利用免疫療法誘導(dǎo)il-12的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在患者中促進IL-12誘導(dǎo)的組合物和方法。該組合物包括激活的同種異體細胞，其為給藥至患有疾病如癌癥的患者。所述組合物的給藥使所述患者的免疫應(yīng)答偏向Th1環(huán)境，并在所述患者的血漿中產(chǎn)生可以檢測到的IL-12水平，而沒有任何IL-12相關(guān)的毒性。
【專利說明】利用免疫療法誘導(dǎo)IL-12
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用免疫細胞的療法，更具體地，本發(fā)明涉及在患者中促進IL-12產(chǎn)生的免疫細胞療法。
【背景技術(shù)】
[0002]所知的最精確、最強大和最安全的疾病預(yù)防和治療機制，是在沒有醫(yī)療介入的情況下，結(jié)合先天免疫元素和適應(yīng)性免疫元素的與生俱來的“滅菌式(sterilizing) ”免疫應(yīng)答以清除身體內(nèi)種類繁多的外源性病原體。免疫系統(tǒng)被設(shè)計為“記憶”清除過的外源性抗原以便對再次感染快速發(fā)動免疫應(yīng)答。即使癌癥患者的免疫系統(tǒng)，也可以識別外源性抗原(例如在病毒和細菌中發(fā)現(xiàn)的外源性抗原)并對其發(fā)動應(yīng)答，足以從身體中徹底破壞和消除這些外源性抗原。這種滅菌式免疫應(yīng)答的猛烈性和特異性可以被以下方式證明，未充分抑制的免疫系統(tǒng)可以在保留自身組織的同時完全破壞大的移植器官如腎、肝或心臟。這種針對外源性抗原的免疫力的破壞效果將是有益的，如果這種效果可以被再定向到腫瘤和/或由于通過所述患者不充分的免疫應(yīng)答而逃脫的其他抗原。
[0003]免疫療法致力于發(fā)展針對包括癌癥的多種感染性和非感性疾病利用、引導(dǎo)和控制免疫應(yīng)答的方法。治療性疫苗是一種旨在用現(xiàn)有癌癥訓(xùn)練免疫系統(tǒng)的免疫療法。在具有現(xiàn)有癌癥的患者中，該疫苗被設(shè)計為該患者的免疫系統(tǒng)將腫瘤細胞識別為外源性抗原。如果腫瘤被免疫系統(tǒng)識別為外源性病原體，則理論上免疫應(yīng)答可以被引發(fā)，該免疫應(yīng)答可能導(dǎo)致免疫細胞破壞大的腫瘤、找出并破壞轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞，無論它們位于體內(nèi)何處。成功的免疫治療后，免疫系統(tǒng)的“記憶”清除過的外源性細胞的能力，使免疫系統(tǒng)在沒有任何額外治療下可以消除任何復(fù)發(fā) 的癌細胞，很像免疫系統(tǒng)防止機會性感染。
[0004]個體的免疫系統(tǒng)對疾病或病原體的應(yīng)答可以是Thl應(yīng)答或Th2應(yīng)答。在Thl應(yīng)答中，CD4+T細胞對于Thl細胞成為極化狀態(tài)，相反地在Th2應(yīng)答中，該CD4+T細胞對于Th2細胞成為極化狀態(tài)。這種日益普及的分類方法被稱為Thl/Th2平衡。Thl細胞促進細胞介導(dǎo)的免疫，而Th2細胞誘導(dǎo)體液免疫。細胞免疫(Thl)引導(dǎo)自然殺傷細胞(NK)、T-細胞和巨噬細胞在感染部位攻擊異常細胞和微生物。體液免疫(Th2)導(dǎo)致用于中和外源性入侵物的抗體的產(chǎn)生。在一般情況下，CD4+T細胞的Th2極化已在大多數(shù)人類和動物癌癥研究中被證明是與癌癥進程相關(guān)的，而Thl極化與腫瘤消退和抗腫瘤免疫力相關(guān)。
[0005]所述個體的Thl/Th2平衡免疫應(yīng)答可以通過在該個體中細胞因子的平衡而被評估。細胞因子是小細胞信號蛋白分子。術(shù)語細胞因子被用作不同群體可溶性蛋白和多肽的通用名稱，這些蛋白和多肽通常以納摩到皮摩濃度在正?；虿±項l件下作為調(diào)節(jié)因子調(diào)控個體細胞和組織的功能活性。這些蛋白也直接介導(dǎo)細胞間相互作用并調(diào)節(jié)發(fā)生在細胞外微環(huán)境中的進程。白介素是涉及免疫調(diào)節(jié)的一組細胞因子，可以通過免疫系統(tǒng)中的各種細胞被合成。存在多種白介素，例如IL-2、IL-4、IL-10和IL-12，并且這些白介素中的每一種在免疫系統(tǒng)中具有特定的作用。
