免疫誘導(dǎo)劑的制作方法
【專利摘要】提供了作為癌的治療劑和/或預(yù)防劑等有用的新穎的免疫誘導(dǎo)劑。所述免疫誘導(dǎo)劑含有選自以下(a)、(b)和(c)的多肽類且具有免疫誘導(dǎo)活性的至少一種多肽、或包含編碼該多肽的多核苷酸且在活體內(nèi)能表達(dá)該多肽的重組載體作為有效成分，即，(a)包含序列表中序列號(hào)4、2、22、24所示氨基酸序列中連續(xù)7個(gè)以上氨基酸的多肽，(b)與上述(a)的多肽具有90％以上的序列同一性、且包含7個(gè)以上氨基酸的多肽，和(c)包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列的多肽。
【專利說明】免疫誘導(dǎo)劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及作為癌的治療劑和/或預(yù)防劑等有用的新穎的免疫誘導(dǎo)劑。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是占全部死亡原因的第一位的疾病，當(dāng)前所實(shí)施的治療主要是手術(shù)療法，其與放射線療法和化學(xué)療法聯(lián)合實(shí)施。盡管近年來開發(fā)了新的手術(shù)法和發(fā)現(xiàn)了新的抗癌劑，但是現(xiàn)狀是，除了一部分癌之外，癌的治療成績?nèi)晕锤纳?。近年來，隨著分子生物學(xué)和癌免疫學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)鑒定了對(duì)癌起反應(yīng)的細(xì)胞毒T細(xì)胞所識(shí)別的癌抗原和編碼癌抗原的基因，并且對(duì)抗原特異性免疫療法的期望提高。
[0003]在免疫療法中，為了減輕副作用，需要作為其抗原被識(shí)別的肽或蛋白質(zhì)基本上不存在于正常細(xì)胞、但特異地存在于癌細(xì)胞。1991年，比利時(shí)Ludwig研究所的Boon等人通過使用自身癌細(xì)胞株和癌反應(yīng)性T細(xì)胞的cDNA表達(dá)克隆法，分離了 CD8陽性T細(xì)胞識(shí)別的人黑素瘤抗原MAGEl (非專利文獻(xiàn)I)。此后，報(bào)導(dǎo)了采用基因表達(dá)克隆法鑒定由抗體識(shí)別的腫瘤抗原的SEREX(通過重組表達(dá)克隆法對(duì)抗原的血清學(xué)鑒定)法，其中所述的抗體是癌患者身體內(nèi)對(duì)自身癌反應(yīng)而產(chǎn)生的抗體(專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)，根據(jù)該方法分離了若干癌抗原。此外，已經(jīng)開始了靶向一部分所述癌抗原的癌免疫療法的臨床試驗(yàn)。 [0004]另一方面，如同人的情況，犬和貓也已知會(huì)患乳腺腫瘤、扁平上皮癌等多種腫瘤，并且犬和貓?jiān)诩膊〗y(tǒng)計(jì)中也是排名靠前。但是，當(dāng)前沒有用于犬或貓的癌的有效治療劑、預(yù)防劑和診斷劑。大部分犬或貓的腫瘤是，腫瘤在進(jìn)行、大部分情形是飼養(yǎng)主直至腫瘤變大才注意到，通過醫(yī)院外科手術(shù)切除腫瘤，即使施用人用藥物(抗癌劑等)也已為時(shí)過晚，多數(shù)在處置后不久死亡。在這樣的現(xiàn)狀下，如果對(duì)犬或貓有效的癌治療劑和預(yù)防劑是可獲得的，則可以期待其應(yīng)用于犬癌癥。
[0005]硬脂酰輔酶A去飽和酶I (S⑶I)導(dǎo)入雙鍵至飽和脂肪酸的C9 一 ClO位。該酶的優(yōu)選底物是棕櫚酰-Cok (16:0)及硬脂酰-Cok (18:0),分別轉(zhuǎn)換為棕櫚油酰-Cok (16:1)及油酰-CoA (18:1)。接下來，獲得的單不飽和脂肪酸能夠用于體內(nèi)磷脂質(zhì)、甘油三酯及膽甾醇酯的制備中。另外，報(bào)導(dǎo)了 SCDl在肝臟癌、食道癌、大腸癌等多種癌中表達(dá)提高，通過siRNA或低分子抑制化合物抑制SCDl的機(jī)能，則抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡(非專利文獻(xiàn)3、4、5)。但是，還沒有報(bào)導(dǎo)SCDl蛋白對(duì)癌細(xì)胞具有免疫誘導(dǎo)活性，由此該蛋白質(zhì)對(duì)于癌的治療和預(yù)防是有用的。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:美國專利第5698396號(hào)
[0009]非專利文獻(xiàn)
[0010]非專利文獻(xiàn)1:Bruggen P.等人，Science, 254:1643-1647 (1991)
[0011]非專利文獻(xiàn)2:Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:11810-11813 (1995)
[0012]非專利文獻(xiàn)3:Scaglia N.等人，PLoS 0ne4: e6812 (2009)[0013]非專利文獻(xiàn)4:Morgan_Lappe SE.等人，Cancer Res67:4390 - 4398(2007)
[0014]非專利文獻(xiàn)5 =Scaglia N.等人，Biochim Biophys Actal687:141 - 151 (2005)
[0015]非專利文獻(xiàn)6:Ariyama H.等人，J Biol Chem(2010)
[0016]發(fā)明概述
[0017]發(fā)明欲解決的課題
[0018]本發(fā)明的目的是，發(fā)現(xiàn)作為癌的治療劑和/或預(yù)防劑等有用的新穎多肽、提供該多肽作為免疫誘導(dǎo)劑的用途。
[0019]用于解決課題的手段
[0020]本申請(qǐng)的
【發(fā)明者】們深入研究的結(jié)果是，通過使用犬精巢衍生的cDNA文庫和荷癌犬血清的SEREX法，獲得了編碼蛋白質(zhì)的cDNA，所述蛋白質(zhì)與來自荷癌活體的血清中存在的抗體結(jié)合，并且基于該cDNA，他們制備了具有序列號(hào)2所示氨基酸序列的犬硬脂酰輔酶A去飽和酶I (以下記載為SCD1)的多肽。另外，基于所獲得的基因的人和小鼠同源性基因，制備了具有序列號(hào)4和6所示氨基酸序列的人和小鼠S⑶I。然后，他們發(fā)現(xiàn)這些S⑶I多肽在乳腺癌、腦腫瘤、大腸癌、肛門周圍腺癌、肥大細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腎臟癌、肝臟癌、肺癌、前列腺癌或白血病的組織或細(xì)胞中特異地表達(dá)。進(jìn)一步地，他們發(fā)現(xiàn)通過向活體內(nèi)施用這些S⑶1，能夠在活體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)S⑶I的免疫細(xì)胞和表達(dá)S⑶I的活體內(nèi)腫瘤的退縮。此外，他們發(fā)現(xiàn)能夠表達(dá)編碼SCDl的多肽或其片段的多核苷酸的重組載體針對(duì)表達(dá)SCDl的癌誘導(dǎo)了活體內(nèi)的抗腫瘤效果。
[0021]進(jìn)一步地，他們發(fā)現(xiàn)SCDl的多肽具有被抗原呈遞細(xì)胞呈遞、使對(duì)該肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞活化和增殖的能力(免疫誘導(dǎo)活性)，由此該多肽對(duì)于癌的治療和/或預(yù)防是有用的；另外，與該多肽接觸了的抗原呈遞細(xì)胞、以及與該抗原呈遞細(xì)胞接觸了的T細(xì)胞對(duì)于癌的治療和/或預(yù)防是有用的，從而完成了本發(fā)明。
[0022]因此，本發(fā)明具有以下特征。
[0023](I)免疫誘導(dǎo)劑，其含有選自以下(a)至(C)的任一多肽類且具有免疫誘導(dǎo)活性的至少一種多肽、或包含編碼該多肽的多核苷酸且在活體內(nèi)能表達(dá)該多肽的重組載體作為有效成分，
[0024](a)包含序列表中序列號(hào)4、2、22、24所記載的氨基酸序列中連續(xù)7個(gè)以上氨基酸的多肽，
[0025](b)與上述(a)的多肽具有85%以上的序列同一性、且包含7個(gè)以上的氨基酸的多肽，
[0026](c)包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列的多肽。
[0027](2) (1)中所記載的免疫誘導(dǎo)劑，其中上述具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是具有序列表中序列號(hào)4、2、22、24所記載的氨基酸序列的多肽。
[0028](3)⑴或⑵中所記載的免疫誘導(dǎo)劑，其是抗原呈遞細(xì)胞的處理劑。
[0029](4)⑴或⑵中所記載的免疫誘導(dǎo)劑，其是癌的治療劑和/或預(yù)防劑。
[0030](5)⑷中所記載的免疫誘導(dǎo)劑，其中上述癌是表達(dá)S⑶I的癌。
[0031](6) (4)或(5)中所記載的免疫誘導(dǎo)劑，其中上述癌是乳腺癌、腦腫瘤、大腸癌、肛門周圍腺癌、肥大細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腎臟癌、肝臟癌、肺癌、前列腺癌或白血病。
[0032](7)⑴~(6)中任一項(xiàng)所記載的免疫誘導(dǎo)劑，其還包含免疫增強(qiáng)劑。[0033](8) (7)中所記載的免疫誘導(dǎo)劑，其中上述免疫增強(qiáng)劑選自由弗氏不完全佐劑、Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體組成的組中的至少之一。
[0034]發(fā)明的效果
[0035]本發(fā)明提供了對(duì)癌的治療和/或預(yù)防等有用的新穎免疫誘導(dǎo)劑。如下文實(shí)施例中具體描述的那樣，向活體施用本發(fā)明中所用的多肽能夠在活體內(nèi)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞，進(jìn)而能使已存在的癌縮小或退縮。因此，該多肽對(duì)癌的治療和預(yù)防是有用的。
[0036]附圖簡述
[0037]圖1是顯示鑒定的S⑶I基因在犬正常組織和腫瘤組織或者癌細(xì)胞株中的表達(dá)模式的圖。參照編號(hào)1:犬SCDl基因在犬的各組織和細(xì)胞株中的表達(dá)模式；參照編號(hào)2:犬GAPDH基因在犬的各組織和細(xì)胞株中的表達(dá)模式。
[0038]圖2是顯示鑒定的S⑶I基因在人正常組織和腫瘤組織或者癌細(xì)胞株中的表達(dá)模式的圖。參照編號(hào)3:人SCDl基因在人的各組織和細(xì)胞株中的表達(dá)模式；參照編號(hào)4:人GAPDH基因在人的各組織和細(xì)胞株中的表達(dá)模式。
