不良水溶性物質(zhì)的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在脂質(zhì)體中包封、尤其通過主動(dòng)裝載包封具有低水溶解度的物質(zhì)的領(lǐng)域。本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，可通過溶解度增強(qiáng)劑首先溶解自身幾乎不溶于水的功能性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)具有高脂質(zhì)體裝載的脂質(zhì)體的有效主動(dòng)裝載。這顯著地使功能性物質(zhì)與脂質(zhì)的質(zhì)量比增加至高于通過常規(guī)主動(dòng)或被動(dòng)裝載技術(shù)而獲得的那些水平的水平，并且擴(kuò)大了適于包封在脂質(zhì)體中的包括藥物在內(nèi)的功能性物質(zhì)的范圍。本發(fā)明一方面提供了主動(dòng)裝載方法。本發(fā)明還提供具有高載藥的脂質(zhì)體組合物。
【專利說明】不良水溶性物質(zhì)的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及在脂質(zhì)體中包封具有低水溶解度的物質(zhì)的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及不良水溶性藥物到脂質(zhì)體中的主動(dòng)裝載。本發(fā)明還提供了具有高載藥的脂質(zhì)體組合物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在醫(yī)學(xué)環(huán)境和研究環(huán)境中，高度期望診斷劑和治療劑向細(xì)胞和組織的有效遞送。盡管多年來已產(chǎn)生了許多用于診斷劑和治療劑的遞送系統(tǒng)，但具有最小副作用和低毒性的用于具有不良水溶解度的化合物的有效遞送系統(tǒng)仍遙不可及。因此，對(duì)于實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的診斷劑和治療劑遞送技術(shù)而言，存在著持續(xù)的需求。
[0004]腦部是藥物治療和診斷的特別具有挑戰(zhàn)性的靶標(biāo)。具體地，因?yàn)檠X屏障(BBB)抑制了診斷劑和治療劑向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的全身給藥的效力。能穿過BBB的大部分藥物以及許多藥理學(xué)目標(biāo)化合物為親脂性的，因此具有非常低的水溶解度或甚至不溶于水。有限的水溶解度妨礙了藥物或功能性化合物的靜脈內(nèi)給藥。此外，通過血液的給藥導(dǎo)致體內(nèi)的毒副作用。此外，藥物或功能性化合物是否能以治療量達(dá)到靶器官仍存在疑問。仍需要用于將治療化合物和/或診斷化合物穿過BBB有效遞送至CNS靶標(biāo)的組合物和方法。
[0005]已經(jīng)提出脂質(zhì)體能增加穿過BBB達(dá)到腦部的藥物遞送(EP 0652775 BI以及其中的參考文獻(xiàn))。本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知脂質(zhì)體能裝載各種組分，包括藥物、肽和蛋白。用于遞送藥物和其他功能性化合物的脂質(zhì)體的優(yōu)勢(shì)主要在于，與靜脈內(nèi)給藥游離化合物相比，由脂質(zhì)體制劑表現(xiàn)出降低的毒副作用。
[0006]在利用用于遞送功能性化合物的脂質(zhì)體時(shí)，通常期望將脂質(zhì)體裝載至高濃度，產(chǎn)生功能性化合物-脂質(zhì)的高質(zhì)量比，因?yàn)檫@降低了每次治療為獲得所需治療作用而給藥的脂質(zhì)體的量，更是因?yàn)樵谥|(zhì)體中使用的多個(gè)脂質(zhì)自身具有劑量限制性毒性(引用)。裝載百分比對(duì)于成本效率也是重要的，因?yàn)椴涣佳b載導(dǎo)致活性化合物的大幅損失。
[0007]用于將功能性化合物、特別是藥物包封在脂質(zhì)體中的多種裝載方法是可行的。例如，親水性化合物能通過將功能性化合物和形成囊泡的脂質(zhì)的混合物水化而被包封在脂質(zhì)體中。該技術(shù)被稱為“被動(dòng)裝載”。當(dāng)納米顆粒形成時(shí)，功能性化合物被包封在脂質(zhì)體中。親脂性以及在較小程度上為兩親性的功能化合物，與親水性功能性化合物相比，稍微更加有效地被裝載，這是因?yàn)樗鼈兎峙湓谥|(zhì)雙層和脂質(zhì)體內(nèi)的含水介質(zhì)中。然而，使用被動(dòng)裝載，最終的功能性化合物與脂質(zhì)的比以及包封效率通常是低的。藥物在脂質(zhì)體中的濃度等于周圍流體的濃度，并且游離的未包封的藥物在包封之后被沖洗掉。
[0008]可使用溶解度增強(qiáng)劑以增加親脂性化合物在脂質(zhì)體外的含水介質(zhì)中的濃度，從而增加被動(dòng)裝載技術(shù)的最終的功能性化合物與脂質(zhì)的比。基于共溶劑、表面活性劑和絡(luò)合劑的使用，已經(jīng)開發(fā)了許多用于溶解親脂性化合物的方法。在含水藥物制劑中常用的多種溶解度增強(qiáng)劑為環(huán)糊精、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、山梨醇、非離子表面活性劑和聚乙氧基化蓖麻油。在一些情況中，極端的PH還可以用于增加不良可溶性藥物的溶解度。然而，這些溶解度增強(qiáng)劑和溶解度增強(qiáng)條件對(duì)于人類而言可能為毒性的或刺激性的。
[0009]由Challa等人，2005給出了環(huán)糊精-藥物絡(luò)合的綜述。McCormack等人，1994&1998描述了使用被動(dòng)裝載技術(shù)將羥丙基-P -環(huán)糊精-藥物包合絡(luò)合物包封入脂質(zhì)體的方法。經(jīng)改性的環(huán)糊精用作用于水不溶性藥物地塞米松、脫氫表雄酮、視黃醇和視黃酸的溶解度增強(qiáng)劑，與當(dāng)裝載有未絡(luò)合的藥物時(shí)獲得的脂質(zhì)體相比，其產(chǎn)生具有增加的藥物與脂質(zhì)體的質(zhì)量比的脂質(zhì)體。
[0010]US 2009/0196918 Al公開了具有羥丙基-P -環(huán)糊精或磺丁醚-P -環(huán)糊精和疏水性內(nèi)酯藥物的包合絡(luò)合物的脂質(zhì)體制劑。通過被動(dòng)裝載將環(huán)糊精-藥物包合絡(luò)合物包封入脂質(zhì)體。
[0011]US 2007/0014845 Al公開了具有小于約50 y g/ml的典型水溶解度的疏水性藥物的脂質(zhì)體遞送載劑，其包含用親水性聚合物衍生化的脂質(zhì)。通過形成藥物-環(huán)糊精包合絡(luò)合物來增加所述疏水性藥物在脂質(zhì)體內(nèi)的溶解度。在脂質(zhì)體內(nèi)的環(huán)糊精濃度優(yōu)選大于400mg/ml。通過被動(dòng)裝載進(jìn)行包合絡(luò)合物的包封。
[0012]這些被動(dòng)裝載技術(shù)的缺點(diǎn)為，除了所需功能性化合物之外的溶解度增強(qiáng)劑環(huán)糊精的不期望的給藥，以及包封效率仍不令人滿意的事實(shí)。
[0013]使用跨膜pH梯度或離子梯度可將某些親水性或兩親性化合物裝載到預(yù)制的脂質(zhì)體中(Zucker等人，2009)。該技術(shù)被稱為主動(dòng)或遠(yuǎn)程裝載。適于主動(dòng)裝載的化合物應(yīng)能從可擴(kuò)散穿過脂質(zhì)體膜的不帶電形式變化為不能擴(kuò)散穿過脂質(zhì)體膜的帶電形式。通常，通過向被制備為具有更低外部/更高內(nèi)部PH梯度或離子梯度的脂質(zhì)體懸浮液添加功能性化合物來裝載所述功能性化合物。通過主動(dòng)裝載，可以實(shí)現(xiàn)功能性化合物與脂質(zhì)的高質(zhì)量比以及高的裝載效率(到達(dá)100%)。實(shí)例為抗癌藥物阿霉素、道諾霉素和長(zhǎng)春新堿的主動(dòng)裝載(Cullis等人，1997，以及其中的參考文獻(xiàn))。
[0014]對(duì)于非極性/極性表面積比>2.31的親脂性化合物，必要的是，藥物具有合理溶解度，即>1.9mM，從而實(shí)現(xiàn)有效的主動(dòng)裝載，這是因?yàn)閮H有可溶性不帶電分子能進(jìn)入脂質(zhì)體(Zucker等人，2009)。這意味著許多親脂性功能性化合物，例如與穿過BBB相關(guān)的藥物，不能通過主動(dòng)裝載而產(chǎn)生足夠高的功能性化合物與脂質(zhì)的質(zhì)量比。
[0015]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0016]本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，可使用溶解度增強(qiáng)劑，通過首先溶解自身不溶于水或具有非常低的水溶解度的功能性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)具有高脂質(zhì)體裝載的脂質(zhì)體的有效主動(dòng)裝載。因此，本發(fā)明將具有低水溶解度的物質(zhì)的功能性物質(zhì)與脂質(zhì)的質(zhì)量比增加至高于通過脂質(zhì)體的常規(guī)的主動(dòng)或被動(dòng)裝載技術(shù)而獲得的那些水平的水平，并且擴(kuò)大了適于包封在脂質(zhì)體中的包括藥物在內(nèi)的功能性物質(zhì)的范圍。
[0017]不希望受到任何理論的束縛或限制本發(fā)明的范圍，要確信的是，本發(fā)明允許使用溶解度增強(qiáng)劑裝載脂質(zhì)體，所述溶解度增強(qiáng)劑在裝載期間和裝載之后保持在脂質(zhì)體外部。在從包含未包封的功能性化合物的流體相分離脂質(zhì)體之后，通常地，在剩余的脂質(zhì)體制劑中存在非常少的增溶劑或根本不存在增溶劑。
[0018]本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見是，本發(fā)明的方法的使用不限于藥物產(chǎn)品。需要不良水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)體包封的任何產(chǎn)品或方法都可受益于本發(fā)明。因此，即使本文具體例示和/或限定的所有實(shí)施方案涉及藥物產(chǎn)品，本申請(qǐng)也包括不涉及藥物產(chǎn)品的實(shí)施方案。
[0019]發(fā)明詳述
[0020]本發(fā)明的第一方面涉及使用不良水溶性物質(zhì)裝載脂質(zhì)體的方法，所述方法包括:[0021 ] a)提供混合物，其包含:
[0022]1.包封內(nèi)部含水介質(zhì)的脂質(zhì)體；
[0023]i1.所述不良水溶性物質(zhì)；
[0024]i i i外部含水介質(zhì)；以及
[0025]iv.增加所述不良水溶性物質(zhì)在所述外部含水介質(zhì)中的溶解度的溶解
[0026]度增強(qiáng)劑；