[0006]Thl細胞產(chǎn)生涉及炎性應(yīng)答的I型細胞因子。I型細胞因子包括，例如IL-2、IL-12、IL-15、IFN-Y、TNF-α ,TNF-β、GM_CSF和C-C趨化因子。Th2細胞產(chǎn)生涉及體液免疫應(yīng)答的II型細胞因子。II型細胞因子包括，例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和TGF-β。Thl和Th2免疫應(yīng)答是反相調(diào)節(jié)的，即增強的I型應(yīng)答下調(diào)II型應(yīng)答而增強的II型應(yīng)答下調(diào)I型應(yīng)答。
[0007]IL-12是由p53亞單位和p40亞單位組成的異質(zhì)二聚體。其是主要通過抗原呈遞細胞(APC)被產(chǎn)生。IL-12也可以通過單核細胞和巨噬細胞、樹突細胞和B細胞被產(chǎn)生。IL-12在T細胞和天然殺傷細胞上發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。內(nèi)源性IL-12被認為與產(chǎn)生優(yōu)化的Thl應(yīng)答有關(guān)，并可以在細胞介導(dǎo)的針對細胞內(nèi)病原體的免疫發(fā)揮重要作用。
[0008]IL-12由于其可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中的重要成分并且被證實具有顯著的抗腫瘤作用，一直是實驗室和動物實驗廣泛研究的對象。例如，在抑制人肺腺癌生長和急性髓系白血病中IL-12都被涉及其中。然而，在治療方案中采用外源性IL-12被其在人體中的高毒性而限制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是顯示了多于一年中在患者的血漿中IL-12水平的圖表。通過各種給藥方式在各個時間點為患者給藥同種異體的、激活的Thl細胞。
【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明涉及導(dǎo)致在患者的血漿中IL-12的水平可以被檢測到的組合物和方法。本發(fā)明包括組合物，當為 患者給藥時，可以導(dǎo)致患者的血漿中內(nèi)源性IL-12產(chǎn)生的水平可以被檢測到，而沒有任何顯著的毒性。該內(nèi)源性IL-12可以在患有癌癥的患者中被意外地檢測到。所述組合物優(yōu)選包括同種異體激活的T細胞。T細胞不能夠產(chǎn)生IL-12，因此為患者給藥該T細胞組合物引起通過該患者自身APC產(chǎn)生IL-12。
[0011]本發(fā)明還包括在患者中通過該患者的自身免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性IL-12的方法。該方法包括給藥同種異體材料的組合物，優(yōu)選地為同種異體的被激活的T細胞。該組合物可以以單劑量或多劑量進行給藥。優(yōu)選地，該同種異體的被激活的T細胞以多次、低劑量進行給藥。該同種異體細胞可以通過皮膚內(nèi)的、靜脈內(nèi)的或病灶內(nèi)的途徑給藥。優(yōu)選地，給藥頻率為不少于每3天一次。給藥這些組合物時，患者自身的免疫系統(tǒng)可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生可以檢測得到水平的血漿IL-12，甚至在患有癌癥的患者體內(nèi)。通常地，由于腫瘤可以抑制IL-12的表達，在患有癌癥的患者體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)IL-12。令人驚奇的是，本文所描述的方法可以克服這種抑制作用，并且在建立足夠誘導(dǎo)血漿中IL-12的長時間表達的環(huán)境，例如，表達幾個月或甚至一年。進一步地，血漿中內(nèi)源性IL-12的存在在患者中并不引起如作為藥物給藥外源性IL-12時的顯著毒性。
[0012]內(nèi)源性IL-12是指該IL-12是在患者體內(nèi)通過其自身的免疫系統(tǒng)合成的。具體地，該IL-12可以通過患者的抗原呈遞細胞(APC)而被合成。APC可以包括單核細胞和巨噬細胞、樹突細胞和B細胞。外源性IL-12是指該IL-12不是通過患者自身的免疫系統(tǒng)合成的。外源性IL-12包括從另一個體中分離和/純化的IL-12，或者通過包括IL-12基因的DNA構(gòu)建體而表達的IL-12。
[0013]有利地，在患者體內(nèi)全身內(nèi)源IL-12的產(chǎn)生對患者引起極小或沒有毒性。該患者可能經(jīng)歷瞬時性癥狀，例如短暫的流感樣癥狀。通常地，當為患者給藥外源性IL-12時，毒性作用限制了其在治療方案(setting)中的應(yīng)用。本文所描述方法促進內(nèi)源性IL-12產(chǎn)生的能力是令人驚訝的，其可以導(dǎo)致在血漿中系統(tǒng)性地可檢測到IL-12的水平而不具有毒性。這種結(jié)果使得能夠利用患者自身的免疫系統(tǒng)以獲得由于存在IL-12對于腫瘤和癌細胞的減少和/或消除所引起的益處。