[0039]圖3是顯示鑒定的S⑶I基因在小鼠正常組織和腫瘤組織或者癌細(xì)胞株中的表達(dá)模式的圖。參照編號(hào)5:小鼠SCDl基因在小鼠的各組織和細(xì)胞株中的表達(dá)模式；參照編號(hào)6:顯示小鼠GAPDH基因在小鼠的各組織和細(xì)胞株中的表達(dá)模式。
[0040]用于實(shí)施發(fā)明的實(shí)施方案
[0041]可以列舉以下作為本發(fā)明免疫誘導(dǎo)劑中的有效成分而含有的多肽。另外，在本發(fā)明中，“多肽”是多個(gè)氨基酸通過肽鍵形成的分子，不僅包含構(gòu)成的氨基酸數(shù)多的多肽分子，也包含構(gòu)成的氨基酸數(shù)少的低分子量分子(寡肽)和全長蛋白質(zhì)；在本發(fā)明中，也包含具有序列號(hào)4、2、22、24中所示氨基酸序列的S⑶I全長蛋白質(zhì)。
[0042](a)由具有序列表中序列號(hào)4、2、22、24中所示氨基酸序列的多肽中的連續(xù)7個(gè)以上氨基酸組成、且具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽，
[0043](b)與(a)的多肽具有85%以上的序列同一性、且包含7個(gè)以上的氨基酸的具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽，
[0044](c)包含(a)或(b)的多肽作為部分序列、且具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽。
[0045]另外，在本發(fā)明中，“具有氨基酸序列”是指氨基酸殘基以這樣的順序排列。因此，例如“具有序列號(hào)2所示氨基酸序列的多肽”是指持有序列號(hào)2中所示的Met Pro AlaHis...(中略)...Tyr Lys Ser Gly的氨基酸序列的、大小為360個(gè)氨基酸殘基的多肽。另外，例如有時(shí)將“具有序列號(hào)2所示氨基酸序列的多肽”略寫為“序列號(hào)2的多肽”。對(duì)于“具有堿基序列”的表述也是同樣的。在這種情況下，用語“具有”與表述“包含”也可以互換。
[0046]在本文中，“免疫誘導(dǎo)活性”是指誘導(dǎo)活體內(nèi)分泌干擾素等細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞的能力。
[0047]上述多肽是否具有免疫誘導(dǎo)活性可以通過例如公知的ELISP0T測定法等確認(rèn)。具體而言，例如如后述的實(shí)施例中所記載的那樣，從施用了需要評(píng)價(jià)免疫誘導(dǎo)活性的多肽的活體獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞等細(xì)胞，將該細(xì)胞與該多肽共存培養(yǎng)，通過使用特異抗體測定由該細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子量，能夠測定該細(xì)胞中的免疫細(xì)胞數(shù)，由此能夠評(píng)價(jià)免疫誘導(dǎo)活性。
[0048]另外，如后述的實(shí)施例中所記載的那樣，將上述(a)~(C)的重組多肽施與荷癌活體，通過其免疫誘導(dǎo)活性也能夠使腫瘤退縮。由此，上述免疫誘導(dǎo)活性也能夠以抑制癌細(xì)胞增殖或使癌組織(腫瘤)縮小或消減的能力(下文中稱為“抗腫瘤活性”)來評(píng)價(jià)。多肽的抗腫瘤活性例如如后述的實(shí)施例中具體記載的那樣，能夠通過研究實(shí)際施用了該多肽的荷癌活體中腫瘤是否縮小等來確認(rèn)。
[0049]或者，也能夠通過研究用該多肽刺激的T細(xì)胞(即，與呈遞該多肽的抗原呈遞細(xì)胞接觸的T細(xì)胞)是否顯示體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，來評(píng)價(jià)多肽的抗腫瘤活性。T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的接觸可以如后述那樣，將兩者在液體培養(yǎng)基中共存培養(yǎng)而實(shí)施。細(xì)胞毒活性的測定可以例如如Int.J.Cancer, 58:p317, 1994中所記載的稱為51Cr釋放測定法的公知方法來實(shí)施。在將上述多肽用于癌的治療和/或預(yù)防用途中的情形時(shí)，不特別地限制評(píng)價(jià)方法，但優(yōu)選以抗腫瘤活性作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)免疫誘導(dǎo)活性。
[0050]本發(fā)明公開的序列表中序列號(hào)2、4、22、24分別顯示的氨基酸序列是S⑶I的氨基酸序列，其是通過使用犬精巢衍生的cDNA文庫和荷癌犬血清的SEREX法，分離與來自荷癌犬的血清中特異存在的抗體結(jié)合的多肽和所述多肽的人、牛、馬同源因子而獲得的(參照實(shí)施例1)。在作為犬S⑶I的人同源因子一人S⑶I中，序列同一性是堿基序列89%、氨基酸序列90%;在作為犬S⑶I的牛同源因子一牛S⑶I中，序列同一性是堿基序列88%、氨基酸序列87%;在作為犬S⑶I的馬同源因子一馬S⑶I中，序列同一性是堿基序列90%、氨基酸序列87%。
[0051]上述(a)的多肽是具有序列號(hào)2、4、22、24所示氨基酸序列的多肽中的連續(xù)7個(gè)以上、優(yōu)選地連續(xù)8、9或10個(gè)以上的氨基酸的多肽、且具有免疫誘導(dǎo)活性。更優(yōu)選地，該多肽包含與序列號(hào)4所示氨基酸序列的序列同一性為85%以上的氨基酸序列的多肽；特別優(yōu)選地，該多肽具有序列號(hào)2、4、22、24所示的氨基酸序列。另外，如本領(lǐng)域公知的那樣，如果是約7個(gè)氨基酸殘基以上的多肽，則能夠發(fā)揮抗原性和免疫原性。因此，只要是序列號(hào)2、4、22,24的氨基酸序列中的連續(xù)7個(gè)氨基酸殘基以上的多肽，由于其具有免疫誘導(dǎo)活性，因此能夠用于本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑的制備中。
[0052]另外，作為通過施用癌抗原多肽來免疫誘導(dǎo)的原理，已知的是，多肽被抗原呈遞細(xì)胞攝入，然后在該細(xì)胞內(nèi)被肽酶分解成為較小的片段，呈遞在該細(xì)胞表面上，細(xì)胞毒T細(xì)胞等對(duì)其識(shí)別，選擇性殺死呈遞該抗原的細(xì)胞?？乖蔬f細(xì)胞的表面上呈遞的多肽大小是比較小的，氨基酸數(shù)為7~30個(gè)左右。因此，從呈遞在抗原呈遞細(xì)胞上這點(diǎn)出發(fā)，作為上述
(a)的多肽，序列號(hào)2、4、22、24所示氨基酸序列中的連續(xù)7~30個(gè)氨基酸左右的多肽是優(yōu)選實(shí)施方案之一，更優(yōu)選地，8~30個(gè)或9~30個(gè)左右的氨基酸組成的多肽是足以呈遞在抗原呈遞細(xì)胞上的。有時(shí)也有比這些尺寸相對(duì)小的多肽不被攝入抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)，而是直接呈遞在抗原呈遞細(xì)胞上的細(xì)胞表面的情形。
[0053]另外，被抗原呈遞細(xì)胞攝入的多肽在該細(xì)胞內(nèi)受到肽酶在隨機(jī)位置處的切斷，產(chǎn)生多種多肽片段。由于這些多肽片段呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面上，如果施用序列號(hào)2、4、22、24的全長區(qū)域這樣大尺寸的多肽，則通過抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)的分解而必然產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)的有效免疫誘導(dǎo)的多肽片段。因此，即使對(duì)于抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)的免疫誘導(dǎo)，能夠優(yōu)選使用大尺寸多肽，也可以是氨基酸數(shù)為30個(gè)以上、更優(yōu)選地100個(gè)以上、更優(yōu)選地200個(gè)以上、更優(yōu)選地250個(gè)以上、更優(yōu)選地序列號(hào)2、4、22、24的全長區(qū)域多肽。
[0054]上述(b)的多肽是在上述(a)的多肽中置換、缺失和/或插入少數(shù)(優(yōu)選地一個(gè)或幾個(gè)的)氨基酸殘基的多肽，是與原始序列具有90%以上、優(yōu)選地95%以上、更優(yōu)選地98%以上、進(jìn)一步優(yōu)選地99%以上或99.5%以上的序列同一性、且具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽。一般地，在蛋白質(zhì)抗原中，即使在該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中置換、缺失或插入少數(shù)氨基酸殘基的情形，本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛已知的是存在有時(shí)與原始蛋白質(zhì)具有幾乎相同的抗原性的情形。因此，上述(b)的多肽由于也能發(fā)揮免疫誘導(dǎo)活性，所以能夠用于本發(fā)明免疫誘導(dǎo)劑的制備。另外，上述(b)的多肽也優(yōu)選的是在序列號(hào)2、4、22、24所示氨基酸序列中置換、缺失和/或插入I個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的多肽。本說明書中的“幾個(gè)”表示2~10的整數(shù)、優(yōu)選地2~6的整數(shù)、進(jìn)一步優(yōu)選地2~4的整數(shù)。
[0055]在本文中，氨基酸序列或堿基序列的“序列同一性”是指在使需要比較的2個(gè)氨基酸序列(或堿基序列)的氨基酸殘基(或堿基)盡可能多地一致下將兩個(gè)氨基酸序列(或堿基序列)比對(duì)，用百分率來表示一致的氨基酸殘基數(shù)(或一致的堿基數(shù))除以總氨基酸殘基數(shù)(或總堿基數(shù))。進(jìn)行上述比對(duì)時(shí)，根據(jù)需要在所比較的2個(gè)序列的一方或雙方中合適地插入空位。這樣的序列比對(duì)能夠使用例如BLAST、FASTA, CLUSTALff等周知的程序進(jìn)行。在插入空位的情形，上述總氨基酸殘基數(shù)變?yōu)閷個(gè)空位作為I個(gè)氨基酸殘基來計(jì)數(shù)的殘基數(shù)。由此，計(jì)數(shù)的總氨基酸殘基數(shù)在所比較的2個(gè)序列間是不同的情形下，序列同一性(％)是以一致的氨基酸殘基數(shù)除以序列較長一方的總氨基酸殘基數(shù)而算出的。
