序列、含有所述核酸序列的載體、藥物組合物和帶有使用說明的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003]對(duì)抗凝血藥物的通常限制是與治療有關(guān)的出血風(fēng)險(xiǎn)和在緊急情況下受限的快速逆轉(zhuǎn)其活性的能力。雖然新出現(xiàn)的抗凝血?jiǎng)├ド嘲?rivaroxaban)是一種具有被證實(shí)的耐受性和安全性的新藥，但是獲得可快速中和其作用的特異性試劑(解毒劑)在醫(yī)學(xué)上是有利的。在此，本發(fā)明人描述了可快速逆轉(zhuǎn)由FXa抑制劑(例如利伐沙班)誘導(dǎo)的抗凝作用從而起到選擇性解毒劑的作用的新的特異性抗體、抗原結(jié)合抗體片段和抗體模擬物。
[0004]血栓栓塞性疾病(thromboembolie disorder)例如深部靜脈血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)、中風(fēng)和心肌梗死是與心血管疾病有關(guān)的發(fā)病和死亡的主要原因。多年以來，通過抗凝血藥物如維生素K拮抗劑(VKA,例如華 法林(warfarin))、普通肝素(unfractionatedheparin, UFH)和低分子量肝素(LMWH)治療和預(yù)防高風(fēng)險(xiǎn)患者中的血栓栓塞是得到廣泛建立的醫(yī)療干預(yù)。然而，抗凝血?jiǎng)┑耐ǔＯ拗剖桥c治療有關(guān)的出血風(fēng)險(xiǎn)和在緊急情況下受限的快速逆轉(zhuǎn)其活性的能力。對(duì)于典型的抗凝劑，可使用某些解毒劑，如硫酸魚精蛋白(針對(duì)UHl和LMWH)和維生素K (針對(duì)VKA)。此外，可考將慮重組VIIa因子或血液制品作為非特異性的逆轉(zhuǎn)劑(reversal agent)。然而,對(duì)于新出現(xiàn)的口服抗凝血?jiǎng)?例如利伐沙班)，沒有可用的或處于臨床(cinical)開發(fā)中的特異性的解毒劑。在未來的數(shù)年中，這些新的抗凝血?jiǎng)?huì)變得越來越重要，并且針對(duì)所述新抗凝血?jiǎng)┲坏奶禺愋越舛緞┑拇嬖跁?huì)在緊急情況中提供醫(yī)療優(yōu)勢(shì)。
[0005]雖然可使用常規(guī)抗凝血?jiǎng)┤鏤FH、LMWH和VKA，但是仍存在對(duì)具有可預(yù)測(cè)的藥代動(dòng)力學(xué)、更好的治療窗口和方便的應(yīng)用的改良治療劑的強(qiáng)烈醫(yī)療需要。利伐沙班為一種新出現(xiàn)的可口服抗凝劑，其直接抑制凝血因子Xa (FXa) (Perzborn E.et al., Nat.Rev.Drug Discov.2011，10 (I):61-7)。FXa 代表凝血級(jí)聯(lián)(coagulation cascade)的關(guān)鍵酶,其通過從凝血酶原產(chǎn)生凝血酶而催化血塊形成。利伐沙班(化學(xué)名:5-氯-N-[[(5S)-2-氧代-3[4-(3-氧代嗎啉-4-基)苯基]-1,3-惡唑啉-5-基]甲基]噻吩-2-甲酰胺)具有436g/mol的分子量，劑量依賴性地抑制FXa (Ki為0.4nM)且其選擇性是對(duì)其他生物學(xué)上相關(guān)色氨酸蛋白酶的選擇性的10，000倍以上。其具有快速起效的作用(km為1.7X10/M-1s-D并可逆結(jié)合(Iitjff為5X10-3S-1)。利伐沙班還抑制結(jié)合的凝血酶原酶(IC5tl為2.1nM)和與FXa有關(guān)的凝結(jié)(IC5tl為75nM)，并在多種動(dòng)物模型中表現(xiàn)出對(duì)靜脈和動(dòng)脈血栓形成的劑量依賴性的抗凝活性。在臨床研究中，利伐沙班表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性情況，并且在非急需施行(elective)的髖或膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)之后可有效預(yù)防成人患者中的VTEo利伐沙班以商品名
【權(quán)利要求】
1.一種在體外和/或體內(nèi)中和抗凝血?jiǎng)┑目鼓钚缘姆蛛x的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物。
2.一種結(jié)合抗凝血?jiǎng)┑姆蛛x的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物。
3.一種結(jié)合抗凝血?jiǎng)┎⒃隗w外和/或體內(nèi)中和所述抗凝血?jiǎng)┑目鼓钚缘姆蛛x的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物，其中所述抗凝血?jiǎng)┚哂行∮?000Da的分子量。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物，其中所述抗凝血?jiǎng)橐蜃覺a抑制劑或凝血酶抑制劑。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物，其中所述FXa抑制劑為含一組式I的化合物、阿哌沙班、貝曲西班、雷扎沙班、依杜沙班、奧米沙班或YM-150或者其中所述凝血酶抑制劑為達(dá)比加群。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物，其中所述抗凝血?jiǎng)槔ド嘲唷?br> 8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體序列包含表1中抗體的可變重鏈CDR序列和可變輕鏈CDR序列。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，包含 由SEQ ID NO: 263 - 265表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 266 - 268表示的可變輕鏈CDR序列，或者 由SEQ ID NO: 251 - 253表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 254 - 256表示的可變輕鏈CDR序列，或者 由SEQ ID NO: 221 - 223表示的可變重鏈CDR序列和由SEQ ID NO: 224 - 226表示的可變輕鏈CDR序列。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體序列包含表I示出的抗體的可變重鏈序列和可變輕鏈序列。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，包含 由SEQ ID NO:489表示的重鏈片段序列和由SEQ ID N0:490表示的輕鏈序列，或者 由SEQ ID NO:217表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO:218表示的可變輕鏈序列，或者 由SEQ ID NO: 117表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO: 118表示的可變輕鏈序列，或者 由SEQ ID NO:207表示的可變重鏈序列和由SEQ ID NO:208表示的可變輕鏈序列，或者 由SEQ ID NO:493表示的重鏈片段序列和由SEQ ID NO:494表示的輕鏈序列。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物，其中所述抗體或抗體模擬物與權(quán)利要求8-11中的抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段的氨基酸序列與表1中示出的至少一個(gè)CDR序列至少50%、55%、60%70%、80%、90或95%相同，或者與表1示出的至少一個(gè)VH或VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。
14.權(quán)利要求12-13任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段的氨基酸序列與M18-G08-G的至少一個(gè)CDR序列至少50%、55%、60%70%、80%、90或95%相同，或者與 M18-G08-G 的 VH 或 VL 序列至少 50%、60%、70%、80%、90%、92% 或 95% 相同。