[0014]這些方法的用途也可以應(yīng)用于對Thl環(huán)境積極應(yīng)答的其他疾病的降低和/或消除，尤其是對IL-12。這種疾病包括癌癥、感染性疾病，包括慢性病毒性和細胞內(nèi)細菌或分枝桿菌性疾病，如乙型肝炎、丙型肝炎、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HPV、結(jié)核桿菌、牙周病和如變應(yīng)性哮喘的變態(tài)反應(yīng)性疾病。此外，促進內(nèi)源性IL-12產(chǎn)生的方法可以通過維持細胞免疫而具有抗衰老的作用。在正常個體中，Thl細胞相對于Th2細胞的平衡作為老齡化進程的-部分而降低，這使得老年人更易患感染性疾病和癌癥。促進內(nèi)源性IL-12產(chǎn)生可以增加Thl/Th2比率，由此防范對疾病的易感性。
[0015]本發(fā)明的所述組合物一般包括外源性抗原，優(yōu)選同種異體抗原。所述藥物組合物還包括至少一種Thl細胞因子和/或至少一種能夠引致樹突細胞成熟化以產(chǎn)生IL-12的樹突細胞效應(yīng)分子。所述治療組合物一般包括至少一種Thl細胞因子，和/或至少一種與所述同種異體抗原結(jié)合在一起的樹突細胞效應(yīng)分子。所述組合物優(yōu)選地包含活的同種異體的被激活的T細胞，這種T細胞能夠在單一細胞類型中提供所述組合物中每個組分。在優(yōu)選的實施方案中，采用活的同種異體Thl細胞，所述活的同種異體Thl細胞被激活以便產(chǎn)生Thl細胞因子，如干擾素-Y、腫瘤壞死因子-α和白介素-2，并在所述細胞表面表達所述樹突細胞成熟化效應(yīng)分子CD40L。或者，所述組合物中的所述三種組分可以來源于多個細胞類型。例如，在組合物中所述Thl細胞因子可以來源于一種細胞類型，所述同種異體抗原來自不同的細胞類型，以及所述樹突細胞效應(yīng)分子來自第三種細胞類型?；蛘撸环N細胞類型可以包含所述組分中的任意兩 種，和第二種細胞類型包含第三種組分。所述細胞類型不需要是活的，只要他們提供所述組合物的所述必要組分的來源。
[0016]或者，所述組合物組分可以來源于天然的或者生物工程的蛋白質(zhì)。例如，重組或純化的Thl細胞因子或樹突細胞成熟化分子或同種異體抗原可以一起使用或與活細胞組分組合使用。所述組合物組分可以被結(jié)合在“芯片”或生物可降解平臺上。所述組分不需要被同時傳遞給患者，而可以以任何順序被傳遞給患者。
[0017]在所述治療組合物中的所述同種異體抗原必須以這樣的方式提供，通過該方式該抗原可被吞噬或提呈給免疫系統(tǒng)從而被處理和提呈給T細胞。該抗原可以是活細胞的天然部分，也可以是利用分子生物學(xué)技術(shù)改變的或生物工程改造的。該抗原可以是可溶性的或者被固定在表面上，活的生物體或細胞的完整部分，或減毒生物體的一部分。在優(yōu)選的實施方案中，所述同種異體抗原為同種異體的T細胞，在更優(yōu)選的實施方式中，為同種異體的被激活的T細胞。
[0018]在一個示例性的實施例中，所述治療組合物包括表達于T細胞上的同種異體抗原。所述T細胞優(yōu)選為CD4+T細胞，更優(yōu)選地為Thl細胞。所述Thl細胞可以是由來源于正常血液供體的幼稚CD4+前體細胞經(jīng)體外分化、擴增和激活而來。優(yōu)選地，所述細胞在給藥時是處于被激活的狀態(tài)的。優(yōu)選地所述細胞通過交聯(lián)針對CD3/CD28表面分子的單克隆抗體而被激活。該交聯(lián)優(yōu)選地通過在表面固定化所述CD3/CD28單克隆抗體而實現(xiàn)。優(yōu)選地，所述表面是微米珠或納米珠顆粒。這些珠子可以是生物可降解的。這些細胞可以產(chǎn)生大量炎癥Thl細胞因子，還可以在細胞表面表達效應(yīng)分子，例如⑶40L，其用于通過引起內(nèi)源性IL-12的產(chǎn)生促進Thl免疫的發(fā)展。
[0019]在優(yōu)選的實施方案中，所述治療組合物包括被激活的同種異體Thl細胞。這些被激活的Thl細胞可以作為強有效的抗炎藥。這些被激活的同種異體Thl細胞和用于制備它們的方法被詳細描述于美國專利7,435, 592,7,678, 572,7,402,431和7，592,431中，通過參照將其并入本文。該被激活的同種異體Thl細胞是故意針對患者錯配的。
