與間充質(zhì)干細(xì)胞外來(lái)體相關(guān)的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來(lái)源之外來(lái)體的組合物，以及在具有某些肺疾病(包括炎性肺疾病)的對(duì)象中使用所述組合物的方法。
【專利說(shuō)明】與間充質(zhì)干細(xì)胞外來(lái)體相關(guān)的方法和組合物
[0001]相關(guān)申請(qǐng)[0002]本申請(qǐng)要求2011年 3 月 11 日提交的題為“METHODS AND COMPOSITIONS RELATINGTO MESENCHYMAL STEM CELL EX0S0MES”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)(序列號(hào)61/451，981)的優(yōu)先權(quán),其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
[0003]聯(lián)邦政府資助的研究
[0004]本發(fā)明在由國(guó)家心肺和血液研究所授予的資助號(hào)R01HL055454和R01HL085446的政府支持下完成。政府享有本發(fā)明的一些權(quán)益。
[0005]發(fā)明背景
[0006]與足月兒或近足月兒相比，早產(chǎn)兒患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生某些慢性肺(或呼吸系統(tǒng))疾病(或病癥)的比率較高。由于嬰兒的肺和呼吸能力受到損害，這些疾病常常是致命的。早產(chǎn)兒存活率的增加導(dǎo)致這種肺疾病的發(fā)病率增加。炎癥是多種肺疾病的關(guān)鍵病理生理特征，所述肺疾病包括肺部高血壓(pulmonary hypertension, PH或PAH)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)和嬰兒的慢性肺疾病(也被稱為支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD) 0早產(chǎn)兒存活率的增加導(dǎo)致BH)及其相關(guān)并發(fā)癥(包括繼發(fā)性PH、哮喘)發(fā)病率的增加，以及在生命的第一年中再住院率的增加。BH)是早產(chǎn)的常見并發(fā)癥(Kinsella 等，Lancet, 2006, 367: 1421-1431 ；Stenmark and Abman, Annu RevPhysiol, 2005,67:623-661)，并且在一些研究中，其可影響多達(dá)35-40%的在< 29孕周出生的早產(chǎn)兒。造成其的原因包括機(jī)械性損傷，氧中毒，感染，以及所導(dǎo)致的肺部炎癥和發(fā)育肺的損傷?？刂艬H)的嘗試涉及溫和通氣(gentle ventilation)策略和使用抗炎劑如皮質(zhì)類固醇。然而，這些治療獲得的成功有限并且具有不可接受的副作用(Baveja和Christou，Semin Perinatol, 2006, 30:209-218)。這些慢性肺疾病的長(zhǎng)期影響也是需要關(guān)注的問題，包括持續(xù)的肺損傷和神經(jīng)發(fā)育延遲。PH是BPD的嚴(yán)重并發(fā)癥，并與高死亡率相關(guān)。它也與其他形式的肺疾病如CCffD相關(guān)。最近，PH被認(rèn)為是血吸蟲病通過(guò)涉及炎癥的機(jī)制的主要并發(fā)癥之一。血吸蟲病在世界的一些地區(qū)具有很高的患病率，并與繼發(fā)性PH高度相關(guān)，潛在地顯著增加了這種血管疾病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明提供了包含間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來(lái)源之外來(lái)體的組合物，以及使用其治療和/或預(yù)防肺疾病的方法。
[0009]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含配制為用于氣管內(nèi)施用或通過(guò)吸入施用的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含配制為用于靜脈內(nèi)施用的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。
[0010]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體和肺表面活性劑。
[0011]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體和肺皮質(zhì)類固醇。肺皮質(zhì)類固醇可以是甲基潑尼松龍(methylprednisolone),盡管其不限于此。[0012]在另一些方面中，本發(fā)明提供了氣溶膠化的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體以及包含氣溶膠化的分離的MSC外來(lái)體的組合物。
[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防肺疾病的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體的組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防肺疾病的藥物組合物，其包含分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。
[0014]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用作治療或預(yù)防肺疾病之藥物的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體的組合物。
[0015]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了方法，其包括向患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的對(duì)象施用有效量的分尚的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。
[0016]在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體在對(duì)象中治療或預(yù)防的肺疾病的用途，或者分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體在制備用于治療或預(yù)防肺疾病的藥物中的用途。
[0017]在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了在用于治療或預(yù)防肺疾病的方法中使用的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體，所述方法包括向患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的對(duì)象施用有效量的分離的MSC外來(lái)體。
[0018]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了方法，其包括向患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的對(duì)象施用有效量的分尚的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。
