顆粒形式的免疫原性組合物和用于產(chǎn)生其的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫學(xué)和疫苗開發(fā)的領(lǐng)域，特別涉及基于天然抗原低聚體的疫苗開發(fā)。提供的是顆粒形式的免疫原性組合物，包含病原體來源的或腫瘤來源的表面暴露的多肽或它們的抗原部分的低聚體，所述低聚體被非共價結(jié)合至顆粒載體，以及藥用稀釋劑或賦形劑。還提供的是重組多肽，該重組多肽包括（A）N-端或C-端的抗原結(jié)構(gòu)域，其包含病原體來源或腫瘤來源的至少一種表面暴露的多肽、或它們的抗原部分，該抗原結(jié)構(gòu)域被融合至（B）低聚化結(jié)構(gòu)域（OMD），所述低聚化結(jié)構(gòu)域通過（C）接頭結(jié)構(gòu)域被融合至（D）由能夠介導(dǎo)多肽對由革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性細(xì)菌樣顆粒（BLP）的非共價連接的單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域組成的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PBD）。
【專利說明】顆粒形式的免疫原性組合物和用于產(chǎn)生其的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)和疫苗開發(fā)的領(lǐng)域，特別涉及基于天然抗原低聚體(寡聚體)的疫苗的開發(fā)。
【背景技術(shù)】 [0002]病原體和腫瘤細(xì)胞的許多表面暴露蛋白質(zhì)以低聚體(寡聚體)起作用。例如，對于病原體的實例是以同源三聚體存在于病毒體(病毒顆粒，virions)中的流感病毒紅血球凝聚素(HA)，和以同源四聚體存在于病毒體中的神經(jīng)氨糖酸苷酶(NA)。同樣，人類免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白gpl40/gpl20在其活性形式中是同源三聚體。同樣地，呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G和F分別以四聚的和三聚的同源低聚體存在于病毒體中。同樣地，如在人類呼吸道冠狀病毒和SARS冠狀病毒的病例中，冠狀病毒刺突由同源三聚體組成。對于腫瘤細(xì)胞的實例是例如，受體酪氨酸激酶(RTK)。對于許多多肽生長因子、細(xì)胞因子和激素，RTK是高親合性的細(xì)胞表面受體。生長因子受體包括:表皮生長因子受體、成纖維細(xì)胞生長因子受體和血小板源性生長因子受體。激素受體包括:雄激素受體和雌激素受體。表皮生長因子受體(EGFR)的實例是四個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的RTK的ErbB蛋白質(zhì)家族。ErbB蛋白質(zhì)家族的四個成員能夠形成同源二聚體、異源二聚體和在由一組潛在的生長因子配體激活時可能形成的更高階的低聚體(higher-order oligomers)。在許多癌癥中ErbB-1是過表達(dá)的。血小板源性生長因子受體(PDGF)家族包括TOGF-A、PDGF-B、PDGF-C和I3DGF-D,其形成亦或同源二聚體亦或異源二聚體(PDGF-AA、PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD)。這四種 PDGF以它們的單體形式是非活性的。病原體和腫瘤細(xì)胞的這類低聚蛋白通常分別與發(fā)病實體(disease-causing entity)(病,細(xì)菌,寄生蟲)的致病性和免疫原性或癌癥發(fā)展有關(guān),并因此成為用于疫苗開發(fā)的重要目標(biāo)。
[0003]然而，在疫苗制備期間，這些低聚體結(jié)構(gòu)的完整性和由此的抗原性可能被不利地影響，例如，如果制造方法包括病原體的滅活?？商娲?，由于用于制造(重組)亞單位疫苗的的生產(chǎn)方法導(dǎo)致可能不能獲得抗原的低聚狀態(tài)。在兩個情況中，這可以導(dǎo)致聚集或離解成為蛋白質(zhì)的單體狀態(tài)和/或錯誤折疊狀態(tài)。
[0004]嵌入在低聚體的四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure )中的構(gòu)象表位可以關(guān)鍵性地促成免疫原性(Weldon et al.PLoS 0ne5 [2010], pi1: el2466)0 例如，Du 等(Virology395[2009], 33-44)發(fā)現(xiàn)免疫兔子沒有提供以下證據(jù)，即與缺少三聚化基序的gpl40相比，三聚的gpl40構(gòu)建體誘導(dǎo)對幾種HIV-1偽病毒顯著增加的中和抗體。另一方面,Grundner等(Virology331 [2005], 33 - 46)示出使用gpl40三聚體免疫兔子比使用亦或gpl20亦或包含切割缺陷的Env的固相脂質(zhì)體引起更高效力和幅度的中和抗體。同樣Wei等(J.Virol.82 [2008]，6200-6208)證明三聚的病毒刺突作為最佳的蛋白質(zhì)免疫原引起針對H5N1分離株的中和抗體。其他注意到的是，Bosch等(J.Virol.84[2010]，10366-10374)提供了在佐劑的存在下流行性豬源2009A (HlNl)流感病毒的可溶性三聚HA和四聚NA的組合在雪貂中提供了針對感染的保護(hù)的證據(jù)。[0005]因此，可以想象在疫苗中存在天然低聚蛋白質(zhì)抗原對于它們的保護(hù)性能力是關(guān)鍵的。在許多實例中，由具有強(qiáng)烈的低聚化性質(zhì)的亞結(jié)構(gòu)域決定低聚化。同樣在很多情況下，疫苗抗原的這種低聚化亞結(jié)構(gòu)域是嵌入細(xì)胞膜中的。為了使疫苗亞單位抗原能夠在沒有脂質(zhì)環(huán)境的情況下低聚化，可以由具有相似的構(gòu)象誘導(dǎo)性質(zhì)的異源卷曲螺旋基序代替天然的低聚化亞結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)成功的應(yīng)用于獲得天然低聚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的這種基序的實例是GCN4轉(zhuǎn)錄因子(GCN)的32-氨基酸形式、來自T4噬菌體的次要纖維蛋白(纖維替代蛋白，fibritin) (T4F)的C-端的27-氨基酸三聚化結(jié)構(gòu)域和雞軟骨基質(zhì)(CART)蛋白的可溶性三聚化結(jié)構(gòu)域(Selvarajah et al., AIDS Res.Hum.Retrovir.24 [2008] 301 - 314; Yang etal.，J.Virol.74[2000]，5716 - 5725;Yang et al.，J.Virol.76[2002]，4634 - 4642)。
[0006]因此，用來產(chǎn)生天然低聚亞單位疫苗抗原的技術(shù)是可利用的。然而，已知的是可溶性亞單位疫苗抗原通常是弱免疫原性的并且需要佐劑和/或顆粒載體系統(tǒng)以提高穩(wěn)固的免疫應(yīng)答。最近，在開發(fā)新的非復(fù)制性抗原呈遞系統(tǒng)以提高能夠用作疫苗的抗原的免疫原性方面存在增強(qiáng)的興趣。這些系統(tǒng)中的許多是以將抗原作為多價顆粒結(jié)構(gòu)來呈遞該抗原的方式設(shè)計的。一些很好理解的實例是:遺傳地融合至口蹄疫病毒(FMDV) (Clarkeet al., Nature330[1987], 381-384)和 HIV (Michel et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 [1988], 7957-7961; Schlienger et al., J.Virol.66 [1992], 2570-2576)抗原的乙型肝炎病毒核心蛋白和表面蛋白；作為抗原載體的Ty病毒樣顆粒(VLP)的開發(fā)(Adams etal.，Nature329 [1987] ,68-70)，其中將抗原遺傳地融合至酵母反轉(zhuǎn)座子Ty的TYA基因編碼蛋白質(zhì)的C末端以形成雜交的Ty-VLP、細(xì)小病毒樣顆粒(Miyamura et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A91 [1994]，8507-8511)。這些技術(shù)確保所討論的抗原在相對大的粒中以多拷貝的形式存在。
[0007]用于抗原的其他已知的顆粒載體是病毒體，其是由體外方法生產(chǎn)的由脂質(zhì)和至少一種病毒性包膜蛋白組成的復(fù)合物。該脂質(zhì)是從亦或雞蛋亦或植物中純化的或合成產(chǎn)生的，并且源于病毒的脂質(zhì)的部分提供包膜蛋白?；旧?，病毒體表現(xiàn)再生的、空的病毒包膜，其缺少包括(一種或多種)源病毒的遺傳物質(zhì)的核衣殼。病毒體不能夠復(fù)制，但是是純的融合活性的囊泡。已知的用作抗原載體的病毒體包括命名為免疫增強(qiáng)型重組流感病毒體(immunopotentiating reconstituted influenza virosomes, IRIV)的病毒體。IRIV 是球形的、單層的囊泡，該囊泡具有150nm的平均直徑并且包括雙層脂質(zhì)膜，該脂質(zhì)膜基本上由磷脂組成，優(yōu)選地由卵磷脂(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)組成。IRIV可以包含插入磷脂雙層膜的功能性病毒性包膜糖蛋白HA和NA。生物學(xué)活性的HA不僅向病毒體制劑賦予結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和均一性，并且也通過維持病毒的融合活性顯著地促進(jìn)免疫性能。
[0008]盡管這些已知的技術(shù)可以提供提高疫苗制劑的免疫性能的顆粒載體，但是這些方法通常是相當(dāng)?shù)芈闊┎⑶倚枰獙I(yè)的設(shè)備和人員。此外，優(yōu)選地避免將病毒材料用作載體。此外，沒有已經(jīng)報道過的在制造天然的低聚體亞單位疫苗中被成功應(yīng)用現(xiàn)有的技術(shù)。
[0009]然而在本領(lǐng)域中(參見例如W002/101026)已知通過將抗原融合至肽聚糖結(jié)合序列并結(jié)合至衍生自革蘭氏陽性菌的顆粒來將抗原呈遞至免疫系統(tǒng)，這種顆粒載體技術(shù)迄今僅在關(guān)于單體抗原的呈遞中被描述和應(yīng)用。
[0010]W099/25836 和 Bosma 等(Appl.Environ.Microbiol.72 [2006]，880_889)教導(dǎo)了一個LysM結(jié)構(gòu)域足以介導(dǎo)抗原實現(xiàn)結(jié)合至革蘭氏陽性微生物和/或肽聚糖微粒(BLP，以前稱為 GEMs)ο 隨后由例如 Raha 等(Appl.Environ.Microbiol.68 [2005], 75-81)和 Moeini 等(Appl.Environ.Microbiol.90 [2010], 77-88)遵循了該方法。然而，僅通過單個 LysM 結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗原是相當(dāng)受限的(Bosma等)并且是不太穩(wěn)定的,如由Raha等(圖6)示出的，Raha等測定了在5天的貯存期之后丟失了約30%至45%的最初結(jié)合抗原。與該觀測結(jié)果一致，在圖6中Moeini等示出在5天的忙存期之后丟失了約40%的通過單個LysM結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗原。
[0011]疫苗的成功制造需要持續(xù)數(shù)月或者有時甚至持續(xù)數(shù)年的長期貯存。使用單個LysM結(jié)合結(jié)構(gòu)域不僅導(dǎo)致低結(jié)合產(chǎn)率(Bosma等)而且也導(dǎo)致被結(jié)合抗原的低穩(wěn)定性(Raha等，Moeini等)。因此，該方法不適合用于BLP類疫苗的經(jīng)濟(jì)可行的疫苗生產(chǎn)方法，BLP類疫苗需要抗原最適負(fù)荷至顆粒即高負(fù)荷產(chǎn)率與在延長的時期內(nèi)保持穩(wěn)定結(jié)合的抗原的組合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]在本發(fā)明之前，通常持有的觀點(diǎn)是:提高LysM結(jié)構(gòu)域的數(shù)目以提高抗原結(jié)合的效力和穩(wěn)定性。事實上，在本領(lǐng)域中證明了在單個構(gòu)建體(成直線的2至3個結(jié)構(gòu)域；順式的/分子內(nèi))中的連續(xù)的LysM結(jié)構(gòu)域提供最優(yōu)的和最穩(wěn)定的結(jié)合。參見Bosma等的圖3，示出通過添加第二 LysM結(jié)構(gòu)域在結(jié)合親合性方面顯著的增加，并且該水平甚至高于包括3個順式LysM結(jié)構(gòu)域的野生型AcmA的結(jié)合親合性。然而，本發(fā)明人觀察到在低聚抗原結(jié)合的情況中在單個構(gòu)建體中使用兩個(或以上)連續(xù)的LysM結(jié)構(gòu)域的方法不產(chǎn)生預(yù)期的結(jié)果。這是因為LysM串聯(lián)重復(fù)介導(dǎo)了不僅將功能性的低聚體(寡聚體)而且也將非功能性的單體結(jié)合至載體的強(qiáng)結(jié)合。在疫苗中存在非功能性單體是高度不希望的，因為這種異源復(fù)合物使得表征所配制的疫苗變得更困難并且更麻煩。此外，包含LysM串聯(lián)重復(fù)的非功能性單體與功能性低聚體強(qiáng)烈競爭BLP上的可利用的結(jié)合位點(diǎn)。最重要地，由于本領(lǐng)域中已知的非功能性的、不正確折疊的抗原可以誘導(dǎo)有害的免疫應(yīng)答，疫苗中的非功能性單體可能對接種的受試者帶來健康風(fēng)險。
[0013]本發(fā)明 人因此目標(biāo)在于提供不僅具有改善的免疫原性而且也可以以相對容易并且經(jīng)濟(jì)上吸引人的方式生產(chǎn)的穩(wěn)定的天然低聚亞單位疫苗。特別是，本申請的目的是以簡單并且可靠的方式提高(當(dāng)前)疫苗的安全性和效力同時避免使用致病的或其他不安全的起始材料。
[0014]令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果僅將抗原融合至與低聚化結(jié)構(gòu)域(寡聚化結(jié)構(gòu)域，0MD)結(jié)合的單個LysM結(jié)構(gòu)域，獲得了優(yōu)先結(jié)合的功能性低聚體(寡聚體)(參見圖2)。通過接頭(linker)序列將單個LysM結(jié)構(gòu)域融合至低聚化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合使疫苗中不需要的非功能性不正確折疊的抗原的存在最少化，從而使疫苗的安全性提高。此外，具有產(chǎn)生自包含單個LysM結(jié)構(gòu)域和OMD的抗原的BLP結(jié)合低聚體的疫苗在延長的貯存時顯示出高的穩(wěn)定性(參見圖5)。
[0015]在不希望受到理論限制的情況下，似乎添加OMD增強(qiáng)了單個LysM結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性，假設(shè)是通過低聚體中多個分子的分子間相互作用，達(dá)到與通過單個分子中的多個LysM結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi)的相互作用所實現(xiàn)的類似的水平。推測地，當(dāng)使用單個LysM結(jié)構(gòu)域時，在功能性低聚體抗原和非功能性單體的混合物中，由于在單體構(gòu)型中單個LysM結(jié)構(gòu)域僅具有微弱的BLP結(jié)合特性，低聚體優(yōu)先地結(jié)合至BLP。另一方面，將低聚體構(gòu)型中的每個單獨(dú)的分子的單個LysM結(jié)構(gòu)域帶入彼此如此緊密的接近度(反式)中(借助于OMD)，獲得了與在單個分子中的兩個以上LySM結(jié)構(gòu)域可比的高的結(jié)合功能性。因此，本發(fā)明的出人意料的認(rèn)知在于通過利用OMD當(dāng)將每個亞單位單個LysM結(jié)構(gòu)域組裝到一個低聚分子中時使得能夠優(yōu)先結(jié)合期望的天然低聚體抗原，這是如果省去OMD或者使用兩個以上(分子內(nèi)的)LysM結(jié)構(gòu)域所不可能的。
[0016]本發(fā)現(xiàn)同樣使得能夠從低聚體和單體的混合物溶液中選擇性結(jié)合期望的天然低聚體，由于具有單個LysM結(jié)構(gòu)域的單體顯示出非常弱的結(jié)合而具有單個LysM結(jié)構(gòu)域的低聚體則非常有效地結(jié)合。如果使用兩個或多個LysM結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這種從低聚體和單體的混合溶液中選擇性結(jié)合低聚體是不可能的，由于在那些情況中觀察到對于單體和低聚體兩者均有效的結(jié)合，或者單體甚至更有效地結(jié)合。