[0056]另外，構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種 氨基酸能夠按具有類似性質(zhì)的氨基酸來分組為具有低極性側(cè)鏈的中性氨基酸(Gly，He, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、具有親水性側(cè)鏈的中性氨基酸(Asn, Gin, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性氨基酸(Asp, Glu)、堿性氨基酸(Arg, Lys, His)、芳香族氨基酸(？1^，了71'，1'印)，已知如果是在它們內(nèi)部的置換，多數(shù)情況下多肽的性質(zhì)不變化。因此，對(duì)本發(fā)明上述(a)的多肽中的氨基酸殘基置換的情形，由于它們各組內(nèi)部的置換能夠維持免疫誘導(dǎo)活性的可能性高，所以是優(yōu)選的。
[0057]上述(c)的多肽包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列、且具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽。即，上述(C)的多肽是在(a)或(b)的多肽一端或兩端添加了其他氨基酸或多肽且具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽。這樣的多肽也能夠用于本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑的制備中。
[0058]上述多肽能夠根據(jù)例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法合成。另外，也能夠利用各種市售的肽合成儀按照常規(guī)方法來合成。此外，通過使用公知的基因工程技術(shù)，制備編碼上述多肽的多核苷酸，將該多核苷酸摻入表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，在該宿主細(xì)胞中生產(chǎn)多肽，能夠得到目的多肽。
[0059]編碼上述多肽的多核苷酸能夠使用公知的基因工程技術(shù)或市售的核酸合成儀根據(jù)常規(guī)方法容易地制備。例如，具有序列號(hào)I的堿基序列的DNA，能夠通過使用犬染色體DNA或cDNA文庫作為模板，用設(shè)計(jì)的一對(duì)能夠擴(kuò)增序列號(hào)I中所記載的堿基序列的引物進(jìn)行PCR來制備。如果是具有序列號(hào)3的堿基序列的DNA，能夠使用人染色體DNA或cDNA文庫作為上述模板同樣地制備。能夠適當(dāng)?shù)卦O(shè)定PCR反應(yīng)條件，能夠例舉例如，以由94°C 30秒(變性)、55°C 30秒~I分鐘(復(fù)性)、72°C 2分鐘(延伸)組成的反應(yīng)行程為I個(gè)循環(huán)，進(jìn)行例如30個(gè)循環(huán)后，72°C反應(yīng)7分鐘的條件等，但不限于此。另外，基于本說明書中的序列表的序列號(hào)1、3所示堿基序列和氨基酸序列信息，制備合適的探針或引物，通過使用它們來篩選犬或人等的cDNA文庫，能夠分離所需要的DNA。cDNA文庫優(yōu)選地從表達(dá)序列號(hào)2、4的蛋白質(zhì)的細(xì)胞、器官或組織制備。上述探針或引物的制備、cDNA文庫的構(gòu)建、cDNA文庫的篩選、以及目的基因的克隆等操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的操作，例如能夠根據(jù)MolecularCloning,第 2 版；Current Protocols in Molecular Biology 等中所記載的方法實(shí)施。自由此獲得的DNA能夠得到編碼上述(a)的多肽的DNA。另外，由于公知編碼各氨基酸的密碼子，能夠容易地確定編碼特定氨基酸序列的多核苷酸的堿基序列。因此，由于也能夠容易地確定編碼上述(b)或(C)的多肽的多核苷酸的堿基序列，所以這樣的多核苷酸也能夠容易地使用市售的核酸合成儀通過常規(guī)方法合成。
[0060]作為上述宿主細(xì)胞，只要是能夠表達(dá)上述多肽的細(xì)胞，任一細(xì)胞均可，作為原核細(xì)胞的例子可以例舉大腸桿菌等，作為真核細(xì)胞的例子可以例舉猴腎臟細(xì)胞C0S1、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO等哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞、出芽酵母、分裂酵母、蠶細(xì)胞、非洲爪蟾卵細(xì)胞等，但不限于它們。
[0061]使用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的情形，作為表達(dá)載體，使用具有在原核細(xì)胞中能夠復(fù)制的起點(diǎn)、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合部位、DNA克隆部位、終止子等的表達(dá)載體。作為大腸桿菌用表達(dá)載體，能夠例示PUC系統(tǒng)、pBluescriptI1、pET表達(dá)系統(tǒng)、pGEX表達(dá)系統(tǒng)等。能夠?qū)⒕幋a上述多肽的DNA摻入這樣的表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞后，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，使編碼上述DNA的多肽在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。此時(shí)，該多肽也能夠與其它的蛋白質(zhì)作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)。 [0062]使用真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的情形，作為表達(dá)載體，使用具有啟動(dòng)子、剪接區(qū)域、多聚(A)添加部位等的真核細(xì)胞用表達(dá)載體。作為這樣的表達(dá)載體，能夠例示pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2 等。與上述同樣地,能夠?qū)⒕幋a上述多肽的DNA摻入這樣的表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞后,培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，使編碼上述DNA的多肽在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。在使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達(dá)載體的情形，能夠使上述多肽作為添加了His標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、GFP等各種標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0063]能夠使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法等周知的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
[0064]為了從宿主細(xì)胞分離純化目的多肽，能夠組合公知的分離操作實(shí)施?？梢岳e例如尿素等變性劑或表面活性劑處理、超音波處理、酶消化、鹽析或溶媒分級(jí)沉淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電點(diǎn)電泳、離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法、反相層析法等，但不限于此。
[0065]在通過以上方法獲得的多肽中，如上所述，也包含與其它的任意蛋白質(zhì)融合的融合蛋白質(zhì)形式的多肽。能夠例示例如與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或His標(biāo)簽融合的融合蛋白質(zhì)等。這樣的融合蛋白質(zhì)形式的多肽也作為上述(c)的多肽包含在本發(fā)明的范圍中。進(jìn)一步地，轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的多肽在翻譯后，存在受到細(xì)胞內(nèi)各種修飾的情形。這樣的翻譯后被修飾多肽只要具有免疫誘導(dǎo)活性也包含在本發(fā)明的范圍中。作為這樣的翻譯修飾，能夠例示N末端甲硫氨酸去除、N末端乙?；?、添加糖鏈、由胞內(nèi)蛋白酶引起的有限分解、十四烷酰化、異戊二烯化、磷酸化等。
[0066]如后述實(shí)施例中具體記載的那樣，向荷癌活體施用具有免疫誘導(dǎo)活性的上述多肽能使現(xiàn)存的腫瘤退縮。因此，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑能夠作為癌的治療劑和/或預(yù)防劑使用。另外，具有免疫誘導(dǎo)活性的上述多肽能夠用于通過免疫誘導(dǎo)來進(jìn)行癌的治療和/或預(yù)防的方法中。[0067]在本文中，用語“腫瘤”和“癌”意指惡性新生物，能夠互換使用。
[0068]在這種情形下，作為對(duì)象的癌，只要是表達(dá)S⑶I的癌即可，不進(jìn)行特別的限定，優(yōu)選地是乳腺癌、腦腫瘤、大腸癌、肛門周圍腺癌、肥大細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腎臟癌、肝臟癌、肺癌、前列腺癌或白血病。
[0069]另外，作為對(duì)象的動(dòng)物，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是包含靈長類、寵物動(dòng)物、家畜類、競技用動(dòng)物等的哺乳動(dòng)物，特別優(yōu)選地是人、犬或貓。
[0070]本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑向活體的施用途徑可以是經(jīng)口施用，也可以是非經(jīng)口施用，但優(yōu)選肌內(nèi)施用、皮下施用、靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用等非經(jīng)口施用。在以治療癌為目的使用該免疫誘導(dǎo)劑的情形，為了提高抗癌作用，如后述實(shí)施例中所記載的那樣，也能夠施用至成為治療對(duì)象的腫瘤附近的所屬淋巴結(jié)。施用量是對(duì)免疫誘導(dǎo)有效的量即可，例如用于癌的治療和/或預(yù)防中時(shí)，對(duì)癌的治療和/或預(yù)防有效的量即可。對(duì)癌的治療和/或預(yù)防有效的量要根據(jù)腫瘤的大小和癥狀等合適地選擇，但是通常對(duì)于對(duì)象動(dòng)物，每天的有效量是