[0020]各種各樣的Thl炎性細胞因子可以被包含在所述治療組合物中。Thl炎性細胞因子的例子包括:IL-1、IL-2、IL-6、IL-12, IL-15, IFN-Y、TNF-α、TNF- β，GM-CSF 和 C-C趨化因子，并且不包括TGF-β、IL-4或IL-10。所述細胞因子組分可以為天然的或重組的細胞因子，或者可以為設(shè)計為與細胞因子的受體相互作用的生物工程分子。所述細胞因子可以被直接包括在所述治療組合物中?；蛘?，所述治療組合物可以包括活的細胞或者其他產(chǎn)生和分泌所述細胞因子的組分。優(yōu)選地，所述細胞因子通過被激活的細胞源自然地被提供，由于外源性細胞因子對于患者往往是極毒的而內(nèi)源性細胞因子卻不是。在一些示例性的實施方式中，這些治療組合物包括處于被激活狀態(tài)而產(chǎn)生和分泌所述Thl炎性細胞因子的T細胞，由此，這些治療組合物可以作為所述這些治療組合物中細胞因子的來源。
[0021]所述治療組合物可以包括引致所述未成熟樹突細胞成熟化的一個因子(afactor)或幾個因子(factors),具體地,促進樹突細胞I細胞成熟化的成熟化因子和引起干擾素- Y產(chǎn)生和Thl適應(yīng)性免疫的IL-12產(chǎn)生。樹突細胞對引發(fā)免疫應(yīng)答是所必需的，該樹突細胞能夠由未成熟的、抗原-捕獲細胞進化為成熟的、抗原-呈遞的、T細胞-致敏的細胞，從而將抗原轉(zhuǎn)化成為免疫原并表達細胞因子、趨化因子、共刺激分子。T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型(Thlvs.Th2)引起取決于從周圍微環(huán)境接收的激活信號的變化。樹突細胞調(diào)控如抗腫瘤和抗感染性疾病免疫的能力取決于促進Thl免疫的樹突細胞成熟化。人類樹突細胞不是同源性群體。除了引`起抗腫瘤免疫，樹突細胞可以引起無效或耐受。樹突細胞源于CD34+造血干細胞(HSC)。髓樣樹突細胞(DCl)和類漿細胞樹突細胞(DC2)為人類樹突細胞的兩個主要亞群，他們的表型、遷移和功能特性差異極大。DCl細胞為有效的T細胞刺激因子，引起腫瘤特異性免疫應(yīng)答。⑶llc+DCl細胞首先引起Thl分化，而表達IL-3 (⑶123)受體的DC2主要促進Th2應(yīng)答。在患有癌癥的患者中兩種樹突細胞群顯著低于在健康供體中的。DCl細胞成熟化后產(chǎn)生IL-12，而DC2細胞產(chǎn)生IL-10。
[0022]在所述樹突細胞成熟化進程中，細胞因子如IL-10和IL-12的產(chǎn)生影響Thl或Th2免疫應(yīng)答的DC誘導(dǎo)。除了抗原呈遞分子和共刺激因子分子水平的高表達，成熟樹突細胞必須釋放大量IL-12從而刺激Thl免疫應(yīng)答。IL-10的釋放通過干擾共刺激因子分子的上調(diào)和IL-12的產(chǎn)生而阻礙所述樹突細胞成熟化進程，這限制了樹突細胞引發(fā)Thl應(yīng)答的能力。
[0023]各種各樣因子可以在攝入和處理抗原后引起樹突細胞的成熟化而成為DCl (IL-12產(chǎn)生細胞)，包括:完整細菌或細菌源性的抗原(例如，脂多糖，LPS)，炎性細胞因子如IFN-Y ,TNF-α、IL-1、GM-CSF，，選擇細胞表面抗體的配體(例如⑶40)，病毒性產(chǎn)品(例如雙鏈RNA),在未成熟樹突細胞上的Fas卩齒合(Fas engagement),例如,這種Fas卩齒合引起成熟化以及IL-1 β和IFN-Y的釋放。⑶40的連接促進所述共刺激因子分子(例如Β7-1/⑶80和B7-2/CD86)和IL-12分泌以及趨化因子釋放的上調(diào)(例如，IL_8、MIP-1 α、MIP-1 β )。[0024]在一些優(yōu)選的實施方案中，包含⑶40L作為用于所述樹突細胞成熟化的因子。引起所述樹突細胞成熟化的其他因子的內(nèi)含物也在本發(fā)明的保護范圍之中。在一些示例性實施方案中，這些治療組合物包括處于被激活狀態(tài)的T細胞，該T細胞在表面上表達高密度的DC40L。DC40L是用于樹突細胞成熟化而產(chǎn)生IL-12的強有效的效應(yīng)分子。
[0025]在一些示例性的實施方案中，所述治療組合物包括被激活的同種異體T細胞、至少一種I型細胞因子和至少一種引致樹突細胞成熟化的效應(yīng)因子。包含這些組分的這些組合物被描述于，例如，在2010年12月14日提交的、專利申請?zhí)枮?2/967，910、審查中的美國專利申請中，并通過參照將其并入本文。