[0027]其中存在跨所述脂質(zhì)體膜的質(zhì)子梯度和/或離子梯度；以及
[0028]b)孵育所述混合物,持續(xù)足以導(dǎo)致至少部分所述不良水溶性物質(zhì)被提取出(drawnout)所述外部含水介質(zhì)并在所述質(zhì)子梯度和/或離子梯度的影響下在所述脂質(zhì)體中蓄積的時(shí)間段。
[0029]在本文件及其權(quán)利要求書中，動(dòng)詞“包括”及其詞形變化以其非限制性含義使用，從而表示在該詞語之后的項(xiàng)目被包括在內(nèi)，但不排除未特別提及的項(xiàng)目。此外，由英文不定冠詞“a”或“an”所提及的元素不排除存在多于一個(gè)所述元素的可能性，除非上下文明確要求有且只有一個(gè)所述元素。因此，英文不定冠詞“a”或“an”表示“至少一個(gè)”。
[0030]脂質(zhì)體
[0031]本發(fā)明包括提供包含預(yù)制脂質(zhì)體的混合物，所述預(yù)制脂質(zhì)體包封內(nèi)部含水介質(zhì)。術(shù)語“脂質(zhì)體”按照其一般含義用 在本文中，是指包封內(nèi)部含水介質(zhì)的、由雙層磷脂或任何類似的兩親性脂質(zhì)組成的微觀脂質(zhì)囊泡。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以為單層囊泡(如小單層囊泡(SUV)和大單層囊泡(LUV))以及多層囊泡(MLV)，通常尺寸為50nm至200nm。在本發(fā)明中，對(duì)脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)沒有施加特別限制。術(shù)語“脂質(zhì)體膜”是指將內(nèi)部含水介質(zhì)與外部含水介質(zhì)分開的雙層磷脂。
[0032]可用于本發(fā)明的脂質(zhì)體膜可以由多種形成囊泡的脂質(zhì)形成，所述形成囊泡的脂質(zhì)通常包括二脂族鏈脂質(zhì)如磷脂，雙甘油二酯，二脂族糖脂(dialiphatic glycolipid),單脂質(zhì)如鞘磷脂和鞘糖脂，膽固醇及其衍生物，以及它們的組合。如本文所定義，磷脂是兩親性物質(zhì)，其具有由長(zhǎng)鏈烷基鏈形成的疏水性基團(tuán)和包含磷酸根部分的親水性基團(tuán)。磷脂包括磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸，以及它們的混合物。優(yōu)選地，所述磷脂選自1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、二肉豆蘧酰-磷脂酰膽堿(DMPC)、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、大豆磷脂酰膽堿(SPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、蛋黃磷脂酰膽堿(EYPC)或氫化蛋黃磷脂酰膽堿(HEPC)。
[0033]本發(fā)明的脂質(zhì)體膜還可以包含離子載體，例如尼日利亞菌素和A23187。
[0034]在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的是，脂質(zhì)體的相變溫度為0°C至100°C，優(yōu)選4°C至650C。相變轉(zhuǎn)化溫度是誘導(dǎo)組成脂質(zhì)體的脂質(zhì)由其中烴鏈完全伸展且緊密堆砌的有序凝膠相變化為其中烴鏈隨機(jī)取向且為流體的無序液晶相的物理狀態(tài)變化所需的溫度。在脂質(zhì)體的相變溫度之上，脂質(zhì)體膜的滲透性增加。選擇脂質(zhì)體始終為凝膠態(tài)的高轉(zhuǎn)變溫度會(huì)提供無滲漏脂質(zhì)體組合物，即，在暴露于環(huán)境時(shí)，內(nèi)部含水介質(zhì)中的不良水溶性物質(zhì)的濃度得到保持?；蛘撸D(zhuǎn)變溫度在其所暴露的環(huán)境的起始溫度至終末溫度之間的脂質(zhì)體會(huì)提供當(dāng)所述脂質(zhì)體經(jīng)過其轉(zhuǎn)變溫度時(shí)釋放不良水溶性物質(zhì)的手段(means)。因此，用于主動(dòng)裝載技術(shù)的加工溫度通常高于脂質(zhì)體相變溫度以促進(jìn)主動(dòng)裝載過程。如本領(lǐng)域普遍已知的，除了其他參數(shù)之外，可通過選擇磷脂和通過添加諸如膽固醇、羊毛固醇、膽留烷醇、糞留醇、麥角固醇等的類固醇來影響脂質(zhì)體的相變溫度。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供任一前述的方法，其中脂質(zhì)體包含一種或多種選自不同磷脂的組分和膽固醇，所述組分和膽固醇的摩爾比有多種，從而改變所述轉(zhuǎn)變、所需加工溫度以及在血漿中的脂質(zhì)體穩(wěn)定性。在混合物中的膽固醇越少會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體在血漿中越不穩(wěn)定。優(yōu)選的磷脂組合物包括10摩爾％至50摩爾％的類固醇，優(yōu)選膽固醇。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，可通過目前已知的或以后為了制備脂質(zhì)體而開發(fā)的任何技術(shù)來制備脂質(zhì)體。例如，脂質(zhì)體可通過用于制備多層脂質(zhì)囊泡(MLV)的常規(guī)技術(shù)而形成，即，通過將一種或多種所選的脂質(zhì)溶解在氯仿中并隨后蒸發(fā)所述氯仿而將所述脂質(zhì)沉積在合適的容器的內(nèi)壁上，然后通過向所述容器添加要包封的水溶液，使所述水溶液將所述脂質(zhì)水化，并旋動(dòng)或渦旋所得的脂質(zhì)懸浮液。該過程產(chǎn)生包含所需脂質(zhì)體的混合物。或者，用于制備大單層脂質(zhì)囊泡(LUV)的技術(shù)，例如逆相蒸發(fā)、輸注法以及去垢劑稀釋，可以用于制備脂質(zhì)體。這些和其他用于制備脂質(zhì)囊泡的方法的可見于文件Liposome Technology, Volume
I,Gregory Gregoriadis Ed., CRC Press, Boca Raton, Fla., (1984),其通過援引加入本文。例如，含脂質(zhì)的顆?？蔀橄率鲂问?留體脂質(zhì)囊泡、穩(wěn)定的多層脂質(zhì)囊泡(SPLV)、單相囊泡(MPV)或脂質(zhì)基質(zhì)載體(LMC)。對(duì)于MLV，若需要，可將脂質(zhì)體進(jìn)行多次(五次或更多次)凍融循環(huán)以增加其包封體積和包封效率，并提供更均勻的溶質(zhì)層間分布。
[0036]在脂質(zhì)體制備之后，可以對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行尺寸調(diào)整(sized)以實(shí)現(xiàn)所需的尺寸范圍和相對(duì)窄的脂質(zhì)體尺寸分布。約20-200納米的尺寸范圍允許通過常規(guī)過濾器(通常0.22或
0.4微米過濾器)過濾對(duì)脂質(zhì)體懸浮液進(jìn)行消毒。如果脂質(zhì)體尺寸已經(jīng)被下調(diào)至約20-200納米，則可以高通量(through-put basis)實(shí)施所述過濾器消毒法。多種技術(shù)可用于將脂質(zhì)體尺寸調(diào)整至所需尺寸。通過浴或探針超聲處理來超聲處理脂質(zhì)體懸浮液產(chǎn)生了逐漸的尺寸降低，直至尺寸小于約50納米的單層囊泡。均化是另一方法，其依賴于剪切能以將大脂質(zhì)體破碎成更小的脂質(zhì)體。在典型的均化操作中，將多層囊泡通過標(biāo)準(zhǔn)乳液均化器再循環(huán)，直至觀察到所選的脂質(zhì)體尺寸，通常為約50-500納米。在兩種方法中，可以通過常規(guī)的激光束粒徑測(cè)定來監(jiān)測(cè)粒徑分布。`通過小孔聚碳酸酯膜或不對(duì)稱陶瓷膜的脂質(zhì)體的擠出也是用于將脂質(zhì)體尺寸降低至相對(duì)界定明確的尺寸分布的有效方法。通常，使懸浮液通過膜循環(huán)一次或多次，直至實(shí)現(xiàn)所需的脂質(zhì)體尺寸分布。可以通過依次更小孔徑的膜來擠出脂質(zhì)體，以實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體尺寸的逐漸降低。其他可用的尺寸調(diào)整方法，例如超聲處理、溶劑蒸發(fā)或逆相蒸發(fā)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0037]為了用于本發(fā)明，尺寸為約50納米至約180納米的脂質(zhì)體是優(yōu)選的。
[0038]如本文所提到的，‘內(nèi)部含水介質(zhì)’通常為這樣的初始介質(zhì):在所述初始介質(zhì)中制備脂質(zhì)體，且當(dāng)形成所述脂質(zhì)體時(shí)，所述初始介質(zhì)首先被包封。根據(jù)本發(fā)明，包封所述初始含水介質(zhì)的新鮮制備的脂質(zhì)體可直接用于主動(dòng)裝載。然而，還可考慮這樣的實(shí)施方案，其中，例如為了貯存，在制備之后將脂質(zhì)體脫水。在這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括向用于產(chǎn)生跨膜梯度的外部含水介質(zhì)直接添加脫水的脂質(zhì)體。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，還可以首先將所述脂質(zhì)體在另一外部介質(zhì)中水化。優(yōu)選地，使用標(biāo)準(zhǔn)冷凍-干燥設(shè)備或等效裝置，在減壓下將脂質(zhì)體脫水?？梢詫⒅|(zhì)體及其周圍介質(zhì)冷凍在液氮中，然后脫水和減壓放置。沒有先前冷凍的脫水與有先前冷凍的脫水相比耗時(shí)更長(zhǎng)，但是，沒有冷凍步驟，總體過程更溫和，因此，隨后對(duì)脂質(zhì)體的破壞更小以及內(nèi)部?jī)?nèi)容物的損失更少。為了確保脂質(zhì)體在不損失大部分內(nèi)部?jī)?nèi)容物的情況下度過(survive)脫水過程，通常采用一種或多種保護(hù)糖以與脂質(zhì)囊泡膜相互作用并且使它們?cè)诔ハ到y(tǒng)中的水時(shí)保持完整?？墒褂枚喾N糖，包括諸如海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖和葡聚糖的糖。通常，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)二糖糖類與單糖糖類相比表現(xiàn)得更好，其中二糖海藻糖和蔗糖最有效。也可使用其他更復(fù)雜的糖。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括鏈霉素和雙氫鏈霉素的氨基糖苷在脫水期間保護(hù)脂質(zhì)體。通常，包含一種或多種糖以作為脂質(zhì)囊泡的內(nèi)部介質(zhì)或外部介質(zhì)的一部分。更優(yōu)選地，將所述糖包含在內(nèi)部介質(zhì)和外部介質(zhì)二者中，從而于它們可與脂質(zhì)體膜的內(nèi)表面和外表面二者相互作用。通過向在脂質(zhì)體形成過程中被包封在脂質(zhì)囊泡中的緩沖劑添加所述一種糖或多種糖，完成在內(nèi)部介質(zhì)中的包含。在這些實(shí)施方案中，在主動(dòng)裝載過程中使用的外部介質(zhì)還應(yīng)優(yōu)選包含所述保護(hù)糖中的一種或多種。