[0019]如下所述，多種實(shí)施方案同樣地適用于本發(fā)明的多個(gè)方面。在一些實(shí)施方案中，肺疾病是炎性肺疾病。在一些實(shí)施方案中，炎性肺疾病為肺部高血壓、哮喘、支氣管肺發(fā)育不良(BH))、變態(tài)反應(yīng)或特發(fā)性肺纖維化。在一些實(shí)施方案中，肺疾病是肺血管疾病。在一些實(shí)施方案中，肺疾病是急性肺損傷。在一些實(shí)施方案中，急性肺損傷急性肺損傷與膿毒癥相關(guān)或者是通氣機(jī)引起的(ventilator-1nduced)急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。
[0020]在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象患有或很可能發(fā)生血吸蟲病。
[0021]在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象是新生兒。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象是嬰兒。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象的年齡是3至18歲。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象是成體。在任意這些實(shí)施方案中，所述對(duì)象可以是早產(chǎn)的。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象在35孕周前出生。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象在26孕周前出生。
[0022]在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體與第二藥劑一起使用。在一些實(shí)施方案中，所述第二藥劑是類固醇、抗氧化劑或吸入的一氧化氮。在一些實(shí)施方案中，所述類固醇是皮質(zhì)類固醇。在一些實(shí)施方案中，所述皮質(zhì)類固醇是甲基潑尼松龍。在一些實(shí)施方案中，所述抗氧化劑是超氧化物歧化酶。
[0023]在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體在出生一小時(shí)內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體在出生1個(gè)月內(nèi)施用。
[0024]在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體靜脈內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體施用至對(duì)象的肺或氣管。在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體通過(guò)吸入施用。在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體以氣溶膠(aerosol)施用。在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體使用噴霧器施用。在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體使用氣管內(nèi)的管施用。
[0025]在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體與肺表面活性劑一起施用或者配制。在一些實(shí)施方案中，所述肺表面活性劑是分離的天然表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，肺表面活性劑是牛肺或豬肺來(lái)源的。在一些實(shí)施方案中，肺表面活性劑是合成的表面活性劑。
[0026]在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體重復(fù)地施用至對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體施用至對(duì)象兩次。在一些實(shí)施方案中，將分離的MSC外來(lái)體連續(xù)地施用至對(duì)象。 [0027]在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體來(lái)源于臍帶血MSC。在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體來(lái)源于骨髓MSC。
[0028]在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體對(duì)所述對(duì)象是自體的。在一些實(shí)施方案中，分離的MSC外來(lái)體是對(duì)所述對(duì)象是同種異體(allogeneic)的。
[0029]在一些實(shí)施方案中，對(duì)象沒有接受細(xì)胞或器官移植。
[0030]因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了配制為遞送至肺的藥物組合物，其包含有效量的分離的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體和肺表面活性劑，其用于患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的人對(duì)象，其中所述對(duì)象的年齡小于4周。類似地，本發(fā)明提供了使用所述MSC外來(lái)體的方法，其包括向患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的人對(duì)象施用配制為遞送至肺的有效量的分離的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體和肺表面活性劑，其中所述對(duì)象的年齡小于4周。本發(fā)明類似地提供了配制為遞送至肺的有效量的分離的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體和肺表面活性劑在患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的人對(duì)象中的用途，其中所述對(duì)象的年齡小于4周。在一些實(shí)施方案中，分離的人MSC外來(lái)體是從人臍帶分離的(例如,華頓氏膠質(zhì)(Wharton' sJelly))。在一些實(shí)施方案中，人對(duì)象是在37孕周前出生的。在一些實(shí)施方案中，人對(duì)象已經(jīng)被施用氧或已經(jīng)在通氣機(jī)(ventilator)上。在一些實(shí)施方案中，人對(duì)象患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良。在一些實(shí)施方案中，支氣管肺發(fā)育不良是非炎性的。在一些實(shí)施方案中，分離的人MSC外來(lái)體在出生I天內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，分離的人MSC外來(lái)體在出生I小時(shí)內(nèi)施用。