0.0001~1000 μ g、優(yōu)選地0.001~1000 μ g，能夠分成I次或數(shù)次施用。優(yōu)選地，分?jǐn)?shù)回、每隔數(shù)日至數(shù)月施用。如后述實(shí)施例中具體例示的那樣，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑能夠使現(xiàn)存的腫瘤退縮。因此，由于對(duì)發(fā)生初期的少數(shù)癌細(xì)胞也能夠發(fā)揮抗癌作用，在癌的發(fā)病前或癌的治療后使用，能夠防止癌的發(fā)病或再發(fā)。即，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑對(duì)癌的治療和預(yù)防兩者都有用。
[0071]本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑可僅由多肽構(gòu)成，也可與適應(yīng)于各施用形式的藥理學(xué)容許的載體、稀釋劑、賦形劑等添加劑適當(dāng)混合來制劑。制劑方法和可以使用的添加劑是醫(yī)藥制劑領(lǐng)域周知的，能夠使用任一方法和添加劑。作為添加劑的具體例子，能夠例舉生理緩沖液這樣的稀釋劑；砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇、甘氨酸等這樣的賦形劑；糖漿、明膠、阿拉伯膠、山梨醇、聚氯乙烯、黃蓍膠等這樣的結(jié)合劑；硬脂酸鎂、聚乙二醇、滑石、硅石等潤滑劑，但不限于此。作為制劑形式，能夠例舉片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等經(jīng)口劑；吸入劑、注射劑、栓劑、液體劑等非經(jīng)口劑等。這些制劑能夠通過常規(guī)已知的制法制備。
[0072]本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑能夠與能在活體內(nèi)強(qiáng)化免疫應(yīng)答的免疫增強(qiáng)劑組合使用。免疫增強(qiáng)劑可以包含于本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑中，也可以作為另一種組合物與本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑聯(lián)合施用給患者。
[0073]作為上述免疫增強(qiáng)劑，能夠例舉例如佐劑。佐劑通過提供抗原的儲(chǔ)備庫(細(xì)胞外或巨噬細(xì)胞內(nèi))、活化巨噬細(xì)胞、并且刺激特定組的淋巴細(xì)胞，能夠強(qiáng)化免疫應(yīng)答，由此提高抗癌作用。因此，特別地，當(dāng)本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑用于癌的治療和/或預(yù)防的情形，免疫誘導(dǎo)劑優(yōu)選地除了作為有效成分的上述多肽之外還包含佐劑。多種類型的佐劑是本領(lǐng)域周知的，可以使用任意佐劑。作為佐劑的具體例子，能夠例舉MPL(SmithKline Beecham)、純化沙門氏菌屬的明尼蘇達(dá)沙門氏菌(Salmonella minnesota) Re595的脂多糖類和酸水解后得到的同類物；QS21 (SmithKline Beecham);從阜樹(Quillja saponaria)提取物純化的純 QA-21 皂苷；PCT 申請(qǐng) W096/33739 (SmithKline Beecham)中記載的 DQS21 ；QS-7, QS-17, QS-18 和 QS-Ll (So 和另外 10 人，Molecules and Cells, 1997 年，第 7 卷，p.178 - 186);弗氏不完全佐劑；弗氏完全佐劑；維生素E ；Montanide ;明礬；CpG寡核苷酸(參見例如，Kreig和另外7人，Nature,第374卷、p.546 — 549);聚肌胞和其衍生物(聚ICLC等);和從角鯊烯和/或生育酚這樣的生物可分解性油制備的多種油包水乳液。其中優(yōu)選弗氏不完全佐劑、Montanide、聚肌胞和其衍生物、以及CpG寡核苷酸。上述佐劑與多肽的混合比一般是約1:10~10:1，優(yōu)選地約1:5~5:1，更優(yōu)選地約1:1。但是，佐劑不限于上述例示，可以在施用本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑時(shí)也使用本領(lǐng)域已知的上述以外的佐劑(參見例如，Goding 著，單克隆抗體:原理與實(shí)踐(Monoclonal Antibodies !Principles andPractice)，第2版，1986年)。制備多肽和佐劑的混合物或乳液的方法是預(yù)防接種領(lǐng)域的技術(shù)人員周知的。
[0074]另外，作為上述免疫增強(qiáng)劑，除了上述佐劑之外，還可以使用刺激對(duì)象的免疫應(yīng)答的因子。例如，具有刺激淋巴細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的特性的多種細(xì)胞因子作為免疫增強(qiáng)劑能夠與本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑組合使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知這樣的可增強(qiáng)免疫應(yīng)答的許多細(xì)胞因子，作為例子能夠例舉強(qiáng)化疫苗的防御作用的白細(xì)胞介素-12 (IL-12)、GM-CSF,IL-18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體，但不限于它們。這樣的因子也能夠作為上述免疫增強(qiáng)劑使用，能夠包含于本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑中，或者作為另一種組合物與本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑聯(lián)合施用給患者。
[0075]另外，通過將上述多肽與抗原呈遞細(xì)胞體外接觸，能夠?qū)⒃摱嚯某蔬f給抗原呈遞細(xì)胞。即，上述(a)至(C)的多肽能夠作為抗原呈遞細(xì)胞的處理劑利用。在本文中，作為抗原呈遞細(xì)胞，能夠優(yōu)選使用保有MHC I類分子的樹狀細(xì)胞或B細(xì)胞。多種MHC I類分子已經(jīng)被鑒定并周知。人中的MHC分子稱作HLA。作為HLA I類分子，能夠例舉HLA-A、HLA-B、HLA_C ;更具體地，能夠例舉 HLA-Al、HLA-A020U HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-Al1、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602 等。
[0076]保有MHC I類分子的樹狀細(xì)胞或B細(xì)胞能夠通過周知的方法自外周血制備。例如，通過使用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3(或IL-4)從骨髓、臍帶血或患者的外周血誘導(dǎo)出樹狀細(xì)胞，向該培養(yǎng)系統(tǒng)中添加腫瘤相關(guān)肽，能夠誘導(dǎo)出腫瘤特異的樹狀細(xì)胞。
[0077]通過施用有效量的該樹狀細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)出癌的治療中希望有的應(yīng)答。使用的細(xì)胞能夠是使用健康人提供的骨髓或臍帶血、患者本人的骨髓或外周血等，但是使用患者本來的自體細(xì)胞的情形安全性高，也能夠期待避免嚴(yán)重的副作用。外周血或骨髓可以是任一新鮮樣品、低溫保存樣品和冷凍保存樣品。外周血可以培養(yǎng)全血，也可以僅分離白細(xì)胞組分并培養(yǎng)，但從效率的觀點(diǎn)看，優(yōu)選后者。進(jìn)一步地，從白細(xì)胞組分中也可以分離單個(gè)核細(xì)胞。另外，在以骨髓或臍帶血為起源的情形時(shí)，可以培養(yǎng)構(gòu)成骨髓的全部細(xì)胞，也可以從中分離單個(gè)核細(xì)胞并培養(yǎng)。外周血或其白細(xì)胞組分、骨髓細(xì)胞中包含作為樹狀細(xì)胞起源的單個(gè)核細(xì)胞、造血干細(xì)胞或未成熟樹狀細(xì)胞或CD4陽性細(xì)胞等。使用的細(xì)胞因子只要安全性和生理活性是經(jīng)確認(rèn)特性的細(xì)胞因子即可，不管是天然型或基因重組型等，也不管其生產(chǎn)方法，但優(yōu)選地使用最小需要量的確保了醫(yī)療用品質(zhì)的樣品。不特別地限定添加的細(xì)胞因子的濃度，只要是誘導(dǎo)樹狀細(xì)胞的濃度即可，通常優(yōu)選10至1000ng/ml左右、更優(yōu)選20至500ng/ml左右的細(xì)胞因子總濃度。培養(yǎng)能夠使用通常用于白細(xì)胞培養(yǎng)的熟知培養(yǎng)基進(jìn)行。不特別地限定培養(yǎng)溫度，只要可以增殖白細(xì)胞即可，但人體溫度37°C左右是最優(yōu)選的。另外，不特別地限定培養(yǎng)中的氣體環(huán)境，只要可以增殖白細(xì)胞即可，但優(yōu)選通氣5%C02。此外，不特別地限定培養(yǎng)期間，只要是必需數(shù)目的細(xì)胞被誘導(dǎo)的期間即可，這通常以3日至2周的期間進(jìn)行。適當(dāng)?shù)膬x器能夠用于細(xì)胞分離或培養(yǎng)，但優(yōu)選此類儀器具有確認(rèn)了醫(yī)療用安全性、且操作穩(wěn)定和簡便。特別地，細(xì)胞培養(yǎng)裝置不限于培養(yǎng)皿、燒瓶和培養(yǎng)瓶等常見的容器，也可以使用分層型容器或多段式容器、滾瓶(roller bottle)、轉(zhuǎn)瓶(spinner bottle)、袋式培養(yǎng)器、中空纖維柱等。