[0026]在消融一些腫瘤細胞后瘤內(nèi)給藥所述治療組合物從而釋放腫瘤相關(guān)抗原進入所述微環(huán)境可以為樹突細胞成熟化為DCl表型提供一個強有效的輔助作用，其中DCl表型產(chǎn)生IL-12并促進I型抗腫瘤免疫的發(fā)展和腫瘤免疫逃逸機制的下調(diào)。給藥所述治療組合物還可以通過其他方法而被完成，例如靜脈內(nèi)的、皮膚內(nèi)的、鞘內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、病灶內(nèi)的、胸膜內(nèi)的給藥和諸如此類。優(yōu)選地，所述組合物首先被皮內(nèi)給藥，因為皮膚有大量的被成為朗格漢斯細胞的未成熟樹突細胞。在Thl炎性細胞因子(如干擾素-Y、腫瘤壞死因子-α、IL-2和GM-CSF)和樹突細胞成熟化因子(如CD40L)的存在下，所述朗格漢斯細胞攝入所述同種異體抗原并成熟化為DC1，該DCl為IL-12產(chǎn)生細胞。這些成熟細胞遷移到淋巴結(jié)并促進Thl免疫的發(fā)展。[0027]皮內(nèi)注射所述組合物可以“致敏”患者對所述組合物中的所述同種異體抗原產(chǎn)生免疫力。多次皮內(nèi)注射可以增強Thl記憶細胞的數(shù)量，這會反過來改變所述Thl/Th2平衡，其中所述Thl記憶細胞特異性針對所述患者的循環(huán)中所述同種異體抗原。優(yōu)選的皮內(nèi)注射劑量為IxlO6個到IxlO7個同種異體的被激活的Thl細胞，每I毫升液體中含有IxlO7個細胞是最優(yōu)選的。所述皮內(nèi)注射劑量優(yōu)選地被重復(fù)多次從而建立循環(huán)中Thl記憶細胞的數(shù)量。所述皮內(nèi)注射劑量的頻率優(yōu)選為每7天注射約3~4次，更優(yōu)選地每3~4天。
[0028]在優(yōu)選的實施方案中，繼皮內(nèi)給藥后是通過腫瘤內(nèi)給藥所述組合物以建立原位疫苗。優(yōu)選地將在靶病灶的一些腫瘤細胞進行原位消融后進行所述腫瘤內(nèi)給藥。優(yōu)選地通過采用極度冷(冷凍消融術(shù))或極度熱(輻射)引致所述消融，但也可以利用各種包括酒精消融法、化學(xué)療法和/或單克隆抗體藥物的方法進行。腫瘤內(nèi)給藥的優(yōu)選劑量在約IxlO7個細胞和IxlO8個細胞之間，最優(yōu)選地為約3xl07個細胞。優(yōu)選地第一次腫瘤內(nèi)給藥在所述消融后即刻進行注射并在約7天內(nèi)節(jié)進行第二次，優(yōu)選地在所述第一次注射的約3~4天內(nèi)。該在消融后進行腫瘤內(nèi)注射所述組合物的過程可以根據(jù)需要重復(fù)。
[0029]所述方法還優(yōu)選地包括通過靜脈內(nèi)給藥所述組合物從而引致(先天的和獲得的)宿主免疫細胞的激活及其向炎性部位的滲出，包括腫瘤部位。靜脈內(nèi)給藥包含同種異體的被激活的Thl細胞的組合物的優(yōu)選劑量包括約IxlO7個細胞~IxlO9個細胞,更優(yōu)選地約5xl07個細胞~IxlO8個細胞。該靜脈輸注可以被重復(fù)若干次，優(yōu)選的以月計。
[0030]所述包含同種異體Thl細胞的組合物優(yōu)選地產(chǎn)生大量I型細胞因子:IL_2、IFN-y ,TNF-α和GM-CSF。在Thl炎性細胞因子的存在的微環(huán)境中未成熟樹突細胞吞噬和處理抗原可以幫助促進成熟化為DCl，該DCl為IL-12產(chǎn)生細胞。IL-12可以刺激IFN-Y的水平，這反過來可以引起促進Thl免疫。IFN-Y是對促進I型抗腫瘤免疫所必須的一種重要的I型細胞因子。IFN-Y可以通過直接抑制腫瘤細胞生長并誘導(dǎo)T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答而調(diào)節(jié)抗腫瘤作用。IFN-Y的分泌可以獨立地影響NK細胞應(yīng)答，還可以增強由IL-12激活的NK細胞應(yīng)答。
[0031]包含被激活的同種異體Thl細胞的優(yōu)選藥劑可以來源于前體細胞，該前體細胞從正常或篩選過的血液供體純化而來。所述細胞應(yīng)以無菌、低內(nèi)毒素的劑型提供，該劑型被制成適于皮內(nèi)的或腫瘤內(nèi)注射或者靜脈輸注。該細胞還可以制成適于腹膜內(nèi)的、胸膜內(nèi)的或硬膜外的輸注。優(yōu)選地供體被測試為HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBV、HCV和RPR (梅毒)為陰性，并且優(yōu)選地細胞被測試為支原體、EBV和CMV陰性。在優(yōu)選的實施方案中，被激活的同種異體細胞為與患者HLA不匹配的。