[0031]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特性與分離的MSC外來(lái)體相似或相同的合成MSC外來(lái)體，包含這樣的合成MSC外來(lái)體的組合物及其使用方法。本發(fā)明設(shè)想合成MSC外來(lái)體可與分離的MSC外來(lái)體以相同的方式配制和使用。合成外來(lái)體可包含1、
2、3、4、5、6、7種或全部8種以下蛋白質(zhì):觸珠蛋白(haptoglobin) (Acc.N0.q61646)、半乳凝素-3-結(jié)合蛋白(galectin-3-binding protein) (Acc.N0.q07797)、血小板反應(yīng)蛋白 _2(thrombospondin-2)(Acc.N0.q03350)、乳黏著蛋白(Iactadherin) (Acc.N0.q21956)、脂肪細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 I (adipocyte enhancer-binding proteinl)(Acc.N0.q640nl)、波形蛋白(vimentin) (Acc.N0.p20152)、蛋白酶體亞基 a 型 2 (Acc.N0.p49722)和淀粉樣M4蛋白(Acc.N0.pl2023)。這些外來(lái)體可以如本文對(duì)分離的MSC外來(lái)體所述的進(jìn)行配制，包括配制用于鼻內(nèi)或氣管內(nèi)施用或吸入。可將它們與肺表面活性劑或其它治療劑一起配制或施用。
[0032]本發(fā)明的這些和其它方面以及實(shí)施方案將在本文中更詳細(xì)地進(jìn)行描述。
[0033]附圖簡(jiǎn)述
[0034]圖1.來(lái)自BM-MSC的分泌因子是抗炎的。BM-MSC-CM對(duì)低氧誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響(A)。將用載劑或BM-MSC-CM或MLF-CM注射的小鼠(n > 8)暴露于低氧(8.5%02)48小時(shí)，并且收集來(lái)自低氧小鼠以及年齡匹配的常氧(normoxic, Nmx)對(duì)照組小鼠的BALF。BALF中肺泡巨噬細(xì)胞的數(shù)目通過(guò)Kimura染色計(jì)數(shù)。來(lái)自低氧和常氧對(duì)照組小鼠的無(wú)細(xì)胞BALF中蛋白質(zhì)的比較免疫印跡分析(B)。合并來(lái)自相同組(n>8)單獨(dú)小鼠的等效體積無(wú)細(xì)胞BALF，并且通過(guò)使用對(duì)MCP-1 (頂部)和HMF/FIZZ1 (底部)特異的抗體通過(guò)western印跡來(lái)分析來(lái)自合并的BALF的等效體積的蛋白質(zhì)。MCP-1和HMF的相對(duì)強(qiáng)度表示為對(duì)來(lái)自相同印跡的IgA信號(hào)的歸一化。
[0035]圖2.從無(wú)細(xì)胞BM-MSC條件培養(yǎng)基分離外來(lái)體。通過(guò)超濾和尺寸排阻色譜分離BM-MSC-CM或MLF-CM中的外來(lái)體。BM-MSC-CM中1.6% (重量/重量)的蛋白質(zhì)與外來(lái)體相關(guān)，來(lái)自尺寸排阻色譜的級(jí)分中的外來(lái)體通過(guò)電子顯微鏡可視化(A-D)。為了驗(yàn)證來(lái)自BM-MSC-CM的外來(lái)體分離，通過(guò)30，000倍放大的負(fù)染色電子顯微鏡分析空隙體積的級(jí)分(ve = V0) (A)和柱子的空隙體積和總體積之間的級(jí)分(V。，<'< vt)⑶。從BM-MSC-CM (C)或MLF-CM(D)分離的外來(lái)體的形態(tài)和大小分布相同。針對(duì)外來(lái)體相關(guān)蛋白質(zhì)的Western印跡分析(E-F)。使用針對(duì)⑶63、14-3-3S、膜突蛋白、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(mCSF)、骨橋蛋白(OPN)和Dicer的抗體在western印跡中測(cè)定各樣品中的3 ii g蛋白質(zhì)。使用35 y gBM-MSC全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的蛋白質(zhì)作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0036]圖3.MEX抑制低氧引起的急性肺部炎癥。將注射載劑或MEX或BM-MSC-CM的無(wú)外來(lái)體級(jí)分或FEX的小鼠(n > 7)暴露于低氧(8.5% O2)48小時(shí)，并且收集低氧小鼠和年齡匹配的常氧老鼠的BALF。來(lái)自每個(gè)小BALF中的肺泡巨噬細(xì)胞的數(shù)量通過(guò)Kimura染色計(jì)算(A)。來(lái)自低氧和常氧對(duì)照小鼠的無(wú)細(xì)胞BALF中蛋白質(zhì)的比較免疫印跡分析(B)。合并來(lái)自相同組(n > 7)中單獨(dú)小鼠的等效體積的無(wú)細(xì)胞BALF，并且使用對(duì)MCP-1(頂部)和HMF/FIZZ1 (底部)特異的抗體通過(guò)western印跡分析來(lái)自等效體積的合并的BALF的蛋白質(zhì)。MCP-1和HMF的相對(duì)水平表示為對(duì)來(lái)自相同印跡的IgA信號(hào)的歸一化。 [0037]圖4.MEX的單次和多次施用對(duì)源自低氧的肺部炎癥的時(shí)程作用。將在第0天注射載劑(A)或MEX(B)的小鼠暴露于低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間。對(duì)于多次注射實(shí)驗(yàn)中，將在第0天接受MEX的小鼠暴露于低氧4天。在第4天第二次注射相同劑量的MEX，隨后再暴露于低氧指定的天數(shù)(C)。在低氧條件的選定時(shí)期收集BALF，并對(duì)來(lái)自單個(gè)小鼠之BALF中肺泡巨噬細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。合并相同組(n> 7)中單獨(dú)小鼠的等效體積的無(wú)細(xì)胞BALF，并且使用對(duì)MCP-1和HMF特異的抗體通過(guò)western印跡分析來(lái)自合并BALF的10% (體積體積)的蛋白質(zhì)(D)。
[0038]圖5.MEX抑制低氧引起的PAH。將注射一次或兩次載劑(在第0天和第4天)或MEX(在第0天和/或第4天)、或FEX(在第0天和第4天)的小鼠(n > 7)暴露于低氧(8.5%02)3周(A)。在實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時(shí)測(cè)量低氧和常氧對(duì)照小鼠的RSVP(B)和富爾頓指數(shù)(Fulton’s Index) (C)。對(duì)來(lái)自各組的隨機(jī)選定小鼠(n = 4)的石臘包埋肺切片進(jìn)行a-SMA免疫染色，以突出肺部動(dòng)脈血管壁(D)。圖像的原始放大倍數(shù):400X。從每個(gè)組選擇具有20至30 直徑的小肺動(dòng)脈以測(cè)量管壁厚度，管壁厚度用血管總面積的百分比表示。數(shù)據(jù)表示為平均值土 SEM(n = 40至50動(dòng)脈/組)。