[0017]作為實例，為了將低聚亞單位抗原以它們的天然構(gòu)象形式結(jié)合至顆粒，將流感HA和NA抗原以及呼吸道合胞病毒F抗原各自融合至GCN4結(jié)構(gòu)域并且通過接頭融合至妝聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Protan)(從 N-端至 C-端:HA-GCN4-Protan 和 Protan-GCM-NA ；F-GCM-Protan)。在人類胚腎(HEK293)細(xì)胞中產(chǎn)生的 HA-GCN4-Protan、F-GCN4_Protan 和Protan-GCM-NA融合體分別呈遞三聚體、三聚體和四聚體,它們也能夠結(jié)合至所述肽聚糖載體顆粒(BLP)。使用中國倉鼠卵巢細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞完成了相似的生產(chǎn)。在使用所述顆粒進(jìn)行的血細(xì)胞凝集分析中證明了固定在顆粒上的HA低聚體的功能性。在小鼠模型中證明了負(fù)載有所述HA低聚體的所述顆粒的免疫原性。在小鼠模型中證明了負(fù)載有F低聚體的顆粒的免疫原性并且在棉鼠(cotton rat)模型中證明了效力。
[0018]因此，本發(fā)明涉及重組多肽，包括:
[0019]A) N-端或C-端抗原結(jié)構(gòu)域，包括至少一種表面暴露的多肽(例如，病原體的或腫瘤細(xì)胞來源的)或它們的抗原部分，該抗原結(jié)構(gòu)域被融合至
[0020]B)低聚化結(jié)構(gòu)域(OMD)，所述低聚化結(jié)構(gòu)域經(jīng)由
[0021]C)接頭結(jié)構(gòu)域被融合至
[0022]D)由能夠介導(dǎo)多肽非共價連接至肽聚糖載體顆粒的單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域組成的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)，該肽聚糖載體顆粒是從革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性細(xì)菌樣顆粒(BLP )，并且其中該多肽作為整體僅包含單拷貝的LySM結(jié)構(gòu)域。
[0023]特別地，本發(fā)明提供了顆粒形式的免疫原性組合物，包括:
[0024]1.由革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性細(xì)菌樣顆粒(BLP)作為顆粒載體；
[0025]ii.非共價連接至所述BLP的重組產(chǎn)生的多肽的低聚體，其中該重組多肽包括:
[0026]A) N-端或C-端抗原結(jié)構(gòu)域，包含病原體來源的或腫瘤來源的至少一種表面暴露的多肽、或它們的抗原部分，該抗原結(jié)構(gòu)域被融合至B)低聚化結(jié)構(gòu)域(0MD)，所述低聚化結(jié)構(gòu)域通過
[0027]C)接頭結(jié)構(gòu)域被融合至
[0028]D)由介導(dǎo)多肽的非共價連接至BLP的單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域組成的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)，并且其中該多肽整體上僅包含單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域；以及
[0029]ii1.藥用稀釋劑或賦形劑。
[0030]本發(fā)明的概念因此依賴于該意想不到的發(fā)現(xiàn)，即，對于將低聚融合蛋白對載體顆粒有效的并且選擇性的結(jié)合，使用僅與單拷貝的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的低聚化結(jié)構(gòu)域是有利的，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域其天然是包含多拷貝的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重復(fù)結(jié)構(gòu)的一部分。例如，對于結(jié)合至具有相似的結(jié)合伴侶(例如，源自降解這種顆粒的酶)的其他載體本體的顆粒，如病毒體、脂質(zhì)體或基于糖類聚合物的顆粒，在低聚體構(gòu)建體中可以改造融合蛋白以包含非重復(fù)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其他重復(fù)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(由該結(jié)構(gòu)域，可以使用單拷貝來結(jié)合至與低聚化結(jié)構(gòu)域結(jié)合的載體本體)的實例包括以下:
[0031]-來自例如自溶素如肺炎鏈球菌的酶LytA(例如，Pfam PF01473)的膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域，用于結(jié)合至包含膽堿的載體。
[0032]-來自例如糖基轉(zhuǎn)移酶如口腔鏈球菌的葡聚糖蔗糖酶(例如PfamPF08363)的葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，用于結(jié)合至由含葡萄糖的聚合物組成的顆粒。
[0033]-磷脂酰肌醇脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如血小板白細(xì)胞C激酶底物蛋白(普列克底物蛋白，Pleckstrin)同源(PH)結(jié)構(gòu)域(Pfam PF00169)。
[0034]杭原結(jié)構(gòu)域[0035]表述“表面暴露的多肽或它們的抗原部分”是指涉及任何伸出的氨基酸其被發(fā)現(xiàn)在其天然環(huán)境中是表面暴露的，例如作為病原體或腫瘤細(xì)胞的一部分，并且其能夠發(fā)動(mounting)保護(hù)性免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中可以使用已知的或尚待發(fā)現(xiàn)的病原性的或腫瘤源性的抗原序列。表面暴露的致病多肽是例如病毒性的、細(xì)菌性的、或寄生生物源性的。在優(yōu)選的實施方式中，它是病毒蛋白質(zhì)。例如，病原體來源的表面暴露的多肽包括包膜病毒蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域、或其抗原部分。示例性的包膜病毒包括流感病毒、冠狀病毒、人類呼吸道冠狀病毒、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、變性肺病毒(metapneumovirus)、副粘液病毒,特別是呼吸道合胞病毒(RSV)。在具體的方面中，表面暴露的多肽或其抗原部分選自由流感紅血球凝聚素胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、流感神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、冠狀病毒刺突(S)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、RSV糖蛋白F胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、HIVgpHO或其部分和RSV糖蛋白G胞外結(jié)構(gòu)域或其部分所組成的組中。
[0036]來自腫瘤細(xì)胞的示例性抗原包括受體酪氨酸激酶(RTK)。對于許多多肽生長因子、細(xì)胞因子和激素，RTK是高親合性的細(xì)胞表面受體。生長因子受體包括:表皮生長因子受體、成纖維細(xì)胞生長因子受體和血小板源性生長因子受體。激素受體包括:雄激素受體和雌激素受體。表皮生長因子受體(EGFR)的實例是四個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的RTK的ErbB蛋白質(zhì)家族。ErbB蛋白質(zhì)家族的四個成員能夠形成同源二聚體、異源二聚體和在被一組潛在的生長因子配體激活時可能的更高階的低聚體。ErbB-1在許多癌癥中是過表達(dá)的。血小板源性生長因子受體(PDGF)家族由TOGF-A、PDGF-B、PDGF-C和TOGF-D組成，其形成亦或同源二聚體亦或異源二聚體(PDGF-AA、PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD)。該四種 PDGF 以它們的單體形式是非活性的。
[0037]肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域
[0038]本發(fā)明的多肽的特征在于僅存在單拷貝的能夠介導(dǎo)多肽結(jié)合至肽聚糖的LysM(溶解素基序)結(jié)構(gòu)域。LysM結(jié)構(gòu)域，在本領(lǐng)域中也稱為“LysM重復(fù)”，為約45個殘基長度。在多個參與細(xì)菌細(xì)胞壁降解的酶中發(fā)現(xiàn)LysM結(jié)構(gòu)域(Joris et al., FEMS Microbiol.Lett.70[1992], 257-264;Andre et al., J.Bacteriol.[2008]，7079-7086)。LysM結(jié)構(gòu)域被假定具有一般的肽聚糖結(jié)合功能。該結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)是已知的(‘The structure of a LysMdomain from E.coli membrane-bound lytic murein transglycosylase D(MltD).Batemanand Bycroft, J.Mol.Biol.299 [2000], 1113-1119)。LysM結(jié)構(gòu)域的存在不限于細(xì)菌蛋白質(zhì)。它們也存在于許多真核蛋白質(zhì)中，然而它們在古細(xì)菌蛋白質(zhì)中缺乏。對于許多包含LysM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)已經(jīng)假定了細(xì)胞壁結(jié)合功能。部分純化的希氏腸球菌(Enterococcus hirae)的溶菌酶_2，一種類似于AcmA并且包括六個LysM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，結(jié)合至相同菌株的肽聚糖片段。李斯特單核細(xì)胞增生菌(Listeria monocytogenes)的p60蛋白質(zhì)包括兩個LysM結(jié)構(gòu)域并且顯示出與細(xì)胞表面相關(guān)?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)的穆勒肽酶(muropeptidases) LytE和LytF在它們的N-端分別具有三個和五個重復(fù)并且都是細(xì)胞壁結(jié)合的。
[0039]重要的是注意到，以前的研究，例如以 申請人:的名義的W099/25836和Bosma等(Appl.Environm.Microbiol.72 [2006], 880-889)顯不單個 LysM 結(jié)構(gòu)域在與 BLP 結(jié)合方面非常弱，并且增加LysM結(jié)構(gòu)域的數(shù)目增強(qiáng)與BLP的結(jié)合。這與以下事實一致即大多數(shù)天然存在的肽聚糖結(jié)合蛋白含有多個(例如2-6個)串聯(lián)重復(fù)的LysM結(jié)構(gòu)域。相反，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)如果在與低聚化結(jié)構(gòu)域(OMD)的結(jié)合中僅使用單個LysM結(jié)構(gòu)域,天然低聚蛋白質(zhì)抗原對顆粒載體的結(jié)合是最有效的，條件是接頭序列存在于OMD與LysM結(jié)構(gòu)域之間。
[0040]通過使用本領(lǐng)域中已知的方法在公共可利用的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基于同源性的(homology-based)搜索,技術(shù)人員將能夠識別LysM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(Buistet al., Mol.Microbiol.68[2008], 838-847;Visweswaran et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.92 [2011] ,921-928)。PFAM網(wǎng)站提供了使用序列家族的一致性可以用于進(jìn)行靈敏性數(shù)據(jù)庫搜索的兩個分布型隱馬爾可夫模型(profile hidden Markov models, profileHMM)。HMMER是用于蛋白質(zhì)序列分析的分布型HMM軟件的自由分配的實施方式。如在本文中使用的，術(shù)語“LysM結(jié)構(gòu)域”通常涉及與根據(jù)對于LysM結(jié)構(gòu)域的PFAM登錄號PF01476的序列顯示出至少50%、優(yōu)選至少60%、最優(yōu)選至少70%的序列相似性的氨基酸序列(參見http://www.sanger.ac.uk/cgi_bin/Pfam/getacc?PF01476)o
[0041]在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多結(jié)合分析，其使得技術(shù)人員能夠測定LysM結(jié)構(gòu)域是否具有所要求的肽聚糖結(jié)合能力。如在本文中以下描述的，可以使用構(gòu)建體轉(zhuǎn)染待評價的宿主細(xì)胞，在其后使得宿主細(xì)胞能夠表達(dá)并在培養(yǎng)物上清液中分泌感興趣的重組多肽。然后分析了分泌的蛋白質(zhì)對于選擇性結(jié)合至獲自通過完善的酸處理方法所制備的革蘭氏陽性細(xì)菌(細(xì)菌樣顆?；駼LP)的肽聚糖顆粒。例如，將0.15mg BLP (干重)與過量的澄清的哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)物上清液接觸并且在室溫下溫育持續(xù)30分鐘同時溫和地混合。然后通過低速離心收集具有結(jié)合的蛋白質(zhì)BLP。使用適當(dāng)?shù)目寡逋ㄟ^SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法對于與BLP的多肽結(jié)合分析顆粒。使用例如純化的BSA作為對照蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE和隨后的考馬斯亮藍(lán)染色可以測定并量化BLP結(jié)合蛋白質(zhì)的量。
[0042]作為另一個實例，可以制備具有(綠色)熒光蛋白的融合體，可以分析該融合體對乳球菌的表面的結(jié)合行為。參見例如Hu et al.，Appl.Environ.Microbiol.8[2010], 2410-2418。
[0043]在一個實施方式中，本發(fā)明的多肽僅包含單拷貝的在乳酸乳球菌的主要的自溶素AcmA的C-端區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的LysM結(jié)構(gòu)域,該AcmA包含由非同源序列(Protan)隔開的三個同源的LysM結(jié)構(gòu)域。AcmA的C-端區(qū)域顯示出介導(dǎo)自溶素的肽聚糖結(jié)合(Buist et al.，J.Bacteriol.177 [1995], 1554-1563)。針對三個AcmA LysM結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，參見例如W099/25836中的圖2 (其中由Rl、R2和R3標(biāo)識三個LysM結(jié)構(gòu)域)，通過引用結(jié)合于此。
[0044]也包括了 AcmA LysM結(jié)構(gòu)域的精確的氨基酸序列內(nèi)的變異體，條件是保持肽聚糖結(jié)合功能。因此，在不失去肽聚糖結(jié)合能力的情況下可以進(jìn)行氨基酸取代、刪除和/或插入。AcmA LysM結(jié)構(gòu)域的某些部分不適合變異,例如在大多數(shù)LysM結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的保守的GDTL、N和GQ基序。然而，在沒有影響LysM結(jié)構(gòu)域結(jié)合載體的效率的情況下可以改變其他序列。例如,可以修改AcmA的三個LysM結(jié)構(gòu)域性質(zhì)(極性、非極性、吸水性、疏水性)非常不同的處的氨基酸殘基。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包括與乳酸乳球菌AcmA的三個LysM結(jié)構(gòu)域之一至少70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%、以及92%，95%，97%或99%相同的序列。
