用于治療糖尿病的包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病的組合物，包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物，以及用于治療糖尿病的治療方法，并且更具體地，長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的同時(shí)施用抑制由胰島素治療引起的體重增加，和由促胰島素肽治療引起的嘔吐和惡心，并且減小胰島素的所需劑量，從而顯著地改善藥物順應(yīng)性。此外，通過(guò)將胰島素或促胰島素肽與免疫球蛋白Fc區(qū)經(jīng)由非肽基連接體連接制備本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物中的每一個(gè)，由此顯示改善的體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間和穩(wěn)定性。
【專利說(shuō)明】用于治療糖尿病的包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素
肽綴合物的組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療糖尿病的包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的組合物，以及用于治療糖尿病的方法，所述方法包括施用所述組合物的步驟。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素是由胰腺的P細(xì)胞分泌的肽，并且在控制機(jī)體中的血糖水平方面發(fā)揮重要作用。代謝性疾病，糖尿病與由胰島素的分泌或功能異常引起的血糖水平升高有夫。I型糖尿病由因胰腺不能產(chǎn)生胰島素所引起的血糖水平升高導(dǎo)致，以及2型糖尿病由因胰島素的分泌或功能異常引起的血糖水平升高導(dǎo)致?；加?型糖尿病的患者通常采用具有化學(xué)物質(zhì)作為主要成分的ロ服降血糖藥劑治療，并且在一些情況下，給予胰島素，而患有I型糖尿病的患者需要膜島素治療。
[0003]最常見(jiàn)的胰島素療法包括在餐前和/或餐后注射胰島素。目前，可注射胰島素是可獲得的，并且一般來(lái)說(shuō)，以皮下注射液給予。施用方法取決于其作用時(shí)程而變化。胰島素注射顯示出比ロ服施用更快速的降血糖效應(yīng)，并且當(dāng)不可能進(jìn)行ロ服施用時(shí)其可以被安全地使用。此外，對(duì)于胰島素使用沒(méi)有劑量限制。然而，長(zhǎng)期一天三次使用胰島素可以導(dǎo)致ー些不利之處，諸如對(duì)針的厭惡、操縱注射設(shè)備的難度、低血糖癥和體重増加。由于長(zhǎng)期使用胰島素引起的體重増加可能増加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)和胰島素抗性。同時(shí)，做出了許多努力通過(guò)保持胰島素肽藥物被機(jī)體吸收后的長(zhǎng)期高水平以使功效最大化。例如，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了長(zhǎng)效胰島素制劑諸如蘭德仕(Lantus)(甘精胰島素(Insulin glargine) ；SanofiAventis)和諾和平(Levemir)(地特膜島素(Insulin detemir) ；Novo Nordisk),并且它們是可購(gòu)買得到的。不像胰島素NPH(中效低精蛋白胰島素)，這些長(zhǎng)效藥物減少睡眠期間的低血糖癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且特別地諾和平與稍微較少的體重増加有關(guān)。然而，這些藥物制劑也是不利的，因?yàn)樗鼈儽匦枰惶煲淮位騼纱谓o予。
[0004]同吋，ー種促胰島素肽，胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)，是由回腸和結(jié)腸的L-細(xì)胞分泌的腸降血糖素。胰高血糖素樣肽-1的作用是以葡萄糖依賴的方式增加胰島素釋放從而防止低血糖癥發(fā)作。由于這種性質(zhì)，其作為用于2型糖尿病的潛在治療而受到關(guān)注。然而，使用GLP-1作為治療藥劑的主要障礙是其在血漿中小于2分鐘的極其短的半衰期。目前，exendin-4作為胰高血糖素樣肽_1受體激動(dòng)劑是可購(gòu)買得到的，并且其是從吉拉毒蜥的唾液腺純化的胰高血糖素樣肽-1類似物。exendin-4對(duì)DPP IV(二肽基肽酶-4)有抗性，并且比胰高血糖素樣肽-1具有更高的生理活性。因此,其體內(nèi)半衰期為2-4小時(shí)，比胰高血糖素樣肽-1的半衰期長(zhǎng)(US5，424，286)。然而，采用僅增加對(duì)DPP IV的抗性的方法，生理活性不能被充分地維持，并且例如，在可購(gòu)買得到的exendin-4 (艾塞那肽(exenatide))的情況下，其需要一天兩次注射給患者，并且艾塞那肽治療的患者仍然經(jīng)歷不良事件諸如惡心和嘔吐。