[0078]上述多肽與抗原呈遞細(xì)胞在體外接觸的方法本身能夠通過周知的方法實(shí)施。例如，能夠通過將抗原呈遞細(xì)胞培養(yǎng)于含有上述多肽的培養(yǎng)液中來實(shí)施。不特別地限定培養(yǎng)基中的肽濃度，通常是I至100μ g/ml左右，優(yōu)選地是約5至20μ g/ml左右。不特別地限定培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞密度，通常是IO3至IO7個(gè)細(xì)胞/ml左右，優(yōu)選地是5X IO4至5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml左右。優(yōu)選在37°C于5%C02環(huán)境中根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。另外，能夠呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面上的肽長度通常是最大30個(gè)氨基酸殘基左右。因此，雖然沒有特別地限定長度，在抗原呈遞細(xì)胞與多肽在體外接觸的情形，也可以制備該多肽的長度為約30個(gè)氨基酸殘基以下。
[0079]通過在上述多肽共存下培養(yǎng)抗原呈遞細(xì)胞，將肽摻入抗原呈遞細(xì)胞的MHC分子并呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面。因此，能夠用上述多肽制備含有該多肽與MHC分子的復(fù)合體的分離的抗原呈遞細(xì)胞。這樣的抗原呈遞細(xì)胞能夠在體內(nèi)或體外呈遞該多肽至T細(xì)胞、誘導(dǎo)并增殖對(duì)該多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞。
[0080]如上述制備的含有上述多肽與MHC分子的復(fù)合體的抗原呈遞細(xì)胞通過與T細(xì)胞在體外接觸，能夠誘導(dǎo)并增殖對(duì)該多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞。這可以通過在液體培養(yǎng)基中將上述抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞共存培養(yǎng)實(shí)施。例如，能夠通過將抗原呈遞細(xì)胞懸浮于液體培養(yǎng)基中、將所得懸浮液置于微量平板的孔等容器中、向其添加T細(xì)胞并培養(yǎng)來實(shí)施。不特別地限定共存培養(yǎng)時(shí)抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞的混合比率，就細(xì)胞數(shù)的比率而言，它通常是1:1至1:100左右、優(yōu)選地是1:5至1:20左右。另外，不特別地限定懸浮于液體培養(yǎng)基中的抗原呈遞細(xì)胞的密度，它通常是100個(gè)至1000萬個(gè)細(xì)胞/ml左右、優(yōu)選地是10000個(gè)至100萬個(gè)細(xì)胞/ml左右。共存培養(yǎng)優(yōu)選地根據(jù)常規(guī)方法在37°C于5%C02環(huán)境中進(jìn)行。不特別地限定培養(yǎng)時(shí)間，它通常是2日至3周、優(yōu)選地是4日至2周左右。另外，共存培養(yǎng)優(yōu)選地在IL-2、IL-6、IL-7和IL-12這樣的白細(xì)胞介素中的I種或多種白細(xì)胞介素存在下進(jìn)行。在這種情況下，IL-2和IL-7的濃度通常是5~20U/ml左右、IL-6的濃度通常是500~2000U/ml左右、IL-12的濃度通常是5~20ng/ml左右，但不限于這些濃度。上述的共存培養(yǎng)也可以追加新鮮的抗原呈遞細(xì)胞、重復(fù)一次至幾次實(shí)施。例如，共存培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)上清，添加新鮮的抗原呈遞細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行共存培養(yǎng)，這樣的操作可以重復(fù)一次至幾次。各共存培養(yǎng)的條件可以與上述同樣。
[0081]通過上述共存培養(yǎng)誘導(dǎo)和增殖對(duì)該多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞。因此，能夠用上述多肽制備與該多肽和MHC分子的復(fù)合體選擇性結(jié)合的分離的T細(xì)胞。
[0082]如后述實(shí)施例中所記載的那樣，SCDl基因在乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌組織、腦腫瘤細(xì)胞、腦腫瘤組織、大腸癌細(xì)胞、大腸癌組織、肛門周圍腺癌組織、肛門周圍腺癌細(xì)胞、肥大細(xì)胞瘤組織、肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、腎臟癌細(xì)胞、腎臟癌組織、肝臟癌細(xì)胞、肝臟癌組織、肺癌細(xì)胞、肺癌組織、前列腺癌細(xì)胞、前列腺癌組織和白血病細(xì)胞中特異地表達(dá)。因此，認(rèn)為在這些癌種類中，SCDl較正常細(xì)胞顯著多地存在。因此，癌細(xì)胞內(nèi)存在的SCDl多肽的一部分呈遞至癌細(xì)胞表面上的MHC分子，當(dāng)將如上述制備的細(xì)胞毒T細(xì)胞施用至活體內(nèi)時(shí)，細(xì)胞毒T細(xì)胞以其作為標(biāo)志物，能夠破壞癌細(xì)胞。另外，由于呈遞SCDl多肽的一部分的抗原呈遞細(xì)胞在活體內(nèi)也能夠誘導(dǎo)并增殖對(duì)該多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞，所以施用該抗原呈遞細(xì)胞至活體內(nèi)也能夠破壞癌細(xì)胞。即，使用上述多肽制備的上述細(xì)胞毒T細(xì)胞或者上述抗原呈遞細(xì)胞作為癌的治療劑和/或預(yù)防劑也如本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑同樣地有用。
[0083]在上述分離的抗原呈遞細(xì)胞或分離的T細(xì)胞施用至活體的情形，為了避免在活體內(nèi)將此類細(xì)胞作為異物攻擊而致活體內(nèi)的免疫應(yīng)答，優(yōu)選此類分離的細(xì)胞是將自接受治療的患者采樣的抗原呈遞細(xì)胞或T細(xì)胞如上所述用上述(a)至(C)的多肽制備的。
[0084]包含抗原呈遞細(xì)胞或分離的T細(xì)胞作為有效成分的癌的治療劑和/或預(yù)防劑的施用途徑優(yōu)選地是靜脈內(nèi)施用或動(dòng)脈內(nèi)施用這樣的非經(jīng)口施用。另外，根據(jù)癥狀或施用目的等適當(dāng)?shù)剡x擇施用量，通常是I個(gè)~10兆個(gè)、優(yōu)選地100萬個(gè)~10億個(gè)細(xì)胞用于施用，并且此類細(xì)胞優(yōu)選地每幾日或幾月施用一次。制劑可以例如是生理緩沖食鹽水中的細(xì)胞懸液，它也可以聯(lián)合其他抗癌劑或細(xì)胞因子等使用。另外，可以添加制劑領(lǐng)域中熟知的I種或2種以上添加劑。
[0085]另外，也通過在對(duì)象動(dòng)物的體內(nèi)表達(dá)編碼上述(a)至(C)的多肽的多核苷酸，能夠在該活體內(nèi)誘導(dǎo)抗體生產(chǎn)或細(xì)胞毒T細(xì)胞，獲得與施用多肽同等的效果。即，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑可以包含編碼上述(a)至(C)的多肽的多核苷酸的、能夠在活體內(nèi)表達(dá)該多肽的重組載體作為有效成分。如后述的實(shí)施例中所示，可以表達(dá)抗原多肽的這種重組載體也稱作基因疫苗。
[0086]不特別地限定用于制備基因疫苗的載體，只要它可以在對(duì)象動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)(優(yōu)選地哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi))表達(dá)即可，它可以是質(zhì)粒載體，也可以是病毒載體，可以使用基因疫苗領(lǐng)域中公知的任意載體。另外，編碼上述多肽的DNA或RNA等的多核苷酸能夠如上所述根據(jù)常規(guī)方法容易地制備。另外，所述多核苷酸可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法摻入載體。
[0087]基因疫苗的施用途徑優(yōu)選地是肌內(nèi)施用、皮下施用、靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用等的非經(jīng)口施用途徑；可以根據(jù)抗原種類等適當(dāng)?shù)剡x擇施用量，施用量通常是就每Ikg體重而言，0.1ug~IOOmg左右、優(yōu)選地1 μ g~IOmg左右的基因疫苗重量。
[0088]作為使用病毒載體的方法，能夠例舉將編碼上述多肽的多核苷酸摻入例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、辛德比斯病毒等RNA病毒或DNA病毒，并用其感染對(duì)象動(dòng)物的方法。其中特別優(yōu)選使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒等的方法。
[0089]作為其他方法，能夠例舉將表達(dá)質(zhì)粒直接施用至肌內(nèi)的方法(DNA疫苗法)、脂質(zhì)體法、Lipofectin法、顯微注射法、磷酸|丐法、電穿孔法等，特別優(yōu)選DNA疫苗法、脂質(zhì)體法。
[0090]對(duì)于本發(fā)明中所用的編碼上述多肽的基因?qū)嶋H上作為醫(yī)藥品發(fā)揮作用，有將基因直接導(dǎo)入體內(nèi)的體內(nèi)(in vivo)方法和自對(duì)象動(dòng)物采樣某種細(xì)胞、體外將基因?qū)朐摷?xì)胞、并將所述細(xì)胞返回體內(nèi)的離體(ex vivo)方法(Nikkei Science, 1994年4月，第20-45頁;月刊藥事，1994年，第36卷，第I號(hào)，p.23 - 48 ;實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，1994年，第12卷，第15號(hào)；以及它們的引用文獻(xiàn)等)，更優(yōu)選體內(nèi)方法。
[0091]在通過體內(nèi)方法施用的情形，可以根據(jù)治療目的的疾病、癥狀等通過適當(dāng)?shù)氖┯猛緩绞┡c。例如，可以靜脈、動(dòng)脈、皮下、肌內(nèi)等實(shí)施施用。在通過體內(nèi)方法施用的情形，例如可以采用液體劑等的制劑形式，通常采用含有編碼本發(fā)明上述肽的DNA作為有效成分的注射劑等，根據(jù)需要可以添加常用的運(yùn)載體。另外，含有該DNA的脂質(zhì)體或膜融合脂質(zhì)體(仙臺(tái)病毒(HVJ)-脂質(zhì)體等)可以采取混懸劑、冷凍劑、離心分離濃縮冷凍劑等脂質(zhì)體制劑的形式。