[0045]對于多肽，‘氨基酸序列相似性的百分比’，如70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%的序列同一性，可以通過在比較窗口內(nèi)比較兩個最佳對齊的序列測定，其中對于兩種氨基酸序列的最佳比對，在比較窗口中多肽序列的一部分與參考序列(其不包含添加或刪除)相比可以包括添加或刪除(即，缺口)。通過以下來計算百分比:(a)測定在兩個序列中相同氨基酸出現(xiàn)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目；(b)將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)；和((3)將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列相似性的百分比。通過已知算法的計算化實施方式、或通過檢查可以進(jìn)行用于比較的序列的最佳對齊。容易利用的序列比較和多重序列比對算法分別是，Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J.Mol.Biol.215[1990], 403;Altschul et al., Nucleic Acid Res.25[1997]，3389-3402)和ClustalW程序,兩者在因特網(wǎng)上是可利用的。
[0046]作為另一個實施例，在本發(fā)明中也可以使用來自發(fā)酵乳桿菌噬菌體內(nèi)溶菌素的LysM 結(jié)構(gòu)域序列(Hu et al., Appl.Environ.Microbiol., 76 [2010], 2410-2418)或顯不出與其至少70%序列同一性的序列。
[0047]低聚化結(jié)構(gòu)域
[0048]如上文描 述的，本發(fā)明的多肽的特征在于存在低聚化結(jié)構(gòu)域(OMD)和單個LysM結(jié)構(gòu)域。OMD是例如二聚化、三聚化或四聚化結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域在本領(lǐng)域中是已知的(O’Sheaet al., Science243[1989], 534-542;Harbury et al.，Science262[1993]，1401 - 1407)。例如，低聚化結(jié)構(gòu)域是GCN4類的二聚化、三聚化或四聚化結(jié)構(gòu)域。酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GCN4的亮氨酸拉鏈區(qū)域包括具有氨基酸序列MKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER的GCN4-pl 二聚化結(jié)構(gòu)域。GCN4類的三聚化結(jié)構(gòu)域(GCM-pII)優(yōu)選包括氨基酸序列MKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK。
[0049]將在本文中使用的術(shù)語“四聚化結(jié)構(gòu)域”限定為介導(dǎo)四個單體蛋白質(zhì)或其部分的四聚化的形成的結(jié)構(gòu)域。合適的四聚化結(jié)構(gòu)域包括但不限于:仙臺病毒磷蛋白四聚化結(jié)構(gòu)域和源自酵母GCN4 二聚化結(jié)構(gòu)域的突變的四聚化結(jié)構(gòu)域(GCM-pLI)。在優(yōu)選的實施方式中，由GCN4類的四聚化結(jié)構(gòu)域提供重組流感神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的四聚化。GCN4類的四聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地包括氨基酸序列MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE。
[0050]對于在本發(fā)明中使用的其他有用的低聚化結(jié)構(gòu)域包括:噬菌體T4次要纖維蛋白(纖維替代蛋白，fibritin)(折疊核(折疊子)，foldon)或其功能部分或其類似物的C-端結(jié)構(gòu)域序列，特別是折疊核的C-端27至30個殘基(Giithe et al.J.Mol.Biol.337[2004],905-915)，和雞軟骨基質(zhì)(CART)蛋白的可溶性三聚化結(jié)構(gòu)域。雞軟骨基質(zhì)蛋白質(zhì)的C-端低聚化結(jié)構(gòu)域是由三個相同的43個殘基組成的三聚的卷曲螺旋(Selvarajah et al.AIDS Res.Hum.Retroviruses, 24[2008]，301-314)。[0051]對于在本發(fā)明中使用的低聚化結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步包括在抗原結(jié)構(gòu)域與卷曲螺旋基序之間的雙重半胱氨酸基序以進(jìn)一步穩(wěn)定低聚的蛋白質(zhì)(Louis et al.，J.Biol.Chem.278[2003]，20278-20286;Magro et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA109[2012]，3089-3094)。
[0052]接頭結(jié)構(gòu)域
[0053]本文中以下的實施例舉例說明了接頭結(jié)構(gòu)域?qū)τ贠MD和/或LysM結(jié)構(gòu)域的最佳功能的重要性。因此，OMD和LysM優(yōu)選被由10與60之間、優(yōu)選地20-50、更優(yōu)選地25-40個氨基酸殘基組成的接頭結(jié)構(gòu)域隔開。將OMD直接融合至LysM結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生不利的結(jié)果。使用具有約30 (例如28-32)個氨基酸長度的接頭結(jié)構(gòu)域獲得了很好的結(jié)果。對于詳細(xì)內(nèi)容參見實施例2。
[0054]在一方面中，接頭結(jié)構(gòu)域包括在乳酸乳球菌AcmA的C-端中的LysM重復(fù)之間中找到的接頭序列。例如，LI:GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST (29個氨基酸)；L2:GSASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ (31 個氨基酸)或 L3:QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS (30個氨基酸)。在優(yōu)選的實施方式中，接頭結(jié)構(gòu)域由 GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST、GSASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ 或QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS組成。也可以使用正確長度(即約10與60個氨基酸殘基之間)的其他接頭結(jié)構(gòu)域序列。技術(shù)人員基于以下示出的實施例和其常識將能夠產(chǎn)生和評估特定接頭序列的合適性。
[0055]此外發(fā)現(xiàn)可以通過末端“加帽結(jié)構(gòu)域”的存在增強(qiáng)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。例如，在添加C-端加帽結(jié)構(gòu)域時，增強(qiáng)了從N-端至C-端由通過OMD和接頭序列將HA融合至單個LysM結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體的表達(dá)(參見圖2A)。因此，本發(fā)明的多肽可以進(jìn)一步包括在N-端是抗原結(jié)構(gòu)域的情況下的C-端加帽結(jié)構(gòu)域，或在C-端是抗原結(jié)構(gòu)域的情況下的N-端加帽結(jié)構(gòu)域。加帽結(jié)構(gòu)域可以在長度方面變化，例如從約10至約60個氨基酸、優(yōu)選地20-50、更優(yōu)選地25-40個氨基酸殘基的長度。使用具有與將OMD連接至LysM結(jié)構(gòu)域的接頭結(jié)構(gòu)域相同序列的加帽結(jié)構(gòu)域獲得了非常好的結(jié)果。換言之，本發(fā)明的多肽中的單拷貝LysM結(jié)構(gòu)域與含有相同的或至少高度(>90%)相似的氨基酸序列側(cè)接(flanked by)是有利地。因此，在具體的實施方式中，加帽結(jié)構(gòu)域，并且優(yōu)選地也是接頭結(jié)構(gòu)域，由選自由以下所組成的組中的氨基酸序列所組成:GASSAGNTNSGGSTTT I TNNNSGTNSSST、SASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ和 QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS。
[0056]可以改變多肽內(nèi)的各結(jié)構(gòu)域的相對方位，條件是接頭結(jié)構(gòu)域序列總是位于OMD與LysM結(jié)構(gòu)域之間。上文中描述了合適的接頭結(jié)構(gòu)域。
[0057]在一個實施方式中，LysM結(jié)構(gòu)域位于來自病原源性的多肽或其抗原部分的C-端。例如，該結(jié)構(gòu)特別適用于包含I型膜蛋白如流感病毒HA、HIV gp 140、冠狀病毒S和RSV F的物質(zhì)。在另一個實施方式中，LysM結(jié)構(gòu)域位于來自病原源性的多肽或其抗原部分的多肽的N-端。對于2型膜蛋白如流感病毒NA和RSV G優(yōu)選后一種來源。多肽可以進(jìn)一步包括促進(jìn)在真核宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)和/或由真核宿主細(xì)胞的分泌的一種或多種序列。有利的序列包括N-端信號序列。本文中將“信號序列”定義為信號肽，該信號肽引導(dǎo)蛋白質(zhì)或其部分運(yùn)輸至真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)——這是分泌途徑的進(jìn)入位點(diǎn)。可以將信號序列定位于蛋白質(zhì)或其部分的N-端。在將蛋白質(zhì)嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之后可以切除信號肽。例如，在一個實施方式中用于在果蠅細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的pMT/BiP載體包括BiP信號序列。在另一個實施方式中，用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的P⑶5載體包括信號序列MPMGSLQPLATLYLLGMLVA，例如CD5糖蛋白的信號肽序列。在又一個實施方式中，在蛋白質(zhì)之前的天然信號序列被用于將前體多肽引導(dǎo)至分泌途徑。
[0058]如在上文中描述的，產(chǎn)生的本發(fā)明的重組多肽適合用于制造顆粒形式的免疫原性組合物。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及顆粒形式的免疫原性組合物，包括作為顆粒載體的從革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性球形肽聚糖顆粒(GEM顆?；蚣?xì)菌樣顆粒(BLP))，其中將重組產(chǎn)生的多肽(每個多肽如在上文中限定)的低聚體被非共價連接至所述BLP，以及藥用稀釋劑或賦形劑 。
[0059]BLP是無活性的、喪失了完整的表面蛋白質(zhì)與胞內(nèi)內(nèi)含物，可以在沒有機(jī)械破壞的情況下通過使用能夠除去細(xì)胞壁成分如蛋白質(zhì)、磷壁(脂質(zhì))酸((Iipo) teichoic acid)或來自所述細(xì)胞壁材料的糖類的溶液處理完整的細(xì)胞獲得BLP，并且其中厚的肽聚糖細(xì)胞壁保持完整。產(chǎn)生的基本上球形的肽聚糖微顆粒反映了革蘭氏陽性細(xì)菌的尺寸和形狀。優(yōu)選地，該細(xì)菌是非病原性細(xì)菌，更優(yōu)選地是食品級細(xì)菌。該細(xì)菌可以選自由乳球菌、乳桿菌、芽胞桿菌和分枝桿菌所組成的組中。
[0060]設(shè)想了多種實施方式，例如可以使用包含源自第一病原體的表面暴露多肽或其抗原部分的多肽的至少第一低聚體和使用包含源自例如相同的或第二種不同的病原體的不同的表面暴露多肽或其抗原部分的多肽的第二低聚體非共價地提供顆粒載體。不同的低聚體例如包含不同的HA血清型、HA和NA、HA和S和/或RSV F。在介導(dǎo)抗RSV保護(hù)性抗體響應(yīng)方面，具有至少10個氨基酸殘基的RSV F蛋白或其免疫原性的活性片段是優(yōu)選的一種。F蛋白跨RSV的兩種主要菌株(A亞族和B亞族)保持高度保守。以非融合性(non-fusogenic)67kDa前體(FO)合成該F蛋白，其經(jīng)受弗林蛋白酶(fur in)的蛋白水解性切割以產(chǎn)生兩種二硫化物連接的多肽，F(xiàn)l和F2。F蛋白經(jīng)由Fl多肽的N-端進(jìn)入細(xì)胞膜，然而跨膜片段定位在C-端附近。與這兩個區(qū)域相鄰的是兩個七肽重復(fù)序列(heptad repeat sequences),標(biāo)識為HR-C和HR-N，其形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的三聚體，在病毒進(jìn)入之前該發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)經(jīng)受構(gòu)象變化以使病毒和細(xì)胞膜能夠接近。在優(yōu)選的實施方式中，F(xiàn)胞外結(jié)構(gòu)域包含兩個突變的切割位點(diǎn)導(dǎo)致鎖定在預(yù)融合的構(gòu)象中的未切割的多肽。
[0061]在優(yōu)選的實施方式中，提供了顆粒形式的免疫原性組合物，包含流感病毒來源的表面暴露的多肽或其抗原部分的低聚體，所述低聚體被非共價結(jié)合至顆粒載體和藥用稀釋劑或賦形劑。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物例如包括一種重組的三聚的流感紅血球凝聚素胞外結(jié)構(gòu)域或其部分或一種重組的四聚的流感神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域或其部分。在抗流感病毒亞型或菌株、或一種以上相關(guān)的流感病毒亞型或菌株的個體中，這種免疫原性組合物特別適用于引起免疫應(yīng)答。然而，在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物包括一種或多種三聚的紅血球凝聚素胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、和/或一種或多種四聚的神經(jīng)氨酸酶的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的組合。
[0062]因此，例如，可以組合2、3、4、5、6、7、8、9或10個三聚的紅血球凝聚素胞外結(jié)構(gòu)域或其部分，如 HU H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15 和 / 或 H16,或可以組合2、3、4、5、6、7、8、或9個四聚的神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域或其部分，如N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、H9、和/或N9。另外，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物可以包括不同的流感亞型的一種或多種三聚的紅血球凝聚素胞外結(jié)構(gòu)域或其部分和一種或多種四聚的神經(jīng)氨酸酶的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的組合。例如，可以組合1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個三聚的紅血球凝聚素胞外結(jié)構(gòu)域或其部分和1、2、3、4、5、6、7、8、或9個四聚的神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域或其部分，如 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、 N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和/或N9。技術(shù)人員將會清楚該術(shù)語“一種或多種胞外結(jié)構(gòu)域”包含來自一種或多種流感病毒亞型如例如甲型流感病毒和乙型流感病毒的一種或多種胞外結(jié)構(gòu)域。因此，根據(jù)本發(fā)明的顆粒形式的免疫原性組合物可以是多價的組合物，與包含一種重組的三聚的流感紅血球凝聚素胞外結(jié)構(gòu)域或其部分或者一種重組的四聚的流感神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的免疫原性組合物相比，使用該多價的組合物可以實現(xiàn)對流感病毒感染的增強(qiáng)的保護(hù)。另外，或可替代地，使用多價的組合物可以實現(xiàn)抗一種以上流感病毒型、或流感病毒亞型或菌株的更寬的保護(hù)。此外，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物對抗原變化的敏感性低于傳統(tǒng)的滅活的或減活的流感病毒疫苗。