[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明人提出了長(zhǎng)效肽綴合物，其通過(guò)將生理活性多肽和免疫球蛋白Fe區(qū)經(jīng)由作為連接體的非肽基聚合物通過(guò)共價(jià)鍵連接來(lái)制備，從而維持所述蛋白藥物的活性并且同時(shí)改善其穩(wěn)定性(韓國(guó)專利號(hào)10-0725315)。具體來(lái)說(shuō)，他們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物中的每ー種均發(fā)揮出顯著增加的體內(nèi)功效(韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?10-2008-0001479 和 10-2010-0054068)。
[0006]然而，當(dāng)以保持穩(wěn)定血糖水平的量注射胰島素或exendin-4時(shí)仍然存在體重增カロ、或惡心和嘔吐的問(wèn)題。因此，存在著開(kāi)發(fā)在使用較低劑量的藥物和較不頻繁的使用藥物的條件下對(duì)糖尿病表現(xiàn)出優(yōu)異療效的治療方法的迫切需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]技術(shù)問(wèn)題
[0008]本發(fā)明人已經(jīng)做出了許多努力來(lái)開(kāi)發(fā)用于糖尿病的治療藥劑，其具有長(zhǎng)效治療功效并且同時(shí)降低了不良事件諸如惡心和嘔吐。他們嘗試進(jìn)行長(zhǎng)效exendin-4綴合物和長(zhǎng)效胰島素綴合物的同時(shí)施用，其同時(shí)刺激胰高血糖素樣肽-1受體和胰島素受體。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的同時(shí)施用改善了體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間和穩(wěn)定性，并且顯著地減小了藥物的劑量，產(chǎn)生了穩(wěn)定的血糖水平。另外，他們發(fā)現(xiàn)其改善了由胰高血糖·素樣肽-1激動(dòng)劑和exendin-4或其衍生物誘發(fā)的不良事件諸如嘔吐和惡心，并且使用長(zhǎng)效exendin-4綴合物減少了由使用胰島素所導(dǎo)致的體重増加，從而完成了本發(fā)明。
[0009]解決問(wèn)題的技術(shù)方案
[0010]本發(fā)明的目的是提供ー種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供一種預(yù)防或治療糖尿病的方法，該方法包括向患有糖尿病或處于患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者施用所述組合物的步驟。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供ー種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和促胰島素肽。
[0013]本發(fā)明的另一目的是提供ー種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括胰島素和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物。
[0014]本發(fā)明的有利效果
[0015]本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物對(duì)糖尿病顯示出優(yōu)異的療效,并且特別地,其同時(shí)施用同時(shí)刺激胰島素受體和胰高血糖素樣肽-1受體以改善其體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間和穩(wěn)定性，并且顯著地減少藥物的所需劑量和穩(wěn)定地將血糖控制在穩(wěn)定水平，導(dǎo)致改善低血糖癥和體重増加。另外，其抑制惡心和嘔吐并且作為用于糖尿病的治療藥劑具有改善的藥物順應(yīng)性。特別地，其具有顯著改善的穩(wěn)定性和體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間，允許減少治療頻率，有利于患者便利。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是示出在向STZ(鏈脲霉素)誘發(fā)的糖尿病小鼠同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物后7天時(shí)期的血糖水平變化的圖；
[0017]圖2是示出向db/db小鼠同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物后空腹血糖變化(A FBG)的圖(按照 Dunnet's MC 檢驗(yàn) *P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001)；和
[0018]圖3是示出向db/db小鼠同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物后體重變化(A Bff)的圖(按照 Dunnet's MC 檢驗(yàn) *P〈0.05，**P〈0.01，_P〈0.001)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]在ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物。本發(fā)明的組合物特征在于長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的同時(shí)施用。
