針對(duì)組織因子途徑抑制物(tfpi)的單克隆抗體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(TFPI)的特異性表位的分離的單克隆抗體和編碼其的分離的核酸分子。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和通過(guò)施用該抗體治療凝血缺乏或缺陷的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】針對(duì)組織因子途徑抑制物(TFPI)的單克隆抗體
[0001]Zhuozhi Wang, John Murphy, Tobias Marquardt, Dieter Moosmayer
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發(fā)明領(lǐng)域
[0002]提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(TFPI)的分離的單克隆抗體及其片段。
[0003]發(fā)明背景
血液凝固(blood coagulation)是血液形成穩(wěn)定的凝塊以使出血停止的過(guò)程。該過(guò)程涉及血液中循環(huán)的許多酶原和輔因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和輔因子原經(jīng)由序貫或同時(shí)將它們轉(zhuǎn)化成活化形式的數(shù)種途徑而相互作用。最后，所述過(guò)程導(dǎo)致在存在因子Va、離子鈣、和血小板的情況下由激活的因子X(jué)(FXa)將凝血酶原激活為凝血酶。激活的凝血酶繼而誘導(dǎo)血小板聚集，而且將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成血纖蛋白，其然后被激活的因子X(jué)lII(FXIIIa)交聯(lián)以形成凝塊。
[0004]可以通過(guò)兩種獨(dú)特的途徑來(lái)實(shí)施導(dǎo)致因子X(jué)激活的過(guò)程:接觸激活途徑(以前稱(chēng)為內(nèi)源性途徑)和組織因子途徑(以前稱(chēng)為外源性途徑)。先前認(rèn)為，凝固級(jí)聯(lián)由連接至共同途徑的同等重要的兩種途徑組成。現(xiàn)在知道用于啟動(dòng)血液凝固的主要途徑是組織因子途徑。
[0005]因子X(jué)可以被與激活的因子VII (F`VIIa)聯(lián)合的組織因子(TF)激活。FVIIa和其必需的輔因子TF的復(fù)合物是凝固(clotting)級(jí)聯(lián)的有力引發(fā)劑(initiator)。
[0006]凝固的組織因子途徑受組織因子途徑抑制物(“TFPI”)的陰性控制。TFPI是FVIIa/ TF復(fù)合物的一種天然的、FXa依賴性反饋抑制物。它是多價(jià)Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物的成員。在生理學(xué)上，TFPI結(jié)合激活的因子X(jué)(FXa)以形成異二聚體復(fù)合物，其隨后與FVIIa/TF復(fù)合物相互作用以抑制其活性，因此關(guān)閉凝固的組織因子途徑。原則上，阻斷TFPI活性可以恢復(fù)FXa和FVIIa/TF活性，因此延長(zhǎng)組織因子途徑作用的持續(xù)時(shí)間，而且放大FXa的生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。
[0007]實(shí)際上，一些初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)已經(jīng)指明，通過(guò)針對(duì)TFPI的抗體來(lái)阻斷TFPI活性使延長(zhǎng)的凝固時(shí)間正?；蛘呖s短出血時(shí)間。例如，Nordfang等人顯示了血友病血漿的延長(zhǎng)的稀釋凝血酶原時(shí)間(dilute prothrombin time)在用針對(duì)TFPI的抗體處理血衆(zhòng)后正?；?Thromb.Haemost., 1991, 66(4): 464-467)。類(lèi)似地,Erhardtsen 等人顯不了通過(guò)抗TFPI抗體顯著縮短血友病A兔模型中的出血時(shí)間(Blood Coagulation and Fibrinolysis,1995，6: 388-394)。這些研究提示了抗TFPI抗體對(duì)TFPI的抑制對(duì)于治療血友病A或B可以是有用的。在這些研究中僅使用多克隆抗TFPI抗體。
[0008]使用雜交瘤技術(shù)，制備并鑒定針對(duì)重組人TFPI (rhTFPI)的單克隆抗體(參見(jiàn)Yang等人，Chin.Med.J.，1998，111(8): 718-721)。測(cè)試了單克隆抗體對(duì)稀釋凝血酶原時(shí)間(PT)和激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的影響。實(shí)驗(yàn)顯示了抗TFPI單克隆抗體縮短因子IX缺乏型血漿的稀釋促凝血酶原激酶凝固時(shí)間。提示了組織因子途徑不僅在生理學(xué)凝固而且在血友病出血中發(fā)揮重要作用(Yang等人，Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao,1997，22(4): 297-300)。
[0009]因而，需要對(duì)TFPI特異性的抗體來(lái)治療血液學(xué)疾病和癌癥。