[0063]本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方式涉及用于提供顆粒形式免疫原性組合物的方法，包括以下步驟:(a)提供根據(jù)本發(fā)明的重組多肽；(b)提供由革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的非活性球形的肽聚糖顆粒(BLP);(c)使得能夠?qū)⑺龆嚯姆枪矁r結(jié)合至所述BLP以形成包含非共價結(jié)合至顆粒載體的病原體來源的或腫瘤來源的表面暴露多肽或其抗原部分的多肽的低聚體的免疫原性復(fù)合物，和(d)將該免疫原性復(fù)合物配制成免疫原性組合物。
[0064]對于步驟(b)，在本領(lǐng)域中描述了用于提供肽聚糖顆粒(BLP)的方式和方法。參見例如TO02/101026和US6，896，887公開了用于獲得革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁材料的方法，包括使用能夠除去來自所述細(xì)胞壁材料的細(xì)胞壁組分如蛋白質(zhì)、磷壁(脂脂)酸或糖的溶液處理所述細(xì)胞壁材料，其中所述細(xì)胞壁材料基本上包括球形的肽聚糖顆粒。由此獲得的顆?？梢院唵蔚嘏c包含重組產(chǎn)生的一種或多種多肽的制劑(例如細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或純化的多肽)混合。借助于它們的LysM結(jié)構(gòu)域和0MD，多肽可以結(jié)合至載體，結(jié)合物被同時、先于和/或隨后組裝入它們的天然低聚體構(gòu)型中。
[0065]也提供的是編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核苷酸序列，以及包含核苷酸序列的載體。如在本文中使用的術(shù)語“載體”被定義為能夠?qū)愒吹暮塑账嵝蛄幸胨拗骷?xì)胞的核苷酸分子，如質(zhì)粒、噬菌體或動物病毒。根據(jù)本發(fā)明的載體使得能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)或產(chǎn)生由異源核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)或其部分。在根據(jù)本發(fā)明的方法中的合適的載體包括，但不限于，pCD5 (Pouyani and Seed, Cell83[1995]，333-343)和 pCAGGS (Niwa etal.,Genel08[1991], 193-199)。“宿主細(xì)胞”是由核苷酸分子如載體轉(zhuǎn)化的、或能夠被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本文中的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”被定義為將外源核苷酸引入受體細(xì)胞。受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生由所述細(xì)胞瞬時表達(dá)重組蛋白質(zhì)，意味著重組蛋白質(zhì)僅表達(dá)限定的時間段。可替代地，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞可以產(chǎn)生穩(wěn)定的表達(dá)，意味著核苷酸被引入細(xì)胞的基因組并因此傳遞給下一代的細(xì)胞。另外，可以實現(xiàn)重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)型表達(dá)。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)要求存在或不存在使得能夠表達(dá)感興趣的核苷酸序列的分子。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的實例包括，但不限于:Tet-On和Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)、激素誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)如例如蛻皮激素誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)、阿拉伯糖誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)、和使用包含誘導(dǎo)型金屬硫蛋白啟動子的PMT/BiP載體(Invitrogen)的果蜆誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。
[0066]進(jìn)一步的實施方式涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或載體的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞有利地用于重組產(chǎn)生本文中公開的多肽。
[0067]本發(fā)明的重組多肽在例如原核細(xì)胞中、或真核細(xì)胞如植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的重組低聚體胞外結(jié)構(gòu)域或其部分可以在植物中表達(dá)。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞在本領(lǐng)域中是熟知的。原核細(xì)胞是例如大腸桿菌或乳酸乳球菌。植物和/或植物細(xì)胞的實例包括，但不限于:玉米(細(xì)胞)、水稻(細(xì)胞)、浮萍(細(xì)胞)、煙草(細(xì)胞，如BY-2或NT-1細(xì)胞)、和馬鈴薯(細(xì)胞)。酵母細(xì)胞的實例是釀酒酵母(Saccharomyces)和畢赤酵母(Pichia)。昆蟲細(xì)胞的實例包括，但不限于:草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞如Tn5、SF_9和SF-21細(xì)胞，以及果蜆細(xì)胞如果蜆Schneider2 (S2)細(xì)胞。適用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的哺乳動物細(xì)胞的實例包括，但不限于:非洲綠猴腎臟(Vero )細(xì)胞、幼崽倉鼠腎臟(如BHK-21)細(xì)胞、人類視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如PerC6細(xì)胞)、人類胚腎細(xì)胞(如HEK293細(xì)胞)、馬-達(dá)二氏(Madin Darby)犬科的腎臟(MDCK)細(xì)胞、雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)、雞胚胎腎臟細(xì)胞(CEK細(xì)胞)、源自胚盤的胚胎干細(xì)胞(例如EB14)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(如3T3細(xì)胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、和小鼠骨髓瘤(如NSO和SP2/0)、以及這些細(xì)胞類型的衍生型。在優(yōu)選實施方式中使用哺乳動物CHO細(xì)胞或S2昆蟲細(xì)胞。
[0068]因此，本發(fā)明也提供了用于提供根據(jù)本發(fā)明的重組多肽的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞、使得能夠表達(dá)多肽并分離該物質(zhì)。優(yōu)選地，該方法使用真核宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞，例如MDCK、HEK、CHO或PerC6細(xì)胞，或昆蟲細(xì)胞，例如S2細(xì)胞。
[0069]本發(fā)明進(jìn)一步提供的是用于在哺乳動物個體中引起抗病原體的免疫應(yīng)答的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物給予所述個體。
[0070]本發(fā)明提供了可以用作疫苗的免疫原性組合物。這些疫苗可以是亦或預(yù)防性的(即，為了防止感染)亦或治療性的(即，為了治療感染)，但將通常是預(yù)防性的。本發(fā)明也提供了用于在哺乳動 物中提高免疫應(yīng)答的方法，包括給予有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟。免疫應(yīng)答優(yōu)選的是保護(hù)性的并且優(yōu)選參與抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。該方法可以提高加強(qiáng)應(yīng)答(booster response)。哺乳動物優(yōu)選是人類。其中該疫苗是用于預(yù)防性用途，人類優(yōu)選是兒童(例如幼兒或嬰兒)或青少年；其中疫苗是用于治療性用途，人類優(yōu)選是青少年或成年人。也可以將意在用于兒童的疫苗給予至成年人例如以評估安全性、劑量、免疫原性等。根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗可以用于治療兒童和成年人兩者。因此，人類患者可以是I歲以下，5歲以下，1-5歲，5-15歲，15-55歲，或至少55歲。用于接受疫苗的優(yōu)選的患者是老年人(例如>50歲，>60歲，并且優(yōu)選>65歲)。然而，疫苗不僅適用于這些年齡組，并且可以更廣泛地應(yīng)用在人群中，包括用于年輕人(例如〈5歲)、住院患者、保健工人、武裝部隊和軍事人員、懷孕的女性、慢性疾病患者、或免疫缺陷性患者。
[0071 ] 例如，本發(fā)明提供了用于在個體中弓丨起抗病毒性疾病的免疫應(yīng)答的方法，優(yōu)選地其中病毒性疾病是由流感病毒、動物冠狀病毒、人類呼吸道冠狀病毒、人類免疫缺陷性病毒(HIV)或副粘液病毒所引起的，特別是由呼吸道合胞病毒(RSV)或變性肺病毒所引起。該方法涉及給予所述個體本發(fā)明的天然低聚體亞單位疫苗，包括:
[0072]A) N-端或C-端抗原結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包括選自由流感紅血球凝聚素(HA)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、流感神經(jīng)氨酸酶(NA)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、冠狀病毒刺突(S)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、RSV糖蛋白F或G胞外結(jié)構(gòu)域或其部分和HIV gpl40胞外結(jié)構(gòu)域或其部分所組成的組中的病原性來源的至少一種表面暴露的多肽或其抗原部分，該抗原結(jié)構(gòu)域被融合至
[0073]B)低聚化結(jié)構(gòu)域(0MD),所述低聚化結(jié)構(gòu)域通過
[0074]C)接頭結(jié)構(gòu)域被融合至
[0075]D)由單拷貝的能夠介導(dǎo)多肽的非共價連接至由革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性細(xì)菌樣顆粒(BLP)的LysM結(jié)構(gòu)域組成的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)，并且其中該多肽作為整體僅包括單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域。
[0076]可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過任何已知的方法給予根據(jù)本發(fā)明的組合物，優(yōu)選用于鼻腔的、舌下的、口服的或非腸道的給藥途徑。在優(yōu)選的實施方式中，給藥途徑是鼻腔途徑。本發(fā)明也提供了以本發(fā)明的免疫原性組合物預(yù)裝的遞送裝置。合適的遞送裝置包括預(yù)裝的(噴霧)的容器和注射器。本發(fā)明的組合物通常將直接給予至患者?？梢酝ㄟ^非腸道的注射(例如皮下的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、或至組織間隙的)，或粘膜地如通過直腸的、舌下的、□服的(例如片劑、噴霧)、陰道的、局部的、透皮的或經(jīng)皮的、鼻內(nèi)的、眼部的、耳內(nèi)的、肺部的或其他粘膜的給藥可以完成直接遞送。如上文討論的，肌內(nèi)的給藥是典型的。
[0077]本發(fā)明可以被用于引起全身的和/或粘膜的免疫，優(yōu)選地引起增強(qiáng)的全身的和/或粘膜的免疫。
[0078]劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。可以在初級免疫(primary immunisation)方案中和/或加強(qiáng)免疫方案中使用多劑量。在多劑量方案中，可以通過相同的或不同的途徑如非腸道的初免(prime)和粘膜的加強(qiáng)(boost)、粘膜的初免和非腸道的加強(qiáng)等給予多種劑量。通常以至少I星期間隔(例如約2星期、約3星期、約4星期、約6星期、約8星期、約10星期、約12星期、約16星期等)給予多劑量。可以將本發(fā)明的免疫原性組合物每年、每2年、每3年等給予至相同的患者。
[0079]也設(shè)想的是將不同的呼吸器官的疫苗同時共給予至受試者，例如與流感疫苗同時給予肺炎球菌疫苗。組合疫苗，其中以混合物給予兩種或多種疫苗，如與呼吸道合胞病毒(RSV)抗原結(jié)合的肺炎球菌的糖類(結(jié)合的或非結(jié)合的)，并且還推測了可以添加許多其他抗原如流感病毒抗原。例如，本發(fā)明可以應(yīng)用于制備包含RSV的融合蛋白(F)、粘附蛋白(G)和基質(zhì)蛋白(M)與流感疫苗的結(jié)合的組合疫苗。
[0080]如上文描述的，本發(fā)明也涉及使用疫苗組合物或用于制備疫苗組合物的方法，用于使哺乳動物免疫抵抗天然構(gòu)象的抗原，特別是抵抗流感或RSV感染，或涉及產(chǎn)生抵抗構(gòu)象的抗原如HA、NA或RSV抗原的誘導(dǎo)的抗體。在一方面中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的重組多肽用于制備意在預(yù)防或治療流感或RSV感染的疫苗或免疫原性組合物的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0081]圖1.各種HA融合蛋白的:示意圖(圖片A和圖片B)、對BLP的結(jié)合(圖片C和圖片D)、以及多聚化狀態(tài)(E)。能夠形成三聚體的線性HA-OMD-Protan(縮寫為ΗΑ_ΡΞ)的示意圖(圖片Α)和以單體存在的HA-Protan (縮寫為ΗΑ-Ρ’的示意圖(圖片B)。OMD是GCN4-pII。融合體的Protan部分(=PBD)在尺寸方面不同。在縮寫的蛋白質(zhì)融合體名稱中的字母P之后的數(shù)字表示Protan部分中的LysM結(jié)構(gòu)域的數(shù)目。L1-2:接頭序列。在縮寫的蛋白質(zhì)融合體名稱中的數(shù)字之后的L表示在最C-端LySM結(jié)構(gòu)域之后存在C-端接頭結(jié)構(gòu)域。LysMl-2:LysM (肽聚糖結(jié)合)結(jié)構(gòu)域。
[0082]圖片C和圖片D示出當(dāng)HA-Protan融合蛋白包含GCN4結(jié)構(gòu)域(OMD)時僅需要I個LysM結(jié)構(gòu)域用于有效的結(jié)合至BLP。在HEK293S (GNT1-)細(xì)胞中表達(dá)不含GCN4三聚化基序的三個不同HA-Protan融合蛋白變異體和一個包含GCN4基序的這種融合蛋白。對于源自HlM (圖片C)和源自X31 (圖片D)的HA蛋白質(zhì)，加倍地完成表達(dá)。通過將150 μ g(干重)的顆粒與過量的約30-45 μ g的融合蛋白溫育并且在溫育之后收集顆粒使得獲得的HA-Protan融合蛋白能夠結(jié)合至BLP。然后通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色[圖片I]分析 50 μ g 的每個 BLP 級分(BLP-fraction)。使用 MAb PA90 ( a -Protan)通過 SDS-PAGE 和蛋白質(zhì)印跡法[圖片II]通過分析來自細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基的樣品來檢查對照表達(dá)。所有融合蛋白都很好的表達(dá)。這些實驗共同顯示與OMD結(jié)合的單個LysM結(jié)構(gòu)域足以用于將蛋白質(zhì)有效結(jié)合至BLP，然而當(dāng)不存在OMD時需要兩個LysM結(jié)構(gòu)域用于有效的結(jié)合。圖片E:包含OMD的HA-Protan融合蛋白主要是低聚的。通過藍(lán)色非變性凝膠電泳隨后使用Protan抗體α-ΡΑ90的蛋白質(zhì)印跡分析不同的HA-GCM-Protan變異體。在將每個變異體施加至凝膠之前，將等量的清澈的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液煮沸持續(xù)10秒(10’ ’)、30秒(30’ ’)或3分鐘(3’)。分析的HA-Protan融合蛋白是HlM病毒衍生的撤-?1二和撤-?11^蛋白質(zhì)。在非常短暫的加熱(10秒)之后所有這些HA蛋白質(zhì)以相當(dāng)于三聚體的遷移率遷移，但是在更長的煮沸時間之后離解成HA的二聚的和單體形式。即使在延長的煮沸樣品之后撤41二和HA-PILh三聚體依然是可檢測的。所有等價的撤^^變異體以單體的遷移率遷移。此外，大多數(shù)這些ΗΑ-Ρ$蛋白質(zhì)表現(xiàn)出變化的、但是有時是強(qiáng)烈的趨勢以形成高分子量的聚集物(由星號標(biāo)識)，很可能是這些非天然蛋白質(zhì)的差的折疊和穩(wěn)定性的結(jié)果。