[0039]如本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的，聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)綴合物已經(jīng)廣泛用于改善脂質(zhì)體包封的功能性化合物的循環(huán)時(shí)間，從而避免或降低功能性化合物從脂質(zhì)體組合物的過早滲漏以及防止身體免疫系統(tǒng)檢測(cè)到脂質(zhì)體。PEG-衍生的脂質(zhì)到脂質(zhì)體的連接被稱為聚乙二醇化。因此，在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體為聚乙二醇化的脂質(zhì)體。通過將PEG的反應(yīng)性衍生物與靶脂質(zhì)體一起孵育，實(shí)現(xiàn)聚乙二醇化。本發(fā)明的合適的PEG衍生的脂質(zhì)包括被下列之一官能化的DSPE-PEG綴合物:羧酸、谷胱甘肽(GSH)、馬來酰亞胺(MAL)、
3-(2-吡啶基二硫基)丙酸(PDP)、氰尿酸(cyanur)、疊氮化物、胺、生物素或葉酸，其中PEG的分子量為2000-5000g/mol。其他合適的PEG衍生的脂質(zhì)為與神經(jīng)酰胺綴合的mPEG，其具有(:8或(:16-尾部，其中mPEG的分子量為750-5000g/mol。其他合適的配體為與甘油磷脂綴合的mPEG或官能化PEG，例如，I, 2- 二肉豆蘧酰-sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2- 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)等。脂質(zhì)體的聚乙二醇化是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的技術(shù)。
[0040]在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用DSPE-PEG-GSH綴合物(高達(dá)5mol%)和/或DSPE-mPEG綴合物(其中PEG分子量通常為750-5000g/mol，例如2000g/mol)將脂質(zhì)體聚乙二醇化。本發(fā)明的磷脂組合物可以包含高達(dá)5-20mol%的PEG-脂質(zhì)綴合物。
[0041]此外，在某些實(shí)施方案中，期望將使脂質(zhì)體特異性靶向特定細(xì)胞類型、組織等的部分摻入脂質(zhì)體膜中。以前已經(jīng)描述了使用多種靶向部分(例如，配體、受體和單克隆抗體)的脂質(zhì)體靶向。這樣的靶向部分的合適的實(shí)例包括:脂蛋白脂肪酶(LPL)、[ a ]2_巨球蛋白([a]2M)、受體相關(guān)蛋白(RAP)、乳鐵蛋白、去氨普酶、組織-和尿激酶-型纖溶酶原激活劑(tPA/uPA)、纖溶酶原激活抑制劑(PA1-1)、tPA/uPA: PA1-1復(fù)合物、黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(或P97)、血小板反應(yīng)蛋白I和2、肝脂肪酶、因子Vlla/組織-因子途徑抑制劑(TFPI)、因子Villa、因子Ixa、A[ P ] 1-40、淀粉樣-[P ]前體蛋白(APP)、C1抑制劑、補(bǔ)體C3、載脂蛋白E (apoE)、假單胞菌外毒素A、CRM66、HIV-1 Tat蛋白、鼻病毒、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)、MMP_13 (膠原酶-3)、鞘脂激活蛋白(SAP)、妊娠帶蛋白、抗凝血酶II1、肝素輔因子I1、[ a ] 1-抗胰蛋白酶、熱休克蛋白96(HSP-96)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、載脂蛋白J(apoJ或叢生蛋白)、與 apoj 和 apoE 結(jié)合的 A[ P ]、抑肽酶、angiopep-2 (TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)、極低密度脂蛋白(VLDL)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、瘦素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、凝集素、對(duì)所述抗體具有特異性的素?cái)M肽和/或人源化單克隆抗體或肽(例如，與人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合的序列HAIYPRH和THRPPMWSPVWP，或抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)單克隆抗體A24)、血紅蛋白、白喉毒素多肽鏈的無毒部分、白喉毒素B鏈的所有或部分、白喉毒素CRM197的無毒突變體的所有或一部分、載脂蛋白B、載脂蛋白E (例如，在與polysorb-80涂層結(jié)合后)、維生素D結(jié)合蛋白、維生素A/視黃醇結(jié)合蛋白、維生素B12/鈷胺素血漿載體蛋白、谷胱甘肽和鈷胺傳遞蛋白-B12。
[0042]靶向機(jī)制通常需要靶向劑以靶向部分可與靶標(biāo)(如細(xì)胞表面受體)相互作用的方式位于脂質(zhì)體表面上。通常以首先在形成膜時(shí)將連接體(connector)部分摻入所述膜的方式來形成脂質(zhì)體。所述連接體部分必須具有親脂性部分，所述親脂性部分被牢固地嵌入和錨固在所述膜中。其必須還具有親水性部分，所述親水性部分在脂質(zhì)體的水性表面上為在化學(xué)上可利用的。選擇所述親水性部分，使得于其在化學(xué)上適于與后來添加的靶向劑形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵。因此，連接體分子必須具有親脂性錨，和從脂質(zhì)體表面伸出去的適于與靶向劑反應(yīng)并將靶向劑保持在其正確位置的親水性反應(yīng)性基團(tuán)。用于將靶向部分摻入脂質(zhì)體膜的技術(shù)在本領(lǐng)域中普遍已知。
[0043]不良水溶件物質(zhì)
[0044]如上所述，本發(fā)明涉及用不良水溶性物質(zhì)裝載脂質(zhì)體。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“不良水溶性”表示不溶于水或在水中具有非常有限的溶解度，更特別地，在環(huán)境溫度(通常為約20°C )和pH=7下具有小于1.9mM的水溶解度，甚至更優(yōu)選具有小于ImM的水溶解度。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，不良水溶性物質(zhì)為選自類固醇、蒽環(huán)類、紫杉醇、雷帕霉素(西羅莫司)、CKD-602、雙氯芬酸、阿霉素、布比卡因、長(zhǎng)春新堿、托泊替康、環(huán)丙沙星、西替利嗪、非索非那定、撲米酮和其他兒茶酚胺類、腎上腺素、這些藥用化合物的鹽和衍生物、以及它們的混合物的藥用化合物。
[0046]然而，該化合物列舉不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，功能性化合物可以為任何不良水溶性的兩親性弱堿或兩親性弱酸。如上所述，也考慮其中不良水溶性物質(zhì)不為藥物或藥用物質(zhì)的實(shí)施方案。`
[0047]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述不良水溶性物質(zhì)為選自類固醇、蒽環(huán)類、紫杉醇、雷帕霉素(西羅莫司)、雙氯芬酸、克唑替尼(Crizotinib)、喹啉酸、F1D 150606、布比卡因、長(zhǎng)春新堿、托泊替康、環(huán)丙沙星、西替利嗪、非索非那定、撲米酮和其他兒茶酚胺、腎上腺素、這些藥用化合物的鹽和衍生物、以及它們的混合物的藥用化合物。
[0048]通常，在本文的語境中，不良水溶性的兩親性弱堿在pH7下具有-2.5至2的辛醇-水分布系數(shù)(1gD)且pKa ( 11，而不良水溶性的兩親性弱酸在pH7下具有-2.5至2的1gD且pKa>3。優(yōu)選地，要主動(dòng)裝載的不良水溶性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性(至約70°C，持續(xù)4小時(shí))和在更高(7-11)或更低(4-7)pH下良好的化學(xué)穩(wěn)定性。
[0049]通常，前述所用的術(shù)語“弱堿”和“弱酸”分別是指在水中僅被部分質(zhì)子化或去質(zhì)子化的化合物?？少|(zhì)子化的物質(zhì)的實(shí)例包括具有可在酸性介質(zhì)中被質(zhì)子化的氨基的化合物，以及在中性介質(zhì)中為兩性離子的且還可在酸性環(huán)境中被質(zhì)子化的化合物。可去質(zhì)子化的物質(zhì)的實(shí)例包括具有可在堿性介質(zhì)中被去質(zhì)子化的羧基的化合物，以及在中性介質(zhì)中為兩性離子的且還可在堿性環(huán)境中被去質(zhì)子化的化合物。
[0050]術(shù)語“兩性離子的”是指可同時(shí)在不同原子上攜帶正電荷和負(fù)電荷的化合物。前述所用的術(shù)語“兩親性的”通常用于指具有親脂性和親水性部分的化合物。前述表明，作為兩親性弱酸或弱堿的化合物的水溶液同時(shí)包含所述化合物的帶電和不帶電形式。僅不帶電形式可以穿過脂質(zhì)體膜。
[0051]豐動(dòng)裝載
[0052]如上所述，按照主動(dòng)或遠(yuǎn)程裝載技術(shù)，用不良水溶性物質(zhì)裝載預(yù)制的脂質(zhì)體。“主動(dòng)裝載”的方法包括使用跨膜電位。一般而言，主動(dòng)裝載的原理已經(jīng)在本領(lǐng)域中廣泛描述。術(shù)語“主動(dòng)裝載”和“遠(yuǎn)程裝載”是同義詞并可交換地使用。
[0053]在主動(dòng)裝載期間，不良水溶性物質(zhì)通過跨膜質(zhì)子梯度或離子梯度，從外部含水介質(zhì)穿過脂質(zhì)體膜而轉(zhuǎn)移至內(nèi)部含水介質(zhì)。本文所用的特定化合物的術(shù)語“梯度”是指從脂質(zhì)體外部(外部含水介質(zhì))到內(nèi)部(內(nèi)部含水介質(zhì))的跨越脂質(zhì)體膜的所述化合物的濃度的不連續(xù)增加。
[0054]為了產(chǎn)生濃度梯度，通常在第一液相(典型地為水相)中形成脂質(zhì)體，然后替換或稀釋所述第一液相。稀釋的或新的外部介質(zhì)具有不同濃度的帶電物質(zhì)或者完全不同的帶電物質(zhì)，由此建立離子梯度或質(zhì)子梯度。