[0092]另外，在本發(fā)明中，在談及“序列號(hào)I所示的堿基序列”的情形，除了指序列號(hào)I實(shí)際上顯示的堿基序列之外，還包含與之互補(bǔ)的序列。因此，在談及“具有序列號(hào)I所示堿基序列的多核苷酸”的情形，包含具有序列號(hào)I實(shí)際上所示堿基序列的單鏈多核苷酸、具有與之互補(bǔ)的堿基序列的單鏈多核苷酸、和由它們組成的雙鏈多核苷酸。在制備編碼本發(fā)明中所用多肽的多核苷酸的情形，選擇適當(dāng)?shù)娜我夂塑账嵝蛄校绢I(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地進(jìn)行這種選擇。
實(shí)施例
[0093]以下基于實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。
[0094]實(shí)施例1:通過SEREX法獲得新穎的癌抗原蛋白
[0095](I) cDNA文庫的制作
[0096]通過酸-胍-酌-氯仿法(Acidguanidium — Phenol — Chloroform 法)從犬的精巢提取總RNA,使用01igotex-dT30mRNA純化試劑盒(寶酒造株式會(huì)社制)，根據(jù)試劑盒所附的方法純化聚腺苷酸RNA。
[0097]使用該獲得的mRNA(5 μ g)合成cDNA噬菌體文庫。使用cDNA合成試劑盒、Zap-cDNA 合成試劑盒、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning 試劑盒(STRATAGENE 公司制)，根據(jù)試劑盒所附的方法制備cDNA噬菌體文庫。制備的cDNA噬菌體文庫的大小是I X 106pfu/ml。
[0098](2 )通過血清篩選cDNA文庫
[0099]使用上述制備的cDNA噬菌體文庫實(shí)施免疫篩選。具體地，感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)，在Φ90χ15πιπι的NZY瓊脂糖平板產(chǎn)生2340個(gè)克隆，在42°C培養(yǎng)3至4小時(shí)以形成噬菌斑，該平板以IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纖維素膜(Hybond C Extra:GE Healthecare Bio-Science公司制)在37°C覆蓋4小時(shí)以誘導(dǎo)并表達(dá)蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到該膜上。此后，將該膜回收，浸泡在含有0.5%脫脂粉乳的TBS(IOmMTris-HCl, 150mM NaCl，pH7.5)中于4°C振搖過夜以抑制非特異性反應(yīng)。使該濾膜與500倍稀釋的患病犬血清在室溫反應(yīng)2至3小時(shí)。
[0100]使用對(duì)患有肛門近位腫瘤的患病犬采樣的血清作為上述患病犬血清。將這些血清保存在-80°c，在緊鄰使用前進(jìn)行前處理。血清的前處理方法根據(jù)以下方法進(jìn)行。即，用未插入外來基因的λ ZAP表達(dá)噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl-BLue MRF’ )后，在NZY平板培養(yǎng)基上于37°C過夜培養(yǎng)。隨后，添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHC03pH8.3的緩沖液至該平板，4°C靜置15小時(shí)后，回收上清作為大腸桿菌/噬菌體提取液。隨后，將回收的大腸桿菌/噬菌體提取液流經(jīng)NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制)，并將大腸桿菌/噬菌體來源的蛋白質(zhì)固定在該柱上。使患病犬血清流經(jīng)固定有蛋白質(zhì)的該柱并反應(yīng)，從血清中除去吸附至大腸桿菌和噬菌體的抗體。將已經(jīng)流過柱的血清級(jí)分用含有0.5%脫脂粉乳的TBS稀釋500倍，將其用作免疫篩選材料。
[0101]已經(jīng)印跡了所述處理血清和上述融合蛋白質(zhì)的膜用TBS-T(0.05%吐溫20/TBS)洗滌4次，使得已經(jīng)用含有0.5%脫脂粉乳的TBS稀釋5000倍的作為二次抗體的山羊抗犬IgG (山羊抗犬IgG-h+I HRP綴合的:BETHYL Laboratories公司制)與該膜在室溫反應(yīng)I小時(shí)，檢測通過使用NBT/BCIP反應(yīng)液(Roche公司制)的酶顯色反應(yīng)實(shí)施，從Φ 90x15mm的NZY瓊脂糖平板上取出與顯色反應(yīng)陽性部位相對(duì)應(yīng)的菌落，溶解于500 μ I SM緩沖液(IOOmMNaCl, IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01%明膠ρΗ7.5)。以與上文所述相同的方法重復(fù)二次、三次篩選直至顯色反應(yīng)陽性菌落呈現(xiàn)單一化，篩選了與血清中IgG反應(yīng)的9110個(gè)噬菌體克隆，分離到I個(gè)陽性克隆。
[0102](3)分離的抗原基因的序列同一性檢索 [0103]為了將通過以上方法分離的I個(gè)陽性克隆供堿基序列分析，實(shí)施自噬菌體載體轉(zhuǎn)變成質(zhì)粒載體的操作。具體地，調(diào)節(jié)至吸光度0D_為1.0的宿主大腸桿菌(XLl-BlueMRF’ )而制備的200 μ I溶液與100 μ I純化的噬菌體溶液和I μ I ExAssist輔助噬菌體(STRATAGENE公司制)混合，37°C反應(yīng)15分鐘后，添加3ml LB培養(yǎng)基，37°C進(jìn)行2.5至3小時(shí)的培養(yǎng)，此后立即在70°C水浴中保溫20分鐘，然后4°C、1000Xg離心15分鐘，將上清作為噬菌粒溶液回收。隨后，調(diào)節(jié)至吸光度0D_為1.0的噬菌粒宿主大腸桿菌(SOLR)而制備的200 μ I溶液與10 μ I純化的噬菌體溶液混合后，37°C反應(yīng)15分鐘，將50 μ I所得物鋪在含有氨芐青霉素(終濃度:50μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化的SOLR的單菌落并且在含有氨芐青霉素(終濃度:50 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)后，使用QIAGEN質(zhì)粒小量制備試劑盒(QIAGEN公司制)純化具有目的插入物的質(zhì)粒DNA。
[0104]使用序列號(hào)7所記載的T3引物和序列號(hào)8所記載的T7引物，通過引物步行法，對(duì)純化的質(zhì)粒進(jìn)行插入物全長序列的分析。通過所述序列分析獲得序列號(hào)I所記載的基因序列。使用該基因的堿基序列和氨基酸序列，實(shí)施序列同一性檢索程序BLASTSearch (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),進(jìn)行與已知基因的序列同一性搜索，結(jié)果表明獲得的基因是SCDl基因。犬SCDl與作為人同源因子的人SCDl的序列同一性是堿基序列89%、氨基酸序列90%;與作為小鼠同源因子的小鼠SCDl的序列同一性是堿基序列84%、氨基酸序列84%。人SCDl的堿基序列示于序列號(hào)3、氨基酸序列示于序列號(hào)4、小鼠SCDl的堿基序列示于序列號(hào)5、氨基酸序列示于序列號(hào)6。
[0105](4)在各組織中的表達(dá)分析
[0106]通過RT_PCR(逆轉(zhuǎn)錄-PCR)法研究以上述方法得到的基因在犬、人和小鼠的正常組織和各種細(xì)胞株中的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下進(jìn)行。即，使用TRIZOL試劑(Invitrogen公司制)，按照其所附的方案從50至IOOmg各組織和各細(xì)胞株5至IOxlO6個(gè)細(xì)胞中提取總RNA。使用用于RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen公司制)根據(jù)所附的方案，利用該總RNA合成cDNA。對(duì)于人正常組織(腦、海馬、精巢、結(jié)腸、胎盤)的cDNA，使用GenePool cDNA(invitrogen 公司制)、QUICK — Clone cDNA(Clonetech 公司制)和 Large —Insert cDNA Library (Clonetech公司制)。使用對(duì)所獲得基因特異的引物(犬引物是序列號(hào)9和10所不、人引物是序列號(hào)11和12所不、小鼠引物是序列號(hào)13和14所不)，如下實(shí)施PCR反應(yīng)。即，添加0.25 μ I通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備的樣品、使上述引物各2 μ M、0.2mM各dNTP、0.65U ExTaq聚合酶(寶酒造社制)的各試劑和所附的緩沖液至25 μ I總量，使用Thermal Cycler (BIO RAD 公司制)，將 94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C I 分鐘的循環(huán)重復(fù) 30次。出于比較對(duì)照的目的，同時(shí)使用GAPDH特異性引物(犬和人GAPDH引物是序列號(hào)15和16所示、小鼠GAPDH引物是序列號(hào)17和18所示)。結(jié)果如圖1所示,犬SCDl基因在健康犬組織中的大部分組織沒有觀察到表達(dá)；另一方面，在犬腫瘤組織中觀察到強(qiáng)表達(dá)。人和小鼠SCDI基因的表達(dá)也與犬SCDI基因同樣，在人和小鼠正常組織中幾乎不能確認(rèn)到表達(dá)；在癌細(xì)胞的大部分細(xì)胞株中檢測到表達(dá)(圖2、3)。
[0107](5)各組織中的定量表達(dá)分析
[0108]通過定量RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄-PCR)法研究由上述方法獲得的基因在人正常組織中的表達(dá)。人正常組織和癌組織的cDNA使用Tissue scan RealTime cancer survey Panel I(ORIGENE 公司制)。另外，使用 BIO RAD 公司制的 CFX96Real Time Cystem - ClOOOThermalCycler實(shí)施定量RT-PCR。使用對(duì)所獲得基因特異的引物(序列號(hào)11和12中所記載)，如下實(shí)施PCR反應(yīng)。即，添加5μ1 cDNA樣品、上述引物各2 μ Μ、2 X SYBR Premix Ex TaqII聚合酶(寶酒造株式會(huì)社制)的各試劑和所附的緩沖液至20μ I總量，將94°C 30秒、55°C 30秒、72°C I分鐘的循環(huán)重復(fù)30次。結(jié)果是，與各正常組織比較，S⑶I基因在乳腺癌、大腸癌、腎臟癌、肝臟癌、前列腺癌、肺癌中表達(dá)全部提高4倍以上。本結(jié)果表明，以人SCDl為標(biāo)的的抗腫瘤劑在正常組織中的副作用完全不用擔(dān)心，能期待藥劑的藥效與副作用的大背離。
