包括d-普萘洛爾和其類似物的磷脂酸磷酸水解酶（pap）的抑制劑，單獨(dú)或與地昔帕明組合 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了可抑制磷脂酸磷酸水解酶（PAP）的化合物及它們的組合用于配制可用于治療癌癥的藥物的用途；PAP抑制劑可以用于阻斷依賴于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、其致癌變體和ErbB家族的其他成員的癌癥的發(fā)展，這是通過誘導(dǎo)其胞吞作用并因此使得它們不能接觸可促進(jìn)癌癥存活和發(fā)展的刺激而進(jìn)行；作為本發(fā)明一部分的PAP抑制劑包括這樣的藥物：其目前用于其他臨床目的，并且除了是陽離子兩親性分子外，它們是不相關(guān)的；這些包括普萘洛爾、地昔帕明和氯丙嗪，用于其他臨床目的的藥物；本發(fā)明包括所有PAP抑制劑，包括鞘氨醇和溴烯醇內(nèi)酯以及任何在未來可能發(fā)現(xiàn)的新抑制劑。
【專利說明】包括D-普萘洛爾和其類似物的磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的抑制劑，單獨(dú)或與地昔帕明組合用于治療依賴于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、其致癌變體和ERBB/HER家族其他成員的癌癥
[0001]本發(fā)明描述了抑制磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的化合物及其組合用于配制用于癌癥治療的藥物的用途。
[0002]本發(fā)明提出使用PAP抑制劑以阻斷癌癥的發(fā)展，所述癌癥依賴于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、其致癌變體和ErbB家族的其他成員，通過誘導(dǎo)它們的胞吞作用，從而使得它們不能接觸可促進(jìn)癌癥維持和發(fā)展的細(xì)胞外刺激。
[0003]作為本發(fā)明一部分的PAP抑制劑是當(dāng)前在臨床上用于其他目的的藥物，除了都對(duì)應(yīng)于兩親性陽離子分子以外，它們是不相關(guān)的。這些包括普萘洛爾(propranolol)、地昔帕明(desipramine)和氯丙嗪，當(dāng)前用于其他臨床目的的藥物。本發(fā)明包括了所有已知的PAP抑制劑，包括鞘氨醇和溴烯醇內(nèi)酯。
[0004]本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)例對(duì)應(yīng)于D-普萘洛爾，單獨(dú)使用或與地昔帕明組合使用。D-普萘洛爾是用于治療高血壓和其他病狀的與L-普萘洛爾的外消旋混合物的一部分。但是，僅L-普萘洛爾具有作為β -腎上腺素能受體的阻斷劑(β -阻斷劑)的活性，其產(chǎn)生抗高血壓作用。本發(fā)明中包括的D-普萘洛爾沒有β-阻斷劑活性。
[0005]本發(fā)明證明了，D-普萘洛爾與地昔帕明的組合可用于抑制依賴于EGFR或其致癌變體(例如EGFRvIII)的癌癥的發(fā)展。
[0006]因此，本發(fā)明提供了用于其他臨床目的的已知藥物的第二用途，還包括任何其他種類的PAP抑制劑，例如 缺乏β_阻斷劑活性的普萘洛爾的類似物。PAP的任何抑制劑可以單獨(dú)使用，或者與其他PAP抑制劑或具有不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物(包括激素、抗體和用于化療的藥物)組合使用。
[0007]本發(fā)明的PAP抑制劑還可與其他種類的治療(包括外科手術(shù)和放射療法)組合使用，同時(shí)地或在其之后。這些化合物不僅作為化療或直接定向阻斷EGFR及其致癌變體的藥物的補(bǔ)充劑，還可在癌細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)當(dāng)前用于抗EGFR的藥物的抗性時(shí)作為唯一可用的治療。
[0008]本發(fā)明開辟了治療癌癥的新的可能性，所述癌癥例如頭頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)EGFR的致癌性改變(過表達(dá)或突變)或其家族成員ErbB2/Neu。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0009]本發(fā)明包括如下領(lǐng)域:
[0010]I)癌細(xì)胞生物學(xué)，其在癌癥的致病性中是決定性的，經(jīng)常涉及EGFR及其酪氨酸激酶受體(ErbB/HER)家族的成員的致癌信號(hào)傳導(dǎo)功能。這種改變?cè)鰪?qiáng)了腫瘤細(xì)胞的進(jìn)攻性和惡性并且對(duì)于它們的生長(zhǎng)、生存和發(fā)展也是關(guān)鍵的，從而為設(shè)計(jì)新的抗癌策略提供了有效的靶點(diǎn)，如本發(fā)明所提出的；[0011]2)胞吞運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)，其在EGFR及其ErbB/HERl-4家族的其他成員的正常和致病功能中起關(guān)鍵作用；
[0012]3)PA/PKA (磷脂酸/蛋白激酶A)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的功能，其幾乎是未知的，直到出現(xiàn)本發(fā)明的論證，其涉及調(diào)節(jié)EGFR對(duì)外部刺激的可及性。PA/PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的這種新功能組成本發(fā)明的基礎(chǔ)。
[0013]4)PAP抑制劑用于治療癌癥的用途。這在以前沒有提出過。
[0014]5)已知的并且已經(jīng)基于不用于PAP抑制的作用機(jī)制用于其他臨床目的的藥物的第二用途。例如，普萘洛爾是L-普萘洛爾和D-普萘洛爾的外消旋混合物，其中僅L-普萘洛爾是β_腎上腺素能受體的非選擇性阻斷劑并具有治療高血壓、心律失常等的效果。另一個(gè)實(shí)例是地昔帕明，其當(dāng)前用作去甲腎上腺素重捕獲的阻斷劑和毒蕈堿膽堿能受體的抑制劑，被開處方用于抗抑郁治療。
[0015]本發(fā)明的基礎(chǔ)在于所有這些領(lǐng)域的相互關(guān)系，并歸因于最近的發(fā)現(xiàn)，所述最近的發(fā)現(xiàn)是關(guān)于ΡΑ/ΡΚΑ信號(hào)傳導(dǎo)途徑的新功能以及EGFR的細(xì)胞表面水平的新調(diào)節(jié)機(jī)制，其對(duì)用于誘導(dǎo)EGFR胞吞作用的藥理操作是敏感的，從而使所述受體不能被其外部刺激激活。
[0016]因此本發(fā)明在于，PAP抑制劑(例如D-普萘洛爾和地昔帕明，原來不是設(shè)計(jì)用于所述目的的藥物)可潛在地用于設(shè)計(jì)新的抗癌治療。這種策略之前沒有用過。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0018]本發(fā)明提出了一種與當(dāng)前用于干涉EGFR依賴性癌癥的發(fā)展的那些策略不同的策略。當(dāng)前使用的藥物和那些處在設(shè)計(jì)階段的藥物都是針對(duì)EGFR分子，試圖阻斷其與外部配體的相互作用或其細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，其為致癌信號(hào)的產(chǎn)生者。相比之下，本發(fā)明提出的化合物并不使用EGF R分子為直接靶點(diǎn)，而是以調(diào)節(jié)其細(xì)胞表面可及性的分子為靶點(diǎn)。
[0019]這適合當(dāng)前靶向治療的趨勢(shì)，所述靶向治療主要涉及消除癌細(xì)胞中改變的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本發(fā)明提出阻斷PAP活性，以此作為通過誘導(dǎo)胞吞作用從細(xì)胞表面除去EGFR的策略。
[0020]另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具有PAP抑制能力的已知結(jié)構(gòu)的幾種分子的可用性，因此其可作為模型用于產(chǎn)生新的抗癌類似物家族，引入之前未用于該目的的作用機(jī)制的。
[0021]一個(gè)另外的重要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)不同類型癌癥的治療的選擇性，其中本發(fā)明使用了涉及以EGFR的致癌功能作為靶點(diǎn)的特定方法。這提供了根據(jù)腫瘤中存在的分子損害來使所述治療個(gè)性化的機(jī)會(huì)，對(duì)所述分子損害的分析是已知的并可使得人們能夠優(yōu)化本發(fā)明的化合物在癌癥中的應(yīng)用以具有更高的反應(yīng)概率。將應(yīng)用限制到呈現(xiàn)出EGFR的致癌性改變的癌癥，具有明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。