[0083]圖2.撤421^和異體和這些變異體與BLP的結(jié)合用于產(chǎn)生疫苗的示意圖。圖片A:生產(chǎn)撤421^和HA-PILh的主要產(chǎn)生三聚變異體但是也產(chǎn)生少量的不需要的、不恰當(dāng)折疊的、單體變異體。圖片B:使單體的和三聚的HA-P2Lh變異體結(jié)合至BLP，接下來是隨后的洗滌，產(chǎn)生具有結(jié)合的天然低聚的HA和不需要的不恰當(dāng)折疊的單體HA的BLP疫苗。將單體的與三聚的HA-PILh變異體結(jié)合至BLP，接下來是隨后的洗滌，產(chǎn)生具有結(jié)合的天然低聚的HA并且不含有不需要的不恰當(dāng)折疊的單體HA的BLP疫苗。因此，使用與OMD如GCN4結(jié)合的單個LysM結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)結(jié)合至BLP使得能夠選擇性結(jié)合所期望的天然生物學(xué)活性的低聚蛋白質(zhì)。
[0084]圖3.具有和不具有OMD的HA-Protan變異體對BLP結(jié)合的量。使增加量的(O -4μ g)HA-PlLH(Hl-GCN4-PlL)和 HA-P2L#(H1-P2L)能夠結(jié)合至固定量(0.3mg)的 BLP。結(jié)合之后測定結(jié)合的HA的量。重復(fù)進(jìn)行該實驗。明顯地，在與用于HA-P2L$的相似的濃度下，更多的HA-PILh結(jié)合至BLP。因此，使用與OMD如GCN4結(jié)合的單個LysM結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)結(jié)合至BLP比使用兩個LysM結(jié)構(gòu)域而沒有OMD更有效。
[0085]圖4.在凝集測試中低聚的HA (與單體HA對比)對BLP的結(jié)合是生物學(xué)功能的。A.血細(xì)胞凝集分析的示意圖。圖片1:與紅血細(xì)胞(RBC ；ery)混合的流感病毒能夠結(jié)合至RBC并且能夠形成引起凝集作用的網(wǎng)絡(luò)。圖片2:連接至BLP并且與RBC混合的HA三聚體(BLP-HAh)能夠結(jié)合至RBC，并且能夠形成引起凝集作用的網(wǎng)絡(luò)。圖片3:連接至BLP并且與RBC混合的HA單體(BLP-HA’不能夠結(jié)合至RBC，并且不能夠形成引起凝集作用的網(wǎng)絡(luò)；RBC在微孔板的孔中的沉積，其可見為圓點(diǎn)。圖片4:與RBC混合的BLP不能夠結(jié)合至RBC并且不引起凝集作用。圖片5:HA三聚體(HAh)結(jié)合至RBC，但是不能夠形成引起凝集作用的網(wǎng)絡(luò)。
[0086]B.使用火雞RBC的血細(xì)胞凝集分析。在融合體中使用的HA是HIM。孔道1:陰性對照，RBC+緩沖液?？椎?:RBC+BLP0孔道3:RBC+BLP與4 μ g結(jié)合的HA-PlL氣孔道4:RBC+BLP 與 2 μ g 結(jié)合的 HA_P1Lh?？椎?5:RBC+BLP 與 I μ g 結(jié)合的 HA_P1Lh?？椎?6:RBC+BLP 與 0.5 μ g 結(jié)合的 HA-P1Lh?？椎?7:RBC+4 μ g HA-PILh0 孔道 8:RBC+BLP 與 4 μ g結(jié)合的HA-P2L'孔道9:RBC+BLP與2 μ g結(jié)合的HA-P2L'孔道10:RBC+BLP與I μ g結(jié)合的 HA-P2L' 孔道 11:RBC+BLP 與(λ 5μ g 結(jié)合的 HA-P2L' 孔道 12:RBC+4yg HA-P2L'該實驗清楚地示出僅低聚的HA結(jié)合至BLP (BLP-HAh)是生物學(xué)功能的，而單體HA結(jié)合至BLP (BLP-HAh)不是生物學(xué)功能的。
[0087]圖5.HA-PILh結(jié)合至BLP的穩(wěn)定性。圖片A:結(jié)合至BLP的HA-PlL三(比率是3.3 μ g HA-PILh結(jié)合至Img BLP)被等分并且在2_8°C下保存。在配制之后在T=0、3、6和9個月時，檢測了一個等分用于分析結(jié)合至BLP的HA-PILh的量(將在T=O時測量的量設(shè)為100%);并且圖片B:在凝集測試中的生物學(xué)活性。AU ;凝集單位。該實驗清楚地顯示在2-8°C下在PBS中上達(dá)至至少9個月的儲存中HA-PILh結(jié)合至BLP是完全穩(wěn)定的并且是生物學(xué)功能的。
[0088]圖6.以μ g/ml為單位的抗HIM IgG抗體的平均量(圖片A);存在于血清中的HI效價(圖片B);以及存在于小鼠的鼻腔洗滌物中的S-1gA (圖片C)，使用以下試劑鼻內(nèi)免疫該小鼠三次:(i)可溶性三聚的HA (HAh) [0.33 μ g/劑量];(ii)與BLP混合的可溶性三聚的 HA (BLP+HA三)[0.33μ 8通三和 0.1mg BLP/劑量];(iii)結(jié)合至 BLP (BLP-HAh)的三聚的 HA (HA-PILh) [0.33 μ g0.1mg BLP/劑量]，以及(iv)結(jié)合至 BLP (BLP-HA’的單體HA (HA-PlLi^) [0.33 μ g HA二和0.1mg BLP/劑量]。清楚地，與可溶性三聚的HA(HAh)以及與BLP混合的可溶性三聚的HA (BLP+HAh)相比，BLP-HAh顆粒制劑是最具免疫原性的制劑。關(guān)于功能性抗體分析(HI效價；圖片B和S-1gA ;圖片C)，低聚的BLP-HA二顆粒制劑引起的比 單體BLP-HA$顆粒制劑更高的應(yīng)答顯示生物學(xué)功能的撤二是最具免疫原性的構(gòu)象。
[0089]圖7.具有多個Protan部分的含GCN4 (OMD)的融合蛋白HAh-Protan的表達(dá)和BLP結(jié)合特性。圖片A:使用各自的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并且溫育，其后收集培養(yǎng)物上清液并且裂解細(xì)胞。使用針對Protan部分(α -ΡΑ90)的抗體通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析每個樣品。不出產(chǎn)生一系列包含GCN4的HA蛋白(稱為HA-P二以顯不它們的三聚化潛力)的Η3 (Χ31)和Hl (HIM)亞型。所有的撤^^變異體被容易地表達(dá)并且被有效地分泌到細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基中，如由它們在細(xì)胞裂解物中有限的存在來判斷的。X3IHA-P Ξ融合蛋白的產(chǎn)生稍微低于HIM HA-P二融合蛋白的豐度(abundant)，而通常融合至PlL和P2L的HA蛋白質(zhì)似乎顯示了在細(xì)胞中具有最有限的保留的最高的產(chǎn)生水平。圖片B:在過量的融合蛋白的存在下通過溫育等量的顆粒來比較不同的含GCN4的HA-Protan融合蛋白對BLP的結(jié)合并且通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)合BLP的蛋白質(zhì)的量。發(fā)現(xiàn)所有的HA-PΞ變異體均結(jié)合但是具有顯著不同的效率。對于HlM和Χ31病毒衍生的HA蛋白質(zhì)兩者，變異體擬-?1氣擬-?11^和擬421^最有效地結(jié)合至BLP。對于HlMl和乂31擬42二蛋白質(zhì)觀察到對BLP的低結(jié)合效率。該結(jié)果顯示與OMD結(jié)合的I個LysM結(jié)構(gòu)域足以使得能夠優(yōu)異地結(jié)合至BLP。圖片C:使用抗HA (抗HIM)溫育的蛋白質(zhì)印跡。通道1:標(biāo)記(marker)蛋白，在邊緣中以kDa顯示大小。通道2:BLP顆粒，30μ g。通道3:ΗΑΞ，其攜帶Str印標(biāo)簽(ΗΑ-Strep二)而不是Protan延伸部(40ng)。通道4:從使用HA-Strep二(840ng)的溫育液中回收BLP (30yg)。通道5:HA-PlLH，44ng。通道6:從使用HA-PILh (880ng)的溫育液中回收BLP (30yg)。這些實驗一起顯示這些融合蛋白被很好地表達(dá)并由哺乳動物細(xì)胞分泌并且在C-端處的細(xì)菌Protan結(jié)構(gòu)域的存在不干擾HA-低聚體融合蛋白的有效分泌(圖片A)。此外，該實驗清楚地顯示I個LysM結(jié)構(gòu)域足以獲得對BLP的優(yōu)異結(jié)合并且盡管需要GCN4結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)單個LysM結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，但其不結(jié)合至BLP (圖片C)。
[0090] 圖8.Protan-NA的示意圖(A)、表達(dá)(B)、多聚化狀態(tài)(C)和結(jié)合至BLP (D)。圖片A:能夠形成四聚體(縮寫為P-NA0)的線性Protan-OMD-NA和以單體(縮寫為P-NA’融合體存在的Protan-NA的示意圖。在NA構(gòu)建體中OMD是GCN4-pLI。融合體的Protan部分(=PBD)包含具有或不具有接頭的I個LysM結(jié)構(gòu)域。在縮寫的蛋白質(zhì)融合名稱中的數(shù)字之后的L表示在LysM結(jié)構(gòu)域后存在C-端接頭結(jié)構(gòu)域。圖片B:示出具有或不具有GCN4四聚化基序的Protan-NA融合蛋白的表達(dá)。使用各自的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并且溫育，在溫育之后收集培養(yǎng)物上清液并且裂解細(xì)胞。使用針對Protan部分的抗體(α -ΡΑ90)通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析每個樣品。與HA-Protan蛋白質(zhì)相似,發(fā)現(xiàn)所有的Protan-NA變異體均被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中；對于包含GCN4四聚化基序的Protan-NA變異體觀察到了少量的細(xì)胞內(nèi)的保留。圖片C:示出包含OMD的NA-Protan融合蛋白是低聚的。在此比較了有(+ )與沒有(_) GCN4的PlL-NA變異體的低聚狀態(tài)。通過藍(lán)色非變性凝膠電泳分析了這些PlL-NA變異體的樣品。大多數(shù)PlL-NAi^蛋白質(zhì)以單體遷移而它們中的部分以二聚體遷移。然而，沒有檢測到四聚體。相反，PlL-NA0蛋白質(zhì)依照四聚體遷移而沒有檢測到單體或二聚體。這些實驗共同顯示NA融合蛋白被良好的表達(dá)并由哺乳動物細(xì)胞分泌，并且在N-端處存在的細(xì)菌Protan結(jié)構(gòu)域不干擾NA-低聚體融合蛋白(針對在C-端處具有Protan的HA低聚體融合蛋白同樣觀察到)的有效分泌。此外，GCN4基序誘導(dǎo)并穩(wěn)定NA融合蛋白中的低聚狀態(tài)，如對于HA融合蛋白所觀察到的。圖片D:分析了不同的NA-Protan融合蛋白的對BLP的結(jié)合特性。通過將150 μ g (干重)的顆粒與過量的約30-45 μ g的融合蛋白溫育，之后收集該顆粒(用B標(biāo)識的通道)，使得具有或不具有LysM結(jié)構(gòu)域的接頭C-端和具有與不具有OMD (GCN4)的Protan Pl變異體能夠結(jié)合至BLP。用S標(biāo)識的通道顯示在結(jié)合之后NA保留在培養(yǎng)基中。BLP與緩沖液的模擬溫育作為陰性對照。然后使用兔抗PA90血清(抗Protan)通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析5 μ g的BLP級分。對于缺少GCN4四聚化基序的PlL-NAi^P Pl-NA$融合蛋白沒有獲得結(jié)合或獲得弱的結(jié)合，如對于HA-Pl $構(gòu)建體所觀察到的。然而，使用PlL-NA0融合蛋白觀察到了明顯有效的BLP結(jié)合。相反，在LysM結(jié)構(gòu)域與OMD結(jié)構(gòu)域之間缺少接頭的Pl-NA0構(gòu)建體，顯示弱的結(jié)合。明顯地，對于有效結(jié)合低聚體Protan形式單個LysM基序已經(jīng)足夠,條件是在LysM結(jié)構(gòu)域與OMD之間存在接頭結(jié)構(gòu)域。
[0091]圖9.NA變異體的神經(jīng)氨酸酶活性。使用胎球蛋白類神經(jīng)氨酸酶活性分析檢測了不具有和具有GCN4的神經(jīng)氨酸酶變異體Pl和PlL兩者的神經(jīng)氨酸酶活性。使用100 μ I的5 μ g/ml胎球蛋白在4?下過夜涂覆Nunc MaxiSorp96孔板。連續(xù)稀釋包含相同量的NA(如通過蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn))的一百微升的細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基樣品并且添加至胎球蛋白涂覆的孔中。在37°C下在溫育Ih之后，洗滌該板并且隨后通過添加過氧化物酶標(biāo)記的花生凝集素(2.5μ g/ml ;Sigma)測量神經(jīng)氨酸酶活性，在室溫下溫育lh，洗滌該板，并且將100 μ I的過氧化物酶底物(TMB)添加至每個孔中。在5分鐘之后，通過添加100 μ I的0.3Μ磷酸來終止反應(yīng)，并且使用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)儀(EL-808[BioTEK])在450nm下測量OD值。如通過曲線圖顯示的，包含GCN4四聚化基序的Protan-NA0蛋白質(zhì)顯示出濃度依賴性唾液酸酶活性。對于缺少GCN4四聚化基序的Protan-NA融合蛋白沒有發(fā)現(xiàn)唾液酸酶活性。這些結(jié)果明顯地證明Protan-NA的低聚形式是酶學(xué)功能的。
[0092]圖10.各種F融合蛋白的示意圖(A和B)和表達(dá)以及對BLP的結(jié)合(C)。能夠形成三聚體的線性F-OMD-Protan (縮寫為F-Ph)(圖片A)與作為單體存在的F-Protan (縮寫為F-P’(圖片B)的示意圖。該OMD是F構(gòu)建體中的GCM-pII序列。融合體的Protan部分(=PBD)在尺寸方面是不同的。在縮寫的蛋白質(zhì)融合體名稱中的字母P之后的數(shù)字表示Protan部分中的LysM結(jié)構(gòu)域的數(shù)目。L1-3:接頭序列。在縮寫的蛋白質(zhì)融合體名稱中的數(shù)字之后的L表示在最C-端LysM結(jié)構(gòu)域之后存在C-端接頭結(jié)構(gòu)域。LysMl_2 =LysM (肽聚糖結(jié)合)結(jié)構(gòu)域。在圖片C中，在過量的融合蛋白的存在下通過溫育等量的顆粒來比較具有和不具有GCN4的不同的F-Protan融合蛋白對BLP的結(jié)合并且通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析BLP結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。發(fā)現(xiàn)具有一個LysM和GCN4結(jié)構(gòu)域的？^^變異體和具有兩個LysM結(jié)構(gòu)域的F-Pi^變異體有效地結(jié)合至BLP。對于具有一個LysM結(jié)構(gòu)域但缺少GCN4的F-P$變異體觀察到對BLP的低效率結(jié)合。該結(jié)果表示與OMD結(jié)合的I個LysM結(jié)構(gòu)域足以能夠優(yōu)異地將F蛋白質(zhì)結(jié)合至BLP，對于HA和NA觀察到了相似的結(jié)果。為了研究Protan-F融合蛋白的表達(dá)，使用各自的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并且溫育，在溫育之后收集培養(yǎng)物上清液并且裂解細(xì)胞。使用針對Protan部分的抗體(α -ΡΑ90)通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析每個樣品。與HA-Protan和Protan-NA蛋白質(zhì)類似,發(fā)現(xiàn)所有的F-Protan變異體被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中。
[0093]圖11.在鼻內(nèi)給予之后結(jié)合至BLP的三聚的F蛋白(BLP-Fh)在小鼠中誘導(dǎo)Synagis?樣抗體應(yīng)答。圖片A ;Synagis?競爭ELISA的示意圖。使用F蛋白涂覆微孔板的孔。使用接種后小鼠的兩倍連續(xù)稀釋的血清溫育這些孔。在溫育之后通過洗滌去除血清稀釋液并且隨后使用非飽和量的Synagis?溫育該孔。在溫育之后，將未結(jié)合的Synagis?