[0055]外部介質(zhì)的替換可以通過各種技術(shù)完成，例如通過使脂質(zhì)囊泡制劑經(jīng)過已用新介質(zhì)平衡的凝膠過濾柱(例如Sephadex或Sepharose柱),或者通過離心、滲析或相關(guān)技術(shù)。
[0056]在其他方面中，向脂質(zhì)體中的主動(dòng)裝載的效率取決于要裝載的物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)以及施用的梯度的類型和大小。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，提供了利用跨脂質(zhì)體膜的梯度的任一前述實(shí)施方案中限定的方法，其中所述梯度選自PH梯度，硫酸鹽梯度，磷酸鹽梯度，檸檬酸鹽梯度或乙酸鹽梯度，EDTA-離子梯度，銨鹽梯度，烷基化銨鹽如甲基_、乙基_、丙基-和戊基-銨鹽梯度，使用或不使用離子載體的Mn2+-梯度、Cu2+-梯度、Na+-梯度、K+-梯度，或者它們的組合。這些裝載技術(shù)已經(jīng)在本領(lǐng)域廣泛描述。
[0057]優(yōu)選地，預(yù)制的(即未 裝載的)脂質(zhì)體的內(nèi)部含水介質(zhì)包含所謂的主動(dòng)裝載緩沖劑，其包含水，并且根據(jù)在主動(dòng)裝載期間所用的梯度類型，可進(jìn)一步包含硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或乙酸鹽、銨鹽、烷基化(如甲基_、乙基_、丙基-和戊基-)銨鹽、Mn2+-鹽、Cu2+-鹽或Na+A+-鹽、EDTA-離子鹽，以及任選地包含用于保持pH梯度的pH緩沖劑。在未裝載的脂質(zhì)體的內(nèi)部含水介質(zhì)中的鹽的優(yōu)選濃度為l-1000mM。
[0058]用于建立主動(dòng)裝載所用的跨膜梯度的外部含水介質(zhì)包含水、溶解度增強(qiáng)劑、要裝載的不良水溶性物質(zhì)，以及任選地包含用于調(diào)節(jié)滲量的蔗糖和/或用于輔助離子載體活性的諸如EDTA的螯合劑，更優(yōu)選地包含蔗糖和/或EDTA。也可以用鹽水調(diào)節(jié)滲量。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了用于主動(dòng)裝載脂質(zhì)體的方法，其中所確立的在內(nèi)部含水介質(zhì)中的形成梯度的鹽的濃度以及在外部介質(zhì)中的不良水溶性物質(zhì)和溶解度增強(qiáng)劑的濃度的大小使得在主動(dòng)裝載期間發(fā)生跨脂質(zhì)體膜的所述不良水溶性物質(zhì)的凈轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0059]在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述梯度選自pH梯度、硫酸鹽梯度和乙酸鈣梯度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的，跨膜pH梯度(內(nèi)部pH較低,外部pH較高)或乙酸鈣梯度可用于主動(dòng)裝載兩親性弱酸。使用硫酸銨梯度或氯化銨梯度也可將兩親性弱堿主動(dòng)裝載到脂質(zhì)體中。未電離的不良水溶性兩親性化合物穿過膜并被質(zhì)子化或去質(zhì)子化和/或與脂質(zhì)體內(nèi)硫酸根、氯或鈣反荷離子一起形成不溶性鹽沉淀。
[0060]根據(jù)脂質(zhì)囊泡膜的滲透性，與濃度梯度相對(duì)應(yīng)的全跨膜電位會(huì)自發(fā)形成，或者可能必須向浴介質(zhì)(bathing medium)添加滲透增強(qiáng)劑，如質(zhì)子離子載體。若需要,可以使用色譜或其他技術(shù)，在裝載已經(jīng)完成之后從制劑除去所述滲透增強(qiáng)劑。
[0061]通常，在主動(dòng)裝載期間的加工溫度為0_100°C，優(yōu)選為0_70°C，且最優(yōu)選為
4-65 °C。
[0062]包封或裝載效率，其被定義為在內(nèi)部水相中包封的不良水溶性物質(zhì)的摩爾量除以在外部水相中的不良水溶性物質(zhì)的初始摩爾量乘以100%，為至少25%，優(yōu)選至少50%、至少60%或至少70%。
[0063] 溶解度增強(qiáng)劑[0064]如本文先前所述，本發(fā)明的主旨是向外部含水介質(zhì)添加溶解度增強(qiáng)劑以增加不良水溶性物質(zhì)從外部介質(zhì)到脂質(zhì)體中的攝取的速率和效率。由此，增加了在本發(fā)明的外部含水介質(zhì)中溶解的不良水溶性物質(zhì)的濃度。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方案，提供了前述實(shí)施方案所定義的方法，所述方法使用選自絡(luò)合劑、共溶劑、表面活性劑和乳化劑的溶解度增強(qiáng)劑。所述溶解度增強(qiáng)劑通常使不良水溶性化合物在外部含水介質(zhì)中的溶解度增加到至少2倍，優(yōu)選至少3倍，優(yōu)選增加到在環(huán)境溫度下大于1.9mM的值，更優(yōu)選增加到大于3.SmM的值。
[0065]如本文所定義的絡(luò)合劑為與不良水溶性化合物形成水溶性包合絡(luò)合物，由此增加所述不良水溶性化合物的水溶解度的水溶性化合物。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所述溶解度增強(qiáng)劑為選自環(huán)糊精和聚乙烯吡咯烷酮(聚維酮)的絡(luò)合劑。
[0066]聚維酮已知與許多功能性化合物形成水溶性絡(luò)合物。本領(lǐng)域也已知環(huán)糊精的與多種兩親性和親脂性客體分子形成穩(wěn)定的非共價(jià)包合絡(luò)合物的能力(Challa等人，2005)。它們具有親脂性內(nèi)腔和親水性外表面，這產(chǎn)生了它們良好的水溶解度。3種天然存在的環(huán)糊精，g卩a-、(6-和Y-環(huán)糊精，在它們環(huán)尺寸和水溶解度方面不同。在這些天然存在的環(huán)糊精中，(6-環(huán)糊精的親脂性內(nèi)腔最適于各種功能性化合物。使用羥丙基-和磺烷基醚基團(tuán)的化學(xué)修飾可以增加天然存在的環(huán)糊精的水溶解度和絡(luò)合活性(Thompson 1997，Muller等人，1985，Szente等人，1999)。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所述絡(luò)合劑選自a-、(6-和Y -環(huán)糊精以及用烷基_、羥基烷基_、二烷基和磺烷基醚基團(tuán)修飾的環(huán)糊精。
[0067]在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述溶解度增強(qiáng)劑為選自P -環(huán)糊精、羥丙基-P -環(huán)糊精(HPPCD)和磺丁醚-(6-環(huán)糊精的絡(luò)合劑。優(yōu)選地，以所述外部含水介質(zhì)的總質(zhì)量計(jì)，所述絡(luò)合劑以0.l-25w%的量、優(yōu)選0.5-15w%的量且最優(yōu)選l_12w%的量存在于所述外部含水介質(zhì)。
[0068]如上所述，所述溶解度增強(qiáng)劑還可以為共溶劑。將共溶劑用于增加有機(jī)藥物類化合物的水溶解度是本領(lǐng)域公知的(Sweetana等人，1996;Rytting等人，2005)。
[0069]因此，在另一實(shí)施方案中，所述溶解度增強(qiáng)劑為共溶劑。在本文的語境中，共溶劑為可水混溶的溶劑，其一旦添加到水中則產(chǎn)生與純水相比具有大幅增加的不良水溶性化合物溶解度的混合物。根據(jù)本發(fā)明，合適的共溶劑為聚乙二醇(PEG)、煙酰胺、脂族羧酸的N，N-二烷基酰胺、二甲基甲酰胺、醇、多元醇、二甲基亞砜和吡咯烷酮，尤其為聚乙二醇(PEG)、煙酰胺、脂族羧酸的N，N- 二烷基酰胺、二甲基甲酰胺、多元醇、二甲基亞砜和吡咯烷酮。然而，該共溶劑列舉不旨在限制本發(fā)明的范圍。
[0070]在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述溶解度增強(qiáng)劑不為滲透所述脂質(zhì)體膜的醇。
[0071]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溶解度增強(qiáng)劑為選自PEG和煙酰胺的共溶劑，甚至更優(yōu)選地，所述共溶劑為分子量為200-400g/mol的PEG。優(yōu)選地，以所述外部含水介質(zhì)的總質(zhì)量計(jì)，所述共溶劑以至少lwt%,更優(yōu)選至少2wt%,最優(yōu)選至少5wt%的量存在。此外,優(yōu)選的是，以所述外部含水介質(zhì)的總質(zhì)量計(jì)，所述共溶劑的量為小于75wt%，優(yōu)選小于50wt%，更優(yōu)選小于33wt%，且最優(yōu)選小于10wt%。
[0072]如本文先前所述，所述溶解度增強(qiáng)劑還可以為表面活性劑和/或乳化劑。本文所定義的表面活性劑或乳化劑為使功能性化合物的微小的流體液滴或固體膠體顆粒在外部含水介質(zhì)中穩(wěn)定，由此使功能性化合物的跨水相分布幾乎均一的化合物。不希望受限于任何特定理論，假設(shè)表面活性劑或乳化劑通過像保持不良水溶性化合物的飽和濃度的儲(chǔ)庫那樣發(fā)揮作用，來增加不良水溶性化合物在外部含水介質(zhì)中的可用性。
[0073]因此，在又一實(shí)施方案中，所述溶解度增強(qiáng)劑為表面活性劑和/或乳化劑，其選自聚乙氧基化蓖麻油(Cremophors ? )、聚乙二醇(macrogol)-15-羥基硬脂酸酯、PEG-脂質(zhì)、泊洛沙姆(Pluixmics ? )、多庫酯鈉、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中鏈甘油三酯、甲基纖維素及其衍生物、糖(如蔗糖)或其替代物(Metoloses?)以及它們的組合，更優(yōu)選選自聚乙氧基化蓖麻油(Cremophors ? )、聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯、PEG-脂質(zhì)、泊洛沙姆(Pluixmics?)、多庫酯鈉、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中鏈甘油三酯、甲基纖維素及其衍生物以及它們的組合。優(yōu)選的乳化劑/表面活性劑為蔗糖酯。通常，所述表面活性劑和/或乳化劑以10vol%的量存在。
[0074]在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了用于主動(dòng)裝載脂質(zhì)體的方法，所述方法包括使用選自HPP⑶、分子量為200-400g/mol的PEG、蔗糖以及它們的混合物的溶解度增強(qiáng)劑。