[0032]本發(fā)明的方法通常涉及在患者的血漿中產(chǎn)生可檢測水平的內(nèi)源性IL-12。該方法包括按照這樣的方式給藥本發(fā)明的組合物，通過該方式能夠操縱患者的免疫系統(tǒng)以在患者的血漿中以可檢測的水平產(chǎn)生內(nèi)源性IL-12。本文中所述的方法可以提高癌癥患者中Thl免疫細胞的循環(huán)數(shù)目，改變Th2環(huán)境與Thl環(huán)境的平衡。另外，該方法也可包括下列步驟:引發(fā)抗腫瘤特異性Thl免疫性和/或激活先天的和適應(yīng)性的免疫反應(yīng)的組分以產(chǎn)生持續(xù)的Thl細胞因子環(huán)境以便下調(diào)腫瘤免疫逃逸。
[0033]本發(fā)明的該方法可以包括給藥一種包含外源性抗原的組合物以促進患者中的Thl免疫抵抗外源性抗原。該方法也可包括消融腫瘤的全部或者部分導(dǎo)致至少一些腫瘤壞死。許多方法可用于在該患者中產(chǎn)生腫瘤壞死。該方法也可包括接近于腫瘤壞死位點，即腫瘤損傷的位點，造成炎性的微環(huán)境。另外，該方法還可以包括激活患者適應(yīng)性的和先天的免疫細胞以保持延長的Thl環(huán)境。在優(yōu)選實施方案中，該方法的主要組成包括使用包含如上所述激活的同種異體的T細胞的藥物或組合物。
[0034]因為大多數(shù)人類癌癥患者通常出現(xiàn)極化的Th2免疫性，這個治療方法的目標通常是用于提高癌癥患者中循環(huán)Thl細胞的量。循環(huán)Thl細胞的數(shù)目在癌癥患者中可以被增加，通過為患者給藥上述包括外源性抗原的治療組合物之一。
[0035]在一示范性實施方案中，患者被皮內(nèi)注射給藥激活的同種異體的Thl細胞。在優(yōu)選實施方案中，皮內(nèi)注射是按照周進度表進行的，一周一次持續(xù)約3-4周。在其它優(yōu)選的實施方案中，皮內(nèi)注射可以是每隔3-4天給藥多次。皮內(nèi)注射可以是每隔一天或相隔至多一年地給藥。注射日程表應(yīng)該設(shè)計成能提高Thl記憶細胞在循環(huán)中的足跡。表達在外源細胞上的同種異體抗原可以刺激有效的免疫排斥響應(yīng)。另外，Thl細胞因子在組合物中的存在或通過同種異體細胞表達Thl細胞因子可以提供炎性的輔助環(huán)境，這對于控制針對同種異體抗原的免疫反應(yīng)朝向Thl記憶免疫性而言是必要的。這可以造成在患者循環(huán)中的提高的Thl記憶細胞匯合，所述患者對于同種異體Thl細胞中包含的同種異體抗原是特異性的。多重給藥可以作為加強注射，提高對于同種異體抗原特異性的循環(huán)記憶Thl細胞的數(shù)目。 [0036]在一些實施方案中，給藥同種異體的激活的T細胞之后可以進行另外的步驟以提高患者響應(yīng)。這些步驟可以包括例如消融腫瘤，其造成腫瘤壞死，以及瘤內(nèi)給藥另外的同種異體的激活的T細胞。也可進行另外的靜脈內(nèi)給藥同種異體的激活的細胞。這些方法被描述于Har-Noy的美國專利N0.7，972，594中，通過參照引入本文。
[0037]使用本文中所述的方法給藥該治療組合物或藥物可以促進在患者中通過患者自身的免疫系統(tǒng)系統(tǒng)性產(chǎn)生內(nèi)源性IL-12?；颊咧械膬?nèi)源性IL-12的濃度足以IL-12可以在患者血漿中被檢測到?？蓹z測水平的IL-12是內(nèi)源的，并且不是任何治療組合物中所包存在的組分的結(jié)果，因為通常該組合物的組分被患者的免疫系統(tǒng)在排斥響應(yīng)中消除，其中排斥響應(yīng)通過給藥同種異體的材料引起。在優(yōu)選實施方案中，該組合物包含不能產(chǎn)生IL-12的T細胞。因此任何在患者血漿中產(chǎn)生的IL-12都是通過患者的自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IL-12的結(jié)果。
[0038]優(yōu)選地，IL-12是通過患者的免疫細胞產(chǎn)生的,例如患者自身單核細胞、天然殺傷細胞和樹突狀細胞。這些細胞將在通過給藥本文中所述的組合物所產(chǎn)生的炎性的或I型細胞因子的影響下成熟。
[0039]患者的血漿中IL-12的濃度可以變化但是通常為至少約8000pg/ml?；颊叩难獫{中IL-12的濃度優(yōu)選在約8000pg/ml至200，000pg/ml之間。如這里所述,在患者的血衆(zhòng)中檢測的IL-12的濃度沒有招致毒性問題。然而，給藥外源的IL-12已經(jīng)知道對于患者是有毒的。與在血清中沒有表達IL-12的患者相比，在血漿中血清轉(zhuǎn)化至IL-12表達的患者具有提高的存活。IL-12的水平可能與存活無關(guān)，只是IL-12的存在是重要的。
[0040]通常在給藥組合物后一段時間檢測IL-12的增加。優(yōu)選地，在給藥治療組合物約3-4周之后，在血漿中可以檢測到IL-12。在給藥上次組合物之后，在IL-12血清轉(zhuǎn)化方面可能會有約90-120天的延遲。