[0109]實(shí)施例2:分析SCDl在活體內(nèi)的癌抗原性
[0110](I)制備在活體內(nèi)表達(dá)S⑶I的重組載體
[0111]基于序列號(hào)5的堿基序列，按照以下方法制備在活體內(nèi)表達(dá)SCDl的重組載體。PCR是自實(shí)施例1中觀察到表達(dá)的小鼠癌細(xì)胞株N2a (購自ATCC)制備cDNA。添加cDNAlyl、使各0.4 μ M的包含HindIII和XbaI限制性酶切序列的2種引物(序列號(hào)19和20中記載)、0.2mM dNTPU.25U PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造株式會(huì)社制)的各試劑和所附緩沖液至50 μ I 總量，使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制)，將 98°C 10 秒、55°C 15 秒、72°C 4 分鐘的循環(huán)重復(fù)30次。另外，上述2種引物是擴(kuò)增編碼序列號(hào)5的氨基酸序列全長區(qū)域的引物。PCR后，用I %瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增的DNA，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制)純化了約1000bp的DNA片段。
[0112]將純化的DNA片段連接入克隆載體pCR-Blunt (Invitrogen公司制)。將所得物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，回收質(zhì)粒，通過測序確認(rèn)擴(kuò)增的基因片段與目的序列一致。用HindIII和XbaI限制性酶處理與目的序列一致的質(zhì)粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化后，將目的基因序列插入用HindII1、XbaI限制性酶處理的哺乳類表達(dá)載體pcDNA3.1 (Invitrogen公司制)。通過使用這種載體能夠在哺乳類的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生SCDl蛋白。
[0113]向100 μ g上述制備的質(zhì)粒DNA添加50 μ g金粒子(Bio Rad公司制)、亞精胺100 μ I (SIGMA公司制)、IM CaCl2IOOy I (SIGMA公司制)，渦旋攪拌，室溫靜置10分鐘(下文稱作“金-DNA粒子”)。3000轉(zhuǎn)/分鐘離心I分鐘后，棄去上清，用100%乙醇(WAK0社制)洗滌3次。添加6mll00%乙醇至金-DNA粒子，通過渦旋徹底攪拌后，將金-DNA粒子流入Tefzel Tubing (Bio Rad公司制)，使沉淀在壁面。將附著有金-DNA粒子的Tefzel Tubing中的乙醇風(fēng)干，切成適用于基因槍的長度。[0114](2)通過DNA疫苗法的S⑶I的抗腫瘤效果
[0115]對(duì)10只的A/J小鼠(7周齡，雄性，購自日本SLC社)和Balb/c小鼠(7周齡，雄性，購自日本SLC社)，將上述制備的管狀物固定在基因槍上，使用純氦氣以400psi壓力將DNA疫苗每7日總共3次經(jīng)皮施用至剃毛小鼠的腹腔(使得質(zhì)粒DNA接種量是2 μ g/只)后，分別移植I X IO6個(gè)小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞株CT26，評(píng)價(jià)抗腫瘤效果(預(yù)防模型)。另外，作為對(duì)照，在各模型中各10只小鼠施用沒有插入SCDl基因的質(zhì)粒DNA。
[0116]以腫瘤的大小(長徑X短徑2/2)和生存小鼠的比例評(píng)價(jià)抗腫瘤效果。本研究的結(jié)果是，在使用成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株的預(yù)防模型中，43天后對(duì)照組和SCDl質(zhì)粒施用組分別變?yōu)?966mm3、759mm3，觀察到S⑶I質(zhì)粒施用組中腫瘤的顯著退縮。另外，觀察生存經(jīng)過的結(jié)果是，在使用成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株的預(yù)防模型中，對(duì)照組在施用后74天全部死亡，與之相反，在S⑶I質(zhì)粒施用組中，60%的小鼠生存下來。由以上結(jié)果可見，S⑶I質(zhì)粒施用組與對(duì)照組相比較具有顯著的抗腫瘤效果。同樣地，在使用大腸癌細(xì)胞株的預(yù)防模型中也是33天后對(duì)照組和S⑶I質(zhì)粒施用組分別變?yōu)?518mm3、604mm3，觀察到S⑶I質(zhì)粒施用組中腫瘤的顯著退縮。另外，觀察生存經(jīng)過的結(jié)果是，對(duì)照組在施用后54天全部死亡，與之相反，在SCDl質(zhì)粒施用組中，50%的小鼠生存下來。由以上結(jié)果可見，S⑶I質(zhì)粒施用組與對(duì)照組相比較具有顯著的抗腫瘤效果。
[0117]實(shí)施例3:人重組S⑶I蛋白的制備和免疫誘導(dǎo)能力的評(píng)價(jià)
[0118](I)人重組S⑶I蛋白的制備[0119]基于序列號(hào)3的基因，根據(jù)以下方法制備人S⑶I的重組蛋白質(zhì)。PCR如下進(jìn)行:添加自實(shí)施例1中制備的各種組織和細(xì)胞cDNA通過RT-PCR法能夠確認(rèn)表達(dá)的cDNAl μ 1、使包含EcoRI和XhoI限制性酶切序列的2種引物(序列號(hào)25和26記載)各0.4μ M、0.2mMdNTP、l.25U PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造社制)的各試劑和所附緩沖液至50 μ I總量，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，將98°C 10秒、55°C 15秒、72°C 4分鐘的循環(huán)重復(fù)30次。另外，上述2種引物是擴(kuò)增編碼序列號(hào)4的氨基酸序列全長區(qū)域的引物。PCR后，用I %瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增的DNA，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制)純化約1000bp 的 DNA 片段。
[0120]將純化的DNA片段連接入克隆載體pCR-Blunt (Invitrogen公司制)。將所得物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，回收質(zhì)粒，通過測序確認(rèn)擴(kuò)增的基因片段與目的序列一致。用EcoRI和XhoI限制性酶處理與目的序列一致的質(zhì)粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化后，將目的基因序列插入用EcoR1、XhoI限制性酶處理的大腸桿菌用表達(dá)載體pET30a (Novagen公司制)。使用這種載體能夠產(chǎn)生His標(biāo)簽融合型的重組蛋白質(zhì)。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)用大腸桿菌BL21(DE3)中，用ImM IPTG進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)。
[0121 ] (2)重組S⑶I蛋白的純化
[0122]將上述獲得的表達(dá)序列號(hào)4的重組大腸桿菌在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)直至在600nm的吸光度變成大約0.7后，添加異丙基-β _D_1_硫代吡喃半乳糖苷至終濃度ImM，再于37°C培養(yǎng)4小時(shí)。此后，4800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集細(xì)菌。菌體沉淀懸浮在磷酸緩沖化生理食鹽水中，再4800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，洗滌菌體。
[0123]將該菌體懸浮在50mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)中，進(jìn)行冰上超聲波破碎。將大腸桿菌超聲波破碎液以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘分離，所得的上清作為可溶性級(jí)分，沉淀物作為不溶性級(jí)分。
[0124]將不溶性級(jí)分懸浮在50mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)中，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分
鐘。重復(fù)本操作2次，進(jìn)行脫蛋白酶操作。
[0125]將該殘?jiān)鼞腋∮诤?M鹽酸胍、0.15M氯化鈉的50mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)中，4°C靜置20小時(shí)，使蛋白質(zhì)變性。該變性操作后，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，將得到的可溶性級(jí)分添加至根據(jù)常規(guī)方法制備的鎳螯合柱(載體:Chelateing Sepharose (商標(biāo))Fast Flow (GE Health Care公司);柱容量:5ml ;平衡緩沖液:含有6M鹽酸胍、0.15M氯化鈉的50mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0),再于4°C靜置過夜，進(jìn)行對(duì)鎳螯合化載體的吸附。將該柱載體于1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，回收上清，將柱載體用磷酸緩沖化生理食鹽水懸浮后，再充填柱。