[0022]最后，本發(fā)明的化合物作用于不直接參與致癌作用的分子的事實(shí)，可延遲或避免形成對(duì)所述治療的抗性——這對(duì)于直接靶向致癌激酶的藥物是很常見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:普萘洛爾和地昔帕明在所培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)EGFR的胞吞作用。該圖像示出了 HeLa對(duì)照細(xì)胞中EGFR的免疫熒光圖案，以及給予75 μ M普萘洛爾或75 μ M地昔帕明、50 μ M美托洛爾(metoprolol)和50 μ M噻嗎洛爾(timolol)時(shí)的圖案。[0024]圖2:對(duì)映異構(gòu)體L-和D-普萘洛爾以及地昔帕明降低了 EGFR的細(xì)胞表面可及性(通過放射性配體結(jié)合評(píng)估)。A.L-和D-普萘洛爾；B.地昔帕明；C.不同濃度的D-普萘洛爾(上面刻度)與地昔帕明(下面刻度)的組合；D.D-普萘洛爾和地昔帕明的EC5tl的組合。
[0025]圖3:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87以及被轉(zhuǎn)染以過表達(dá)致癌突變體EGFRvIII的U87(U87-EGFRvIII)作為具有不同增殖速率的腫瘤模型。
[0026]圖4:作為不連續(xù)治療加入的D-普萘洛爾和地昔帕明對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87和U87-EGFRvIII以及非腫瘤上皮細(xì)胞MDCK的生存力的作用。
[0027]圖5:在過表達(dá)EGFR的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBMl)的原代培養(yǎng)物中，使用低濃度的D-普萘洛爾(Prop)和地昔帕明(Des)的連續(xù)治療選擇性地抑制U87-EGFRvIII和腫瘤細(xì)胞的過度增殖(D-普萘洛爾(Prop)、地昔帕明(Des)或這兩種藥物的組合)。
[0028]圖6:在來自患有過表達(dá)EGFR的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM1)的患者的原代培養(yǎng)物中，使用兩種濃度(10和30 μ Μ，與心律失常的患者血液中發(fā)現(xiàn)的接近)的D-普萘洛爾(單獨(dú)使用或與I μ M地昔帕明組合使用)進(jìn)行的連續(xù)治療，選擇性地抑制不同癌細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞的增殖(D-普萘洛爾(Prop)、地昔帕明(Des)或這兩種藥物的組合)。
[0029]圖7:用于EGFR-依賴性癌癥的新治療策略，其基于D-普萘洛爾和地昔帕明的作用。
【背景技術(shù)】
[0030]作為健康問題的癌癥
[0031]癌癥包括一組由異常細(xì)胞的不受控制的侵襲性生長(zhǎng)造成的疾病，在沒有有效的治療的情況下其可以在相對(duì)短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致患者死亡(〈12個(gè)月或在最惡性的病例中甚至在5-9個(gè)月內(nèi))。因此，癌癥因其頻率和死亡率成為世界上嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
[0032]女性最常見的癌癥為乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌和肺癌，而男性中最常見的癌癥為肺癌、前列腺癌、胃癌和結(jié)腸直腸癌(1、2)。作為一種死亡原因,癌癥在世界上占據(jù)心血管疾病和傳染病之后的第三位，但僅考慮發(fā)達(dá)國(guó)家時(shí)其通常為第二大死亡原因(1、2)。在2002年當(dāng)年患有某種癌癥的2460萬患病病例中，有1090萬新病例和670萬例死亡(3796000例男性，2928000例女性)(I)。其中導(dǎo)致最多死亡的癌癥為肺癌(1179000例死亡)、胃癌(700000 )、肝癌(598000 )和結(jié)腸直腸癌(528000 )，5年存活率低于20%的惡性程度最聞的癌癥為肺癌、食管癌、胃癌、肝癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(1-3)。
[0033]在智利癌癥患者的發(fā)病率和存活率無法準(zhǔn)確知道。每年有近350000例住院并發(fā)生約140萬例癌癥死亡。在過去的40年里，死亡率已經(jīng)從每100000名居民中86例增加至123例(截至2000年)，估計(jì)每年有36500例新病例(MINSAL, 2005; (4)。
[0034]當(dāng)前治療通常不能有效對(duì)抗高度惡性的晚期癌癥
[0035]癌癥治療包括切除手術(shù)、輻射、化療、激素療法、生物療法和靶向療法，靶向療法產(chǎn)生了治療高致死率癌癥的新的期望，并且對(duì)化療的反應(yīng)相對(duì)較低。癌癥是全世界一個(gè)主要死亡原因，反映了現(xiàn)有治療對(duì)惡性及較晚期的病例效能較低。每年診斷出多于1000萬病例并且約600萬人死于此病。由于人口增加、預(yù)期壽命延長(zhǎng)(暗示著老齡化)和更多地暴露于風(fēng)險(xiǎn)因素，這些數(shù)字在未來會(huì)逐漸地增加。估計(jì)在接下來20年中新病例的數(shù)目甚至可增加50%，到2020年達(dá)到1500萬。在工業(yè)化國(guó)家中四分之一的人會(huì)死于癌癥(2、5)。[0036]新的抗癌藥物可以增加一些癌癥中的反應(yīng)率和總體存活率，但是仍然有多種癌癥維持高水平的惡性和死亡率。癌癥例如肺癌、胃癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其5年存活率低于20%且在診斷后9個(gè)月內(nèi)具有較高死亡率，明顯需要新的治療策略。
[0037]肺癌
[0038]全部癌癥死亡中的約30%是由于肺癌——世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因(6)。約90%的肺癌是由于影響世界上約13億人的吸煙，其每年殺死約500萬年齡為30歲以上的人(7)。在智利，肺癌在男性(100000名居民中25.3對(duì)比17)和女性(100000名居民中
13.8對(duì)比7.4)中的發(fā)病率均低于胃癌，并且在女性中低于膽道癌(100000名居民中17.1對(duì)比 7.4) (4)。
[0039]非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是具有高死亡風(fēng)險(xiǎn)的晚期惡性腫瘤之一。如果不進(jìn)行治療，患有NSCLC和有轉(zhuǎn)移灶的患者的中位生存期為4-5個(gè)月。僅10%的患者能活過I年。對(duì)于晚期或轉(zhuǎn)移的NSCLC,標(biāo)準(zhǔn)的第一線治療是基于化療與二鉬復(fù)合物(platinum-duplex)的組合，其使中位生存期增加至8-11個(gè)月，一年生存率增加至約30%，兩年生存率增加至約14-20% (8)。
[0040]胃癌
[0041]胃癌是最常見的上皮衍生癌癥之一(9)。其發(fā)病率在過去的50年里一直在下降，但其發(fā)病頻率仍然位居第四，作為死亡原因之一排在肺癌后位居第二，并且在性別和種群之間有顯著差異。每年診斷出約100萬新病例，并且有約800000人死于該原因。在智利，胃癌發(fā)病率在男性中排名第一 ，比例為每100000名居民中25.3 ;在女性中排在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤之后位居第二，比例為每100000名居民13.8(4，10)。在最近這些年，智利每年的胃癌死亡率保持穩(wěn)定，在2003年達(dá)到3115例死亡(11)。具有原位癌(localized cancer)的患者的5年存活率接近60%，然而具有轉(zhuǎn)移灶的患者的僅為2% (12)。在晚期疾病的情況中，如果不進(jìn)行治療，中位生存期低于12個(gè)月(經(jīng)常僅5.4個(gè)月)。新的化療方式已經(jīng)不能使中位生存期更低，所述中位生存期在過去的10-20年里基本沒有改變。對(duì)于這種癌癥沒有已確立的化學(xué)療法(13-15)。
[0042]膠質(zhì)母細(xì)胞瘤:
[0043]“膠質(zhì)瘤”包括所有被假定具有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞起源的腫瘤，并且它們是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的腫瘤。III級(jí)(間變性星形細(xì)胞瘤)和IV級(jí)(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)被認(rèn)為是惡性膠質(zhì)瘤(3)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有每年3/100，000人的頻率，它們屬于所有人類癌癥中最致命的腫瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期在數(shù)十年中一直維持在約9-12個(gè)月。65歲以上的患者僅2%并且45歲以下患者中30%可以生存2年，然而約75%在診斷后18個(gè)月死亡(16、17)。侵襲性特征和對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療(包括放療和化療)的弱反應(yīng)造成了差的預(yù)后(18)。目前的放療并同時(shí)給予替莫唑胺(temozolomide),然后給予輔藥替莫唑胺的治療,使12.1個(gè)月的中位生存期增加至僅14.6個(gè)月(19)。在智利，Lorenzoni et al (20)證明了患者的存活率與在其他具有更尖端的診斷和外科系統(tǒng)以及最好的現(xiàn)代技術(shù)的國(guó)家中報(bào)告的存活率沒有不同。因此，獲得更好的治療結(jié)果的可能性不依賴于診斷或外科能力。
[0044]使用特定分子靶點(diǎn)的癌癥治療
[0045]細(xì)胞和分子水平上對(duì)癌癥的知識(shí)的增加開辟了新的治療預(yù)期，其定位于特定分子靶點(diǎn)并根據(jù)致癌病變將所述方法個(gè)性化。[0046]癌細(xì)胞源自遺傳損傷，獲得了偏離正常細(xì)胞行為的新性質(zhì)。通常，三種類型基因的變化可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生:(i)致癌基因，(ii)腫瘤抑制基因；和(iii)涉及遺傳穩(wěn)定性的基因(21、22)。這些基因中的改變導(dǎo)致獲得惡性表型，所述惡性表型的特征在于以下異常性質(zhì):1)增殖信號(hào)的自給自足；2)對(duì)抗增殖信號(hào)不敏感；3)避免程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)；4)無限的復(fù)制潛能；5)持續(xù)的血管發(fā)生；6)組織侵入和轉(zhuǎn)移(22)。
[0047]盡管有所有這些異常性質(zhì)，癌細(xì)胞確實(shí)“依賴”于特定的內(nèi)部信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的高活性。幸運(yùn)的是，這可用于使用藥物對(duì)抗其惡性，所述藥物被特別設(shè)計(jì)以抑制對(duì)應(yīng)的高活性網(wǎng)絡(luò)(23-26)?？梢宰钚〉睦^發(fā)效應(yīng)獲得最大的益處，只要每種腫瘤中支持所述高活性信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的改變的基因易于被鑒定(27)。對(duì)于某些關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑來說，遺傳病變的鑒定是相對(duì)先進(jìn)的，因此允許個(gè)性化對(duì)特定靶點(diǎn)的藥物使用，無論是作為第一線還是與化療組合(28)。
[0048]現(xiàn)在的趨勢(shì)和廣泛共識(shí)是需要基于對(duì)關(guān)鍵遺傳病變，以及將癌細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開的經(jīng)常改變的分子和生化過程的知識(shí)，使癌癥治療個(gè)性化(21) (22)。
[0049]激酶作為直接治療的通常靶點(diǎn)
[0050]大多數(shù)的治療是靶向在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的蛋白激酶。
[0051]因其在腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、遷移和轉(zhuǎn)移過程中的重要性而被識(shí)別的獲得最多研究的分子當(dāng)然是具有使絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基磷酸化的蛋白激酶活性的酶。這些酶及其直接的調(diào)節(jié)子是導(dǎo)致腫瘤的基因(癌基因)或抑制腫瘤的基因(抗癌基因)，所述基因在大多數(shù)癌癥中經(jīng)常被突變(29)。實(shí)例包括致癌基因分子PI3KCA、EGFR和B-RAF;激活PI3K和Raf的Ras致癌基因家族；以及抑制PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的腫瘤抑制子PTEN (29)。
[0052]激酶抑制劑已經(jīng)改善了對(duì)所選擇組的癌癥的治療，但是抗激酶藥物尚未顯示出對(duì)致死率癌癥的預(yù)期效能(29)。此外，開始時(shí)受益亞組通常會(huì)在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)。腫瘤細(xì)胞由于使其具有抗性的分子靶中的消除突變而逃脫激酶抑制劑的作用。因此需要尋找其他的不同于直接抑制所述酶本身的策略。
[0053]EGFR 激酶
[0054]EGFR是控制著在惡性腫瘤表型的形成和維持中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞過程的酪氨酸激酶的范例。
[0055]EGFR 是由 HERl/EGFR/ErBBl/、HER2/Neu/ErBB2、HER3/ErBB3 和 HER4/ErBB4 組成的受體酪氨酸激酶家族的成員。這些受體跨膜一次，并因此展示出與配體相互作用的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和載有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(30)。其主要位于質(zhì)膜內(nèi)，在此其在與特異性配體刺激物相互作用時(shí)被激活，這首先導(dǎo)致其二聚化，然后是其細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶的激活。
[0056]因此起始了調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生存和遷移過程的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，這些途徑全部涉及腫瘤發(fā)生。EGFR是這些過程的最普遍的受體調(diào)節(jié)劑之一，并可被至少七個(gè)不同配體(包括EGF、HB-EGF和經(jīng)常由腫瘤細(xì)胞分泌的腫瘤生長(zhǎng)因子a (TGF-α ))激活(31 )。EGFR還被多種其他受體(特別是與GTP酶偶聯(lián)的受體)的刺激物反式激活(trans-activated) (32)。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)揭示，一個(gè)由包括ATP的核苷酸組成的非常普遍存在的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，和P2Y1受體能夠反式激活EGFR (33)。
[0057]因此，EGFR功能必須處在嚴(yán)格的控制系統(tǒng)之下，這些系統(tǒng)失效或所述受體自身改變可確定夸大的信號(hào)并且導(dǎo)致或伴隨有可產(chǎn)生并支持癌細(xì)胞的細(xì)胞致癌性轉(zhuǎn)化(23，30)。[0058]這些受體主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞表面，在此它們接受并編譯(interpret)調(diào)節(jié)增殖、遷移和細(xì)胞生存過程的刺激；所有這些在癌癥的發(fā)病機(jī)制中都是關(guān)鍵的。因此，能夠誘發(fā)從細(xì)胞表面向細(xì)胞內(nèi)小室的受體內(nèi)攝的藥物將通過改變其位置阻止其與外界刺激的相互作用以及致癌信號(hào)傳導(dǎo)。在這些條件下，來源自活化EGFR的信號(hào)會(huì)被改變，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性。
[0059]EGFR功能的改變
[0060]EGFR的功能改變是頻繁的并且在多種實(shí)體癌的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。
[0061]考慮到許多實(shí)體癌中該EGFR受體有改變的且致癌的功能，EGFR已經(jīng)是作為新一代的抗癌藥物靶點(diǎn)而被研究最多且最有前景的分子之一(34) (27) (35)。最頻繁的改變包括過表達(dá)(36、37)或源自基因重排或特定氨基酸的替換的突變(38-40)。當(dāng)EGFR的功能因過表達(dá)或激活的突變而被改變時(shí)，向細(xì)胞內(nèi)發(fā)出的信號(hào)被夸大，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的形成、維持和侵襲(34)。