[0075]如本文先前所述，存在于外部含水介質(zhì)中的溶解度增強(qiáng)劑優(yōu)選在不良水溶性化合物的主動(dòng)裝載期間不被轉(zhuǎn)移穿過脂質(zhì)體膜。因此，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，提供了根據(jù)任一前述實(shí)施方案的主動(dòng)裝載方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑不能或僅稍微能夠物理地最終(intime)通過脂質(zhì)體膜。
[0076]在優(yōu)選實(shí)施方案中，存在于外部含水介質(zhì)中的溶解度增強(qiáng)劑不滲透所述脂質(zhì)體`膜。
[0077]在所述溶解度增強(qiáng)劑為絡(luò)合劑的情況中，優(yōu)選的是，所述絡(luò)合劑和不良水溶性物質(zhì)在外部介質(zhì)中的解離速率超過將所述不良水溶性物質(zhì)從所述外部介質(zhì)攝取入脂質(zhì)體中的速率。不希望受限于任何特定理論，確信的是，前者可以通過使所述外部介質(zhì)中的絡(luò)合劑和不良水溶性物質(zhì)的濃度和/或組合以及跨越所述脂質(zhì)體膜的質(zhì)子梯度和/或離子梯度最優(yōu)化而建立。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了根據(jù)任一前述實(shí)施方案的用于裝載預(yù)制脂質(zhì)體的方法，其中，使在主動(dòng)裝載期間的加工溫度、脂質(zhì)體的相變溫度、在外部介質(zhì)中的絡(luò)合劑和不良水溶性物質(zhì)的濃度和/或組合、以及跨越脂質(zhì)體膜的質(zhì)子梯度和/或離子梯度最優(yōu)化至使溶解度增強(qiáng)劑的脂質(zhì)體攝取足夠低的大小。優(yōu)選地，以不良水溶性物質(zhì)和溶解度增強(qiáng)劑的總摩爾數(shù)計(jì)，在已裝載的脂質(zhì)體的內(nèi)部含水介質(zhì)中的溶解度增強(qiáng)劑的濃度小于20mol%,更優(yōu)選地，在已裝載的脂質(zhì)體中的溶解度增強(qiáng)劑的濃度小于5mol%，最優(yōu)選地，其小于 lmol%。
[0078]如前述所顯而易見的，將給定的不良水溶性物質(zhì)主動(dòng)裝載入脂質(zhì)體中的速率和效率受許多因素的影響，特別是受跨膜梯度、溶解度增強(qiáng)劑的選擇、脂質(zhì)體膜的組成、加工溫度等的影響。調(diào)整并最優(yōu)化這些參數(shù)并同時(shí)得到最有效的方法(即，對(duì)于給定的不良水溶性物質(zhì)而言)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力和標(biāo)準(zhǔn)慣例的范圍內(nèi)。[0079]不論如何，本發(fā)明的意義為首次認(rèn)識(shí)到，在外部介質(zhì)中使用溶解度增強(qiáng)劑與其中不采用溶解度增強(qiáng)劑的相同主動(dòng)裝載方法相比通常增加了攝取速率。
[0080]因此，本發(fā)明的另一方面涉及將如前所述的溶解度增強(qiáng)劑用于脂質(zhì)體的主動(dòng)裝載以增加不良水溶性物質(zhì)的裝載效率和/或速率。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述溶解度增強(qiáng)劑選自絡(luò)合劑、共溶劑、表面活性劑、乳化劑以及它們的組合。應(yīng)理解，優(yōu)選的實(shí)施方案包括施用如任一前述實(shí)施方案中定義的預(yù)制脂質(zhì)體、不良水溶性物質(zhì)、內(nèi)部含水介質(zhì)、外部含水介質(zhì)、梯度等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述使用包括將所述溶解度增強(qiáng)劑與所述不良水溶性物質(zhì)、第一含水介質(zhì)(即，本文先前所定義的外部介質(zhì))和包封第二含水介質(zhì)(即，內(nèi)部介質(zhì))的脂質(zhì)體組合。
[0081]本發(fā)明的第三方面涉及可通過前述的主動(dòng)裝載方法獲得的脂質(zhì)體組合物。應(yīng)理解，優(yōu)選的實(shí)施方案包括這樣的脂質(zhì)體組合物，其中脂質(zhì)體、不良水溶性物質(zhì)、內(nèi)部含水介質(zhì)等均為如任一前述實(shí)施方案所定義的。
[0082]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物的不良水溶性物質(zhì)與脂質(zhì)的質(zhì)量比為至少1:25,優(yōu)選至少1:15,更優(yōu)選至少1:10,更優(yōu)選至少1:7,更優(yōu)選至少1:5,并且更優(yōu)選至少1:2。
[0083]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，通常所述脂質(zhì)體組合物包含主要為沉淀形式的不良水溶性物質(zhì)。通常，不多于小部分的在脂質(zhì)體內(nèi)的不良水溶性物質(zhì)與溶解度增強(qiáng)劑絡(luò)合，例如，在內(nèi)部含水介質(zhì)中，小于10mol%且優(yōu)選小于lmol%的不良水溶性化合物與溶解度增強(qiáng)劑絡(luò)
口 o
[0084]此外，在一實(shí)施 方案中，以不良水溶性物質(zhì)和溶解度增強(qiáng)劑的總量計(jì)，在已裝載的脂質(zhì)體的內(nèi)部含水介質(zhì)中的溶解度增強(qiáng)劑的量小于20mol%，更優(yōu)選地，在已裝載的脂質(zhì)體中的溶解度增強(qiáng)劑的濃度小于5mol%，最優(yōu)選地，其小于lmol%。
[0085]通過下列實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，所述實(shí)施例不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例
[0086]實(shí)施例1.預(yù)制的主動(dòng)裝載脂質(zhì)體的制備
[0087]脂質(zhì)體可以由多種摩爾比的不同磷脂和膽固醇組成，從而修改轉(zhuǎn)變/加工溫度和血漿中的顆粒穩(wěn)定性。具體地，將磷脂與膽固醇(Chol)以不同比例使用，所述磷脂例如1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、大豆磷脂酰膽堿(SPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)或蛋黃磷脂酰膽堿(EYPC)，其中，混合物中的Chol越少，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體在血漿中越不穩(wěn)定。將組分溶解在乙醇或異丙醇中。此外，為了增加(體內(nèi))顆粒穩(wěn)定性和增強(qiáng)腦部遞送，可以將由DSPE-PEG-GSH(高達(dá)5mol%)組成的膠束和/或DSPE-mPEG(Mw2000)以不同的摩爾百分比(總計(jì)高達(dá)5-10mol%)添加到溶液中，所述DSPE-PEG-GSH是使用DSPE-PEG-MAL和新鮮的還原谷胱甘肽溶液在制備脂質(zhì)體之前合成的。將(脂質(zhì))混合物注入包含不同離子強(qiáng)度(1-1OOOmM)的主動(dòng)裝載緩沖劑(例如2mg/mL硫酸銨或lmg/mL乙酸|丐)的水溶液中。在攪拌之后，將形成的囊泡通過膜而擠出或者在乳化器中均化以產(chǎn)生均勻尺寸的脂質(zhì)體。或者，在通過在25°C至高達(dá)60°C下孵育2小時(shí)至高達(dá)24小時(shí)(取決于脂質(zhì)混合物的相變溫度以及物質(zhì)的溫度敏感性)而制備脂質(zhì)體之后，添加DSPE-PEG-GSH或DSPE-mPEG。通過一般分離方法,例如滲析或滲濾,將脂質(zhì)體與過量的主動(dòng)裝載緩沖劑分離。通過測(cè)量粒徑(在MalvernZetasizer 上為 50-200nm)、(電位、磷脂含量(使用 Phopholipids B 試劑盒或 HPLC/UPLC系統(tǒng))以及肽含量(基于HPLC/UPLC或OPA測(cè)定，為0.2-10mol% GSH)來表征脂質(zhì)體。
[0088]實(shí)施例2.不良溶解性化合物A的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載
[0089]具有低分子量的小分子(化合物A)在環(huán)境溫度(約20°C)下的水溶解度為
0.003mg/ml。在不同pH下(測(cè)試范圍為pHl.5_10)，溶解度沒有顯著增加，其中在環(huán)糊精、PEG200和煙酰胺中，溶解度在pH=7下增加至2.5mg/ml。
[0090]在5-60 u g/ml的濃度下，在262nm使用UV測(cè)定化合物，或使用裝備有C-18RP柱的HPLC系統(tǒng)測(cè)定化合物。
[0091]將溶解的化合物以不同的藥物與脂質(zhì)的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列實(shí)施例1所述的預(yù)制脂質(zhì)體，以測(cè)定最優(yōu)包封效率條件。
[0092]具體地，最優(yōu)裝載條件如下。在60°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在2mg/mL硫酸銨溶液中。向該溶液添加溶解于乙醇(在60°C)的HSPC (55%)和膽固醇(40%)，并通過經(jīng)由過濾器的擠出直至獲得約IOOnm的顆粒來制備脂質(zhì)體。隨后，通過滲析除去游離硫酸銨，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。然后，制備在10%羥丙基(6-環(huán)糊精(HPPCD)中的化合物A的2.5mg/mL溶液，并添加到預(yù)制脂質(zhì)體(在60°C，持續(xù)60分鐘)中，從而使化合物A與硫酸銨的銨交換，并在脂質(zhì)體核內(nèi)沉淀。之后，直接將已裝載的脂質(zhì)體在冰上冷卻，并通過滲析除去HP ^⑶中過量的化合物A，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。與最優(yōu)裝載條件相對(duì)應(yīng)的初始的藥物與脂質(zhì)比為1:4。
[0093]最優(yōu)包封效率為60-70%，并且最終產(chǎn)物具有含lmg/ml化合物A且藥物與脂質(zhì)的比為1:5.7的脂質(zhì)體?？梢噪S后將該脂質(zhì)體溶液濃縮2-3倍，以提供甚至更濃的溶液。相反，溶解在PEG2tltl和煙酰胺中的 化合物A沒有產(chǎn)生進(jìn)入相同預(yù)制脂質(zhì)體的活性裝載。
[0094]測(cè)試已裝載的脂質(zhì)體在50mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.4，5%蔗糖)中，在4°C和37°C下持續(xù)12天(2、4、6、24、48、120、288小時(shí))的體外滲漏。在測(cè)量之前，使用尺寸排阻色譜，將釋放的化合物從溶液除去，并且用50%2_丙醇釋放包封的化合物，并進(jìn)行測(cè)量。從該分析測(cè)定的是，一些化合物從脂質(zhì)體釋放，在第一個(gè)24小時(shí)期間在兩個(gè)溫度下相似(約20%)，并且在24小時(shí)之后，該滲漏穩(wěn)定。