[0039]圖6、MSC來(lái)源外來(lái)體的純化。外來(lái)體經(jīng)S^hacryl S-400凝膠過(guò)濾柱色譜進(jìn)行純化。將帶負(fù)電的熒光50nm納米顆粒施加到S-400柱上并且使用與純化外來(lái)體相同的條件洗脫(A)。從外來(lái)體純化，將等效體積的每種級(jí)分在10%變性聚丙烯酰胺凝膠(B)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳(C) 二者上分離。用抗-CD81抗體染色瓊脂糖凝膠的印跡(D)。[0040]圖7.MSC來(lái)源外來(lái)體和無(wú)外來(lái)體級(jí)分的比較生物化學(xué)分析。在12%變性聚丙烯酰胺凝膠(A)上分離外來(lái)體級(jí)分(M)和無(wú)外來(lái)體級(jí)分(MF) 二者合并物中的等效蛋白量。用膠體藍(lán)染色用外來(lái)體級(jí)分和無(wú)外來(lái)體級(jí)分二者的合并物中等效蛋白質(zhì)量以及不存在(左、B)或存在(右、B)0.5% SDS的情況下50nm的納米顆粒上樣的1.2%瓊脂糖凝膠。使用溴化乙錠(對(duì)核酸)(左、C)或膠體藍(lán)(對(duì)蛋白質(zhì))(右、C)染色用外來(lái)體級(jí)分和無(wú)外來(lái)體級(jí)分二者的合并物中等效蛋白質(zhì)量上樣的1.2%瓊脂糖凝膠電泳。使用抗-⑶81和抗-SPP-1抗體(D)免疫染色在1.2%瓊脂糖凝膠和12%變性聚丙烯酰胺凝膠二者上分離的上樣有外來(lái)體級(jí)分和無(wú)外來(lái)體級(jí)分二者的合并物中等效蛋白質(zhì)量的凝膠的印跡。M，外來(lái)體級(jí)分合并物；MF，無(wú)外來(lái)體級(jí)分合并物；N，帶負(fù)電熒光50nm納米球。
[0041]圖8.肺中低氧誘導(dǎo)的HMF/FIZZ-l/Retnl a分泌。將小鼠暴露于單壓(monobaric)低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間段。合并來(lái)自同一組中各單獨(dú)小鼠的經(jīng)體積(A)和數(shù)量(B)歸一化的BAL中的蛋白質(zhì)，并且在14%聚丙烯酰胺凝膠上分離。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析評(píng)價(jià)HIMF、溶菌酶和IgA的水平。
[0042]圖9.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺中抑制低氧誘導(dǎo)的HMF/FIZZ-l/Retnl a分泌。將通過(guò)尾靜脈注射IOii g的MEX(M)或載劑(V)的小鼠暴露于單壓低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間段。合并來(lái)自同一組中各單獨(dú)小鼠的經(jīng)體積(A)和數(shù)量(B)歸一化的BAL中的蛋白質(zhì)，并且在14%聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析評(píng)價(jià)HIMF、溶菌酶和IgA的水平。
[0043]圖10.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺中抑制低氧誘導(dǎo)的HMF/FIZZ-l/Retnl a分泌。將通過(guò)尾靜脈注射10 ii g的MEX(M)或載劑(V)的小鼠暴露于單壓低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間段。在14%聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離來(lái)自每個(gè)單獨(dú)小鼠的IOyg BAL蛋白(A、B)。合并來(lái)自同一組中各單獨(dú)小鼠的經(jīng)數(shù)量歸一化的BAL中的蛋白質(zhì)，并且在14%聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離(C)。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析評(píng)價(jià)HIMF、溶菌酶和IgA的水平。
[0044]圖11.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺組織中抑制低氧誘導(dǎo)的HIF2 a上調(diào)。將通過(guò)尾靜脈注射IOy g MEX或載劑的小鼠暴露于單壓低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間段。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)自個(gè)體肺組織勻漿的等效量的蛋白質(zhì)。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析檢測(cè)HIF2a和肌動(dòng)蛋白 的水平(A、B)。HIF2 a /肌動(dòng)蛋白的相對(duì)強(qiáng)度通過(guò)光密度分析(C)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。**，P < 0.01相對(duì)常氧(n = 4土SD，單因素AN0VA) ;，P < 0.01相對(duì)載劑(低氧，2天)(n = 4土SD，單因素AN0VA)。
[0045]圖12.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺組織中抑制低氧誘導(dǎo)的NFkB p65活化。將通過(guò)尾靜脈注射IOy g MEX或載劑的小鼠暴露于單壓低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間段。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)自個(gè)體肺組織勻漿的等效量蛋白質(zhì)。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析檢測(cè)P65、磷酸化p65(S536)和肌動(dòng)蛋白的水平(A、B)。P_p65/肌動(dòng)蛋白的相對(duì)強(qiáng)度通過(guò)光密度分析(C)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。'P <0.05相對(duì)常氧(11 = 4±50，單因素六勵(lì)￥八);##，P
<0.01相對(duì)載劑(低氧，2天)(n = 4土SD，單因素AN0VA)。
[0046]圖13.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺組織中抑制低氧誘導(dǎo)的STAT3活化。將通過(guò)尾靜脈注射IOyg MEX或載劑的小鼠暴露于單壓低氧(8.5%02)2天。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)自個(gè)體肺組織勻漿的等效量蛋白質(zhì)。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析檢測(cè)STAT3、磷酸化STAT3(Y705)和肌動(dòng) 蛋白的水平(A)。P-STAT3/STAT3的相對(duì)強(qiáng)度通過(guò)光密度分析進(jìn)行了評(píng)價(jià)(B)。**，P < 0.01相對(duì)常氧(n = 4土SD，單因素ANOVA)嚴(yán)，P < 0.01相對(duì)載劑(n = 4土 SD，單因素ANOVA)。