[0020]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)效胰島素綴合物”是指經(jīng)由非肽基連接體與免疫球蛋白Fe區(qū)連接的胰島素。
[0021]本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物與天然胰島素相比具有改善的體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間，并且該長(zhǎng)效胰島素綴合物可以包括通過(guò)天然胰島素的氨基酸序列的修飾、置換、添加或缺失而制備的胰島素、與生物可降解聚合物諸如聚乙二醇(PEG)綴合的胰島素、與長(zhǎng)效蛋白諸如白蛋白或免疫球蛋白綴合的胰島素、與具有結(jié)合體內(nèi)白蛋白的能力的脂肪酸綴合的胰島素、或包封在生物可降解的納米粒子中的胰島素，但是長(zhǎng)效胰島素綴合物的類型不限于此。
[0022]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“胰島素”是指響應(yīng)于血液中升高的葡萄糖水平由胰腺分泌的肽，其攝取肝、肌肉或脂肪組織中的葡萄糖并且將其轉(zhuǎn)變成糖原，并且停止利用脂肪作為能量來(lái)源，并且因此控制血糖水平。該肽包括天然胰島素、基礎(chǔ)胰島素、胰島素激動(dòng)劑、其前體、衍生物、片段及其變體。`
[0023]術(shù)語(yǔ)“天然胰島素”是由胰腺分泌以促進(jìn)葡萄糖吸收并抑制脂肪分解并且因此起控制血糖水平的作用的激素。胰島素由沒(méi)有調(diào)節(jié)血糖水平的功能的前體——已知為胰島素原——通過(guò)加工而形成。胰島素的氨基酸序列如下:
[0024]a 鏈:
[0025]Gly-1le-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-1le-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID N0.1)
[0026]^ 鏈:
[0027]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CyS-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID N0.2)
[0028]術(shù)語(yǔ)“基礎(chǔ)胰島素”是指管理正常每天血糖波動(dòng)的肽，例如諾和平、甘精胰島素、德谷胰島素(Deglude)等。
[0029]術(shù)語(yǔ)“胰島素激動(dòng)劑”是指結(jié)合至胰島素受體以顯示與胰島素相等的生物活性的化合物，其與胰島素的結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。
[0030]術(shù)語(yǔ)“胰島素變體”是具有ー個(gè)或多個(gè)與天然胰島素不同的氨基酸序列的肽，并且是指保留了控制體內(nèi)血糖水平的功能的肽，且其可以通過(guò)在天然胰島素的部分氨基酸序列中置換、添加、缺失和修飾中的任一種或通過(guò)其組合進(jìn)行制備。
[0031]術(shù)語(yǔ)“胰島素衍生物”是指與天然胰島素具有至少80%氨基酸序列同源性的肽，其氨基酸殘基上的一些基團(tuán)可以被化學(xué)取代(例如，a -甲基化、a-羥基化)、缺失(例如，脫氨基)或修飾(例如，N-甲基化)，并且該衍生物具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能。[0032]術(shù)語(yǔ)“胰島素片段”是指在天然胰島素的N-末端或C-末端處添加或缺失ー個(gè)或多個(gè)氨基酸的片段，其中可以添加非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，并且該片段具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能。
[0033]用于胰島素的激動(dòng)劑、衍生物、片段和變體的每ー種制備方法可以單獨(dú)或組合使用。例如，本發(fā)明包括具有ー個(gè)或多個(gè)與天然肽不同的氨基酸和N-末端氨基酸殘基的脫氨基并且具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能的肽。
[0034]在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的胰島素可以通過(guò)重組技術(shù)制備，并且也可以使用固相合成法合成。[0035]此外，本發(fā)明中使用的胰島素的特征在于將非肽基聚合物連接至胰島素的P鏈的氨基末端。此非肽基聚合物可以用作本發(fā)明中的連接體。該非肽基聚合物作為連接體連接，從而保持胰島素的活性并改善胰島素的穩(wěn)定性。
[0036]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“非肽基聚合物”是指包括彼此通過(guò)除肽鍵以外的任何共價(jià)鍵連接的兩個(gè)或多個(gè)重復(fù)單元的生物相容性聚合物。在本發(fā)明中，非肽基聚合物可以與非肽基連接體互換使用。