[0062]差不多40-50%的實(shí)體瘤依賴于由遺傳改變決定的EGFR酪氨酸激酶的活性劇增。EGFR遺傳改變的詳細(xì)列舉包括:(i)導(dǎo)致所述蛋白過表達(dá)的EGFR基因拷貝數(shù)目的增加。膠質(zhì)瘤和肺腫瘤經(jīng)常顯示出這種基因擴(kuò)增(36、37)。但是如在胃癌中觀察到的，存在其他沒有基因擴(kuò)增的未知的EGFR過表達(dá)機(jī)制(13、14)。EGFR過表達(dá)通常與較高的惡性有關(guān)；(ii)產(chǎn)生高活性EGFR的突變；a)通過刪除產(chǎn)生的EGFRvIII突變體缺少符合所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外區(qū)域，這在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中是最重要的(40) ；b)其中亮氨酸858被替換為精氨酸的EGFR185*?突變體以及除去了保守性序列LREA的缺失了外顯子19的EGFRme746_A75°突變體，兩種突變都影響所述受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(EGFRTKDmut)，并可見于10-15%的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中(38、39)。
[0063]認(rèn)為腫瘤細(xì)胞確實(shí)依賴于由EGFR發(fā)出的夸大的信號(hào)(致癌性的)。通過抑制這種活性，癌細(xì)胞受到比正常細(xì)胞更多的損害。因此干擾EGFR的這種致癌功能已經(jīng)成為開發(fā)直接針對(duì)特定靶點(diǎn)的新的藥物和抗腫瘤治療策略的范例(24、41)。通過相對(duì)簡(jiǎn)單的分析來檢測(cè)EGFR中的致癌變化，可以個(gè)性化這些治療。其可以優(yōu)化治療反應(yīng)。
[0064]當(dāng)前使用的針對(duì)EGFR的用于治療某些癌癥的藥物
[0065]在20世紀(jì)80年代開發(fā)的被FDA批準(zhǔn)的首批抗EGFR藥物包括兩種類型的拮抗劑
(35): (i)抑制配體結(jié)合的針對(duì)EGFR細(xì)胞外區(qū)域的單克隆抗體(西妥昔單抗(Cetuximab)和帕尼單抗(Panitumumab))。西妥昔單抗(erbitux ;Merk KGaA, Darmstad, Germany ；W02009099649)是以高親和力結(jié)合EGFR并競(jìng)爭(zhēng)性阻斷配體結(jié)合的人源化單克隆抗體。其還誘導(dǎo)EGFR的胞吞作用和負(fù)調(diào)控。其主要用于治療表達(dá)EGFR的晚期結(jié)腸直腸癌(42、43) ；(ii)抑制EGFR的酪氨酸激酶的小分子，例如埃羅替尼(Erlotinib)和吉非替尼(Gefitinib) (35) (W003103676和W02005117887)。這些藥物與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，從而抑制EGFR底物的磷酸化，所述磷酸化對(duì)于起始促進(jìn)過度增殖的信號(hào)級(jí)聯(lián)是至關(guān)重要的。酪氨酸激酶抑制劑可用于治療轉(zhuǎn)移性的NSCLC和結(jié)腸癌、頭頸癌以及胰腺癌(28、35)。
[0066]抑制EGFR功能的抗腫瘤藥物的其他專利包括W003097855、US5795898。
[0067]EGFR作為個(gè)性化治療的靶點(diǎn)
[0068]因?yàn)镋GFR是控制惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組成部分(23、30)，其已經(jīng)成為用于個(gè)性化的和定向的癌癥治療的研究最多且最優(yōu)選的靶點(diǎn)之一(35)。具有陽性結(jié)果的基于遺傳病變的個(gè)性化治療中兩個(gè)最顯著的實(shí)例為NSCLC和結(jié)腸癌，其中對(duì)EGFR致癌突變的分析幫助決定是否可便利地使用酪氨酸激酶抑制劑(44-46)。
[0069]在NSCLC中，僅10-20%的患者對(duì)埃羅替尼或吉非替尼有反應(yīng)，顯著改善了總體存活率、無進(jìn)展生存期、癥狀和生活質(zhì)量(47、48)?？笶GFR抗體西妥昔單抗不太有效(49)。對(duì)埃羅替尼或吉非替尼有反應(yīng)的患者亞群所患有的腫瘤在EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中帶有突變，所述突變不僅提供了致癌性質(zhì)還使所述受體對(duì)所述藥物敏感(39、50、51)。對(duì)埃羅替尼和吉非替尼治療敏感的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變(EGFR?mut)中接近90%具有第858位的亮氨酸被替換為精氨酸的置換α858Κ;Ε6Ρ#858Κ)，或具有消除了保守序列LREA的外顯子19中的缺失(delE746-A750;EGFRDel) (39)。這些突變似乎組成型地激活EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，并增加其對(duì)埃羅替尼和吉非替尼的親和力，這可以解釋為對(duì)所述治療有超敏感性
(39)。這些患者具有接近80-90%的反應(yīng)率、約80%的一年存活率和可達(dá)28個(gè)月的中位生存期(44、45、52-54)。因此這些EGFRTKI)mut突變的典型化(typification)使得能夠進(jìn)行有效的個(gè)性化治療。
[0070]可用的抗EGFR藥物的限制
[0071]目前對(duì)抗EGFR的致癌功能的藥物的主要限制是相對(duì)低的效能(因?yàn)楹艽蟊壤环磻?yīng))和開始時(shí)敏感的腫瘤產(chǎn)生抗性。
[0072]已有證據(jù)顯示EGFR是有前景的抗腫瘤祀點(diǎn)，但是使用當(dāng)前使用的藥物時(shí)有嚴(yán)重的限制性，這激勵(lì)著研究用于干擾其功能的新的和補(bǔ)充性的策略(27、28)。
[0073]例如，對(duì)于那些患有不帶對(duì)埃羅替尼或吉非替尼敏感的EGFR突變的NSCLC的患者(占了病例的差不多85-90%)，沒有什么可為他們提供的。這也適用于其他對(duì)這類抑制劑不反應(yīng)的癌癥。此外，經(jīng)常 觀察到，甚至在那些開始時(shí)對(duì)埃羅替尼或吉非替尼有反應(yīng)的敏感患者中，腫瘤生長(zhǎng)會(huì)在6個(gè)月到2年的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)。幾乎50%的這些耐藥腫瘤展示出第二突變——將酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的甲硫氨酸790替換為蘇氨酸，這阻斷了所述藥物與ATP結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。最近的研究報(bào)道了新的藥物，其目前抑制EGFR T790M突變體(55)。但是，對(duì)所述新藥物產(chǎn)生抗性的可能性仍然存在，因?yàn)檫@是激酶抑制劑的常見問題(29)。另一方面，仍有另50%的病例產(chǎn)生了抗性但是沒有所述T790M突變，其中的機(jī)制仍然未知(56-58)。
[0074]總之，所述證據(jù)使得可以這樣推斷，EGFR是設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物的好的靶點(diǎn)，但必須找到不同于已經(jīng)在用的那些機(jī)制的替代機(jī)制以阻斷其致癌功能，這依靠配體結(jié)合或酪氨酸激酶活性的阻斷劑(35)。
[0075]EGFR功能中的胞吞作用途徑及作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)
[0076]胞吞作用途徑在控制EGFR功能的多種機(jī)制中占有大的優(yōu)勢(shì)。配體結(jié)合誘導(dǎo)EGFR的快速胞吞。一旦被內(nèi)化(internalized)，激活的受體可以再循環(huán)或進(jìn)入溶酶體降解途徑，從而在降解前有可變的和受控的信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)間(59、60)。因此，胞吞作用為減弱并隔開EGFR信號(hào)傳導(dǎo)提供了受控的機(jī)制。因?yàn)檫@種重要作用，胞吞作用為旨在設(shè)計(jì)新的癌癥療法的針對(duì)EGFR功能的藥物介入提供了好機(jī)會(huì)。事實(shí)上，基于單克隆抗體的治療的抗腫瘤效果中的至少一部分被認(rèn)為是依賴于對(duì)EGFR胞吞作用的誘導(dǎo)(61 )。但是，導(dǎo)致EGFR被從細(xì)胞表面除去的對(duì)EGFR胞吞作用的誘導(dǎo)之前沒有被用作替代抗體小分子藥物(small drug)的抗腫瘤策略，抗體經(jīng)常在接觸腫瘤內(nèi)的癌細(xì)胞方面受到限制(61)。