[0010]一般而言，已經(jīng)使用遺傳工程改造來(lái)生成鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗體以生成用于人疾病的治療性抗體。顯示了鼠單克隆抗體作為治療劑具有有限的用途，這是由于短的血清半衰期、不能觸發(fā)人效應(yīng)物功能、和人抗-小鼠-抗體的生成(Brekke和 Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of theTwenty-first Century,” Nature 2, 53, 52-62，Jan.2003)。已經(jīng)顯不了嵌合抗體引起人抗嵌合抗體應(yīng)答。人源化抗體進(jìn)一步使抗體的小鼠組分最小化。然而，完全人抗體完全避免與鼠元件有關(guān)的免疫原性。因此，需要開(kāi)發(fā)完全人抗體以避免與其他形式的遺傳工程化單克隆抗體有關(guān)的免疫原性。特別是，長(zhǎng)期預(yù)防性治療諸如血友病治療需要人源化或優(yōu)選，完全人抗體。如果使用具有鼠組分或鼠來(lái)源的抗體，抗TFPI單克隆抗體具有形成對(duì)該治療的免疫應(yīng)答的高風(fēng)險(xiǎn)，這是由于需要的許多給藥和治療的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。例如，血友病A的抗體療法可以每周需要給藥，持續(xù)患者一生。這對(duì)免疫系統(tǒng)會(huì)是連續(xù)的挑戰(zhàn)。因此，需要用于血友病和相關(guān)的遺傳性和獲得性凝血缺乏或缺陷的抗體療法的完全人抗體。
[0011]已經(jīng)經(jīng)由由Koehler 和 Milstein 在“Continuous Cultures of Fused CellsSecreting Antibody of Predefined Specificity, ” Nature 256, 495-497 (1975)中所描述的雜交瘤技術(shù)來(lái)制備治療性抗體。也可以在原核生物和真核生物中重組制備完全人抗體。治療性抗體優(yōu)選抗體在宿主細(xì)胞中的重組生成而不是雜交瘤生成。重組生成具有如下的優(yōu)點(diǎn)，即較大的產(chǎn)物一致性、可能地較高的生產(chǎn)水平、和受控制的制備，其使動(dòng)物衍生的蛋白質(zhì)的存在最小化或消除動(dòng)物衍生的蛋白質(zhì)的存在。出于這些原因，想要具有重組生成的單克隆抗TFPI抗體。
[0012]另外，因?yàn)門(mén)FPI以高親和力·結(jié)合活化的因子X(jué)(FXa)，所以有效的抗TFPI抗體應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)?shù)挠H和力。因此，期望具有具有可以與TFPI/FXa結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)合親和力的抗TFPI抗體。
[0013]發(fā)明概述
提供了具有特異性結(jié)合到人組織因子途徑抑制物(TFPI)的特異性表位的單克隆抗體。也提供了編碼抗TFPI單克隆抗體的多核苷酸。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和治療遺傳性和獲得性凝血缺乏或缺陷諸如血友病A和B的方法。
[0014]附圖簡(jiǎn)述
圖1描述通過(guò)大小排阻分析Fab A和TFPI Kunitz結(jié)構(gòu)域2的復(fù)合物形成。
[0015]圖2描述人組織因子途徑抑制物和其抗體(Fab A)之間的相互作用的卡通圖示。具有表示的可變輕(')和重(Vh)結(jié)構(gòu)域的Fab A表示為下面的結(jié)構(gòu)。TFPI的Kunitz結(jié)構(gòu)域2 (KD2)表示為上面的結(jié)構(gòu)。
[0016]圖3 描述在 Fab A 表面的關(guān)鍵表位殘基 Aspl02 (D102)、Ilel05 (I105)、Argl07(R107)、Cysl06-Cysl30 二硫鍵和 TFPI 的結(jié)合。
[0017]圖4描述TFP1- Fab A復(fù)合物和胰蛋白酶結(jié)合的Kunitz結(jié)構(gòu)域2 (KD2)的疊加，并且顯示TFPI與因子X(jué)a和Fab A同時(shí)結(jié)合的排除。KD2和Fab A以卡通圖示顯示，胰蛋白酶顯示為透明表面。還表示Fab A和胰蛋白酶的空間位阻。
[0018]圖5描述通過(guò)大小排阻分析Fab B和TFPI Kunitz結(jié)構(gòu)域1+2的復(fù)合物形成。
[0019]圖6描述顯示在第一角和相對(duì)于第一角旋轉(zhuǎn)90度的另一角處人組織因子途徑抑制物和其抗體(Fab B)之間的相互作用的兩個(gè)卡通圖示。具有表示的可變輕(\ 和重(Vh )結(jié)構(gòu)域的Fab B顯示在圖的下面部分(灰色陰影)。TFPI Kunitz結(jié)構(gòu)域I (KDl)以白色顯示，并且TFPI Kunitz結(jié)構(gòu)域2 (KD2)以黑色顯示。
[0020]圖7 描述在Fab B表面的關(guān)鍵表位殘基Asp31 (D31)、Asp32 (D32)、Pro34 (P34)、Lys36 (K36)、Glu60 (E60)、Cys35_Cys59 二硫鍵和 Kunitz 結(jié)構(gòu)域 I TFPI 的結(jié)合。還顯示，但未枚舉，Kunitz結(jié)構(gòu)域2的結(jié)合。