[0126]用柱容量10倍量的含有0.5M氯化鈉的0.1M乙酸緩沖液(pH4.0)實(shí)施柱未吸附級(jí)分的洗凈操作后，立即用含有0.5M氯化鈉的0.1M乙酸緩沖液(pH3.0)洗脫作為純化級(jí)分，以后將該純化級(jí)分作為施用試驗(yàn)用的材料。另外，各洗脫級(jí)分中的目的蛋白質(zhì)通過根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行的考馬斯染色確認(rèn)。
[0127]將通過上述方法獲得的純化樣品置換為反應(yīng)用緩沖液(50mM Tris-HCl, IOOmMNaCl, 5mM CaCl2 (ρΗ8.0))后，使用 FactorXa Cleavage Capture Kit (Novagen 公司制)，按照所附的方案，通過因子Xa蛋白酶切去His標(biāo)簽，并進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的純化。隨后，將通過上述方法得到的純化樣品12ml使用超濾NAN0SEPIOK OMEGA (PALL社制)，并使用生理用磷酸緩沖液(日水制藥社制)置換之后，用HT Tuffryn Acrodisc0.22 μ m (PALL社制)進(jìn)行無菌過濾，將所得物用于實(shí)驗(yàn)。
[0128](3)對(duì)人重組S⑶I蛋白反應(yīng)性的⑶8陽性細(xì)胞毒T細(xì)胞的誘導(dǎo)
[0129]從健康人分離外周血，覆以淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)(OrganonpTeknika, Durham, NC),以500轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心分離20分鐘。回收含有外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的級(jí)分，在冷的磷酸鹽緩沖液中洗凈3次(或者3次以上)，得到PBMC。將得到的PBMC懸浮于20ml AIM-V培養(yǎng)基(Life Technololgies, Inc.,美國紐約州 Grand Island)中，于 37°C、5% CO2 條件下在培養(yǎng)瓶(Falcon)中貼壁2小時(shí)。非貼壁細(xì)胞用于T細(xì)胞制備、貼壁細(xì)胞用于制備樹狀細(xì)胞。
[0130]另一方面，將貼壁細(xì)胞在AM-V培養(yǎng)基中于IL-4(1000U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)存在下培養(yǎng)。6天后，回收得到的非貼壁細(xì)胞群體，以10 μ g/ml的濃度添加人重組SCDl蛋白，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后交換為添加了 IL-4 (1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6 (1000U/ml、Genzyme，Cambridge, MA)> IL-1 β (lOng/ml、Genzyme,Cambridge, MA)和 TNF- a (10ng/ml、Genzyme, Cambridge, MA)的 AIM-V 培養(yǎng)基，再培養(yǎng) 2天后得到的非貼壁細(xì)胞群體作為樹狀細(xì)胞使用。
[0131]將制備的樹狀細(xì)胞以細(xì)胞密度I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml懸浮于AIM-V培養(yǎng)基中，再次以10 μ g/ml的濃度添加人重組S⑶I蛋白，使用96孔平板在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，所述細(xì)胞用X射線照射(3000rad)，用AIM-V培養(yǎng)基洗凈，懸浮于含有10%人AB 血清(Nabi, Miami, FL)、IL-6(1000U/ml)和 IL-12(10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的AM-V培養(yǎng)基中，分別以IXlO5個(gè)細(xì)胞/孔的量添加至24孔平板中。進(jìn)一步地，以I X IO6個(gè)細(xì)胞/孔的量添加制備的T細(xì)胞群體，于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。7天后棄去各培養(yǎng)上清，與上述同樣地用人重組SCDl蛋白處理后且X射線照射過的樹狀細(xì)胞懸浮于含有 10% 人 AB 血清(Nabi, Miami, FL)、IL-7 (10U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)和 IL-2 (IOU/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的AM-V培養(yǎng)基中(細(xì)胞密度:1 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml)，將所述細(xì)胞分別以IxlO5個(gè)細(xì)胞/孔的量添加至24孔平板，再進(jìn)行培養(yǎng)。每7天進(jìn)行同樣的操作，重復(fù)4~6次后，回收刺激的T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)⑶8陽性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。
[0132]另外，作為陰性對(duì)照，使用具有本發(fā)明范圍之外的序列的蛋白質(zhì)(序列號(hào)27)。
[0133]接下來，研究了用本多肽刺激的CD8陽性T細(xì)胞是否能破壞表達(dá)SCDl的腫瘤細(xì)胞。
[0134]已確認(rèn)了表達(dá)S⑶I的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U - 87MG (購自ATCC)105個(gè)細(xì)胞收集于50ml容量離心管中，添加100 μ Ci鉻51并在37°C孵育2小時(shí)。此后，所述細(xì)胞用含有10%人AB血清的AM-V培養(yǎng)基洗滌3次并以IO3個(gè)細(xì)胞/孔的量添加至96孔V形底平板；進(jìn)一步地，此后分別添加用包含10%人AB血清的AM-V培養(yǎng)基懸浮的105、5x104、2.5x104和1.25xl04個(gè)已經(jīng)用人重組S⑶I蛋白刺激過的⑶8陽性T細(xì)胞，于37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，使用Y計(jì)數(shù)器測定培養(yǎng)上清中從受到破壞的腫瘤細(xì)胞釋放出的鉻51的量，由此算出人重組S⑶I蛋白刺激的⑶8陽性T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
[0135]結(jié)果表明，人重組S⑶I蛋白刺激的⑶8陽性T細(xì)胞具有對(duì)U - 87MG的細(xì)胞毒活性。另一方面，使用陰性對(duì)照蛋白質(zhì)(序列號(hào)27)誘導(dǎo)的CD8陽性T細(xì)胞沒有顯示細(xì)胞毒活性。因此，明確了本發(fā)明使用的人重組S⑶I蛋白具有誘導(dǎo)能夠破壞腫瘤細(xì)胞的⑶8陽性細(xì)胞毒T細(xì)胞的能力。
[0136]另外，細(xì)胞毒活性顯示的是，如上述刺激誘導(dǎo)的IO5個(gè)⑶8陽性T細(xì)胞與攝入了鉻51的IO3個(gè)惡性腦腫瘤細(xì)胞株U - 87MG細(xì)胞混合，培養(yǎng)4小時(shí)，培養(yǎng)后測定培養(yǎng)基中釋放的鉻51的量，通過式I算出的⑶8陽性T細(xì)胞針對(duì)T98G的細(xì)胞毒活性。
[0137]式1:細(xì)胞毒活性(％)=添加了⑶8陽性T細(xì)胞時(shí)來自U - 87MG的鉻51游離量(cpm) +來自添加了 IN鹽酸的標(biāo)的細(xì)胞的鉻51游離量(cpm) xlOO。
[0138]產(chǎn)業(yè)上的利用可能性
[0139]由于本發(fā)明提供了包含對(duì)各種癌發(fā)揮抗腫瘤活性的多肽的免疫誘導(dǎo)劑，因此對(duì)癌的治療和/或預(yù)防是有用的。
【權(quán)利要求】
1.免疫誘導(dǎo)劑，其含有選自以下(a)至(C)的任一多肽且具有免疫誘導(dǎo)活性的至少一種多肽、或包含編碼該多肽的多核苷酸且在活體內(nèi)能表達(dá)該多肽的重組載體作為有效成分， (a)包含序列表中序列號(hào)4、2、22、24所記載的氨基酸序列中連續(xù)7個(gè)以上氨基酸的多肽， (b)與所述(a)的多肽具有85%以上的序列同一性、且包含7個(gè)以上氨基酸的多肽， (C)包含所述(a)或(b)的多肽作為部分序列的多肽。
2.權(quán)利要求1所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中所述具有免疫誘導(dǎo)活性的多肽是具有序列表中序列號(hào)4、2、22、24所記載的氨基酸序列的多肽。
3.權(quán)利要求1或2所述的免疫誘導(dǎo)劑，其是抗原呈遞細(xì)胞的處理劑。
4.權(quán)利要求1或2所述的免疫誘導(dǎo)劑，其是癌的治療劑和/或預(yù)防劑。
5.權(quán)利要求4所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中所述癌是表達(dá)SCDl的癌。
6.權(quán)利要求4或5所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中所述癌是乳腺癌、腦腫瘤、大腸癌、肛門周圍腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、肥大細(xì)胞瘤、腎臟癌、肝臟癌、肺癌、前列腺癌或白血病。
7.權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其還包含免疫增強(qiáng)劑。
8.權(quán)利要求7所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中所述免疫增強(qiáng)劑選自由弗氏不完全佐劑、Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體組成的組中的至少之一。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK103547278SQ201280024222
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月19日
【發(fā)明者】栗原祥, 岡野文義 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社