[0077]本發(fā)明人最近描述了控制EGFR胞吞作用的新機(jī)制，其包括下調(diào)蛋白激酶A的磷脂酸磷酸水解酶(PAP)酶活性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑(PA/PKA途徑)。該機(jī)制可被對(duì)PAP的藥理性抑制所觸發(fā)，因?yàn)樵撁笇A水解為甘油二酯。由對(duì)降解cAMP的磷酸二酯酶的PA依賴性激活所導(dǎo)致的PKA活性降低，是在利用PAP的小分子藥物抑制劑誘導(dǎo)EGFR胞吞作用時(shí)的關(guān)鍵步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0078]本發(fā)明描述了使用D-普萘洛爾(單獨(dú)地或與地昔帕明組合地)抑制PAP作為新的策略，以阻斷依賴于EGFR或其致癌變體的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這是通過誘導(dǎo)胞吞作用來介導(dǎo)的。
[0079]雖然文獻(xiàn)中有普萘洛爾在癌癥中的作用的研究，但是它們都是基于其β -阻斷劑活性，并且基于這樣的假設(shè)和相當(dāng)有爭(zhēng)議的觀點(diǎn)，即應(yīng)激促進(jìn)表達(dá)β -腎上腺素能受體的癌細(xì)胞中的腫瘤發(fā)生。普萘洛爾(其表示D和L-普萘洛爾的外消旋混合物)已被用作β-阻斷劑(即注重于其有效成分為L(zhǎng)-普萘洛爾而不是D-普萘洛爾)，用于實(shí)驗(yàn)性地弱化表達(dá)β-腎上腺素能受體的癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在這些實(shí)驗(yàn)中，普萘洛爾僅阻止β_腎上腺素能刺激，所述刺激被假定可促進(jìn)在模仿應(yīng)激狀態(tài)下的腫瘤發(fā)生，這是相當(dāng)有爭(zhēng)議的觀點(diǎn)(62、63)。國(guó)際公開文本W(wǎng)02006/017185描述了幾種在體外展示出抗增殖作用的化合物，其中提到了地昔帕明。但是，該公開文本沒有提到任何利用地昔帕明使所述作用最佳化的機(jī)制。另一方面，國(guó)際公開文本W(wǎng)02008/112297描述了酸性鞘磷脂酶的抑制劑，其中地昔帕明似乎作為類似的化合物，預(yù)測(cè)其可能具有抗癌效果，但是沒有報(bào)道具體結(jié)果。
[0080]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)公開了，作為L(zhǎng)-和D-普萘洛爾的外消旋混合物的普萘洛爾誘導(dǎo)EGFR的胞吞作用，示出了包括ΡΑΡ抑制、ΡΑ增加和隨后的4型磷酸二酯酶(PDE4)活性增加的機(jī)制，其導(dǎo)致cAMP水平降低和PKA活性降低(64)。這種新的控制系統(tǒng)給出了以下可能性:使用PA/PKA途徑的不同酶(包括PAP)作為新的靶點(diǎn)以誘導(dǎo)EGFR胞吞作用并降低其惡性依賴于致癌性EGFR功能的腫瘤的生長(zhǎng)。
[0081]本發(fā)明還基于以下額外的觀察結(jié)果:1)D_普萘洛爾活性的對(duì)映異構(gòu)體和地昔帕明均沒有β_阻斷劑活性，兩者都被用作PAP的抑制劑以誘導(dǎo)EGFR胞吞作用；2)D-普萘洛爾和地昔帕明抑制表達(dá)EGFR的致癌性改變(包括EGFR過表達(dá)和EGFRvIII突變體)的癌細(xì)胞的增殖。這些藥物的作用是選擇性針對(duì)惡性細(xì)胞的，相對(duì)地不影響或很弱地影響非腫瘤細(xì)胞。它們的組合明顯好于單獨(dú)使用每種藥物。
[0082]沒有β -阻斷劑活性的D-普萘洛爾及其類似物(單獨(dú)地或與地昔帕明組合)可被用于補(bǔ)充基于化療或EGFR抑制劑(例如西妥昔單抗、埃羅替尼和吉非替尼)的治療，也可在已經(jīng)對(duì)目前的抗EGFR治療產(chǎn)生抗性時(shí)用作單獨(dú)的治療。
[0083]本發(fā)明開辟了治療其惡性常常依賴于EGFR的致癌性改變(過表達(dá)和突變)或ErbB2的癌癥的新的可能性，所述癌癥包括結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、頭頸癌、肝癌和和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
[0084]本發(fā)明的發(fā)明人之前已經(jīng)證明，PKA抑制誘導(dǎo)了 EGFR的內(nèi)化(internalization)
(65)。最近，他們證明了，通過抑制PAP酶活性(其將PA水解為甘油二酯)而實(shí)現(xiàn)的磷脂酸的增加，再現(xiàn)了 PKA抑制作用，在沒有配體情況下也導(dǎo)致了 EGFR的內(nèi)化。該機(jī)制包括，PA介導(dǎo)的4型磷酸二酯酶(PDE4)的激活，導(dǎo)致cAMP水平和PKA活性降低(64)。該P(yáng)A/PDE4/cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑之前已有記載，但是其功能仍然是未知的(66)。本發(fā)明人的結(jié)果表明，該P(yáng)A/PDE4/cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑可調(diào)節(jié)作用于所述受體胞吞作用和再循環(huán)的EGFR的細(xì)胞表面水平(64)。
[0085]可誘導(dǎo)EGFR胞吞作用的PA/PKA途徑(64)可被作為PAP抑制劑的普萘洛爾或地昔帕明激活(66)，這是與這些藥物的通常臨床用途不同的用途。普萘洛爾臨床上被用作β-腎上腺素能受體的非選擇性阻斷劑，用于治療高血壓。地昔帕明被用于阻斷去甲腎上腺素的重捕獲，并被開處方用于治療抑郁。與其他兩親性陽離子化合物(包括氯丙嗪和鞘氨醇)類似，普萘洛爾和地昔帕明已被記載用于抑制ΡΑΡ活性(66-68)。該作用發(fā)生在較高濃度下(10-70 μ Μ)，遠(yuǎn)高于用于治療高血壓(普萘洛爾)或抑郁(地昔帕明)時(shí)它們的血液濃度。普萘洛爾因其ΡΑΡ抑制作用而被廣泛用于研究許多細(xì)胞過程中的ΡΑ和DAG功能，所述細(xì)胞過程包括信號(hào)傳導(dǎo)途徑、蛋白運(yùn)輸或細(xì)胞骨架功能(69 )。 [0086]在ΡΑ參與的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，PDE4的激活被研究的較少。ΡΑ對(duì)TOE4的激活導(dǎo)致cAMP水平降低并因此導(dǎo)致PKA的活性降低——由普萘洛爾誘發(fā)的不依賴于其β -阻斷劑作用的作用，以及由地昔帕明誘發(fā)的不依賴于其對(duì)去甲腎上腺素重捕獲的作用的作用(66、67)。
[0087]實(shí)施例
[0088]實(shí)施例1:ΡΑΡ抑制劑例如普萘洛爾和地昔帕明誘導(dǎo)EGFR的胞吞作用
[0089]圖1的間接免疫熒光顯示，使用普萘洛爾(L和D外消旋混合物)進(jìn)行的治療誘導(dǎo)了 EGFR從細(xì)胞表面向細(xì)胞內(nèi)(主要是核周圍的)位置的重新分布，已通過EGFR與轉(zhuǎn)鐵蛋白的共定位將其鑒別為再循環(huán)內(nèi)體，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白是這類內(nèi)體的標(biāo)記物(64)。這種作用不是由于β -阻斷劑活性，因?yàn)槠洳荒苡善渌?-阻斷劑例如美托洛爾和噻嗎洛爾再現(xiàn)。對(duì)ΡΑΡ活性也有抑制作用的地昔帕明(66、67)模仿了普萘洛爾的胞吞效應(yīng)(圖1)。
[0090]到目前為止，所有已知的ΡΑΡ抑制劑都引發(fā)與普洛萘爾和地昔帕明相同的效應(yīng)，因此本發(fā)明的范圍擴(kuò)展至任何的ΡΑΡ抑制劑。本文示出的結(jié)果僅是示例，其不約束或限制本發(fā)明的范圍。
[0091]本發(fā)明人之前已經(jīng)描述了，如通過125I_EGF結(jié)合減少所反映的，L和D普萘洛爾的外消旋混合物僅在30分鐘內(nèi)就降低了細(xì)胞表面的EGFR水平，在最高劑量時(shí)(300mM)降低達(dá)到 80% (64)。
[0092]這些結(jié)果證明了本發(fā)明的基礎(chǔ)之一，即通過胞吞作用重定位誘導(dǎo)從細(xì)胞表面向細(xì)胞內(nèi)小室的EGFR移除，因此使得所述受體不能與細(xì)胞外配體接觸，從而減少其致癌作用。
[0093]實(shí)施例2:通過對(duì)125I_EGF結(jié)合進(jìn)行測(cè)量來比較評(píng)價(jià)L-、D-普萘洛爾和地昔帕明對(duì)EGFR內(nèi)化的作用
[0094]由本發(fā)明提出的，普萘洛爾作為PAP抑制劑用于阻斷EGFR致癌作用的作用，需要的濃度高于其在體外作為β_腎上腺素能阻斷劑時(shí)的濃度(62、63)。L-普萘洛爾的β-腎上腺素能阻斷劑效能幾乎是D-普萘洛爾的100倍。但是，本發(fā)明人的結(jié)果證明，L-普萘洛爾和D-普萘洛爾在減少細(xì)胞表面EGFR的能力方面是等同的(圖2，Α)。它們的50%有效濃度(EC5Q)都為約75μΜ。[0095]用于臨床的普萘洛爾(外消旋的L和D混合物)的β -阻斷作用僅依賴于L-普萘洛爾的作用(70 )。D-普萘洛爾還是一種有過報(bào)告的ΡΑΡ抑制劑(67 )，可以以較高劑量用于臨床中。
[0096]地昔帕明還有效地誘導(dǎo)125I_EGF結(jié)合的降低，EC50為約20 μ Μ (圖2Β)。如通過1251-EGF結(jié)合測(cè)定所評(píng)估的，地昔帕明(20 μ Μ)和普萘洛爾(75 μ Μ)的EC5(I的組合減少了細(xì)胞表面上75-80%的EGFR (圖2C和D)。