[0047]圖14.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺組織中抑制低氧誘導(dǎo)的STAT3活化。將通過(guò)尾靜脈注射IOy g MEX或載劑的小鼠暴露于單壓低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間段。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)自個(gè)體肺組織勻漿的等效量蛋白質(zhì)。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析檢測(cè)磷酸化STAT3 (Y705)和肌動(dòng)蛋白的水平(A、B)。P-STAT3/肌動(dòng)蛋白的相對(duì)強(qiáng)度通過(guò)光密度分析進(jìn)行評(píng)價(jià)(C)。_，P< 0.001相對(duì)常氧或載劑(低氧、7天)或MEX(低氧，2和7天)(n = 4土SD，單因素AN0VA) ; ，P < 0.001相對(duì)載劑(低氧、2天)(n = 4土SD，單因素ANOVA) ;ns常氧相對(duì)MEX (低氧、2天)(n = 4土SD，單因素AN0VA)。
[0048]圖15.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺組織中抑制低氧誘導(dǎo)的HMF上調(diào)。將通過(guò)尾靜脈注射IOug MEX或載劑的小鼠暴露于單壓低氧(8.5%02)7天。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)自個(gè)體肺組織勻漿的等效量蛋白質(zhì)。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析檢測(cè)HMF和肌動(dòng)蛋白的水平(A)。HMF/肌動(dòng)蛋白的相對(duì)強(qiáng)度通過(guò)光密度分析進(jìn)行了評(píng)價(jià)(B)。**,P <0.01相對(duì)常氧(n = 4土SD，單因素AN0VA) ;#，P < 0.05相對(duì)載劑(11 = 4±50，單因素ANOVA) ；MEX與常氧之間統(tǒng)計(jì)學(xué)不顯著(n = 4土SD，單因素AN0VA)。
[0049]圖16.MSC來(lái)源外來(lái)體在肺組織中抑制低氧誘導(dǎo)的HMF上調(diào)。將通過(guò)尾靜脈注射IOug MEX或載劑的小鼠暴露于單壓低氧(8.5% O2)指定的時(shí)間段。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)自個(gè)體肺組織勻漿的等效量蛋白質(zhì)。使用特異性抗體通過(guò)western印跡分析檢測(cè)HMF和肌動(dòng)蛋白的水平(A、B)。HMF/肌動(dòng)蛋白的相對(duì)強(qiáng)度通過(guò)光密度分析進(jìn)行了評(píng)價(jià)(C、D)。***，P < 0.001 相對(duì)常氧(n = 4土SD，單因素 AN0VA) ;**，P < 0.01 相對(duì)常氧(n=4土SD，單因素 AN0VA) ;#，P < 0.05 相對(duì)載劑(n = 4土SD，單因素 AN0VA)。
[0050]圖17.MSC來(lái)源外來(lái)體保護(hù)長(zhǎng)期低氧引起的右心肥大。將通過(guò)尾靜脈注射IOy gMEX(M)或載劑(V)的小鼠暴露于單壓低氧(8.5% 02)3周(A)。處理單個(gè)鼠的心然后測(cè)量RV/ (LV+S)比值(B)。***，P < 0.001 相對(duì)常氧(n = 9，單因素 AN0VA) ; ，P < 0.001 相對(duì)載劑(n = 11，單因素ANOVA) ;MEX和常氧之間統(tǒng)計(jì)上不顯著(單因素AN0VA)。
[0051]圖18.MSC外來(lái)體經(jīng)FPLC(快速蛋白液相色譜)純化的高分辨率譜。上圖:MSC外來(lái)體純化的快速蛋白質(zhì)液相色譜?；|(zhì):HiPrep Sephracyl S-400。流動(dòng)相磷酸鹽緩沖鹽水，300mM。流速:0.5ml/分鐘。將濃縮的條件培養(yǎng)基加到柱上并且由A280監(jiān)測(cè)洗脫的蛋白質(zhì)。分離的MSC外來(lái)體(MEX)在65.5ml洗脫。將直徑50納米的納米顆粒的分子大小標(biāo)準(zhǔn)與MSC外來(lái)體共同洗脫。下圖:洗脫的級(jí)分被應(yīng)用到非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳并且隨后對(duì)總蛋白染色。MEX級(jí)分作為高M(jìn)W形式遷移，有別于條件培養(yǎng)基中的大量蛋白(bulkprotein)。
[0052]圖19.小鼠或人源的MEX抑制STAT3低氧活化。(A)用10 y g MEX制備物處理來(lái)自個(gè)體動(dòng)物肺的總蛋白提取物。右圖:低氧暴露2天在小鼠肺中通過(guò)磷酸化Tyr-705 (pY_STAT3)導(dǎo)致STAT3活化，這被鼠源MEX的處理預(yù)防。右圖:STAT3活化的定量。對(duì)于所有的組，n = 4，單因素ANOVA:**, P < 0.01相對(duì)常氧。' P < 0.01相對(duì)PBS中。(B)將人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(hPAEC)的原代培養(yǎng)物暴露于低氧(1% 02，5小時(shí))表現(xiàn)出強(qiáng)STAT3活化，STAT3活化在由人臍帶基質(zhì)MSC分泌的MEX(hUC-MEX)之存在下被有效抑制。經(jīng)hUC-MSC(hUC-ExD-CM)條件化的培養(yǎng)基的微囊泡耗竭級(jí)分對(duì)STAT3的活化沒有影響。[0053]圖20.MEX處理在肺中抑制低氧誘導(dǎo)的miR_17微小RNA超家族并且增加抗增殖miR-204的水平。用IOiig MEX制劑處理來(lái)自動(dòng)物的全部小鼠肺中的微小RNA水平。低氧暴露7天的miR水平通過(guò)qPCR進(jìn)行評(píng)估，并且表示為相對(duì)于常氧組的平均值。(A)選擇代表miR-17至92、miR-106b至25和miR-106a至363簇的miR。(B)選擇已報(bào)道的參與低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的miR。(C)肺小動(dòng)脈特異性miR-204的基礎(chǔ)水平在MEX處理后上調(diào)。點(diǎn)代表獨(dú)立動(dòng)物中的表達(dá)水平。NRX:常氧；HPX:低氧。對(duì)于所有的組，n = 4，單因素ANOVA:**, P
<0.01 ；f, P < 0.001 相對(duì)常氧?！?，P < 0.001 相對(duì) PBS。
[0054]圖21.綜合本研究結(jié)果的非限制性假設(shè)的圖解。低氧轉(zhuǎn)變了肺中免疫介體的Thl/
Th2的平衡，導(dǎo)致替換性活化的肺泡巨噬細(xì)胞(AA-AMtp),并在早期階段誘導(dǎo)肺上皮細(xì)