轉(zhuǎn)移至第二板并且，在結(jié)合之后，使用第二抗體檢測。檢測的結(jié)合Synagis?的量是接種的小鼠的血清中的Synagis?樣抗體的量的測量結(jié)果。圖片B:競爭ELISA的結(jié)果，其清楚地顯示在使用BLP-F二鼻內(nèi)接種的小鼠的血清中得到Synagis?樣抗體。
[0094]圖12.在使用BLP-Fh鼻內(nèi)接種棉鼠之后的療效(圖片A)、血清學(xué)檢測(圖片B)和安全性(圖片C)。使用以下各項使用14天的間隔鼻內(nèi)免疫棉鼠三次:(i)可溶性F (F單)[4yg/劑量]jP(ii)結(jié)合至 BLP (BLP-Fh)的三聚的 F (F-PILh) [4 μ gHA，P 0.5mgBLP/劑量]，以及(iii) PBS作為陰性對照。將使用鋁鹽絡(luò)合的肌內(nèi)福爾馬林滅活的RSV(F1-RSV)作為增強(qiáng)的疾病對照給予。在最后的接種之后的第14天使用RSV/a/Long激發(fā)(challenged) (1.η.)所有動物。在第0、28天和42天時對動物采血以用于病毒中和效價(VN)0在激發(fā)之后的第5天處死所有動物，并且收集整個肺臟以及將肺臟分成兩部分用于病毒滴定和病理組織學(xué)以評價增強(qiáng)的疾病特性。圖片A顯示與PBS接種相比，BLP-F二接種之后病毒效價方面的顯著減少。在第28天和第42天時低病毒效價與最高水平的VN效價相符合(圖片B)。明顯地，與可溶性F (F’和PBS相比BLP-F三顆粒制劑是最具免疫原性和保護(hù)性的制劑。圖片C:針對間質(zhì)性肺炎和肺泡炎評價接種的棉鼠的肺臟的組織病理學(xué)切片。與F1-RSV接種和隨后的RSV激發(fā)之后所觀察的評分相比，BLP-Fh接種隨后是RSV感染僅導(dǎo)致低的肺臟組織病理學(xué)評分。明顯地，BLP-F二顆粒制劑在棉鼠中不誘導(dǎo)增強(qiáng)的疾病 。
【具體實施方式】
[0095]材料和方法
[0096]1.1基因和表達(dá)載體
[0097]合成編碼流感病毒A/Aichi/2/68H3N2(X31)與 A/California/04/2009H1N1(H1M)的血細(xì)胞凝集素(HA)胞外結(jié)構(gòu)域(a.a.17-522)、A/Mallard/Netherlands/2/2005H5N2(Taxonomy ID:571469)的神經(jīng)氨酸酶(NA)頭部結(jié)構(gòu)域(a.a.75-469)、和呼吸道合胞病毒(RSV) A亞型的融合蛋白(F)胞外結(jié)構(gòu)域，分離株GA7SA99VR360 (a.a.26-513)的人類密碼子優(yōu)化的基因(GenScript)并且將它們克隆到p⑶5載體中——該載體源自表達(dá)質(zhì)粒Sl-1g(Li et al., Nature426 [2003], 450-454)-用于在 HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)。
[0098]由編碼N-端⑶5信號序列和C-端人工GCN4三聚化序列(GCN4-pII) (Harburyet al.，Science262[1993], 1401-1407)的序列側(cè)接HA基因、隨后是四個Protan結(jié)構(gòu)域變異體之一(圖1A)。這些構(gòu)建體中的三個證明了很好的表達(dá)和對BLP的結(jié)合并且對于這些變異體也構(gòu)建了缺少三聚化序列的結(jié)構(gòu)(圖1B)。由編碼N-端⑶5信號序列隨后是Pl或PlL Protan結(jié)構(gòu)域和人工GCN4四聚化序列(GCN4-pLI) (Harbury etal.，Science262 [1993]，1401-1407)的序列側(cè)接NA基因(圖8A)?；谶@些構(gòu)建體，產(chǎn)生了缺少人工GCN4四聚化序列的兩個另外的構(gòu)建體(圖8A)。由編碼N-端CD5信號序列和C-端人工 GCN4 三聚化序列(GCM-pII) (Harbury et al.，Science262 [1993]，1401-1407)隨后是一個Protan結(jié)構(gòu)域(圖10A)的序列側(cè)接F基因。也構(gòu)建了缺少三聚化序列隨后一個或兩個Protan結(jié)構(gòu)域的兩個構(gòu)建體(圖10B)。
[0099]1.2蛋白質(zhì)表達(dá)并結(jié)合至BLP
[0100]使用聚乙烯亞胺(PEI)以1:5的比率(μ gDNA: μ gPEI)使用包含HA、F或NA編碼序列的P⑶5表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后6h時，由293SFM II表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)替代轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,補(bǔ)充碳酸氫鈉(3.7g/升)、葡萄糖(2.0g/升)、PrimatoneRL-UF (3.0g/ 升,Kerry Bio-Science,Zwijndrecht,荷蘭)、青霉素(100 單位/ml)、鏈霉素(100 μ g/ml)、glutaMAX (Gibco)和1.5%DMS0。在轉(zhuǎn)染后5-6天收集組織培養(yǎng)物上清液。使用Protan (LysM)特異性多克隆兔抗血清a-PA90作為第一抗體、與辣根過氧化物酶連接的豬_ α _兔(Dako)作為第二抗體并且使用ECL? (Amersham?, GE Healthcare)檢測,通過蛋白質(zhì)印跡法證實HA-Protan和Protan-NA蛋白表達(dá)。
[0101]通過將0.15mg BLP (干重)添加至過量的澄清的HEK293T表達(dá)培養(yǎng)物上清液將分泌的HA-Protan、F-Protan或Protan-NA蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合至BLP并且在室溫下溫育30分鐘同時溫和地混合。然后通過低速離心法收集結(jié)合蛋白質(zhì)的BLP并且使用DPBS洗滌沉淀三次。最后在等于添加的BLP的原始體積的DPBS的體積中重懸沉淀。使用α -ΡΑ90抗血清通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法評估HA、F和NA融合蛋白對BLP的結(jié)合，而使用純化的BSA作為對照蛋白通過SDS-PAGE和隨后的考馬斯亮藍(lán)染色測定BLP結(jié)合蛋白質(zhì)的量。
[0102]通過在藍(lán)色非變性凝膠中的電泳和隨后使用α -ΡΑ90的蛋白質(zhì)印跡法測定融合蛋白的低聚狀態(tài)。
[0103]1.3重組HA-Protan和Protan-NA融合蛋白的生物學(xué)特性。
[0104]通過使用雞紅細(xì)胞或火雞紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集分析評估BLP結(jié)合HA的生物學(xué)活性。僅有功能性三聚的HA蛋白質(zhì)結(jié)合至它們的表面，BLP將介導(dǎo)交聯(lián)的紅細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)(‘網(wǎng)’)的形成，該方法稱為凝集。單獨(dú)的三聚的HA或BLP將不交聯(lián)紅細(xì)胞。在該試驗中，將25 μ I的可溶性HA-Protan、BLP結(jié)合的HA或BLP連續(xù)稀釋在96孔中(V-形的CellStarO，Greiner Bio-One)的25 μ I的DPBS+1%BSA中。從最后的稀釋液中棄去25ul以便在所有的孔中獲得相同的體積。向所有的孔中添加等體積的0.5%雞紅細(xì)胞，溫和地混合該懸浮液并且在4°C下溫育45分鐘以使得能夠交聯(lián)和/或沉淀紅細(xì)胞。 [0105]使用胎球蛋白固相分析評估可溶性Protan-NA融合蛋白的功能(Lambre etal.Clin.Chim.Acta[1991] 198:183-193)。使用 100 μ I 的 I μ g/ml 胎球蛋白在 4°C 下過夜涂覆Nunc MaxiSorp96孔板。將包含相似量的Protan-NA融合蛋白(基于通過蛋白質(zhì)印跡法測定的Protan的量)的澄清的HEK293T表達(dá)培養(yǎng)物上清液連續(xù)稀釋在PBS-Ca/Mg [0.901mM/0.493mM]中，之后將100 μ I的混合物添加至胎球蛋白涂覆的孔中。在37°C下在溫育Ih之后，洗滌該板并且通過添加過氧化物酶標(biāo)記的花生凝集素(2.5 μ g/ml ；Sigma)、在室溫下溫育lh、洗滌該板、并且將100 μ I的過氧化物酶底物(TMB)添加至每個孔隨后測量神經(jīng)氨酸酶活性。在5分鐘之后，通過添加100 μ I的0.3Μ磷酸來終止反應(yīng)，并且使用 ELISA 儀(EL-808[BioTEK])在 450nm 下測量 OD 值。
[0106]1.4使用低聚體蛋白質(zhì)制劑免疫小鼠。
[0107]使用以下4種不同的HA制劑(HIM)以10天的間隔鼻內(nèi)三次免疫6_8周齡的十只雌性Balb/c小鼠四組:(i)可溶性三聚的HA (HAh) [I Ug/劑量];(ii)與BLP混合的可溶性三聚的 HA (BLP+HAh) [lug 擬三和0.311^ BLP/劑量];(iii)三聚的 HA (HA-PILh)結(jié)合至BLP (BLP-HAh) [Iyg擬三和0.3mg BLP/劑量]，以及(iv)單體HA (HA-P2L單)結(jié)合至BLP (BLP-HA’ [lug HAi^POJmg BLP/劑量]。在第3次免疫之后的十四天，采集血清和鼻腔洗滌物用于ELISA分析以測定抗HIM IgG (血清樣品)和抗HIM S-1gA (鼻腔洗滌物)應(yīng)答。為了該目的，使用200ng HA (HIM)/孔來涂覆孔板。將連續(xù)稀釋的血清溫育90分鐘并且使用抗小鼠IgG和IgA-HRP結(jié)合物(Southern Biotech)分別檢測HlM特異性的IgG和IgA的結(jié)合。對于校準(zhǔn)曲線將小鼠IgG稀釋成三份(第一孔0.5 μ g/ml)(小鼠IgGl，Sigma)(僅僅針對血清IgG)。在染色之后，在ELISA微孔板讀數(shù)儀中測定492nm下的吸光度。使用校準(zhǔn)曲線(通過4-參數(shù)擬合(4-parameterfit)測定曲線的參數(shù))以計算血清中的特異的抗HA IgG抗體(以μ g/ml表示)。為了計算鼻腔洗漆物中的特異的抗HA IgA抗體(以效價表示，其是計算的樣品稀釋液的倒數(shù)，在背景校正之后其對應(yīng)于A492=0.3)，通過4-參數(shù)擬合測定了曲線的參數(shù)。使用在34天時收集的每組的(每個個體動物)血清測定HA-特異的血細(xì)胞凝集抑制反應(yīng)的滴定度(HI)。在56°C下持續(xù)30分鐘滅活血清樣品并且隨后在室溫下使用高嶺土過夜溫育以降低特異性血細(xì)胞凝集素抑制。使用多通道移液器一式兩份以連續(xù)的兩倍的稀釋液將高嶺土處理的樣品應(yīng)用到孔板上并且與合適的同源的滅活的流感病毒(A/California/07/2009 (H1N1)，4HAU;NIBSC，UK)混合并且在室溫下溫育40分鐘。隨后，將1%荷蘭豬紅細(xì)胞溶液添加至每個孔。允許血細(xì)胞凝集素持續(xù)兩個小時并且評價觀察到血細(xì)胞凝集的最高的稀釋。[0108]使用以下2種不同的BLP-Fh制劑以10天的間隔鼻內(nèi)三次免疫6_8周齡的十只雌性Balb/c小鼠兩組:(i)結(jié)合至BLP的F (BLP-Flg) [0.6 μ g卩三和0.5mg BLP/劑量]jP(ii)結(jié)合至BLP的F[2.2μ g 0.5mg BLP/劑量]。在第三次免疫之后十四天，采集血清樣品并且集中每組用于Synagis?競爭ELISA分析以測定誘導(dǎo)的Synagis?樣抗體的水平。對于該目的，使用IOOng F/孔來涂覆孔板。將血清的連續(xù)稀釋液(包括預(yù)免疫血清)溫育持續(xù)90分鐘，隨后是洗滌。然后，以亞飽和量的Synagis?溫育
該孔板。在溫育之后，將未結(jié)合的Synagis?轉(zhuǎn)移至第二 F涂覆的孔板并且，在結(jié)合之后，使
用第二抗人類IgG抗體檢測。在492nm下測量顯色。
[0109]1.5使用低聚的F-Protan免疫棉鼠并且隨后使用RSV激發(fā)。
[0110]使用以下4種不同的制劑以14天的間隔三次免疫5只年輕的成年棉鼠(6-8周齡)四組:(i)PBS (陰性對照);(ii)可溶性單體F (F’[4yg/劑量];(iii)三聚的F (F-P1LΞ)結(jié)合至BLP (BLP-Fh) [4 μ g0.5mgBLP/劑量]，和(iv)在鋁鹽中配制的福爾馬林滅活的RSV疫苗(F1-RSV) [Lot#100 (1:125)]。組I至組3鼻內(nèi)接種并且組4肌內(nèi)接種。
[0111]在第0、28天和42天時采集血清用于病毒中和分析。對于該目的，在96孔板中連續(xù)稀釋熱滅活的血清。向每個孔添加25至50個噬斑形成單位(PFU)。在25-30°C下溫育該稀釋的孔板持續(xù)Ih以使得血清樣品和病毒能夠相互作用。然后將病毒血清混合物轉(zhuǎn)移至HEp-2細(xì)胞用于病毒滴定。與混合物一起溫育該細(xì)胞持續(xù)lh，隨后添加甲基纖維素覆蓋。在37°C下溫育該細(xì)胞4天,在溫育之后去除覆蓋(overlay)。添加結(jié)晶紫色素并且允許在25-30°C下固定2至4個小時。通過使用冷水漂洗來去除色素。然后在讀數(shù)之前允許該孔板完全的風(fēng)干。使用解剖顯微鏡計算每孔的噬斑形成單位(PFU)的數(shù)目。在42天時，使用100 μ L的RSV/A/Long以105pfu/動物激發(fā)每個動物。在激發(fā)后第5天處死動物并且收集整個肺臟以及將肺臟分成兩部分用于病毒滴定(左部分)和組織病理學(xué)(右部分)。對于間質(zhì)性肺炎和肺泡炎對組織病理學(xué)部分評分。
[0112]實施例1.HA-Protan、F-Protan 和 Protan-NA 融合蛋白的表汰
[0113]為了在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)可溶性HA-Protan、F-Protan和Protan-NA嵌合蛋白質(zhì)，將胞外結(jié)構(gòu)域編碼序列首先克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。在表達(dá)HA-Protan融合蛋白的P⑶5載體中，由信號肽編碼序列引導(dǎo)HA-胞外結(jié)構(gòu)域序列，以使得能夠有效分泌重組蛋白，并且隨后是編碼四種Protan結(jié)構(gòu)域變異體之一的序列和在HA與Protan結(jié)構(gòu)域變異體之間的人工GCN4四聚體基序(GCM-pII ;0MD)的序列(圖1A)。對于最有效表達(dá)和分泌的三個HA-Protan融合蛋白變異體(參見下文)，我們也構(gòu)建并表達(dá)了缺少GCN4三聚化序列的融合蛋白質(zhì)(0MD ;圖1B)。