[0021]圖8 描述 Kunitz 結(jié)構(gòu)域 2 的表位殘基 GlulOO (E100)、GlulOl (ElOl)、Prol03(P103)、Ilel05 (1105)、Argl07 (R107)、Tyrl09 (Y109)和 Fab B 的結(jié)合和相互作用的視野的兩個(gè)角。Argl07與Kunitz結(jié)構(gòu)域I的Gly33 (G33)和Cys35 (C35)相互作用。
[0022]圖9描述TFP1- Fab B復(fù)合物和BPT1、因子VIIa和組織因子的復(fù)合物的疊加，并且顯示TFPI與因子VIIa/組織因子和Fab B的同時(shí)結(jié)合的排除。Fab B與因子Vila、和Fab B與組織因子的空間位阻通過(guò)箭頭表示。
[0023]圖10描述TFP1- Fab B復(fù)合物和胰蛋白酶結(jié)合的Kunitz結(jié)構(gòu)域2的疊加，并且顯示TFPI與因子X(jué)a和Fab B同時(shí)結(jié)合的排除。表示Fab B與胰蛋白酶、和Fab B結(jié)合的Kunitz結(jié)構(gòu)域I與胰蛋白酶的空間位阻。
[0024]圖11描述(A) Fab A的輕鏈和重鏈(SEQ ID NOs:2和3)和Fab C的輕鏈和重鏈(SEQ ID N0s:6和7)的序列比對(duì)以及(B) TFP1- Fab A X-射線結(jié)構(gòu)與Fab C的同源性模型的疊加。(A)互補(bǔ)位殘基為粗體文字并且突出表示。在Fab A和Fab C中不同的互補(bǔ)位殘基hc_Asn32用星號(hào)標(biāo)記。(B) Kunitz結(jié)構(gòu)域2 (KD2)顯示為黑色卡通。Fab結(jié)構(gòu)顯示為灰色帶?；パa(bǔ)位殘基hc_Asn32顯不為棒。
[0025]圖12描述(A) Fab B的輕鏈和重鏈(SEQ ID N0s:4和5)和Fab D的輕鏈和重鏈(SEQ ID N0s:8和9)的序列比對(duì)以及(B) TFP1- Fab B X-射線結(jié)構(gòu)與Fab D的同源性模型的疊加。(A)互補(bǔ)位殘基為粗體文字并且突出表示。在Fab B和Fab D中不同的互補(bǔ)位殘基用星號(hào)標(biāo)記。(B) Kunitz結(jié)構(gòu)域I (KDl)和Kunitz結(jié)構(gòu)域2 (KD2)分別顯示為淺灰色和黑色卡通。Fab結(jié)構(gòu)顯不為灰色帶。在Fab B和Fab D中不同的互補(bǔ)位殘基顯不為棒。
[0026]圖13描述(A)阻斷FXa結(jié)合至TFPI上的Fab C和Fab D的表面等離子體共振(Biacore)數(shù)據(jù)，以及(B)阻斷FVIIa/TF結(jié)合至TFPI上的Fab C和Fab D的表面等離子體共振(Biacore)數(shù)據(jù)。
[0027]發(fā)明詳述 定義
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“組織因子途徑抑制物”或“TFPI”指由細(xì)胞天然表達(dá)的人TFPI的任何變體、同種型和物種同系物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對(duì)TFPI的結(jié)合減少血液凝固時(shí)間。 [0028]如本文中所使用的，“抗體”指整個(gè)抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈。該術(shù)語(yǔ)包括天然存在的或由正常的免疫球蛋白基因片段重組過(guò)程形成的全長(zhǎng)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)，或免疫球蛋白分子中保留特異性結(jié)合活性的免疫學(xué)活性部分諸如抗體片段。不管結(jié)構(gòu)，抗體片段與由全長(zhǎng)抗體識(shí)別的相同抗原結(jié)合。例如，抗TFPI單克隆抗體片段結(jié)合TFPI的表位?？贵w的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。抗體的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合部分”內(nèi)涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，即一種由Vh、(^和Chi結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，即一種包含由鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii) Fd片段，其由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(iv) Fv片段，其由抗體的單條臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，(V) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546),其由Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ; (vii)微型抗體(minibody)、雙抗體、三抗體、四抗體、和K體(參見(jiàn)例如Ill等人，Protein Eng 1997; 10:949-57) ;(viii)駱駝IgG;和(ix) IgNAR0此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即'和Vh是由不同基因編碼的，但是可以使用重組方法通過(guò)合成的接頭來(lái)連接它們，所述合成的接頭使它們能夠作為單條蛋白質(zhì)鏈生成，其中Vlj和Vh區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱(chēng)為單鏈Fv(scFv);參見(jiàn)例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426;和Huston等人(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。此類(lèi)單鏈抗體也意圖涵蓋在抗體的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)獲得這些抗體片段，并以與完整的抗體相同的方式來(lái)對(duì)片段分析功效。