[0097]因此，D-普萘洛爾和地昔帕明的組合可以比單獨(dú)使用每種藥物時(shí)更有效地用于治療以下癌癥，所述癌癥依賴于EGFR或其致癌突變體的致癌性刺激。
[0098]實(shí)施例3:依賴于EGFR及其致癌變體EGFRvIII的具有不同增殖速率的腫瘤細(xì)胞模型
[0099]所述來自人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞系U87表達(dá)低水平的EGFR (數(shù)據(jù)未示出)，并且當(dāng)被轉(zhuǎn)染以過表達(dá)所述突變體EGFRvIII時(shí)，其增殖速率大大增加(圖3)。這些細(xì)胞提供了用于測(cè)試所述藥物的適當(dāng)?shù)难芯磕Ｐ汀?br> [0100]所使用的其他模型系統(tǒng)來自多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，所述細(xì)胞直接來自患者(GBM1)，其表達(dá)高水平的EGFR而不是EGFRvIII (數(shù)據(jù)未示出)。
[0101]實(shí)施例4:D-普萘洛爾和地昔帕明的不連續(xù)治療對(duì)所培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤作用。
[0102]在所培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中證明了 D-普萘洛爾和地昔帕明作為依賴于EGFR的腫瘤細(xì)胞的增殖和生存力的抑制劑的效能。
[0103]每天兩次(持續(xù)60分鐘)給予所述細(xì)胞培養(yǎng)物D-普萘洛爾(60 μ Μ)(單獨(dú)的或與地昔帕明(2 μ Μ)組合的)，抑制了 U87細(xì)胞和U87-EGFRvIII細(xì)胞的增殖和生存力(圖4)。
[0104]在U87-EGFRvIII細(xì)胞中，對(duì)D-普萘洛爾和地昔帕明的組合的敏感性較高。作為選擇性的對(duì)照，所述實(shí)驗(yàn)顯示MDCK細(xì)胞——一種表達(dá)低水平EGFR并且不是惡性的犬腎細(xì)胞系(33)沒受到單獨(dú)的所述藥物的影響，并且在使用組合治療時(shí)其生存力降低20%。這些結(jié)果表明了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的治療選擇性因表達(dá)致癌變體EGFRvIII而增加。
[0105]實(shí)施例5:D-普萘洛爾和地昔帕明的低劑量連續(xù)治療對(duì)所培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤作用
[0106]為了抑制增殖和細(xì)胞生存力，還可以在更長(zhǎng)時(shí)期的治療中使用低得多的濃度。濃度低至2 μ Μ的普萘洛爾(僅是所記載的以普萘洛爾治療高血壓的患者血漿中濃度的兩倍)與0.6 μ Μ地昔帕明(所記載的血漿中濃度的一半)在U87-EGFRVIII細(xì)胞中達(dá)到了顯著的效果，而沒有明顯影響不表達(dá)這種致癌突變體的細(xì)胞(圖5)。
[0107]兩種藥物的組合的這種令人驚奇的作用使得可以對(duì)表達(dá)EGFRvIII的癌癥使用臨床上可接受的劑量。
[0108]總之，D-普萘洛爾(和沒有β -阻斷劑活性的類似物)和地昔帕明(單獨(dú)地或組合地)可用于治療其惡性依賴于EGFR的致癌性改變的癌癥，所述EGFR的致癌性改變是通過過表達(dá)(例如ΒΜΒ1)或通過突變(例如EGFRvIII)產(chǎn)生。
[0109]本發(fā)明的范圍擴(kuò)展至表達(dá)其他致癌性EGFR變體(例如肺癌中記載的那些)或者甚至其他家族成員(例如ErbB2/Neu)的癌癥，以及其他PAP抑制劑(鞘氨醇和氯丙嗪)。
[0110]附圖詳細(xì)說明[0111]圖1:普萘洛爾和地昔帕明在所培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)EGFR的胞吞作用:所述免疫熒光圖像示出了 HeLa對(duì)照細(xì)胞和用所示出的藥物處理30分鐘的細(xì)胞中EGFR的分布。普洛萘爾(75 μ Μ)和地昔帕明(75 μ Μ)都誘導(dǎo)了所述受體從細(xì)胞表面(對(duì)照，由細(xì)胞邊界染色指示)向細(xì)胞內(nèi)小室(由小泡和核周染色指示)的分布改變。其他的β_腎上腺素能阻斷劑——美托洛爾(50 μ Μ)和噻嗎洛爾(50 μ Μ)，沒有作用。
[0112]圖2:通過放射性配體結(jié)合確定的，對(duì)映異構(gòu)體L-和D-普萘洛爾以及地昔帕明降低了細(xì)胞表面上EGFR的可及性:將已預(yù)先除去血清4小時(shí)的Hela細(xì)胞用所示劑量的不同藥物處理30分鐘，然后通過將所述細(xì)胞與20ng/ml1251-EGF在4°C下孵育1小時(shí)進(jìn)行放射性配體結(jié)合測(cè)定，以檢測(cè)細(xì)胞表面上的EGFR。A.L-和D-普萘洛爾導(dǎo)致125I_EGF結(jié)合的下降，反映了為75 μ Μ濃度(EC5Q)下細(xì)胞表面的EGFR減少約50%，以及在250 μ Μ下減少80%。L_和D-普萘洛爾的作用是不能區(qū)分的；Β.地昔帕明也誘導(dǎo)了放射性配體結(jié)合水平的下降，EC50為約20-25 μ M ；C.不同濃度的D-普萘洛爾(上面刻度)和地昔帕明(下面刻度)的組合；D.以其各自的EC5Q使用的D-普萘洛爾(75 μ Μ)和地昔帕明(25 μ Μ)的組合導(dǎo)致了 125I_EGF結(jié)合減少約75%。
[0113]圖3:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87以及被轉(zhuǎn)染以過表達(dá)致癌突變體EGFRvIII的U87(U87-EGFRvIII)作為具有不同增殖速率的腫瘤模型。將10000個(gè)細(xì)胞接種在24孔板中補(bǔ)充有10%FBS和抗生素(青霉素100 U/ml和鏈霉素100mg/ml)的MEM培養(yǎng)基中。用質(zhì)粒pcDNA3-EGFRvII1-myc永久轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞(U87_EGFRvIII)顯示出比U87細(xì)胞更高的增殖。
[0114]圖4:D_普萘洛爾和地昔帕明的不連續(xù)處理對(duì)腫瘤性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87、U87-EGFRvIII和正常的上皮MDCK細(xì)胞的生存力的作用。
[0115]將5000個(gè)細(xì)胞(U87、U87_EGFRvIII和MDCK)接種在96孔板的每個(gè)孔中，所述孔中含有補(bǔ)充有10%FBS和抗生素(青霉素100U/ml和鏈霉素100mg/ml)的DMEM培養(yǎng)基。在三天中每天兩次用60 μ M D-普萘洛爾(Prop)、2yM地昔帕明(Des)或其組合處理1小時(shí)。結(jié)晶紫比色測(cè)定評(píng)估的細(xì)胞生存力表示為未處理細(xì)胞(對(duì)照)的百分?jǐn)?shù)％。每種藥物使U87和U87-EGFRvIII細(xì)胞的生存力降低了約60%，但是沒有降低MDCK細(xì)胞的生存力。所述兩種藥物的組合可顯著更有效地對(duì)抗U87-EGFRvIII細(xì)胞，殺死95%以上的U87-EGFRvIII細(xì)胞，而MDCK細(xì)胞僅減少20%。
[0116]圖5:低濃度D-普萘洛爾和地昔帕明的連續(xù)處理選擇性抑制過表達(dá)EGFR的U87-EGFRvIII和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM1細(xì)胞的過度增殖。在每孔接種2000個(gè)細(xì)胞(U87、U87-EGFRvII1、MDCK和GBM1)并在與圖3所述相同條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，將所述培養(yǎng)基替換為不含所示藥物(對(duì)照)或含所示藥物的培養(yǎng)基，所述藥物為:2μΜ D-普萘洛爾(Prop)或0.6 μ Μ地昔帕明(Des)或其兩者的組合，每24小時(shí)更換所述培養(yǎng)基，連續(xù)6天。使用結(jié)晶紫測(cè)定評(píng)估生存力并且表示為相對(duì)于未處理的對(duì)照的百分?jǐn)?shù)％。D-普萘洛爾和地昔帕明的組合降低了 U87-EGFRvIII細(xì)胞的生存力達(dá)幾乎5倍，降低GBM1細(xì)胞的生存力達(dá)一半，而U87細(xì)胞僅降低10%，MDCK沒有受到影響。
[0117]圖6:基于D-普萘洛爾和地昔帕明的作用來治療EGFR-依賴的癌癥的新策略:與目前直接靶向EGFR分子，試圖抑制配體結(jié)合或酪氨酸激酶活性的策略不同，本發(fā)明提出了誘導(dǎo)由藥物介導(dǎo)的所述受體的胞吞作用，所述藥物抑制PAP并激活PA/PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的，從而誘導(dǎo)EGFR從細(xì)胞表面向內(nèi)體的重新定位。