[0037]在本發(fā)明中有用的非肽基聚合物可以選自:生物可降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸及其組合，并且優(yōu)選地生物可降解聚合物可以是聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸こ醇酸(PLGA)，且更優(yōu)選地是聚乙二醇(PEG)。另外，本領(lǐng)域中已知的其衍生物和通過(guò)本領(lǐng)域中的已知方法容易制備的衍生物可以包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0038]在通過(guò)常規(guī)框內(nèi)融合法獲得的融合蛋白中使用的肽連接體的缺點(diǎn)在于其在體內(nèi)容易被蛋白水解酶裂解，并且因此不能如期望的那樣獲得通過(guò)載體増加活性藥物的血清半衰期的充分效應(yīng)。然而，在本發(fā)明中，對(duì)蛋白水解酶具有抗性的聚合物可以用來(lái)將肽的血清半衰期保持與載體的半衰期相似。因此，可以使用任何非肽基聚合物而沒(méi)有限制，只要其是具有上述功能的聚合物即可，即，對(duì)體內(nèi)蛋白水解酶具有抗性的聚合物。該非肽基聚合物的分子量在1-1OOkDa的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選為l_20kDa。本發(fā)明的與免疫球蛋白Fe區(qū)連接的非肽基聚合物可以是ー種聚合物或不同類型的聚合物的組合。
[0039]在本發(fā)明中使用的非肽基聚合物具有能夠結(jié)合至免疫球蛋白Fe區(qū)和蛋白藥物的反應(yīng)基團(tuán)。該非肽基聚合物在兩個(gè)末端均具有反應(yīng)基團(tuán)，所述反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選地選自:反應(yīng)性醛、丙醛、丁醛、馬來(lái)酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物。琥珀酰亞胺衍生物可以是琥珀酰亞胺基丙酸酷、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基羧甲基或琥珀酰亞胺基碳酸酷。具體地，當(dāng)非肽基聚合物在其兩個(gè)末端均具有反應(yīng)性醛基時(shí)，其在兩個(gè)末端有效地連接生理活性多肽和免疫球蛋白，具有最小的非特異性反應(yīng)。通過(guò)醛鍵的還原性烷基化生成的最終產(chǎn)物比通過(guò)酰胺鍵連接的產(chǎn)物穩(wěn)定得多。醛反應(yīng)基團(tuán)在低PH下選擇性地結(jié)合至N-末端，并且在高pH諸如9.0下結(jié)合至賴氨酸殘基以形成共價(jià)鍵。非肽基聚合物的兩個(gè)末端處的反應(yīng)基團(tuán)可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可以在一端具有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，而在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。當(dāng)使用在其兩個(gè)末端具有反應(yīng)性羥基的聚乙二醇作為非肽基聚合物時(shí)，羥基可以通過(guò)已知的化學(xué)反應(yīng)被活化成各種反應(yīng)基團(tuán)，或可以使用具有可購(gòu)買得到的修飾的反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇以制備本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物。優(yōu)選地，非肽基聚合物可以連接于胰島素的P鏈的N-末端處。[0040]本發(fā)明的胰島素可以用非肽基聚合物修飾。
[0041]實(shí)際上，用于防止低血糖癥和改善功效的持續(xù)時(shí)間的PEG(聚乙二醇)修飾使得生理活性肽的效價(jià)非常低。然而，在使用免疫球蛋白片段開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效胰島素綴合物中這個(gè)缺點(diǎn)變成了優(yōu)點(diǎn)。因此，PEG修飾的胰島素可以經(jīng)由非肽基聚合物連接至免疫球蛋白Fe區(qū)。在胰島素修飾中使用的非肽基聚合物可以選自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、生物可降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸及其組合，并且優(yōu)選地是聚乙二醇。在PEG修飾的胰島素中的PEG修飾的特征在于PEG選擇性地結(jié)合至胰島素的a鏈的N-末端或結(jié)合至胰島素的P鏈的特定賴氨酸殘基。PEG修飾胰島素優(yōu)選地包括在其末端的反應(yīng)性醛基和琥珀?；鶊F(tuán)，并且更優(yōu)選地包括反應(yīng)性琥珀?；鶊F(tuán)。
[0042]本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物的制備方法和功效詳細(xì)地描述在韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010-0054068、2010-0054067和2011-0030868中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在免疫球蛋白Fe區(qū)的N-末端處進(jìn)行單聚乙二醇化，并用其修飾胰島素的P鏈位置I處的苯丙氨酸以制備長(zhǎng)效胰島素綴合物(實(shí)施例1)。