[0029]此外，考慮抗體模擬物中可以涵蓋抗原結(jié)合片段。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體模擬物”或“模擬物”意指展現(xiàn)出與抗體類(lèi)似的結(jié)合，但是是更小的備選抗體或非抗體蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。此類(lèi)抗體模擬物可以包含在支架中。術(shù)語(yǔ)“支架”指用于以改編的功能和特征工程改造新產(chǎn)物的多肽平臺(tái)。
[0030]術(shù)語(yǔ)“表位”是指抗體特異性結(jié)合或相互作用的抗原的范圍或區(qū)域，在一些實(shí)施方案中，其表示抗原與抗體物理接觸的地方。相反，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)位”是指抗原特異性結(jié)合的抗體的范圍或區(qū)域。如果相應(yīng)抗體的結(jié)合是相互排斥的，即一種抗體的結(jié)合排斥另一種抗體的同時(shí)結(jié)合，則特征在于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的表位被稱(chēng)為重疊的。如果抗原能夠同時(shí)容納兩個(gè)相應(yīng)抗體的結(jié)合，則表位被稱(chēng)為是獨(dú)立的(唯一的)。
`[0031]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“競(jìng)爭(zhēng)性抗體”是指結(jié)合與如本文所述的TFPI約、本質(zhì)上或基本上相同，或甚至相同的表位的抗體?！案?jìng)爭(zhēng)性抗體”包括具有重疊的表位特異性的抗體。因此,競(jìng)爭(zhēng)性抗體能夠有效地競(jìng)爭(zhēng)如本文所述的抗體結(jié)合TFPI。優(yōu)選地，競(jìng)爭(zhēng)性抗體可以結(jié)合與本文所述的抗體相同的表位。從另外的觀點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性抗體具有與本文所述的抗體相同的表位特異性。
[0032]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抑制結(jié)合”和“阻斷結(jié)合”(例如，指抑制/阻斷TFPI配體對(duì)TFPI的結(jié)合)可互換使用，并且涵蓋部分和完全抑制或阻斷兩者。抑制和阻斷還意圖包括與不與抗TFPI抗體接觸的TFPI相比在與抗TFPI抗體接觸時(shí)TFPI對(duì)生理學(xué)底物的結(jié)合親和力的任何可測(cè)量降低，例如阻斷TFPI與因子X(jué)a的相互作用或者阻斷TFP1-因子X(jué)a復(fù)合物與組織因子、因子VIIa或組織因子/因子VIIa的復(fù)合物的相互作用達(dá)至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0033]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一分子組成的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。因而，術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”指具有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)和恒定區(qū)的展示單一結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或者通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。
[0034]如本文中所使用的，“分離的抗體”意圖指基本上沒(méi)有具有不同抗原性特異性的其他抗體的抗體(例如結(jié)合TFPI的分離的抗體基本上沒(méi)有結(jié)合與TFPI不同的抗原的抗體)。然而，結(jié)合人TFPI的表位、同種型或變體的分離的抗體可以具有與其他相關(guān)抗原(例如來(lái)自其他物種的(例如TFPI物種同系物))的交叉反應(yīng)性。此外,分離的抗體可以基本上沒(méi)有其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物。
[0035]如本文中所使用的，“特異性結(jié)合”指抗體對(duì)預(yù)定抗原的結(jié)合。典型地，抗體以至少約IO5M4的親和力結(jié)合，而且以比其結(jié)合與預(yù)定抗原或緊密相關(guān)抗原不同的無(wú)關(guān)抗原(例如BSA、酪蛋白)的親和力高(例如大至少兩倍)的親和力結(jié)合預(yù)定抗原。短語(yǔ)“識(shí)別抗原的抗體”和“對(duì)抗原特異性的抗體”在本文中與術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。