胞中HMF的表達(dá)。HMF對(duì)血管的有絲分裂作用需要Th2細(xì)胞因子，如IL-4。朝向增殖的轉(zhuǎn)變的后果包括STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的低氧活化和微小RNA的miR-17家族的上調(diào)。使用MEX處理干擾肺中的早期低氧信號(hào)，抑制炎癥和HMF轉(zhuǎn)錄上調(diào)二者。另外，MEX處理可直接上調(diào) miR-204 的水平，從而打破 STAT3-miR-204_STAT3 的前饋回路(feed-forward loop)，將平衡轉(zhuǎn)變?yōu)槌蚩乖鲋碃顟B(tài)。
[0055]圖22.對(duì)來(lái)自人華頓氏膠質(zhì)(WJ)MSC之外來(lái)體特異的標(biāo)記物。Western印跡分析來(lái)自與下列來(lái)源的50nm級(jí)分(El):UC:非條件化MSC生長(zhǎng)培養(yǎng)基。MPD UC:微顆粒耗竭生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在=通過(guò)聚乙二醇沉淀去除生長(zhǎng)基中的外來(lái)體標(biāo)記物。hMEX:來(lái)自WJ MSC的外來(lái)體。hFEX:來(lái)自人皮膚成 纖維細(xì)胞的外來(lái)體。四跨膜蛋白(tetraspanins)CD9和⑶81在外來(lái)體級(jí)分中富集。
[0056]圖23.mMEX在小鼠肺成纖維細(xì)胞中抑制HIFla的低氧上調(diào)和STAT3的磷酸化。如所示的，在存在或不存在小鼠骨髓MSC來(lái)源外來(lái)體(mMEX)的條件下，將小鼠肺成纖維細(xì)胞暴露于低氧。通過(guò)western印跡測(cè)定低氧誘導(dǎo)因子(HIF)的穩(wěn)定性和STAT3經(jīng)磷酸化的活化(P-STAT3)。
[0057]圖24.將使用來(lái)自小鼠骨髓來(lái)源MSC的外來(lái)體(mMEX，I U g/ml)或來(lái)自小鼠肺成纖維細(xì)胞的外來(lái)體(mFEX，I u g/ml)處理的hPAEC暴露于I % 026小時(shí)。STAT3 (P-STAT3)的低氧活化、總STAT3和HIF2a的穩(wěn)定性由western印跡確定。NRx:常氧。PBS:低氧對(duì)照。
[0058]圖25.將使用來(lái)自華頓氏膠質(zhì)MSC的外來(lái)體(hMEX，I U g/ml)或來(lái)自人真皮成纖維細(xì)胞(hFEX，I u g/ml)的外來(lái)體處理的人PAEC暴露于I % 026小時(shí)。通過(guò)western印跡測(cè)定sSTAT = 3活化(P-STAT3)和總STAT3。NRX:常氧。PBS:低氧對(duì)照。
[0059]發(fā)明詳述
[0060]本發(fā)明部分基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于間充質(zhì)干細(xì)胞的外來(lái)體對(duì)一些肺疾病(包括但不限于炎性肺疾病)提供治療效果。
[0061]本發(fā)明廣泛地涉及源自間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的外來(lái)體(可互換地稱為間充質(zhì)干細(xì)胞外來(lái)體或MSC外來(lái)體)的組合物，以及使用其治療和/或預(yù)防一些肺疾病(包括但不限于炎性肺疾病)的方法。
[0062]外來(lái)體和外來(lái)體的制備
[0063]本發(fā)明的外來(lái)體(exosome)是從間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的膜(即脂質(zhì)雙層)囊泡。其直徑范圍為約30nm至100nm。通過(guò)電子顯微鏡，外來(lái)體呈現(xiàn)出杯形形態(tài)。他們?cè)诩s100，000 Xg沉降并且在蔗糖中的浮力密度為約1.10至約1.21 g/ml O外來(lái)體可被稱為微囊泡或納米裳泡。
[0064]外來(lái)體可以包含一些蛋白質(zhì)和/或核酸(包括RNA類，例如miRNA)。可以在外來(lái)體中表達(dá)的蛋白質(zhì)包括六11乂、丁56101、0)63、0)9、0)81、膜突蛋白(moesin)、HSP70、Dicer、M-CSF、骨橋蛋白(osteopontin)，和一種或更多種列于表1的蛋白質(zhì)(包括2、3、4、5、6、7或8種這些蛋白質(zhì)與任意上述蛋白質(zhì)的任意組合)。在一些實(shí)施方案中，外來(lái)體(包括下面討論的合成外來(lái)體)包含miRNA、Dicer、M-CSF、骨橋蛋白和表1的一種或更多種蛋白質(zhì)(包括表1中所有的蛋白質(zhì))。
[0065]本發(fā)明的一些方面涉及分離的外來(lái)體。如本文所用，分離的外來(lái)體是與其自然環(huán)境物理上分離的外來(lái)體。分離的外來(lái)體可以從其天然存在的組織或細(xì)胞(包括間充質(zhì)干細(xì)胞)整體或部分地物理分離的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，分離的外來(lái)體的組合物可以不含細(xì)胞例如間充質(zhì)干細(xì)胞，或者其可以不含或基本不含條件培養(yǎng)基(conditionedmedia)。在一些實(shí)施方案中，分離的外來(lái)體可以以比未經(jīng)操作之條件培養(yǎng)基中存在的外來(lái)體更高的濃度提供。
[0066]外來(lái)體可以從間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基中分離。從間充質(zhì)干細(xì)胞收獲外來(lái)體的方法在實(shí)施例中提供。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這種方法涉及，首先在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞直到它們達(dá)到約70%匯合度，然后在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，隨后收集條件培養(yǎng)基并進(jìn)行差速離心(400XglO分鐘和12000XglO分鐘)以除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后將澄清的條件培養(yǎng)基通過(guò)使用IOOkDa MWCO濾器(Millipore)的超濾濃縮，然后在12000Xg再次離心10分鐘。然后通過(guò)以下使用尺寸排阻色譜分離外來(lái)體:將濃縮的條件培養(yǎng)基上樣到PBS平衡的Chroma S-200柱(Clontech公司)，用PBS洗脫，并收集350-550微升的級(jí)分。鑒定包含外來(lái)的級(jí)分并可能地進(jìn)行合并。使用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford測(cè)定(Bio-Rad)測(cè)量蛋白濃度。富集的外來(lái)體制備物的等分試樣可在_80°C下儲(chǔ)存。
[0067]也可以通過(guò)在100，OOOXg下超速離心澄清的條件培養(yǎng)基來(lái)純化外來(lái)體。它們也可以通過(guò)超速離心成鹿糖墊(cushion)來(lái)純化。已經(jīng)在J Immunol Methods2002 ；270:211-226中描述了用于從樹突狀細(xì)胞純化外來(lái)體的GMP方法。