[0118]技術(shù)描述
[0119]試劑和抗體
[0120]重組人EGF購(gòu)自Invitrogen (Carlsbad, CA),蛋白A_瓊脂糖凝膠、普萘洛爾和高葡萄糖DMEM購(gòu)自Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)，胎牛血清購(gòu)自HycloneLaboratories (Logan, UT)，細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自 Invitrogen 和 Sigma Aldrich,用于組織培養(yǎng)的塑料板購(gòu)自Nalge Nunc (Naperville, IL) 0購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)的雜交瘤HB8506的培養(yǎng)基被用作針對(duì)人EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的來源。針對(duì)EGFR的羧基端結(jié)構(gòu)域的兔單克隆抗體購(gòu)自Millipore。
[0121]用于表達(dá)EGFRvIII原癌基因的質(zhì)粒的構(gòu)建
[0122]在(65)中描述的克隆到pBK-CMV載體中HindllI和Smal位點(diǎn)之間的EGFR cDNA被用于構(gòu)建用于致癌變體EGFRvIII的表達(dá)載體。首先，使用含有限制性位點(diǎn)(針對(duì)第一片段為ΚρηΙ和EcoRV，針對(duì)第二片段為EcoRV和Xbal)的引物獲得了對(duì)應(yīng)于外顯子1_2和7_28的PCR片段。在連接這些片段后，獲得了對(duì)應(yīng)于缺少外顯子2-7的EGFRvIII的新片段，然后將其克隆到pcDNA3.1和pcDNA3.lmyc載體中的ΚρηΙ和Xbal位點(diǎn)之間，分別獲得了載體pcDNA3-EGFRvI11和pcDNA3-EGFRvII1-myc。通過測(cè)序分析這兩個(gè)構(gòu)建體。
[0123]細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0124]用于放射性配體結(jié)合測(cè)定和EGFR胞吞作用的HeLa細(xì)胞之前已經(jīng)在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中被表征(33、64、65)。將所述細(xì)胞培養(yǎng)至達(dá)到約80%匯合并在測(cè)試前無血清維持2小時(shí)。
[0125]培養(yǎng)購(gòu)自ATCC的U87人雜交瘤細(xì)胞并用pcDNA3.l-EGFRvII1-myc轉(zhuǎn)染。所述轉(zhuǎn)染是按照制造商說明(Invitrogen)使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofectamine)法進(jìn)行。將100000個(gè)U87細(xì)胞接種在15mm板中，在接種48小時(shí)后用1 μ g的質(zhì)粒pcDNA3-EGFRvII1-myc轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，加入補(bǔ)充有抗生素(100IU/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素)和0.8mg/ml遺傳霉素(Geneticin) (G418，Sigma)的選擇培養(yǎng)基(DMEM，10%胎牛血清(FBS))。在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，獲得永久轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(U87-EGFRvIII)并使用抗EGFR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的兔單克隆抗體(Millipore)通過間接免疫突光進(jìn)行分析。
[0126]從被診斷患有多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者的活組織檢查樣本獲得GBM1細(xì)胞。所述腫瘤的活組織檢查樣本為約1cm。將其用PBS洗滌4次，切片并在含有0.125%胰蛋白酶、5mM EDTA的PBS中在37°C下孵育15分鐘，同時(shí)連續(xù)地?cái)噭?dòng)。在用巴斯德吸管機(jī)械破碎后，將細(xì)胞在臺(tái)式離心機(jī)中以1200rpm離心10分鐘。將所得沉淀物重懸于含有卵類粘蛋白抑制劑(lmg/ml)和DNA酶I (lmg/ml)的2ml PBS中，然后再次以1200rpm離心10分鐘。將所得細(xì)胞重懸于PH7.2的NH4C1/Tris中并在37°C下孵育5分鐘(5ml到5千萬細(xì)胞)，并通過以1200rpm離心10分鐘加以沉淀，最后重懸并培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM中。將這些細(xì)胞維持至少10次傳代。
[0127]所培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞體外增殖和生存力以及用D-普萘洛爾和地昔帕明進(jìn)行的處理的評(píng)價(jià) [0128]將U87細(xì)胞、U87-EGFRvII1、MDCK和GMB1細(xì)胞以每孔2000-10000個(gè)細(xì)胞的密度
(如在相應(yīng)的圖中所示)接種在96孔板中，并培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%FBS和抗生素(青霉素100U/ml和鏈霉素100mg/ml)的DMEM中。在24小時(shí)更換培養(yǎng)基并以連續(xù)或不連續(xù)方式進(jìn)行處理。通過在三天中每天兩次將所述細(xì)胞與單獨(dú)的60 μ M D-普萘洛爾(Prop)或與單獨(dú)的2 μ Μ地昔帕明，或與60 μ M D-Prop和2μΜ Des的組合孵育1小時(shí)，來進(jìn)行不連續(xù)的處理。連續(xù)的處理是將所述細(xì)胞與2-30 μ M D-Prop、0.6-1 μ Μ Des或這兩種藥物的組合一起孵育，每24小時(shí)更換培養(yǎng)基。各對(duì)照僅接受培養(yǎng)基。通過結(jié)晶紫比色測(cè)定以550nm處的光密度評(píng)估細(xì)胞生存力，所述550nm處的光密度的強(qiáng)度與貼壁到所述板上的細(xì)胞數(shù)成比例，或者在自動(dòng)計(jì)數(shù)器中直接計(jì)數(shù)細(xì)胞評(píng)估細(xì)胞生存力。在這兩種情況下，100%對(duì)應(yīng)于在未處理細(xì)胞(對(duì)照)中測(cè)量的光密度。
[0129]間接免疫熒光和共定位分析
[0130]將生長(zhǎng)在玻璃蓋玻片上的HeLa細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌三次并在無血清的DMEM-HEPES培養(yǎng)基中在37°C下孵育2小時(shí)，以在細(xì)胞表面上積累EGFR。然后將所述細(xì)胞用PBS洗滌并在室溫下用溶于補(bǔ)充有0.1mM CaCl2和ImM MgCl2的PBS(PBS-CM)中的4% 低聚甲醛固定 30 分鐘。用含 0.2% 明膠的 PBS (300Bloom, Sigma Aldrich, PBS-CM-G)洗滌三次(每次5分鐘)后，將細(xì)胞用0.2%Triton X-100在室溫下透化處理10分鐘，然后與抗EGFR的單克隆抗體(mAb) HB8506 (在PBS-CM-G中1/100)在室溫下孵育1小時(shí)。在PBS-CM-G中洗滌至少6次后，將細(xì)胞與偶聯(lián)Alexa488的二抗抗小鼠IgG (稀釋度1/1000)在室溫下孵育1小時(shí)。如(64)所述，在裝有油浸物鏡Plan-Apochromat63X/l.4和ZeissAxiocam攝像機(jī)的Zeiss Axiophot顯微鏡上獲得了突光數(shù)字圖像，并將所述圖像在運(yùn)行成像軟件AxioVision (Zeiss, Thorn-wood, NY)的計(jì)算機(jī)工作站上轉(zhuǎn)化為14位。
[0131 ] 配體結(jié)合測(cè)定和胞吞速率常數(shù)
[0132]通過如(71)所述的氯胺T方法制備放射性配體1251_人EGF，得到50000-70000cpm/ng的比放射性(specific activity)。如(65)所述,在含有20mM HEPES和0.1%牛血清白蛋白(BSA)的Hanks溶液中在4°C下進(jìn)行結(jié)合測(cè)定2小時(shí)。將已除去血清4小時(shí)的HeLa細(xì)胞用所示劑量的多種藥物處理30分鐘，然后與20ng/ml1251-EGF在4°C下于結(jié)合培養(yǎng)基(MEM-Hank，s，25mM HEPES,0.2%BSA RIA級(jí))中孵育，劇烈攪拌1小時(shí)。將所得細(xì)胞用1NNaOH在室溫下裂解2小時(shí)，在y計(jì)數(shù)器中確定每個(gè)樣品(一式三份)的每分鐘計(jì)數(shù)，包括通過用過量(500倍)冷配體孵育獲得的非特異性結(jié)合點(diǎn)，其值被從每個(gè)樣品中減去。在飽和條件中的放射性配體結(jié)合提供了細(xì)胞表面上EGFR量的估值。