[0036]如本文中所使用的，關(guān)于IgG抗體的術(shù)語(yǔ)“高親和力”指至少約IO7M'在一些實(shí)施方案中至少約IO8M'在一些實(shí)施方案中至少約Kat1UOkT1UO11M-1或更大，例如多達(dá)IO13M-1或更大的結(jié)合親和力。然而，對(duì)于其他抗體同種型，“高親和力”結(jié)合可以有所變化。例如，IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指至少約1.0xIO7IT1的結(jié)合親和力。如本文中所使用的，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(lèi)(例如IgM或IgGl)。
[0037]“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”指抗體分子的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)內(nèi)形成與結(jié)合的抗原的三維結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的N端抗原結(jié)合表面的三個(gè)高變區(qū)之一。從重鏈或輕鏈的N端出發(fā)，這些互補(bǔ)決定區(qū)分別表示為“⑶R1”、“⑶R2”和“⑶R3”。⑶R參與抗原-抗體結(jié)合，而且⑶R3包含對(duì)于抗原-抗體結(jié)合特異性的獨(dú)特區(qū)域。因此，抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包括6個(gè)CDR，其包含來(lái)自各個(gè)重鏈和輕鏈V 區(qū)的CDR區(qū)。
[0038]如本文中所使用的，“保守取代”指涉及用一種或多種氨基酸取代具有相似生物化學(xué)特性的氨基酸且不導(dǎo)致多肽的生物學(xué)或生物化學(xué)功能損失的多肽修飾?！氨Ｊ匕被崛〈敝赣镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替換氨基酸殘基的取代。本領(lǐng)域中已經(jīng)限定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3 -分支的側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。涵蓋的是，本發(fā)明的抗體可以具有保守的氨基酸取代，而且仍保留活性。
[0039]對(duì)于核酸和多肽，術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)同源性”指明在最佳比對(duì)和比較時(shí)兩個(gè)核酸或兩個(gè)多肽或其指定序列在至少約80%的核苷酸或氨基酸，通常至少約85%，優(yōu)選地約90%、91%、92%、93%、94%、或 95%，更優(yōu)選地至少約 96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%,99.3%,99.4%、或 99.5%的核苷酸或氨基酸中是相同的，具有適當(dāng)?shù)暮塑账峄虬被岵迦牖蛉笔??；蛘撸?dāng)區(qū)段在選擇性雜交條件下與該鏈的互補(bǔ)物雜交時(shí)存在核酸的實(shí)質(zhì)同源性。本發(fā)明包括與本文中所列舉的特定核酸序列和氨基酸序列具有實(shí)質(zhì)同源性的核酸序列和多肽序列。
[0040]兩個(gè)序列間的百分比同一性是序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，%同源性=相同位置的數(shù)目/位置總數(shù)X 100)，其考慮缺口的數(shù)目和每個(gè)缺口的長(zhǎng)度，它們需要被引入以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。可以使用數(shù)學(xué)算法(諸如不限于VectorNTITM(InVitix)genCorp., Carlsbad, CA)的AlignX?模塊)來(lái)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列間的序列比較和百分比同一I"生測(cè)定。對(duì)于AlignX?，多重比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)是:缺口開(kāi)放罰分:10 ;缺口延伸罰分:0.05 ;缺口分開(kāi)罰分范圍:8 ;比對(duì)延遲的％同一性:40。(進(jìn)一步的詳情參見(jiàn)
【權(quán)利要求】
1.分離的單克隆抗體，其結(jié)合人組織因子途徑抑制物(SEQID NO:1)的表位，其中所述表位包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:SEQ ID N0:1的Glul00、Glul01、Aspl02、Prol03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Lysl26、Glyl28、Glyl29、Cysl30、Leul31、Glyl32、和 Asnl33。
2.權(quán)利要求1的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含SEQID NO:1的殘基Ilel05。