[0043]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物”是指經(jīng)由非肽基連接體與免疫球蛋白Fe區(qū)連接的促胰島素肽。
[0044]在本發(fā)明中，“促胰島素肽”是指保留了釋放胰島素的功能并且刺激胰腺P細(xì)胞中胰島素的合成或表達(dá)的肽。 優(yōu)選地，促胰島素肽是GLP (胰高血糖素樣肽)-Uexendin-3或exendin-4，但不限于此。促胰島素肽包括天然促胰島素肽、其前體、其激動(dòng)劑、其衍生物、其片段及其變體。
[0045]本發(fā)明的促胰島素肽衍生物可以包括脫氨基組氨酰基衍生物——其中促胰島素肽的N-末端氨基被去除、(6-羥基咪唑并丙?；苌铩渲邪被涣u基取代、二甲基組氨?；苌铩渲邪被粌蓚€(gè)甲基修飾、P-羧基咪唑并丙?；苌铩渲蠳-末端氨基被羧基取代、或咪唑并こ酰基衍生物——其中N-末端組氨酸殘基的a碳被去除以僅保留咪唑并こ?；⑶乙虼艘瞥税被恼姾?，并且其他N-末端氨基修飾的衍生物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0046]在本發(fā)明中，促胰島素肽衍生物更優(yōu)選是具有化學(xué)修飾的N-末端氨基(或胺)基團(tuán)或氨基酸殘基的exendin-4衍生物,甚至更優(yōu)選地通過(guò)移除或取代exendin-4的N-末端Hisl殘基的a碳中存在的a氨基或者通過(guò)移除或取代a碳制備的exendin_4衍生物。還更優(yōu)選地，移除N-末端氨基的脫氨基組氨酰基-exendin-4 (DA-Exendin-4)、通過(guò)用羥基取代氨基制備的0 -羥基咪唑并丙基-exendin-4 (HY-exendin-4)、通過(guò)用羧基取代氨基制備的P -羧基咪唑并丙基-exendin-4 (CX-exendin-4)、通過(guò)用兩個(gè)甲基殘基修飾氨基制備的二甲基-組氨?；?61611(1;[11-4(011-61611(1;[11-4)、或移除1^-末端組氨酸殘基的a碳的咪唑并こ酸基-exendin-4 (CA-exendin-4)。
[0047]GLP-1是由小腸分泌的激素，并且通常促進(jìn)胰島素的生物合成和分泌、抑制胰高血糖素分泌并且促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖。在小腸中，胰高血糖素前體分解成三種肽，即，胰高血糖素、GLP-1和GLP-2。在此，GLP-1是指GLP-1 (1_37)，其最初為沒(méi)有促胰島素功能的形式，但其然后被加工并轉(zhuǎn)變成活化的GLP-1 (7-37)形式的GLP-1。GLP-1 (7_37)氨基酸的序列如下:[0048]GLP-1 (7-37)
[0049]HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G (SEQ ID N0.3)
[0050]術(shù)語(yǔ)“GLP-1衍生物”是指表現(xiàn)出與GLP-1具有至少80%氨基酸序列同源性的肽，可以是化學(xué)修飾的形式，并且表現(xiàn)出與GLP-1至少相等或更多的促胰島素功能。 [0051]術(shù)語(yǔ)“GLP-1片段”是指其中在天然GLP-1的N-末端或C-末端處添加或缺失ー個(gè)或多個(gè)氨基酸的形式，其中添加的氨基酸可能是非天然氨基酸(例如，D-型氨基酸)。
[0052]術(shù)語(yǔ)“GLP-1變體”是指具有促胰島素功能的肽，其具有ー個(gè)或多個(gè)與天然GLP-1不同的氨基酸序列。
[0053]Exendin-3和exendin-4是由39個(gè)氨基酸組成的促胰島素肽,其與GLP-1具有53%氨基酸序列同源性。Exendin-3和exendin-4的氨基酸序列如下:
[0054]Exendin-3
[0055]HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEff LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID N0.4)
[0056]Exendin-4
[0057]HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEff LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID N0.5)
[0058]術(shù)語(yǔ)“exendin激動(dòng)劑”是指在體內(nèi)與受體反應(yīng)并且具有與exendin相等的生物活性的化合物。
[0059]術(shù)語(yǔ)“exendin衍生物”是指與天然exendin具有至少80%氨基酸序列同源性的肽，其氨基酸殘基上的一些基團(tuán)被化學(xué)取代(例如，a -甲基化、a -羥基化)、去除(例如，脫氨基)或修飾(例如，N-甲基化)，并且具有促胰島素功能。
[0060]術(shù)語(yǔ)“exendin片段”是指在天然exendin的N-末端或C-末端處添加或缺失ー個(gè)或多個(gè)氨基酸的片段，其中可以添加非天然氨基酸(例如，D-型氨基酸)，并且具有促胰島素功能。
[0061]術(shù)語(yǔ)“exendin變體”是指具有至少ー個(gè)與天然exendin不同的氨基酸序列的肽，其具有促胰島素功能，并且exendin變體包括用絲氨酸或精氨酸在exendin-4的位置12處置換賴氨酸制備的肽。