[0095]從基于細(xì)胞的測(cè)定獲知的是，化合物A為藥物流出泵乳腺癌耐藥蛋白(BCRP，還稱為ABCG2)的底物，所以在野生型小鼠和BCRP敲除小鼠中測(cè)試制劑。將化合物以2.5mg/kg的劑量注入小鼠的尾靜脈。用脂質(zhì)體化合物或在HP ^ CD中配制的游離化合物來注射動(dòng)物。在注射后6個(gè)小時(shí)，在血漿中回收了脂質(zhì)體化合物A的注射劑量的52%，并且在野生型小鼠的腦勻漿中回收了 0.5%。在BCRP敲除小鼠中，這些值分別為50%(在血漿中)和0.6%(在腦勻漿中)。相反，對(duì)于HPP⑶制劑，在野生型動(dòng)物中，這些值僅為0.01%(在血漿中)和
0.03%(在腦勻漿中)，其中BCRP敲除小鼠在8小時(shí)之后，在腦勻漿中具有配制在HPP CD中的化合物A的注射劑量的0.23%，并且在血漿中，濃度低于檢出水平。
[0096]總之，通過提高化合物A在HP 0⑶中的溶解度，由使用硫酸銨梯度的主動(dòng)裝載機(jī)制制備了高度濃縮且穩(wěn)定的脂質(zhì)體制劑。該脂質(zhì)體制劑提供化合物A的長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間，并且顯著地使化合物A的腦部遞送增加至超過可在僅用配制在HPP CD中的最大耐受量的化合物A注射的BCRP敲除小鼠中 獲得的水平的2倍，并且超過可在野生型小鼠中達(dá)到的水平的15倍。
[0097]實(shí)施例3.不良溶解性化合物B的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載
[0098]化學(xué)分子(化合物B)具有低分子量。在水中的溶解度為0.048mg/ml，并且該化合物在堿性PH下分解。溶解度在PEG2tltl中增加至高達(dá)8mg/ml。
[0099]在5-60 U g/ml的濃度下，在295nm用UV測(cè)定化合物。將溶解的化合物暴露于一系列實(shí)施例1所述的預(yù)制脂質(zhì)體。具體地，制備具有良好包封效率的兩種不同的組合物。首先，在60°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在250mM乙酸鈣溶液中。向該溶液添加溶解在乙醇(在60°C下)中的HSPC(55%)和膽固醇(40%)。其次，在25°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在250mM乙酸鈣溶液中。向該溶液添加溶解在乙醇(在25°C下)中的DMPC(55%)和膽固醇(40%)。對(duì)于兩種組合物，通過經(jīng)由過濾器的擠出直至獲得約IOOnm的顆粒來制備脂質(zhì)體。隨后，通過滲析除去游離乙酸鈣，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。然后，制備在PEG2tltl和5%蔗糖水溶液的(1: lvol/vol)混合物中的化合物B的4mg/mL溶液，并以不同的藥物與脂質(zhì)的比添加至預(yù)制脂質(zhì)體中(對(duì)于第一種組合物在60°C下，并且對(duì)于第二種組合物在25°C下，二者均持續(xù)60分鐘)，從而使化合物B與乙酸鈣交換并在脂質(zhì)體核內(nèi)沉淀。之后，直接將已裝載的脂質(zhì)體在冰上冷卻，并通過滲析除去PEG2tltl/蔗糖混合物中過量的化合物B，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。
[0100]第一組合物的最優(yōu)包封效率在1:3的初始的藥物與脂質(zhì)比下為60-70%。最終產(chǎn)物具有包含1.8mg/ml化合物B且藥物與脂質(zhì)的比為1:4.5的脂質(zhì)體。對(duì)于第二組合物，最優(yōu)包封效率在1:3的初始的藥物與脂質(zhì)比下為25-30%的包封。最終產(chǎn)物具有包含2mg/ml化合物B且藥物與脂質(zhì)的比為1:25的脂質(zhì)體?？梢詫⑦@些脂質(zhì)體溶液濃縮2-3倍，從而提供甚至更濃的溶液。相反，溶解在純PEG2qq和HP P⑶中的化合物B沒有產(chǎn)生進(jìn)入相同預(yù)制脂質(zhì)體的主動(dòng)裝載，并且還沒有產(chǎn)生在包含`硫酸銨的預(yù)制脂質(zhì)體中的主動(dòng)裝載。
[0101]測(cè)試已裝載的脂質(zhì)體在50mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.4，5%蔗糖)中，在4°C和37°C下，在制備之后的第1、3和7天的體外滲漏。在測(cè)量之前，使用尺寸排阻色譜，將釋放的化合物從溶液除去，并且用50%2_丙醇釋放包封的化合物，并進(jìn)行測(cè)量。從該分析測(cè)定的是，兩種制劑在冷藏箱中至少穩(wěn)定I周，并且對(duì)于第一組合物，在37°C下至少穩(wěn)定I天。第二組合物在37°C下在I天之后失去了其大部分化合物。
[0102]將配制的化合物以2mg/kg的劑量注入小鼠的尾靜脈。用脂質(zhì)體化合物(組合物I和2)或在PEG4tltl-HP PCD(10:90v/v)中配制的游離化合物來注射動(dòng)物。然而，兩種脂質(zhì)體制劑具有出人意料地短的血漿半衰期。因此，在注射之后15分鐘進(jìn)行在制劑之間的分布差異的評(píng)估。在這些樣品中，對(duì)于組合物I和2，在血漿中分別回收了脂質(zhì)體化合物B的注射劑量的52%和18%，而在腦勻漿中分別回收了 3.1%和1.0%。相反，對(duì)于PEG4qq-HP P⑶制劑，這些值為7%(在血漿中)和2.8%(在腦勻漿中)。
[0103]總之，通過提高化合物B在PEG2qq和5%蔗糖的1:1混合物中的溶解度，由使用乙酸鈣的主動(dòng)裝載機(jī)制制備了高度濃縮且穩(wěn)定的脂質(zhì)體制劑。這些脂質(zhì)體制劑具有短的血液循環(huán)時(shí)間，但在注射之后不久與沒有脂質(zhì)體相比具有更高的血漿水平(Cmax)，并且脂質(zhì)體制劑與已由PEG4citl-HPP⑶制劑獲得的高的腦水平相比，沒有顯著增加化合物B的腦部遞送。例如通過降低乙酸鈣緩沖劑濃度來增加脂質(zhì)體的血漿穩(wěn)定性會(huì)進(jìn)一步增加化合物B向腦部的遞送。_4] 實(shí)施例4.不良溶解性化合物C的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載
[0105]NMDA受體的血腦屏障可滲透激動(dòng)劑(化合物C)具有低分子量，其在水中具有pH依賴性溶解度，所述溶解度在pH5下為0.003mg/mL,在pH6下為0.020mg/mL,在pH7下為0.35mg/mL,在pH8下為0.9mg/mL。在pH=7下，在HP P⑶中，溶解度進(jìn)一步增加至高達(dá)2.2mg/mL。
[0106]在5-60 u g/ml的濃度下，在262nm使用UV測(cè)定化合物，或使用裝備有C-18RP柱的HPLC系統(tǒng)測(cè)定化合物。
[0107]將溶解的化合物以不同的藥物與脂質(zhì)的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列實(shí)施例1所述的預(yù)制脂質(zhì)體，以測(cè)定最優(yōu)包封效率條件。
[0108]具體地，最優(yōu)裝載條件如下。在25°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在250mM乙酸鈣溶液中。向該溶液添加溶解于乙醇(在25°C )的DMPC(57%)和膽固醇(38%)，并通過經(jīng)由過濾器的擠出直至獲得約IOOnm的顆粒來制備脂質(zhì)體。隨后，通過滲析除去游離乙酸鈣，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。然后，制備在2w/w%HP0 CD水溶液中的化合物C的
2.2mg/mL溶液，并添加到預(yù)制脂質(zhì)體(在25°C，持續(xù)60分鐘)中，從而使化合物C與乙酸鈣的鈣交換，并在脂質(zhì)體核內(nèi)沉淀。之后，直接將已裝載的脂質(zhì)體在冰上冷卻，并通過滲析除去HP ^⑶中過量的化合物C，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。
[0109]包封效率為60-70%，并且最終產(chǎn)物在為1:2的藥物與脂質(zhì)比下具有含lmg/ml化合物C的脂質(zhì)體?？梢詫⒃撝|(zhì)體溶液能被濃縮3.5倍，從而提供甚至更濃的溶液。
[0110]將化合物以10mg/kg的劑量注入小鼠的尾靜脈。用脂質(zhì)體化合物或在HPP CD中配制的游離化合物來注射動(dòng)物。在注射之后30分鐘，在血漿中回收了脂質(zhì)體化合物C的注射劑量的14%，在腦勻漿中回收了 0.26%并且在腦脊液中(CSF)回收了 0.09%。相反，對(duì)于化合物C的HP 3 CD制劑，這些值為6% (在血漿中)，0.08% (在腦勻漿中)和0.03% (在CSF中)。通過定量環(huán)鳥苷3' ,5'-單磷酸(cGMP)水平的增加，在小鼠的小腦中生物化學(xué)地評(píng)價(jià)激動(dòng)劑對(duì)NMDA受體的作用。在注射之后30分鐘，化合物C的HP P CD制劑沒有產(chǎn)生cGMP水平的變化，其中脂質(zhì)體制劑產(chǎn)生了對(duì)照水平的160%的顯著增加。
[0111]總之，通過提高化合物C在HPP⑶中的溶解度，由使用乙酸鈣梯度的主動(dòng)裝載機(jī)制制備了高度濃縮的脂質(zhì)體制劑。盡管血漿半衰期較短，但該脂質(zhì)體制劑顯著地將化合物C的腦部和CSF遞送增加至超過可在僅用配制在HP ^ CD中的最大耐受量的化合物C以相同劑量水平注射的小鼠中獲得的水平的3倍，并且超過可用最大耐受量的濃脂質(zhì)體制劑達(dá)到的水平的15倍。例如通過降低乙酸鈣緩沖劑濃度來增加脂質(zhì)體的血漿穩(wěn)定性會(huì)進(jìn)一步增加化合物C向腦部的遞送。由該脂質(zhì)體制劑獲得的增加的腦部遞送能在小腦中引起受體特異性作用，這用游離化合物是未觀察到的。
[0112]實(shí)施例5.不良溶解性克嗶替尼的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載
[0113]具有450Da的低分子量的小分子酪氨酸激酶抑制劑(克唑替尼)在環(huán)境溫度(約20°C )下的水溶解度〈0.lmg/ml。在羥丙基3 -環(huán)糊精(HP ^ CD)中的溶解度增加至2.2mg/ml，其中，在PEG2qq和煙酰胺中，在pH=7下溶解度增加到至少5mg/ml。
[0114]在5-60 u g/ml的濃度下使用UV測(cè)定化合物，或使用裝備有C_18 RP柱的HPLC系統(tǒng)測(cè)定化合物。
[0115]將溶解的化合物以不同的藥物與脂質(zhì)的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列實(shí)施例1所述的預(yù)制脂質(zhì)體，以測(cè)定最優(yōu)包封效率條件。