3.權(quán)利要求1的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含SEQID N0:1的殘基Ilel05和Aspl02o
4.權(quán)利要求1的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含SEQID N0:1的殘基Ilel05、Asp 102 和 Leul31。
5.權(quán)利要求2-4的分離的單克隆抗體，其中所述表位進(jìn)一步包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:SEQ ID NO:1 的 Glul00、Glul01、Aspl02、Prol03、Glyl04、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Lysl26、Glyl28、Glyl29、Cysl30、Leul31、Glyl32、和 Asnl33。
6.分離的單克隆抗體，其結(jié)合人組織因子途徑抑制物(SEQID NO:1)的表位，其中所述表位包含由SEQ ID NO:1的殘基Cysl06和Cysl30之間的二硫鍵連接的兩個(gè)氨基酸環(huán)。
7.權(quán)利要求6的分離的單克隆抗體，其中所述表位進(jìn)一步包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:SEQ ID NO:1 的 GlulOO, GlulOl、Aspl02、Prol03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Lysl26、Glyl28、Glyl29、Cysl30、Leul31、Glyl32、和 Asnl33。
8.權(quán)利要求7的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含SEQID N0:1的殘基Ilel05。
9.權(quán)利要求7的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含SEQID N0:1的殘基Aspl02。
10.權(quán)利要求7的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含SEQID N0:1的殘基Leul31。
11.權(quán)利要求8-10的分離的單克隆抗體,其中所述表位進(jìn)一步包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:SEQ ID NO:1 的 GlulOO, GlulOl、Aspl02、Prol03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Lysl26、Glyl28、Glyl29、Cysl30、Leul31、Glyl32、和 Asnl33。
12.分離的單克隆抗體，其結(jié)合人組織因子途徑抑制物(SEQID NO:1)的表位，其中所述表位包含Kunitz結(jié)構(gòu)域I的一個(gè)或多個(gè)殘基和Kunitz結(jié)構(gòu)域2的一個(gè)或多個(gè)殘基。
13.權(quán)利要求12的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:Asp31、Asp32、Gly33、Pro34、Cys35、Lys36、Cys59、Glu60 和 Asn62。
14.權(quán)利要求13的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含殘基Pro34。
15.權(quán)利要求13的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含殘基Pro34 和 Glu60。
16.權(quán)利要求13的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含殘基Pro34、Lys36 和 Glu60。
17.權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:Asp31、Asp32、Gly33、Cys35、Lys36、Cys59、Glu60和Asn62。
18.權(quán)利要求12的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:Glul00、GlulOl、Prol03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Phell4、Asnll6、Glul23、Argl24、Lysl26、Tyrl27 和 Glyl28。
19.權(quán)利要求18的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含殘基Argl07。
20.權(quán)利要求18的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含殘基GIuIO1
21.權(quán)利要求18的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含殘基Tyrl09o
22.權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基進(jìn)一步包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:Glul00、Glul01、Prol03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Phell4、Asnll6、Glul23、Argl24、Lysl26、Tyrl27 和 Glyl28。