15.權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)重鏈CDR序列和/或至少一個(gè)輕鏈CDR序列，所述重鏈CDR序列符合共有序列 SEQ ID NO:497 或 SEQ ID NO:502 (CDR HI), SEQ ID NO:222 或 SEQ ID NO:503 (CDRH2)，或者SEQ ID NO:498或SEQ ID NO: 504 (CDR H3)，，所述輕鏈CDR序列符合共有序列SEQ ID N0:499 或 SEQ ID NO:505 (CDR LI),SEQ ID N0:500 或 SEQ ID NO:506 (CDR L2),或者 SEQ ID NO:501 或 SEQ ID NO:507 (CDR L3)。
16.權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段， a.其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含符合SEQID NO:497 (⑶R HI), SEQ IDNO:222 (CDR H2)和 SEQ ID NO:498 (CDR H3)的重鏈 CDR 序列，和符合 SEQ ID NO:499 (CDRLI)、SEQ ID NO: 500 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 501 (CDR L3)的輕鏈 CDR 序列，或者 b.其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含符合SEQID N0:502(CDR HI),SEQ ID NO:503(CDR H2)和 SEQ ID NO:504 (CDR H3)的重鏈 CDR 序列，和符合 SEQ ID NO:505 (CDR LI)、SEQ ID NO: 506 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 507 (CDR L3)的輕鏈 CDR 序列。
17.權(quán)利要求12-16的抗體或抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含表1示出的至少一個(gè)⑶R序列或者至少一個(gè)可變重鏈或輕鏈序列。
18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗原結(jié)合片段，其中所述片段為Fab片段。
19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或片段是單克隆的。
20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或片段為人的、人源化的或嵌合的。
21.一種分離的多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1-20的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物。
22.—種載體,其包含權(quán)利要求20的多核苷酸。
23.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求21的多核苷酸序列或權(quán)利要求22的載體。
24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為酵母或大腸桿菌細(xì)胞。
26.—種通過以下方式來產(chǎn)生權(quán)利要求1-20的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物的方法，即培養(yǎng)權(quán)利要求24所述的宿主細(xì)胞和分離所述抗體或片段或抗體模擬物。
27.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-20的抗體或其抗原結(jié)合片段，或者抗體模擬物。
28.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求7-20抗體或其抗原結(jié)合片段，或者抗體模擬物。
29.權(quán)利要求1-20的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物用作藥物。
30.權(quán)利要求1-20的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物用作用于使由所述抗凝血?jiǎng)┱T導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正常化的藥物。`
31.權(quán)利要求1-20的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物用作用于使由所述FXa抑制劑誘導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正?；乃幬?。
32.權(quán)利要求1-20的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物用作用于使由含一組式I的化合物誘導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正常化的藥物。
33.權(quán)利要求7-20的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物用作用于使由利伐沙班誘導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正常化的藥物。
34.一種治療方法，其使用權(quán)利要求27的藥物組合物使由抗凝血?jiǎng)┱T導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正?；?。
35.一種治療方法，其使用權(quán)利要求27的藥物組合物使由FXa抑制劑誘導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正?；?。
36.一種治療方法，其使用權(quán)利要求27的藥物組合物使由含一組式I的化合物誘導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正?；?br> 37.一種治療方法，其使用權(quán)利要求28的藥物組合物使由利伐沙班誘導(dǎo)的抗凝狀態(tài)正常化。
38.實(shí)施例1K或?qū)嵤├?L的化合物。
39.權(quán)利要求38的化合物用于分離或檢測(cè)抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物的用途。
40.一種診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求38的化合物和/或權(quán)利要求1-20的抗體或其抗原結(jié)合片段。
41.權(quán)利要求1-20的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體模擬物用作用于在體外和/或體內(nèi)診斷測(cè)定法中定性和/或定量確 定抗凝血?jiǎng)┑脑\斷試劑。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK103619883SQ201280014817
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月19日
【發(fā)明者】F·迪特默, A·布奇穆勒, C·格德斯, A·特爾斯迪根, M·J·格諾斯, L·林登, A·哈倫加, J·格魯?shù)陆鹚箍?高寶, M·杰斯科, M·沙弗爾, J·博肯費(fèi)爾德, H·鮑爾森, R·芬納恩, A·邁耶-巴奇米德, A·?？藸? S·格利文, S·斯泰尼格 申請(qǐng)人:拜耳知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限責(zé)任公司