[0133]本發(fā)明新的癌癥治療策略的綜述
[0134]表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)屬于包含四個(gè)成員(ErbBl_4或HER1-4)的酪氨酸激酶受體家族ErbB/HER。EGFR被至少六種不同的特異性配體激活以傳播細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)根據(jù)細(xì)胞環(huán)境可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、生存、遷移和細(xì)胞凋亡過程。所有這些過程在癌癥發(fā)生期間均被改變，并常常與通過EGFR過表達(dá)或高活性突變確定的致癌性功能障礙有關(guān)。腫瘤細(xì)胞完全依賴于這些改變的EGFR所發(fā)出的致癌信號(hào)，這反映在它們對(duì)EGFR抑制劑的敏感性高于正常細(xì)胞。因此，EGFR是用于開發(fā)定向和個(gè)性化抗腫瘤治療的新藥物和策略以及主要靶點(diǎn)(25) (41)。治療可通過用于確定EGFR中致癌性改變的腫瘤分析來加以個(gè)性化和優(yōu)化。到目前為止，所述策略集中于使藥物定向到EGFR分子自身，試圖用抗體抑制配體結(jié)合或用小分子抑制受體酪氨酸激酶活性。臨床使用的藥物包括阻斷配體結(jié)合的人源化單克隆抗體(例如西妥昔單抗)以及與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR酪氨酸激酶的活性位點(diǎn)而抑制其活性的藥物(吉非替尼和埃羅替尼)。雖然臨床數(shù)據(jù)支持了 EGFR是定向和個(gè)性化抗腫瘤治療的良好靶點(diǎn)的觀點(diǎn)，但是這類藥物的效能仍然有限，通常限于敏感患者的小的亞群(subgrup) (35)。另外，激酶抑制劑的一般問題是相對(duì)頻繁地出現(xiàn)賦予針對(duì)所述治療的抗性的突變。因此有必要獲得作用機(jī)制與當(dāng)前使用的那些藥物不同且互補(bǔ)的新的藥物。
[0135]本發(fā)明提出了創(chuàng)新性的策略，其是使用小分子藥物來藥理性誘發(fā)通過內(nèi)吞作用(endocytic internalization)進(jìn)行的從細(xì)胞表面除去EGFR,從而降低了其對(duì)細(xì)胞外激活刺激的可及性，同時(shí)改變了已經(jīng)活化的受體的信號(hào)傳播的細(xì)胞位置。這兩種替代方案對(duì)于其惡性基于細(xì)胞表面上過高的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)活性的腫瘤細(xì)胞都是有害的?？烧T導(dǎo)EGFR胞吞作用的小分子藥物可以抑制EGFR依賴性腫瘤惡性細(xì)胞的增殖和生存力。這種策略(示于圖5)是新穎的。其在以前沒有被用過，因?yàn)槠涫腔谠诒景l(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[0136]胞吞作用在EGFR的功能中起到重要作用。當(dāng)EGFR在細(xì)胞表面結(jié)合于其配體時(shí)，其首先被激活然后被胞吞，保持活性達(dá)不同的時(shí)間并被再循環(huán)至細(xì)胞表面以最終被送至終止其信號(hào)傳導(dǎo)的降解通路(59)。本發(fā)明人已經(jīng)證明用作磷脂酸磷酸水解酶(PAP)活性抑制劑的普萘洛爾(L和D普萘洛爾的外消旋混合物)可誘導(dǎo)EGFR的胞吞作用和細(xì)胞內(nèi)積累，而不依賴于配體(64)。本發(fā)明人還證明，這種作用依賴于包括磷脂酸(PA)增加的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其可激活4型磷酸二酯酶，導(dǎo)致cAMP減少并因此導(dǎo)致PKA活性降低。本發(fā)明人后來已經(jīng)證明EGFR胞吞作用還可由D-普萘洛爾以及由地昔帕明觸發(fā)。在通過PAP抑制來激活PA/PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑后，EGFR被內(nèi)化并因此不能接觸外部的有絲分裂刺激。這些觀察結(jié)果開辟了使用該P(yáng)A/PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑來設(shè)計(jì)新的藥物制劑以對(duì)抗大部分癌癥的惡性的可能性，所述癌癥依賴于EGFR的致癌性改變，包括過表達(dá)和激活突變。
[0137]這種策略的可行性被本發(fā)明人的另外的結(jié)果所證明。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，均被用作PAP抑制劑的D-普萘洛爾(幾乎沒有β -阻斷劑活性)和地昔帕明不僅誘導(dǎo)EGFR胞吞作用，還抑制過表達(dá)EGFR (源自患者的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞GBM1)或致癌變體EGFRvIII (轉(zhuǎn)染EGFRvIII的U87細(xì)胞)的 腫瘤癌細(xì)胞的增殖并降低其生存力。D-普萘洛爾和地昔帕明的組合被證明更有效。
[0138]本發(fā)明擴(kuò)展至表達(dá)EGFR的其他致癌變體或ErbB/HER家族的其他成員(例如ErbB2/Neu)的癌癥。其還擴(kuò)展至對(duì)PAP有抑制作用的其他化合物，無論是已知化合物(例如鞘氨醇和氯丙嗪)還是任何可能在將來出現(xiàn)的其他新化合物。本發(fā)明提出的PAP抑制劑可用于治療多種癌癥，包括頭頸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。本發(fā)明提出的治療可以補(bǔ)充其他的治療或者在已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)化療或EGFR抑制藥物的抗性時(shí)作為唯一的治療。
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【權(quán)利要求】
1.磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的抑制劑的用途，其特征在于其可用于制備用于治療癌癥的藥劑。
2.權(quán)利要求1的PAP抑制劑的用途，其特征在于所述癌癥依賴于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)0
3.權(quán)利要求1的PAP抑制劑的用途，其特征在于所述EGFR包括了所有致癌變體和其他ErbB家族成員/HER。
4.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制劑選自普萘洛爾、地昔帕明、氯丙嗪、鞘氨醇和溴烯醇內(nèi)酯。
5.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制劑為普萘洛爾。
6.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制劑選自普萘洛爾的外消旋混合物。
7.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制劑為D-普萘洛爾。
8.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制劑單獨(dú)使用或與另外的PAP抑制劑組合使用。
9.權(quán)利要求8的用途，其特征在于選擇所述PAP抑制劑普萘洛爾與地昔帕明組合。
10.權(quán)利要求9的用途，其特征在于所述PAP抑制劑選自D-普萘洛爾與地昔帕明的組合。
11.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)依賴的癌癥選自頭頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和/或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
12.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制劑單獨(dú)使用或與通過不同于PAP抑制的途徑抑制EGFR的藥物組合使用。
13.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制劑單獨(dú)使用或與其他方法例如放射治療或外科手術(shù)組合使用。
【文檔編號(hào)】A61K31/55GK103635186SQ201280017339
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月8日
【發(fā)明者】A·岡薩雷斯, A·蘇佐, C·梅斯 申請(qǐng)人:智利天主教教皇大學(xué)