[0114]在表達(dá)Protan-NA嵌合蛋白的P⑶5載體中，由信號肽編碼序列引導(dǎo)NA-頭部結(jié)構(gòu)域序列，以使得能夠有效分泌重組蛋白，并且隨后是編碼Protan結(jié)構(gòu)域變異體(一個LysM結(jié)構(gòu)域)的序列，該P(yáng)rotan結(jié)構(gòu)域變異亦或具有亦或不具有置于Protan結(jié)構(gòu)域與NA序列之間的人工GCN4四聚體基序(GCN4-pLI ；OMD)(圖8A)。
[0115]在表達(dá)F-Protan融合蛋白的pCD5載體中，由信號肽編碼序列引導(dǎo)F-胞外結(jié)構(gòu)域序列，以使得能夠有效分泌重組蛋白，并且隨后是編碼一個LysM結(jié)構(gòu)域變異體和在F與LysM結(jié)構(gòu)域之間的人工GCN4四聚體基序(GCN4-pII ;0MD)的序列(圖10A)。我們也構(gòu)建并表達(dá)了缺少GCN4三聚化序列(OMD)的兩個F-Protan融合蛋白，它們分別具有一個和兩個LysM結(jié)構(gòu)域(圖1OB)。
[0116]通過將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中分別實現(xiàn)了具有或不具有人工三聚的、三聚的或四聚的GCN4多聚化基序(OMD)的HA-Protan、F-Protan和Protan-NA融合蛋白的表達(dá)。通過將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液經(jīng)受凝膠電泳隨后使用針對Protan部分的抗體(α -ΡΑ90)通過蛋白質(zhì)印跡法驗證HA-Protan、F-Protan和Protan-NA蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌。將包含GCN4結(jié)構(gòu)域(OMD)的HA-Protan融合蛋白和F-Protan融合蛋白縮寫為HA_P，P F_PH，分別表示這些融合蛋白的三聚化潛力。將缺少GCN4結(jié)構(gòu)域(OMD)的HA-Protan和F-Protan融合體縮寫為HA-Pi^PF-Pl，分別表示蛋白質(zhì)的單體狀態(tài)。同樣地，將Protan-NA融合體縮寫為:對于包含GCN4結(jié)構(gòu)域(OMD)的變異體縮寫為P-NA0表示融合蛋白的四聚化潛力以及對于缺少GCN4結(jié)構(gòu)域(OMD)的變異體縮寫為P-NA$表示該蛋白質(zhì)的單體狀態(tài)。如在對于HA-PΞ變異體的圖7Α中示出的，Χ31和HlM流感病毒兩者衍生的HA的所有HA-P變異體被容易地表達(dá)并且有效地分泌到細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基中，在細(xì)胞中僅具有最少保留的融合蛋白。與HlM的HA-Ph蛋白質(zhì)相比較，產(chǎn)生的乂31撤4二融合蛋白是稍微較低豐度的。雖然在表達(dá)水平方面可以發(fā)生HA種屬差異，一般的似乎是分別與Pl和Ρ2變異體相比較，融合至PlL和P2L的HA顯示了最高的生產(chǎn)水平，融合蛋白在細(xì)胞中具有最有限的保留。與HA-Protan蛋白質(zhì)類似，發(fā)現(xiàn)所有的Protan-NA和F-Protan變異體被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中(圖8Β和圖10C)。對于包含GCN4 四聚化基序的Protan-NA變異體僅觀察到一些有限的細(xì)胞內(nèi)的保留(圖8Β)。
[0117]明顯地，在細(xì)菌的Protan結(jié)構(gòu)域變異體的N-端或C-端上的存在不干擾由哺乳動物表達(dá)細(xì)胞有效分泌HA低聚的融合蛋白和NA低聚的融合蛋白。
[0118]實施例2.HA-GCN-Protan、F-GCN-Protan 和 Protan-GCN-NA 融合蛋白對 BLP 的結(jié)
合
[0119]在過量的各種Protan融合蛋白的存在下，通過比較對BLP的結(jié)合測定了各種HA-Protan> F-Protan和Protan-NA融合蛋白對BLP的結(jié)合特性。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析證明所有撤^^變異體的結(jié)合。GCN4結(jié)構(gòu)域強(qiáng)烈地增強(qiáng)單個LysM結(jié)構(gòu)域(IL)構(gòu)建體的結(jié)合性。在使用幾個結(jié)合至BLP的HA-P構(gòu)建體的實驗中證明了結(jié)合性。圖1C和圖1D示出以一式兩份測試的缺少OMD GCN4的三個HA-Protan變異體:Protan變異體P2L單、Protan變異體PlL單和Protan變異體Pl單與包含GCN4的具有Protan變異體？比三的HA-Protan融合蛋白相比較。當(dāng)在缺少GCN4結(jié)構(gòu)域的單體構(gòu)建體中延伸部僅包含一個LysM結(jié)構(gòu)域(PlLi^PPll)時，考馬斯染色的結(jié)果(圖片I) 一致地證明了弱的(HIM)或幾乎沒有(X31)結(jié)合。正如所期待的當(dāng)單體融合蛋白具有2個LysM結(jié)構(gòu)域(P2L’時發(fā)生了更有效的結(jié)合。相反，在HA-Protan融合蛋白具有GCN4的情況下，使用I個LysM結(jié)構(gòu)域(PILh)已經(jīng)實現(xiàn)了有效的結(jié)合。明顯地，不同于單體的HA-PiOtan融合蛋白，對于有效結(jié)合三聚的HA-Protan形式，單個LysM基序已經(jīng)足夠。[0120]在另一個實驗中，將與OMD結(jié)合的具有單個LysM結(jié)構(gòu)域的HA構(gòu)建體(HA-GCN4-P1L或HA-PILh)的結(jié)合效率與具有兩個LysM結(jié)構(gòu)域的單體的HA結(jié)構(gòu)相比較(圖3)。對于該目的，使遞升量(O - 4μ g)的HA-PIL二和HA-P2L$(兩者示出對BLP的有效結(jié)合(參見圖1C/D))能夠結(jié)合至固定量(0.3mg)的BLP。在與用于HA-P2L$相似的濃度下，更多的HA-PILh結(jié)合至BLP。因此，在低聚的構(gòu)建體中使用與OMD如GCN4結(jié)合的單個LysM結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)結(jié)合至BLP比在單體的構(gòu)建體中使用兩個LysM結(jié)構(gòu)域更有效。
[0121]在另一個實驗中(圖5A)在2-8°C下在PBS中長期儲存時評估HA-GCN4-P1L與BLP的結(jié)合的穩(wěn)定性。該數(shù)據(jù)示出與OMD結(jié)合的具有單個LysM結(jié)構(gòu)域的HA構(gòu)建體保持對BLP的穩(wěn)定結(jié)合持續(xù)至少9個月。這與Raha等(2005)和Moeini等(2010)的觀察形成強(qiáng)烈對t匕，他們的實驗示出在5天的存儲期內(nèi)對細(xì)菌使用單個LysM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合超過40%的損失。
[0122]不同Protan-NA和F-Protan融合蛋白的BLP結(jié)合佐證了使用HA構(gòu)建體的觀察即與OMD結(jié)合的單個LysM結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生有效的結(jié)合。在圖8D和圖1OC中，對于缺少GCN4多聚化基序的PlL-NA' Pl-NAi^P PlL-Fi^i合蛋白沒有獲得或獲得弱的結(jié)合，與對于HA-Pl $構(gòu)建體所觀察的一致。然而，使用F-PlL氣F-PZLi^P PlL-NA0融合蛋白觀察到明顯有效的BLP結(jié)合。
[0123]作為對照，我們示出OMD本身不能夠結(jié)合至BLP顆粒。對于該目的，比較了HA-Sti^pΞ(其攜帶Str印標(biāo)簽而不是Protan延伸部)和擬_11^對BLP顆粒的結(jié)合。圖7C示出其中HA-Sti^pΞ (通道3)與BLP混合蛋白質(zhì)印跡?；厥誃LP并且將其加載在凝膠上(通道4)。沒有發(fā)生HA-StRpI^結(jié)合。相反，對于HA-1Lh(比較通道5和6)觀察到有效的結(jié)合。
[0124]此外，對于HlM (圖1C)和對于Χ31病毒衍生的HA蛋白質(zhì)(圖7Β)兩者，變異體HA-Pl氣擬呼11^和擬呼21^最有效地結(jié)合至BLP。對于HlMl與乂31擬-?2二蛋白質(zhì)對BLP觀察到低結(jié)合效率。對于在LysM結(jié)構(gòu)域與OMD結(jié)構(gòu)域之間缺少接頭的Pl-NA0結(jié)構(gòu)也觀察到了，其示出了弱結(jié)合。明顯地，對于正確結(jié)合至BLP，LysM結(jié)構(gòu)域與OMD之間的連接結(jié)構(gòu)域是需要的。
[0125]在天然的情形中如在單體的AcmA中觀察到的，3個連續(xù)的分子內(nèi)LysM結(jié)構(gòu)域(順式)促進(jìn)有效的結(jié)合。將該數(shù)減少至I個LysM結(jié)構(gòu)域?qū)е陆Y(jié)合效率的強(qiáng)烈降低(Bosma等[2006])和低的穩(wěn)定性(Raha等[2005]和Moeini等[2010])?？傊?，我們的結(jié)果顯示當(dāng)將單個LysM結(jié)構(gòu)域置于其中每個均包含單個LysM結(jié)構(gòu)域的亞基被OMD多聚化的多聚的分子間構(gòu)象中時(LysM結(jié)構(gòu)域反式(in trans)相互作用),單個LysM結(jié)構(gòu)域可高效并穩(wěn)定的對BLP的結(jié)合。此外，存在于LysM結(jié)構(gòu)域與OMD之間的接頭結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步提高產(chǎn)量和結(jié)合效率。
[0126]使用單個LysM結(jié)構(gòu)域具有一些優(yōu)點(diǎn):(i)它降低結(jié)合結(jié)構(gòu)域的大小并且，(ii)它阻止了免疫原性差的單體融合蛋白的結(jié)合，當(dāng)使用2個以上LysM結(jié)構(gòu)域時仍可以結(jié)合(HA-PlLi^f結(jié)合至BLP相比于HA-P2L$結(jié)合至BLP，參見圖1C和圖1D，圖片I和II ;F_P1L$不結(jié)合至BLP相比于HA-P2L$結(jié)合至BLP，參見圖10C)。因此，單個LysM結(jié)構(gòu)域促進(jìn)選擇性結(jié)合融合蛋白的免疫原性最相關(guān)的(即多聚的)形式(參見圖2)。
[0127]實施例 3.HA-GCN-Protan 和 Protan-GCN-NA 融合蛋白的功倉R[0128]融合蛋白的低聚狀態(tài)
[0129]通過藍(lán)色非變性凝膠電泳分別分析了具有或不具有人工OMD(其是四聚的GCN4多聚化基序的三聚體)的HA-Protan和Protan-NA蛋白質(zhì)的低聚狀態(tài)。已經(jīng)顯示結(jié)合至BLP的HA-PiOtan融合蛋白的樣品，即源自HlM病毒的撤41二和白被煮沸持續(xù)10秒、30秒或3分鐘以便離解HA三聚體。當(dāng)短暫的加熱時(煮沸持續(xù)10秒)所有HA-Ph蛋白質(zhì)依照三聚體的遷移率在凝膠中遷移，而在延長的樣品煮沸之后這些HA三聚體離解成HA的二聚形式和單體形式(圖1E，左圖片)。即使在延長的樣品煮沸之后撤41二和HA-PILhS聚體仍然是可檢測的。相反，所有等價的撤^^變異體以單體的遷移率遷移。此外，大部分這些撤4$蛋白顯示出變化，但是有時強(qiáng)烈傾向于形成高分子量的聚集物(圖1E，右圖片，由星號顯示)，很可能是這些非天然蛋白質(zhì)的差的折疊和穩(wěn)定性的結(jié)果。[0130]通過藍(lán)色非變性凝膠電泳分析了具有和不具有GCN4的PlL-NA變異體的樣品(圖SC)。大多數(shù)P1L-NA(6蛋白以單體遷移，其部分以二聚體遷移，而沒有檢測四聚體。PlL-NA0蛋白依照四聚體遷移，沒有檢測到單體或二聚體。
[0131]這些數(shù)據(jù)清楚地證明需要存在OMD如GCN4基序以獲得具有天然的四級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的低聚蛋白質(zhì)。
[0132]融合蛋白的生物學(xué)活性
[0133]通過使用紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集分析可以評估存在于顆粒中的天然HA的生物學(xué)活性(圖4A)。使用該分析評價HA蛋白的唾液酸受體結(jié)合功能一僅由三聚的HA表現(xiàn)出的生物學(xué)性能。為了證明在描述的分析中的凝集作用是關(guān)鍵性地取決于存在HA低聚體結(jié)合至BLP而不是HA單體結(jié)合至BLP，將擬-?11^和擬-?21^ (均是HIM)結(jié)合至BLP。圖4B清楚地顯示HA-PILh結(jié)合至BLP能夠以濃度依賴性方式引起紅血細(xì)胞的凝集作用(通道3_6)，而HA-P2L$結(jié)合至BLP不能夠引起凝集作用(通道8_11)。這些結(jié)果清楚地顯示僅低聚形式的HA結(jié)合至BLP是生物學(xué)活性的。
[0134]通過以具有唾液酸化血液糖蛋白胎球蛋白作為底物的固相結(jié)合分析測量了可溶性單體的和低聚的Pl-NA與PlL-NA蛋白的唾液酸酶活性來研究它們的生物學(xué)功能。借助于PNA凝集素結(jié)合活性(如在材料和方法部分中詳述的)測量了通過Protan-NA的去唾液酸化。如在圖9中示出的，包含GCN4四聚化基序的Protan-NA0蛋白顯示出濃度依賴性唾液酸酶活性。對于缺少GCN4四聚化基序的Protan-NA融合蛋白(P-NA’沒有發(fā)現(xiàn)唾液酸酶活性。這些結(jié)果清楚地證明了低聚(而不是單體)形式的Protan-NA是有功能的。