[0116]具體地，最優(yōu)裝載條件如下。在60°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在2mg/mL硫酸銨溶液中。向該溶液添加溶解于乙醇(在60°C)的HSPC (55%)和膽固醇(40%)，并通過經(jīng)由過濾器的擠出直至獲得約IOOnm的顆粒來制備脂質(zhì)體。隨后，通過滲析除去游離硫酸銨，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。然后，制備在20%HPP⑶中的克唑替尼的2.2mg/mL溶液，并添加到預(yù)制脂質(zhì)體(在60°C，持續(xù)60分鐘)中，從而使克唑替尼與硫酸銨的銨交換，并在脂質(zhì)體核內(nèi)沉淀。之后，直接將裝載的脂質(zhì)體在冰上冷卻，并通過滲析除去HP ^ CD中過量的克唑替尼，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。與最優(yōu)裝載條件相對(duì)應(yīng)的初始的藥物與脂質(zhì)比為1:4。
[0117]最優(yōu)包封效率為60-70%，并且最終產(chǎn)物具有含lmg/ml克唑替尼且藥物與脂質(zhì)的比為1:5.7的脂質(zhì)體?？梢噪S后將該脂質(zhì)體溶液濃縮2-3倍，以提供甚至更濃的溶液。
[0118]測(cè)試已裝載的脂質(zhì)體在50mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.4，5%蔗糖)中，在4°C和37°C下持續(xù)12天(2、4、6、24、48、120、288天)的體外滲漏。在測(cè)量之前，使用尺寸排阻色譜，將釋放的化合物從溶液除去，并且用50%2_丙醇釋放包封的化合物，并進(jìn)行測(cè)量。從該分析測(cè)定的是，一些化合物從脂質(zhì)體釋放，在第一個(gè)24小時(shí)期間在兩個(gè)溫度下相似(約20%)，并且在24小時(shí)之后,該滲漏穩(wěn)定。
[0119]從基于細(xì)胞的測(cè)定獲知的是，酪氨酸激酶抑制劑通常為藥物流出泵乳腺癌耐藥蛋白(BCRP，還稱為ABCG2)的底物，所以在野生型小鼠和BCRP敲除小鼠中測(cè)試制劑。將化合物以2.5mg/kg的劑量注入小鼠的尾靜脈。用脂質(zhì)體化合物或在HP ^ CD中配制的游離化合物來注射動(dòng)物。在注射后6個(gè)小時(shí)，在血漿中回收了脂質(zhì)體克唑替尼的注射劑量的52%，并且在野生型小鼠的腦勻漿中回收了 0.5%。在BCRP敲除小鼠中，這些值分別為50%(在血漿中)和0.6% (在腦勻漿中)。相反， 對(duì)于HP ^⑶制劑，在野生型動(dòng)物中，這些值僅為0.01% (在血漿中)和0.03%(在腦勻漿中)，其中BCRP敲除小鼠在8小時(shí)之后，在腦勻漿中具有配制在HP 3⑶中的克唑替尼的注射劑量的0.23%，并且在血漿中，濃度低于檢出水平。
[0120]總之，通過提高克唑替尼在HPP⑶中的溶解度，由使用硫酸銨梯度的主動(dòng)裝載機(jī)制制備了高度濃縮且穩(wěn)定的脂質(zhì)體配制劑。該脂質(zhì)體制劑提供克唑替尼的長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間，并且顯著地使克唑替尼的腦部遞送增加至超過可在僅用配制在HPP CD中的最大耐受量的克唑替尼注射的BCRP敲除小鼠中獲得的水平的2倍，并且超過可在野生型小鼠中達(dá)到的水平的15倍。
[0121]實(shí)施例6.不良溶解性PD150606的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載
[0122]提供鈣蛋白酶抑制劑(HH50606)，其具有306Da的低分子量。在水中的溶解度低于0.05mg/ml，并且該化合物在堿性pH下分解。溶解度在PEG2tltl中增加至高達(dá)8mg/ml。
[0123]在5-60 u g/ml的濃度下用UV測(cè)定化合物。將溶解的化合物暴露于一系列實(shí)施例I所述的預(yù)制脂質(zhì)體。具體地，制備具有良好包封效率的兩種不同的組合物。首先，在60°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在250mM乙酸鈣溶液中。向該溶液添加溶解在乙醇(在60°C下)中的HSPC (55%)和膽固醇(40%)。其次，在25°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在250mM乙酸鈣溶液中。向該溶液添加溶解在乙醇(在25°C下)中的DMPC(55%)和膽固醇(40%)。對(duì)于兩種組合物，通過經(jīng)由過濾器的擠出直至獲得約IOOnm的顆粒來制備脂質(zhì)體。隨后，通過滲析除去游離乙酸鈣，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。然后，制備在PEG200和5%蔗糖水溶液的(1: lvol/vol)-混合物中的化合物B的4mg/mL溶液，并以不同的藥物與脂質(zhì)的比添加至預(yù)制脂質(zhì)體中(對(duì)于第一種組合物在60°C下，并且對(duì)于第二種組合物在25°C下，二者均持續(xù)60分鐘)，從而使150606與乙酸鈣交換并在脂質(zhì)體核內(nèi)沉淀。之后，直接將已裝載的脂質(zhì)體在冰上冷卻，并通過滲析除去PEG2qq/蔗糖混合物中過量的ro150606，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。
[0124]第一組合物的最優(yōu)包封效率在1:3的初始的藥物與脂質(zhì)比下為60-70%。最終產(chǎn)物具有包含1.8mg/ml PD 150606且藥物與脂質(zhì)的比為1:4.5的脂質(zhì)體。對(duì)于第二組合物，最優(yōu)包封效率在1:3的初始的藥物與脂質(zhì)比下為25-30%的包封。最終產(chǎn)物具有包含2mg/mlPD 150606且藥物與脂質(zhì)的比為1:25的脂質(zhì)體?？梢詫⑦@些脂質(zhì)體溶液濃縮2_3倍，從而提供甚至更濃的溶液。相反，溶解在純PEG2qq和HPP⑶中的150606沒有產(chǎn)生進(jìn)入相同預(yù)制脂質(zhì)體的主動(dòng)裝載，并且還沒有產(chǎn)生在包含硫酸銨的預(yù)制脂質(zhì)體中的主動(dòng)裝載。
[0125]測(cè)試已裝載的脂質(zhì)體在50mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.4，5%蔗糖)中，在4°C和37°C下，在制備之后的第1、3和7天的體外滲漏。在測(cè)量之前，使用尺寸排阻色譜，將釋放的化合物從溶液除去，并且用50%2_丙醇釋放包封的化合物，并進(jìn)行測(cè)量。從該分析測(cè)定的是，兩種配制劑在冷藏箱中至少穩(wěn)定I周，并且對(duì)于第一組合物，在37°C下至少穩(wěn)定I天。第二組合物在37°C下在I天之后失去了其大部分化合物。
[0126]將配制的化合物以2mg/kg的劑量注入小鼠的尾靜脈。用脂質(zhì)體化合物(組合物I和2)或在PEG4tltl-HP PCD(10:90v/v)中配制的游離化合物來注射動(dòng)物。然而，兩種脂質(zhì)體制劑具有出人意料地短的血漿半衰期。因此，在注射之后15分鐘進(jìn)行在制劑之間的分布差異的評(píng)估。在這些樣品中，對(duì)于組合物I和2，在血漿中分別回收了脂質(zhì)體150606的注射劑量的52%和18%，而在腦勻漿中分別回收了 3.1%和1.0%。相反，對(duì)于PEG4tltl-HP P⑶配制劑，這些值為7%(在血漿中)和2.8%(在腦勻漿中)。
[0127]總之，通過提高ro 150606在PEG2qq和5%蔗糖的1:1混合物中的溶解度，由使用乙酸鈣的主動(dòng)裝載機(jī)制制備了高度濃縮且穩(wěn)定的脂質(zhì)體配制劑。這些脂質(zhì)體配制劑具有短的血液循環(huán)時(shí)間，但在注射之后`不久與沒有脂質(zhì)體相比具有更高的血漿水平(Cmax)，并且脂質(zhì)體制劑與已由PEG4tltl-HP ^⑶制劑獲得的高的腦水平相比，沒有顯著增加I3D 150606的腦部遞送。例如通過降低乙酸鈣緩沖劑濃度來增加脂質(zhì)體的血漿穩(wěn)定性會(huì)進(jìn)一步增加ro150606向腦部的遞送。
[0128]實(shí)施例7.不良溶解性的喹啉酸的高主動(dòng)脂質(zhì)體裝載
[0129]NMDA受體的血腦屏障可滲透激動(dòng)劑(喹啉酸)具有167Da的低分子量，其在水中具有PH依賴性溶解度，所述溶解度在pH5下為0.003mg/mL,在pH6下為0.020mg/mL,在pH7下為0.35mg/mL,在pH8下為0.9mg/mL。在pH=7下，在HP P⑶中，溶解度進(jìn)一步增加至高達(dá) 2.2mg/mL。
[0130]在5-60 u g/ml的濃度下，在262nm使用UV測(cè)定化合物，或使用裝備有C-18RP柱的HPLC系統(tǒng)測(cè)定化合物。
[0131]將溶解的化合物以不同的藥物與脂質(zhì)的比(4:1、2:1、1:1、1:2、1:4)暴露于一系列實(shí)施例1所述的預(yù)制脂質(zhì)體，以測(cè)定最優(yōu)包封效率條件。
[0132]具體地，最優(yōu)裝載條件如下。在25°C下，將GSH-PEG-DSPE膠束(5%)溶解在250mM乙酸鈣溶液中。向該溶液添加溶解于乙醇(在25°C )的DMPC(57%)和膽固醇(38%)，并通過經(jīng)由過濾器的擠出直至獲得約IOOnm的顆粒來制備脂質(zhì)體。隨后，通過滲析除去游離乙酸鈣，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。然后，制備在2w/w%HP ^ CD水溶液中的喹啉酸的
2.2mg/mL溶液，并添加到預(yù)制脂質(zhì)體(在25°C，持續(xù)60分鐘)中，從而使喹啉酸與乙酸鈣的鈣交換，并在脂質(zhì)體核內(nèi)沉淀。之后，直接將已裝載的脂質(zhì)體在冰上冷卻，并通過滲析除去HPP⑶中過量的喹啉酸，并且在4°C貯存以供進(jìn)一步使用。
[0133]包封效率為60-70%，并且最終產(chǎn)物在為1:2的藥物與脂質(zhì)比下具有含lmg/ml喹啉酸的脂質(zhì)體?？梢詫⒃撝|(zhì)體溶液濃縮3.5倍，從而提供甚至更濃的溶液。
[0134]將化合物以10mg/kg的劑量注入小鼠的尾靜脈。用脂質(zhì)體化合物或在HP P CD中配制的游離化合物來注射動(dòng)物。在注射之后30分鐘，在血漿中回收了脂質(zhì)體喹啉酸的注射劑量的14%，在腦勻漿中回收了 0.26%并且在腦脊液(CSF)中回收了 0.09%。相反，對(duì)于喹啉酸的HP 3 CD配制劑，這些值為6%(在血漿中),0.08%(在腦勻漿中)和0.03% (在CSF中)。通過定量環(huán)鳥苷3' ,5'-單磷酸(cGMP)水平的增加，在小鼠的小腦中生物化學(xué)地評(píng)價(jià)激動(dòng)劑對(duì)NMDA受體的作用。在注射之后30分鐘，喹啉酸的HP ^ CD制劑沒有產(chǎn)生cGMP水平的變化，其中脂質(zhì)體制劑產(chǎn)生了對(duì)照水平的160%的顯著增加。