[0068]外來(lái)體也可以使用設(shè)定孔徑的尼龍膜濾器通過(guò)差異過(guò)濾純化。通過(guò)大孔徑的第一過(guò)濾將保留細(xì)胞部分和碎片。通過(guò)較小孔徑的隨后過(guò)濾會(huì)保留外來(lái)體并且從更小尺寸的污染物中純化它們。
[0069]本發(fā)明還考慮使用具有本文所述分離的MSC外來(lái)體的一些或全部特點(diǎn)的合成外來(lái)體。這些合成的外來(lái)體將在體外合成(而不是來(lái)自或分離自MSC或MSC-CM)。它們可以是具有一種或更多種(包括2、3、4、5、6、7、8種或更多種列于表1或圖22中的)蛋白質(zhì)的合成脂質(zhì)體。它們可包含或可不包含編碼一種或更多種(包括2、3、4、5、6、7、8種或更多種)這些蛋白質(zhì)的核酸。脂質(zhì)體合成在本領(lǐng)域是已知的，并且脂質(zhì)體可以從商業(yè)來(lái)源購(gòu)買。應(yīng)當(dāng)理解的是，涉及來(lái)自或分離自MSC或MSC-CM的外來(lái)體的多種本文所述組合物、制劑、方法和用途也在合成外來(lái)體的情況中被考慮。
[0070]本發(fā)明考慮了外來(lái)體的立即使用或替代的外來(lái)體的短期和/或長(zhǎng)期儲(chǔ)存，例如，使用前在冷凍保存狀態(tài)下儲(chǔ)存。冷凍介質(zhì)中通常包含蛋白酶抑制劑，由于它們?cè)陂L(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中提供了外來(lái)體的完整性。在-20°C下冷凍不是優(yōu)選的，因?yàn)槠渑c外來(lái)體活性的損失增加相關(guān)。在-80°C下快速冷凍是更優(yōu)選的，因?yàn)檫@保留了活性(參見例如KidneyInternational (2006)69，1471-1476)?？梢允褂脤?duì)冷凍介質(zhì)的添加劑，以加強(qiáng)外來(lái)體生物活性的保存。這樣的添加劑與用于冷凍保存完整細(xì)胞的添加劑是相似的，并且可包括但不限于DMS0、甘油和聚乙二醇。
[0071]表1
[0072]與MEX比FEX相關(guān)的特異性和富集蛋白質(zhì)
【權(quán)利要求】
1.配制為遞送至肺的用于患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病之人對(duì)象的藥物組合物，其包含有效量的分離的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體和肺表面活性劑，其中所述對(duì)象小于4周齡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述分離的人MSC外來(lái)體分離自人臍帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中所述人對(duì)象在37孕周前出生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中所述人對(duì)象已被施用氧氣或者已與通氣機(jī)連通。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的藥物組合物，其中所述人對(duì)象患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述支氣管肺發(fā)育不良是非炎性的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5或6所述的藥物組合物，其中所述分離的人MSC外來(lái)體在出生I天內(nèi)施用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述分離的人MSC外來(lái)體在出生I小時(shí)內(nèi)施用。
9.方法，其包括 向患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的對(duì)象施用有效量的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。
10.分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體的組合物，其用于治療或預(yù)防肺疾病。
11.分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體的組合物，其用作治療或預(yù)防肺疾病的藥物。
12.包含分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體的藥物組合物，其用于治療或預(yù)防肺疾病。
13.分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體在治療或預(yù)防對(duì)象中的肺疾病中的用途。
14.分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體在制備藥物中的用途，所述藥物用于在患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的對(duì)象中治療或預(yù)防肺疾病。
15.分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體，其用于治療或預(yù)防肺疾病的方法中，所述方法包括向患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生肺疾病的對(duì)象施用有效量的所述分離的MSC外來(lái)體。
16.權(quán)利要求9所述的方法，權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的組合物，權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)所述的用途，或權(quán)利要求15所述的分離的MSC外來(lái)體，其中肺疾病是炎性肺疾病、肺血管疾病或急性肺損傷。
17.權(quán)利要求16所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述炎性肺疾病是肺部高血壓、哮喘、支氣管肺發(fā)育不良(BPD)、變態(tài)反應(yīng)或特發(fā)性肺纖維化。
18.權(quán)利要求16所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述急性肺損傷與膿毒癥相關(guān)或者是通氣機(jī)引起的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。
19.權(quán)利要求9所述的方法，權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的組合物，權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)所述的用途，或權(quán)利要求15所述的分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象患有或可能發(fā)生血吸蟲病。
20.權(quán)利要求9至19中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象是新生兒。
21.權(quán)利要求9至19中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象是嬰兒。