[0041]可以通過使用許多方法檢測血漿中的IL-12。IL-12具有兩個亞基，稱為p40和P35鏈，優(yōu)選p40特異性的抗體用于檢測。 許多方法可以用來檢測IL-12的存在。IL-12的檢測可以包括例如ELISA和細胞因子珠陣列。
[0042]本文中所述的方法可以適于許多患者包括人類。該方法也可對其它哺乳動物使用。
[0043]本發(fā)明還包括治療患者中疾病的方法。該疾病可以包括如上所述的癌性的腫瘤、血液惡性腫瘤以及由病原體所引起的疾病。對患者中Thl響應(yīng)敏感的其它疾病也可以使用本文中所述的方法治療。根據(jù)本文中所述的方法為患者給藥同種異體的組合物。患者的血漿然后后監(jiān)控IL-12的存在。檢測到內(nèi)源性IL-12可以是患者對該疾病免疫反應(yīng)的表現(xiàn)?？梢赃M行另外的給藥治療組合物用于維持IL-12水平并且由此保持患者的免疫反應(yīng)抵抗疾病抗原。
[0044]實施例
[0045]進行該研究以監(jiān)控被同種異體的激活的Thl細胞治療的患者中的IL-12水平。這些激活的同種異體Thl細胞和用于制備他們的方法被描述于美國專利N0.7，435，592。激活的同種異體Thl細胞故意與患者錯配。
[0046]皮內(nèi)注射-皮內(nèi)注射給藥激活的同種異體Thl細胞。細胞懸浮于Iml中，密度為1x107個細胞/ml。
[0047]瘤內(nèi)注射-在消融一小時內(nèi)，在被消融的腫瘤的壞死中給進行瘤內(nèi)注射給藥。
[0048]冷凍消融是利用CryoCare_28Percutaneous Probe System(Endocare,CA,USA)進行的。該系統(tǒng)使用Joule-Thomson效應(yīng)以在封閉系統(tǒng)中冷卻冷凍探針的末端。根據(jù)氣體系數(shù)和針頭的尺寸，不同的氣體元素在接近枕頭的區(qū)域產(chǎn)生不同的溫度交換事件。氬氣用于冷卻(-187 °C )，氦氣用于加熱(67 V )。
[0049]在CT成像引導(dǎo)下，鑒定和定位所計劃的目標腫瘤損傷。形成無菌區(qū)域，并且為計劃的插入位點給藥局部麻醉藥。皮下插入導(dǎo)引探針，并且通過CT確認在目標腫瘤損傷內(nèi)。進行一兩次凍-融循環(huán)。根據(jù)目標腫瘤的尺寸，使用2-mm或5-mm的單個探針。冷凍的時間為大約5~20分鐘，依賴于CT上可見到的“冰球”的出現(xiàn)。融化時通過在開始第二次冷凍處理之前，在與冷凍相同的時間內(nèi)輸入氦氣而完成的。該過程需要消融腫瘤損傷樣品，而不需要完整地消融腫瘤以及無腫瘤邊緣。
[0050]在第二冷凍循環(huán)之后，在注射同種異體激活的Thl細胞之前，對損傷進行冷卻。
[0051]表1、2和3顯示了具體治療的時機，以及在所指定日期患者血漿中IL-12的水平。圖1是在該研究過程中患者免疫系統(tǒng)表達IL-12的示意圖。
[0052]表1
[005 3]
【權(quán)利要求】
1.一種能夠引起在血漿中IL-12出現(xiàn)的組合物，其特征在于，所述藥物組合物基本上由以下組成: 外源性抗原； 至少一種Thl細胞因子；和 樹突細胞成熟化分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述外源性抗原為同種異體抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述Thl細胞因子為IL-l、IL-2、IL-6、IL-8、IL-15、干擾素-Y、TNF- a、GM-CSF 的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述樹突細胞成熟化分子為CD40L和/或 FasL0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述同種異體抗原于活的T細胞上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述T細胞為CD4+細胞或Thl細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述Thl細胞是被激活的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述Thl細胞是通過CD3和CD28交聯(lián)而被激活的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述被激活的Thl細胞分泌下列至少一種 Thl 細胞因子:IL-2、IFN- Y 和 GM-CSF。