23.權(quán)利要求12的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:Asp31、Asp32、Gly33、Pro34、Cys35、Lys36、Cys59、Glu60 和 Asn62,并且其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:GlulOO、GlulOUProl03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Phell4、Asnll6、Glul23、Argl24、Lysl26、Tyrl27 和 Glyl28。
24.分離的單克隆抗體，其結(jié)合人組織因子途徑抑制物(SEQID NO:1)的表位，其中所述表位包含由SEQ ID NO:1的殘基Cys35和Cys59之間的二硫鍵連接的兩個(gè)氨基酸環(huán)。
25.權(quán)利要求24的分離的單克隆抗體,其中所述表位進(jìn)一步包含Kunitz結(jié)構(gòu)域I的一個(gè)或多個(gè)殘基和Kunitz結(jié)構(gòu)域2的一個(gè)或多個(gè)殘基。
26.權(quán)利要求25的分離的單克隆抗體,其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:Asp31、Asp32、Gly33、Pro34、Cys35、Lys36、Cys59、Glu60 和 Asn62。
27.權(quán)利要求25的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:GlulOO、GlulOl、Prol03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Phell4、Asnll6、Glul23、Argl24、Lysl26、Tyrl27 和 Glyl28。
28.權(quán)利要求22的分離的單克隆抗體，其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域I的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:Asp31、Asp32、Gly33、Pro34、Cys35、Lys36、Cys59、Glu60 和 Asn62,并且其中所述Kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基:GlulOO、GlulOl、Prol03、Glyl04、Ilel05、Cysl06、Argl07、Glyl08、Tyrl09、Phell4、Asnll6、Glul23、Argl24、Lysl26、Tyrl27 和 Glyl28。
29.結(jié)合TFPI的分離的單克隆抗體，其中所述分離的單克隆抗體與權(quán)利要求1-28的任何分離的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TFPI。
30.結(jié)合TFPI的分離的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體與權(quán)利要求1-28的任何分離的單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TFPI。
31.藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的單克隆抗體和藥學(xué)可接受的載體。
32.藥物組合物，其包含治療有效量的至少兩種權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的單克隆抗體和藥學(xué)可接受的載體。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中第一種單克隆抗體包含權(quán)利要求1的分離的單克隆抗體，并且第二種單克隆抗體包含權(quán)利要求12的分離的單克隆抗體。
34.用于治療遺傳性或獲得性凝血缺乏或缺陷的方法，其包括將治療有效量的權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的藥物組合物施用于患者。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述方法治療血友病A、B或C。
36.用于 縮短出血時(shí)間的方法，其包括將治療有效量的權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)的藥物組合物施用于患者。
37.編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制物(SEQID NO:1)的表位的抗體的分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的所述分離的單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103797030SQ201280026938
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月1日
【發(fā)明者】王卓智, J.墨菲, T.馬夸特, D.莫斯邁爾 申請(qǐng)人:拜爾健康護(hù)理有限責(zé)任公司