[0135]總之，在哺乳動物細(xì)胞中有效地產(chǎn)生了融合至不同的Protan變異體的生物學(xué)活性的可溶性三聚的HA和可溶性四聚的NA蛋白。使用I個LysM結(jié)構(gòu)域已經(jīng)實現(xiàn)了對BLP的有效的結(jié)合，條件是該融合蛋白包含0MD，如GCN4低聚化結(jié)構(gòu)域；換言之，由單個LysM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的有效的結(jié)合取決于——并且選擇針對——以低聚狀態(tài)存在的蛋白質(zhì)。此外，蛋白質(zhì)以它們的低聚狀態(tài)結(jié)合至BLP證明了與天然蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)活性。
[0136]實施例4.以顆粒形式的低聚HA-Protan的免瘡原件
[0137]在兩次肌內(nèi)給予小鼠之后評價結(jié)合至BLP (BLP-HAh)的三聚的HA (HA-PILh)的免疫原性。使用的HA亞型是HIM。將BLP-HAh顆粒制劑與可溶性三聚的HA(HAh)和與BLP混合的可溶性三聚的HA (BLP+HAh)相比較。在制劑中的HAh的量是0.33 μ g/劑量。第二次免疫之后的第十天采集血清并且集中每組用于ELISA分析以測定抗HIM IgG應(yīng)答。圖6A中的結(jié)果清楚地示出了與可溶性三聚的HA (HAh)和與BLP混合的可溶性三聚的(BLP+HAΞ)相比較，在血清HA特異性IgG應(yīng)答方面BLP-HA顆粒制劑是最具免疫原性的制劑。然而，高度相關(guān)的(圖6Β)是與結(jié)合至BLP的單體HA (BLP-HA’相比較，結(jié)合至BLP的三聚的HA(BLP-HAh)引起更高功能性的抗體效價(以血凝抑制反應(yīng)(HI)效價測定)的觀察結(jié)果。此外，在鼻腔的粘膜分泌物中僅有結(jié)合至BLP的三聚的HA (BLP-HAh)引起HA特異性分泌的IgA (S-1gA)的顯著水平(圖6C)。這些結(jié)果最可能是結(jié)合至BLP的三聚的HA (BLP-HAh)的正確折疊和功能性的反映。
[0138]因此，通過使用OMD和單個LysM結(jié)構(gòu)域所確定的包含結(jié)合的天然低聚的抗原組合物的顆粒BLP制劑是高度免疫原性的并且與可溶性低聚的和單體結(jié)合的制劑相比引起更有效的、以及性質(zhì)上更相關(guān)的應(yīng)答。
[0139]實施例5.以顆粒形式的低聚的F-Protan的免疫原性、功效和安全性
[0140]在三次鼻內(nèi)給予小鼠之后評價了結(jié)合至BLP (BLP-Fh)的三聚的HA (HA-PILh)的免疫原性。使用了三次劑量(OJyg/劑量和2.2 μ g/劑量)的BLP-Fh顆粒制劑。在第三次免疫之后的第十天，采集血清并且集中每組用于Synagis?競爭ELISA分析(圖11A)以測定抗F抗體應(yīng)答。在該分析中，由中和性Synagis?抗體識別結(jié)合至的F表位的由疫苗在小鼠中引起的抗體，阻止了 Synagis?的結(jié)合。因此，在分析中未結(jié)合的Synagis?的測量的量是由疫苗引起的Synagis?樣抗體的量。圖1lB中的結(jié)果清楚地示出結(jié)合至BLP的三聚的F (BLP-Fh)以劑量依賴性方式引起Synagis?樣抗體。如所期望的，預(yù)免疫的血清是陰性的。
[0141]總之,通過使用OMD和單個LysM結(jié)構(gòu)域所確定的包含結(jié)合的天然低聚的F抗原的顆粒BLP制劑是高度免疫原性的并且引起中和性類型的抗體。
[0142]該棉鼠接近地重演了破壞性的病理學(xué)結(jié)果，稱為增強(qiáng)性疾病(enhanceddisease)，其與1960年代的RSV-疫苗失敗有關(guān)。在1960年代，使用在鋁鹽中配制的福爾馬林滅活的RSV疫苗(F1-RSV)在美國進(jìn)行了嬰兒實驗。在隨后的天然RSV暴露期間，在接受該疫苗的嬰兒中的病毒感染率并不低(并且可能甚至更高)于使用副流行性感冒疫苗免疫的對照組。最顯著地，80%的RSV疫苗接種者需要住院治療，然而在對照的副流行性感冒疫苗中僅5%的這種感染需要準(zhǔn)許住院。兩個接種的嬰兒死亡。因此，F(xiàn)1-RSV是聲名狼籍的疫苗候選物而非保護(hù)物，其在暴露至天然RSV感染時初免的幼小嬰兒疾病惡化。將F1-RSV給予至棉鼠隨后是RSV感染導(dǎo)致可比較的增強(qiáng)的(肺臟)病變(該病變的特征在于間質(zhì)性肺炎和肺泡炎)。因此，在RSV疫苗開發(fā)中在棉鼠中的概念RSV疫苗的安全測試(沒有增強(qiáng)性疾病)是必需的步驟。
[0143]在三次鼻內(nèi)給予棉鼠之后評價了結(jié)合至BLP的三聚的F (HA-PILh) (BLP-Fh)的功效和安全性(沒有增強(qiáng)性疾病癥狀)并且與單體F (F’相比較。在病毒中和分析中以在每次疫苗給予之后的14天獲取的樣品測定由疫苗引起的血清抗體抑制RSV復(fù)制的能力。對于安全性的評價，將在鋁鹽中配制的福爾馬林滅活的RSV疫苗(F1-RSV)肌內(nèi)給予至另外一組動物。已知F1-RSV在棉鼠的肺臟中引起病狀，該病狀與增強(qiáng)性疾病(間質(zhì)性肺炎和肺泡炎)的癥候相關(guān)。在最終免疫之后的第十四天，使用RSV激發(fā)每個動物。在激發(fā)后第5天處死動物并且收集肺臟用于測定病毒效價、病毒中和效價和用于通過組織病理學(xué)對間質(zhì)性肺炎和肺泡炎的評分。這些結(jié)果清楚地顯示(圖12A)與單體F (F’相比較，結(jié)合至BLP的三聚的F (HA-PILh) (BLP-Fh)在減少肺臟病毒效價方面是更有效的。該觀測結(jié)果與來自使用BLP-Fh免疫的動物的血清的更高的病毒中和能力很好地相關(guān)聯(lián)(與？$免疫的動物相比較)(圖12B)。重要地，結(jié)合至BLP的三聚的F (HA-PILh) (BLP-Fh)的提高的功效與缺少增強(qiáng)性疾病(肺臟中的間質(zhì)性肺炎和肺泡炎)的癥候相關(guān)，對于在此模型中使用F1-RSV其是典型的(圖12C)。
[0144] 總之,通過使用OMD和單個LysM結(jié)構(gòu)域所確定的包含結(jié)合的天然的低聚的F抗原的顆粒BLP制劑是高度有效的，引起病毒中和抗體并且具有有利的安全性曲線。
【權(quán)利要求】
1.一種顆粒形式的免疫原性組合物，包括: 1.由革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性細(xì)菌樣顆粒(BLP)作為顆粒載體； ?.非共價連接至所述BLP的重組產(chǎn)生的多肽的低聚體，其中所述重組多肽包括: A)N-端或C-端的抗原結(jié)構(gòu)域，包含病原體來源或腫瘤來源的至少一種表面暴露多肽或它們的抗原部分，所述抗原結(jié)構(gòu)域被融合至 B)低聚化結(jié)構(gòu)域(OMD),所述低聚化結(jié)構(gòu)域通過 C)接頭結(jié)構(gòu)域被融合至 D)由介導(dǎo)將所述多肽非共價連接至所述BLP的單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域組成的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)，并且其中所述多肽作為整體僅包含單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域；以及 ii1.藥用稀釋劑或賦形劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，在所述重組多肽的所述抗原結(jié)構(gòu)域中的所述表面暴露的多肽包含包膜病毒蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地其中所述病毒是流感病毒、動物冠狀病毒、人類呼吸道冠狀病毒、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、或副粘液病毒，特別是呼吸道合胞病毒(RSV)或變性肺病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫原性組合物，其中，所述表面暴露的多肽或其抗原部分選自由以下所組成的組中:流感紅血球凝聚素(HA)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、流感神經(jīng)氨酸酶(NA)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、冠狀病毒刺突(S)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域或其部分、RSV糖蛋白F或G胞外結(jié)構(gòu)域或其部分和HIV gpl40胞外結(jié)構(gòu)域或其部分。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的免疫原性組合物，其中，所述重組多肽的所述接頭結(jié)構(gòu)域由10至60之間、優(yōu)選20-50、更優(yōu)選25-40個氨基酸，例如約30個氨基酸組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述接頭結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組中的氨基酸序列:GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST、GSASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ和 QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的免疫原性組合物，其中，所述重組多肽的所述低聚化結(jié)構(gòu)域(OMD)是二聚化的、三聚化的或四聚化的結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地其中所述低聚化結(jié)構(gòu)域選自GCN4類二聚化的、三聚化的或四聚化的結(jié)構(gòu)域；T4次要纖維蛋白(折疊核)或其功能性部分或其類似物的C-端結(jié)構(gòu)域序列(C-端的27至30個殘基)和雞軟骨基質(zhì)(CART)蛋白的可溶性三聚化結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的免疫原性組合物，其中，所述重組多肽進(jìn)一步包括，在N-端是抗原結(jié)構(gòu)域的情況下的C-端加帽序列，或在C-端是抗原結(jié)構(gòu)域的情況下的N-端加帽序列。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的免疫原性組合物，其中，所述細(xì)菌是非病原性細(xì)菌，優(yōu)選地是食品級細(xì)菌，更優(yōu)選地其中所述細(xì)菌選自由乳球菌、乳桿菌、芽胞桿菌和分枝桿菌所組成的組中。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的免疫原性組合物，其中，使用包含源自第一病原體的表面暴露的多肽或其抗原部分的至少第一低聚體和包含源自第二病原體的表面暴露的多肽或其抗原部分的第二低聚體非共價地提供所述顆粒載體。
10.一種用于提供根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟:a)提供在權(quán)利要求1-7中任一項所述的重組多肽,包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述多肽的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞使得表達(dá)所述多肽，和分離所述多肽； b)提供由革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性細(xì)菌樣顆粒(BLP)； c)使得一個或多個所述多肽非共價結(jié)合至所述BLP以形成包含非共價結(jié)合至顆粒載體的病原體來源的表面暴露的多肽或其抗原部分的低聚體的免疫原性復(fù)合物，以及 d)將所述免疫原性復(fù)合物配制成免疫原性組合物。
11.一種用于引起個體中抵抗病原體的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述個體根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的免疫原性組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，用于引起個體中抵抗病毒性疾病的免疫應(yīng)答，優(yōu)選地其中所述病毒性疾病是由流感病毒、動物冠狀病毒、人類呼吸道冠狀病毒、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、或副粘液病毒所引起的，特別是由呼吸道合胞病毒(RSV)或變性肺病毒所引起的。
13.一種重組多肽，包括: A)N-端或C-端的抗原結(jié)構(gòu)域，包含至少一種表面暴露的多肽(例如病原體來源或腫瘤細(xì)胞來源的多肽)或它們的抗原部分，所述抗原結(jié)構(gòu)域被融合至 B)低聚化結(jié)構(gòu)域(OMD),所述低聚化結(jié)構(gòu)域通過 C)接頭結(jié)構(gòu)域被融合至 D)由能夠介導(dǎo)所述多肽的非共·價連接至肽聚糖載體顆粒的單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域組成的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)，所述肽聚糖載體顆粒是由革蘭氏陽性細(xì)菌獲得的無活性細(xì)菌樣顆粒(BLP)，并且其中所述多肽作為整體僅包含單拷貝的LysM結(jié)構(gòu)域。
14.一種核苷酸序列，編碼根據(jù)權(quán)利要求13所述的多肽。
15.—種載體，包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的核苷酸序列。
16.一種宿主細(xì)胞，包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的核苷酸序列或根據(jù)權(quán)利要求15所述的載體，優(yōu)選其中所述宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞，更優(yōu)選是哺乳動物宿主細(xì)胞。
【文檔編號】A61K47/48GK103547676SQ201280024687
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月22日
【發(fā)明者】科內(nèi)利斯·約翰內(nèi)斯·林豪特施, 貝特·揚(yáng)·海杰馬, 馬爾藤·萊昂納德斯·范羅斯馬倫, 彼得魯斯·約瑟夫斯·瑪麗·羅蒂爾, 科內(nèi)利斯·亞歷山大·瑪麗亞·德哈恩, 貝倫德·揚(yáng)·博希 申請人:繆科西斯私人有限公司