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述樹突細胞成熟化分子CD40L和/或FasL表達于所述被激活的Thl細胞表面。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組分固定在表面上。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述表面是生物可降解的。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述活的T細胞被包裝于注射器或軟質(zhì)容器中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述細胞的濃度為IxlO7個細胞/毫升以上。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述細胞被懸浮于非營養(yǎng)培養(yǎng)基中。
16.一種在患者中升高血漿IL-12水平的方法，其特征在于，包括: 給藥包含同種異體細胞的組合物，其中所述細胞的至少一部分為被激活的T細胞； 監(jiān)控患者中IL-12的水平；和 如果在所述患者的血漿中未檢測到足夠的IL-12水平，再次給藥所述組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述IL-12的檢測對所述患者是無毒的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述被激活的T細胞為CD4+細胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述被激活的CD4細胞是Thl細胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述Thl細胞是通過⑶3和⑶28交聯(lián)而被激活的。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述組合物的給藥增加所述患者中所述IFN- Y的水平和/或所述Thl應(yīng)答。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，在所述患者的血漿中所述IL-12的水平為至少約5000pg/毫升。
23.一種治療疾病患者的方法，其特征在于，包括: 給藥包含同種異體細胞的組合物，其中至少一部分為被激活的T細胞，其中所述T細胞是通過交聯(lián)至少一種藥劑被激活的，其中所述藥劑在所述T細胞上與所述細胞表面物類結(jié)合； 監(jiān)控所述患者的血漿中所述IL-12的水平；和 如果在所述患者的血漿中未檢測到IL-12，再次給藥所述組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述疾病為癌癥或為病原感染的結(jié)果。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述再次給藥被重復(fù)直至所述內(nèi)源性IL-12的濃度可以被檢測到。
26.一種用于升高所述內(nèi)源性IL-12水平的治療組合物，其包括:激活的同種異體T細胞， 其中，所述組合物的給藥導(dǎo)致在患者的血漿中內(nèi)源性IL-12水平可以被檢測到而對所述患者無毒性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的治療組合物，其特征在于，所述患者具有癌癥或者感染性疾病。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的治療組合物，其特征在于，所述T細胞為CD4+細胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所`述的治療組合物，其特征在于，所述T細胞通過是通過交聯(lián)至少一種藥劑被激活的，其中所述藥劑在所述T細胞上與所述細胞表面物類結(jié)合。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的治療組合物，其特征在于，所述至少一種藥劑為單克隆抗體，如抗-CD3單克隆抗體和抗-CD28單克隆抗體。
【文檔編號】A61P37/04GK103687602SQ201280021818
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月3日
【發(fā)明者】邁克爾·哈-諾伊 申請人:免疫創(chuàng)新治療有限公司