[0062]用于exendin激動(dòng)劑、衍生物、片段和變體的每ー種制備方法可以單獨(dú)或組合使用。例如，本發(fā)明包括促胰島素肽，其具有氨基酸序列，該氨基酸序列具有至少ー個(gè)與天然促胰島素肽的氨基酸不同的氨基酸，以及具有在N-末端處被脫氨基的氨基酸殘基。
[0063]在具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的天然促胰島素肽和修飾的促胰島素肽可以使用固相合成方法合成，并且包括天然促胰島素肽的大多數(shù)天然肽可以通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)。
[0064]在本發(fā)明中使用的長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物是指經(jīng)由非肽基連接體與免疫球蛋白片段諸如免疫球蛋白Fe連接的促胰島素肽。非肽基連接體與上述的相同。長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物是如在長(zhǎng)效胰島素綴合物中使用免疫球蛋白片段的綴合物，并且保持了促胰島素肽的常規(guī)體內(nèi)活性，諸如促進(jìn)胰島素的合成和分泌、食欲控制、體重減輕、P細(xì)胞對(duì)血液中葡萄糖的敏感性増加、促進(jìn)3細(xì)胞増殖、延緩胃排空和胰高血糖素抑制，并且進(jìn)一步顯著地増加促胰島素肽的血液半衰期，并且隨之增加肽的體內(nèi)功效持續(xù)效應(yīng)。因此，其在糖尿病和肥胖癥的治療中是有用的。
[0065]長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的類型和制備方法詳細(xì)地描述在韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?008-001479,2008-0069234 和 2010-0047019 中。
[0066]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，咪唑并こ?；鵨xendin_4(CA exendin-4)的賴氨酸(Lys)用PEG修飾,并且PEG修飾的exendin-4與免疫球蛋白Fe連接以制備長(zhǎng)效exendin-4綴合物(實(shí)施例2)。
[0067]在本發(fā)明中使用的胰島素和促胰島素肽使用非肽基聚合物作為連接體與載體物質(zhì)連接。在本發(fā)明中有用的載體物質(zhì)可以選自免疫球蛋白Fe區(qū)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和PEG，并且優(yōu)選免疫球蛋白Fe區(qū)。
[0068]本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物和促胰島素肽綴合物中的每ー個(gè)通過(guò)將胰島素或促胰島素肽經(jīng)由非肽基連接體與免疫球蛋白Fe區(qū)連接進(jìn)行制備，由此顯示持續(xù)性和穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，免疫球蛋白Fe可以與免疫球蛋白片段互換使用。
[0069]此外，F(xiàn)e片段就具有Fe 片段的絡(luò)合物的制備、純化和產(chǎn)率而言是有益的，因?yàn)槠湎鄬?duì)于整個(gè)免疫球蛋白分子具有小的分子量。此外，由于因抗體間氨基酸序列的差異而表現(xiàn)出高度不均一性的Fab區(qū)被移除，F(xiàn)e片段具有大大增加的物質(zhì)均一性和低的誘導(dǎo)血清抗原性的可能性。
[0070]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白Fe區(qū)”是指含有免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)2(CH2)和重鏈恒定區(qū)3(CH3)——不包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)、免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)
I(CHl)和輕鏈恒定區(qū)I(CLl)的蛋白。其還可以包括重鏈恒定區(qū)處的鉸鏈區(qū)。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)可以含有部分或全部的Fe區(qū)，包括重鏈恒定區(qū)I (CHl)和/或輕鏈恒定區(qū)I (CLl)，不包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)，只要其具有與天然蛋白基本相似或更好的生理功能即可。此外，免疫球蛋白Fe區(qū)可以是CH2和/或CH3的氨基酸序列的相對(duì)長(zhǎng)的部分缺失的片段。即，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)可以包括1)CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域，2) CHl結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，3) CHl結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，5) —個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白鉸鏈區(qū)(或鉸鏈區(qū)的一部分)的組合，和6)重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的每個(gè)結(jié)構(gòu)域的二聚體。