22.權(quán)利要求9至19中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象的年齡為3至18歲。
23.權(quán)利要求9至19中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象是成體。
24.權(quán)利要求9至23中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象是早產(chǎn)的。
25.權(quán)利要求9至24中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象在35孕周前出生。
26.權(quán)利要求9至25中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象在30孕周前出生。
27.權(quán)利要求9至26中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象在26孕周前出生。
28.權(quán)利要求9至27中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體與第二藥劑一起使用。
29.權(quán)利要求28所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述第二藥劑是類固醇、抗氧化劑或吸入的一氧化氮。
30.權(quán)利要求29所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述類固醇是皮質(zhì)類固醇。
31.權(quán)利要求30所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述皮質(zhì)類固醇是甲基潑尼松龍。
32.權(quán)利要求29所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述抗氧化劑是超氧化物歧化酶。
33.權(quán)利要求20或24至27中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體在出生I小時(shí)內(nèi)施用。
34.權(quán)利要求20或24至27中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體在出生I個(gè)月內(nèi)施用。
35.權(quán)利要求9至34中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體通過(guò)靜脈內(nèi)施用。
36.權(quán)利要求9至34中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體被施用至所述對(duì)象的肺或氣管。
37.權(quán)利要求36所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體通過(guò)吸入施用。
38.權(quán)利要求36所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體在氣溶膠中施用。
39.權(quán)利要求36所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體使用噴霧器施用。
40.權(quán)利要求36所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體使用氣管內(nèi)的管施用。
41.權(quán)利要求9至40中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體與肺表面活性劑一起施用。
42.權(quán)利要求41所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述肺表面活性劑是分離的天然表面活性劑。
43.權(quán)利要求42所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述肺表面活性劑來(lái)源于牛肺或豬肺。
44.權(quán)利要求41所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述肺表面活性劑是合成的表面活性劑。
45.權(quán)利要求9至44中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體被重復(fù)施用至所述對(duì)象。
46.權(quán)利要求9至44中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體被施用至所述對(duì)象兩次。
47.權(quán)利要求9至44中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體被連續(xù)地施用至所述對(duì)象。
48.前述權(quán)利要求9至47中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體來(lái)源于臍帶血MSC。
49.權(quán)利要求9至47中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體來(lái)源于骨髓MSC。
50.權(quán)利要求9至49中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體對(duì)于對(duì)象是自體的。
51.權(quán)利要求9至49中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述分離的MSC外來(lái)體對(duì)于所述對(duì)象是同種異體的。
52.權(quán)利要求9至51中任一項(xiàng)所述的方法、組合物、用途或分離的MSC外來(lái)體，其中所述對(duì)象未接受細(xì)胞或器官移植。
53.組合物，其包含 配制用于氣管內(nèi)施用或通過(guò)吸入施用的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。
54.組合物，其包含 分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體，以及 肺表面活性劑。
55.組合物，其包含 分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體，以及 肺皮質(zhì)類固醇。
56.權(quán)利要求55所述的組合物，其中所述肺皮質(zhì)類固醇是甲基潑尼松龍。
57.氣溶膠化的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)外來(lái)體。
58.組合物，其包含權(quán)利要求57所述的氣溶膠化的分離的MSC外來(lái)體。
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK103648509SQ201280019239
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月11日
【發(fā)明者】S·亞歷山大·米特西利斯, 李昌鎮(zhèn), 斯特蘭·庫(kù)雷姆巴納斯 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)學(xué)中心公司