[0135]總之，通過提高喹啉酸在HP ^ CD中的溶解度，由使用乙酸鈣梯度的主動(dòng)裝載機(jī)制制備了高度濃縮的脂質(zhì)體制劑。盡管血漿半衰期較短，但該脂質(zhì)體制劑顯著地將喹啉酸的腦部和CSF遞送增加至超過可在僅用配制在HPP CD中的最大耐受量的喹啉酸以相同劑量水平注射的小鼠中獲得的水平3倍，并且超過可用最大耐受量的濃脂質(zhì)體制劑達(dá)到的水平的15倍。例如通過降低乙酸鈣緩沖劑濃度來增加脂質(zhì)體的血漿穩(wěn)定性會(huì)進(jìn)一步增加喹啉酸向腦部的遞送。由該脂質(zhì)體制劑獲得的增加的腦部遞送能在小腦中引起受體特異性作用，這用游離化合物是未觀察到的。
[0136]參考文獻(xiàn)
[0137]D.Zucker 等人，Journal of Controlled Release, 2009 139 73-80
[0138]B.McCormack, G.Gregoriades, Journal of drug targeting, 19942 (5)449-454
[0139]B.McCormack, G.Gregoriades, Internationl Journal of Pharmaceutics, 1998162 59-69
[0140]P.R.Cullis 等人，Biochimica et Biophysica Acta 1997 1331 187-211
[0141]R.Challa 等人，AAPS PharmSciTech20056 (2) E329-E357
[0142]J.Gubernator 等人，Journal of Controlled Release 2010 146 68-75
[0143]A.Fritze 等人，Biochimica et Biophysica Acta 2006 1758 1633-1640
[0144]A.S.Taggar 等人，Journal of Controlled Release 2006 114 78-88
[0145]B.C.L.Cheung 等人，Biochimica et Biophysica Acta 1998 1414 205-216
[0146]D.B.Fenske 等人，Biochimica et Biophysica Acta 1998 1414 188-204
[0147]D.0.Thompson, CRC Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.1997 14 1-104
[0148]B.ff.Muller 等人，Int.J.Pharm.1985 26 77-88
[0149]L.Szente 等人,Adv.Drug Deliv.Rev.1999 36 17-38
[0150]S.Sweetana 等人，PDA J.Pharm.Sc1.Technol.1996 50 330-342
[0151]E.Rytting 等人，The AAPS Journal 20057 (I) E78-E105
【權(quán)利要求】
1.用不良水溶性物質(zhì)裝載脂質(zhì)體的方法，所述方法包括: a)提供混合物，其包含: i.包封內(nèi)部含水介質(zhì)的脂質(zhì)體； ii.所述不良水溶性物質(zhì)； iii.外部含水介質(zhì)；以及 iv.增加所述不良水溶性物質(zhì)在所述外部含水介質(zhì)中的溶解度的溶解度增強(qiáng)劑； 其中存在跨所述脂質(zhì)體膜的質(zhì)子梯度和/或離子梯度；以及 b)孵育所述混合物，持續(xù)足以導(dǎo)致至少部分所述不良水溶性物質(zhì)被提取出所述外部含水介質(zhì)并在所述質(zhì)子梯度和/或離子梯度的影響下在所述脂質(zhì)體中蓄積的時(shí)間段。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑為絡(luò)合劑，優(yōu)選為選自環(huán)糊精及其衍生物、聚維酮以及它們的組合的絡(luò)合劑。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑為共溶劑，優(yōu)選為選自聚乙二醇、煙酰胺、脂族羧酸的N，N-二烷基酰胺、醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、吡咯烷酮以及它們的組合的助溶劑，更優(yōu)選為選自聚乙二醇、煙酰胺、脂族羧酸的N，N-二烷基酰胺、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、吡咯烷酮以及它們的組合的共溶劑。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑為表面活性劑或乳化劑，優(yōu)選為選自聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯、PEG-脂質(zhì)、泊洛沙姆、多庫酯鈉、月旨肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中鏈甘油三酯、甲基纖維素及其衍生物、糖或其替代物以及它們的組合的表面活性劑或乳化劑，更優(yōu)選為選自聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯、PEG-脂質(zhì)、泊洛沙姆、多庫酯鈉、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸、聚山梨酯、中鏈甘油三酯、甲基纖維素及其衍生物以及它們的組合的表面活性劑或乳化劑。
5.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑不為滲透所述脂質(zhì)體膜的醇。
6.如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在孵育期間的加工溫度為0-1000C，優(yōu)選為0-70°C，且最優(yōu)選為4-65°C。
7.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述不良水溶性物質(zhì)在水中的溶解度〈1.9mM。
8.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑使所述不良水溶性物質(zhì)在所述外部含水介質(zhì)中的初始濃度增加到至少2倍，達(dá)到在20°C下至少為1.9mM的值。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟b)期間，存在跨所述脂質(zhì)體膜的pH梯度、硫酸鹽梯度、磷酸鹽梯度、檸檬酸鹽梯度或乙酸鹽梯度、EDTA-離子梯度、銨鹽梯度、烷基化銨鹽梯度、任選使用在所述脂質(zhì)體膜中的離子載體的Mn2+-梯度、Cu2+-梯度、Na+-梯度、K+-梯度、或它們的組合。
10.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述外部含水介質(zhì)包含鹽水和/或蔗糖和/或EDTA，優(yōu)選包含蔗糖和/EDTA，并且所述內(nèi)部含水介質(zhì)包含不良水溶性物質(zhì)，以及硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或乙酸鹽、烷基化銨鹽、Mn2+離子、Cu2+離子、Na+離子或K+離子中的至少之一。
11.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述不良水溶性物質(zhì)包含可質(zhì)子化胺、羧基官能團(tuán)或二者。
12.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述不良水溶性物質(zhì)為選自類固醇、蒽環(huán)類、紫杉醇、雷帕霉素(西羅莫司)、CKD-602、雙氯芬酸、阿霉素、布比卡因、長(zhǎng)春新堿、托泊替康、環(huán)丙沙星、西替利嗪、非索非那定、撲米酮和其他兒茶酚胺類、腎上腺素、這些化合物的鹽和衍生物、以及它們的混合物的藥用化合物，更優(yōu)選為選自類固醇、蒽環(huán)類、紫杉醇、雷帕霉素(西羅莫司)、雙氯芬酸、克唑替尼、喹啉酸、PD 150606、布比卡因、長(zhǎng)春新堿、托泊替康、環(huán)丙沙星、西替利嗪、非索非那定、撲米酮和其他兒茶酚胺類、腎上腺素、這些化合物的鹽和衍生物、以及它們的混合物的藥用化合物。
13.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟b)包括孵育所述混合物，持續(xù)足以實(shí)現(xiàn)在步驟a)中向所述混合物添加的不良水溶性物質(zhì)的總量的至少25%、優(yōu)選至少50%的裝載的時(shí)間段。
14.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑在步驟b期間不被轉(zhuǎn)運(yùn)穿過所述脂質(zhì)體膜。
15.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述溶解度增強(qiáng)劑不滲透所述脂質(zhì)體膜。
16.溶解度增強(qiáng)劑用于在用不良水溶性物質(zhì)主動(dòng)裝載脂質(zhì)體的方法中改善裝載效率的用途，所述溶解度增強(qiáng)劑優(yōu)選共溶劑、絡(luò)合劑、表面活性劑或乳化劑。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其包括將所述溶解度增強(qiáng)劑與所述不良水溶性物質(zhì)、第一含水介質(zhì)和包封第二含水介質(zhì)的脂質(zhì)體組合。
18.脂質(zhì)體組合物，其可通過權(quán)利要求1至15中任一權(quán)利要求所述的方法獲得。
19.脂質(zhì)體組合物，其包含裝載有不良水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)體，所述組合物的藥物與脂質(zhì)的重量比為至少1:25,優(yōu)選至少 1:15,更優(yōu)選至少1:7,更優(yōu)選至少1:5,更優(yōu)選至少1:2,所述組合物包含小于所述不良水溶性物質(zhì)的總量的20mol%的溶解度增強(qiáng)劑。
20.如權(quán)利要求18至19中任一權(quán)利要求所述的脂質(zhì)體組合物，其中所述脂質(zhì)體包含的所述溶解度增強(qiáng)劑的量不超過所述不良水溶性物質(zhì)的總量的10mol%。
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK103501766SQ201280021180
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月1日
【發(fā)明者】P·J·蓋拉德, C·C·M·阿佩爾多恩, J·里普 申請(qǐng)人:to-BBB控股股份有限公司