[0071]本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)包括天然氨基酸序列，及其序列衍生物(突變體)。氨基酸序列衍生物是由于一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入、非保守或保守置換或其組合引起的與天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fe中，在位置214至238、297至299、318至322或327至331處，已知在結(jié)合中重要的氨基酸殘基可以用作修飾的合適靶標(biāo)。
[0072]此外，其他多種衍生物是可能的，包括其中能夠形成二硫鍵的區(qū)域缺失，或在天然Fe形式的N末端處去除特定的氨基酸殘基或向其添加甲硫氨酸殘基的衍生物。此外，為了去除效應(yīng)器功能，缺失可以發(fā)生在補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)，諸如Clq-結(jié)合位點(diǎn)和ADCC (抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用)位點(diǎn)。制備免疫球蛋白Fe區(qū)的此類序列衍生物的技術(shù)公開(kāi)在W097/34631 和 W096/32478 中。
[0073]蛋白和肽中的氨基酸交換在本領(lǐng)域中是已知的，其通常不改變蛋白或肽的活性(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最常發(fā)生的交換是雙方向的 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。另外，如果需要，F(xiàn)e區(qū)可以通過(guò)磷酸化、硫酸化、?；⑻腔?、甲基化、法尼基化、こ?；?、酰胺化等被修飾。[0074]上述的Fe衍生物是具有與本發(fā)明的Fe區(qū)相同的生物活性或改善的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，例如針對(duì)熱、pH等的衍生物。
[0075]另外，這些Fe區(qū)可以從分離自人和其他動(dòng)物的天然形式獲得，所述動(dòng)物包括奶牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉(cāng)鼠、大鼠和豚鼠，或可以是獲得自轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞或微生物的其重組體或衍生物。在此，它們可以通過(guò)從人或動(dòng)物有機(jī)體分離整個(gè)免疫球蛋白并用蛋白水解酶處理它們而從天然免疫球蛋白獲得。木瓜蛋白酶將天然免疫球蛋白消化為Fab和Fe區(qū)，并且胃蛋白酶處理導(dǎo)致產(chǎn)生pF’ c和F(ab)2片段。這些片段可以進(jìn)行例如尺寸排阻色譜以分離Fe或pF’ C。優(yōu)選地，人源Fe區(qū)是從微生物獲得的重組體免疫球蛋白Fe區(qū)。
[0076]另外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)可以以具有天然糖鏈的形式，與天然形式相比具有増加的糖鏈的形式或與天然形式相比具有減少的糖鏈的形式，或可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fe糖鏈的增加、減少或去除可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，諸如化學(xué)方法、酶學(xué)方法和使用微生物的基因工程方法。從Fe區(qū)去除糖鏈導(dǎo)致與第一補(bǔ)體成分Cl的Clq部分的結(jié)合親和カ急劇下降，以及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用的減少或喪失，從而不會(huì)在體內(nèi)誘導(dǎo)不必要的免疫應(yīng)答。就此而言，去糖基化或無(wú)糖基化形式的免疫球蛋白Fe區(qū)可以更適合于本發(fā)明的作為藥物載體的目的。 [0077]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“去糖基化”是指從Fe區(qū)通過(guò)酶法去除糖部分，并且術(shù)語(yǔ)“無(wú)糖基化”是指通過(guò)原核生物，優(yōu)選大腸桿菌以無(wú)糖基化的形式生產(chǎn)Fe區(qū)。
[0078]同時(shí)，免疫球蛋白Fe區(qū)可以來(lái)源于人或其他動(dòng)物，包括奶牛、山羊、豬、小鼠、免、倉(cāng)鼠、大鼠和豚鼠，并且優(yōu)選來(lái)源于人。
[0079]另外，免疫球蛋白Fe區(qū)可以是來(lái)源于IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fe區(qū)，或通過(guò)其組合或其雜合體制造的Fe區(qū)。優(yōu)選地，其來(lái)源于IgG或IgM，兩者是人血液中最豐富的蛋白，并且最優(yōu)選來(lái)源于IgG，已知其增強(qiáng)配體結(jié)合蛋白的半衰期。
[0080]另ー方面，如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“組合”是指編碼相同來(lái)源的單鏈免疫球蛋白Fe區(qū)的多肽與不同來(lái)源的單鏈多肽連接以形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可以由兩個(gè)或多個(gè)選自IgG Fe、IgA Fe、IgM Fe、IgD Fe和IgE Fe片段的片段形成。
[0081]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“雜合體”是指編碼不同來(lái)源的兩個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白Fe區(qū)的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fe區(qū)中。在本發(fā)明中，多種類型的雜合體是可能的。即，雜合結(jié)構(gòu)域可以由 1-4 個(gè)選自 IgG Fe、IgM Fe、IgA Fe、IgE Fe 和 IgD Fe 的 CH1、CH2、CH3和CH4的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，并且可以包括鉸鏈區(qū)。
[0082]另ー方面，IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類，并且本發(fā)明包括其組合和雜合體。優(yōu)選IgG2和IgG4亞類，并且最優(yōu)選IgG4的Fe區(qū)，其很少具有效應(yīng)器功能諸如CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用)。
[0083]即，作為本發(fā)明的藥物載體，最優(yōu)選的免疫球蛋白Fe區(qū)是人IgG4源的非糖基化Fe區(qū)。人源的Fe區(qū)比非人源的Fe區(qū)更優(yōu)選，非人源的Fe區(qū)可能充當(dāng)人身體中的抗原并且導(dǎo)致不期望的免疫應(yīng)答，諸如產(chǎn)生針對(duì)該抗原的新抗體。
[0084]本發(fā)明的組合物特征在于長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的同時(shí)施用。
[0085]當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的同時(shí)施用時(shí)，長(zhǎng)效胰島素綴合物充當(dāng)胰島素受體并且同時(shí)長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物充當(dāng)胰高血糖素樣肽-1受體，使得與其単一施用相比，血糖水平降低并保持穩(wěn)定的血糖水平。綴合物的同時(shí)施用的作用是減少可以被胰島素的単一施用誘發(fā)的低血糖癥和體重増加的風(fēng)險(xiǎn)，并且由于促胰島素肽的作用還減少總胰島素的劑量。同時(shí)施用的優(yōu)點(diǎn)還在于促胰島素肽諸如exendin-4的劑量也可以減小從而防止不利的影響諸如由exendin-4的單ー施用引起的惡心和嘔吐。長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的使用顯著地増加了血液半衰期和體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間，使得減少治療頻率以改善遭受每天注射的慢性患者的生活質(zhì)量。因此，其對(duì)于糖尿病的治療是非常有用的。此外，本發(fā)明的藥物組合物顯示了優(yōu)異的體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間和效價(jià)，并且在同時(shí)施用時(shí)可以大大地減少劑量。
[0086]長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物可以同時(shí)、序貫或逆序施用，并且可以以有效劑量的適宜組合同時(shí)施用。優(yōu)選地，長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物可以單獨(dú)地保存在單個(gè)容器中，并且然后同時(shí)、序貫或逆序施用。
[0087]此外，用于本發(fā)明的同時(shí)施用的組合物可以以用于糖尿病的治療試劑盒的形式，其包括處于單一容器中的或分開(kāi)地處于單個(gè)容器中的長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物。所述試劑盒可以包括藥學(xué)上可接受的載體和說(shuō)明書(shū)手冊(cè)。
[0088]在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施例中，在向STZ (鏈脲霉素)誘發(fā)的糖尿病小鼠同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物后檢查血糖水平變化。結(jié)果，與単一施用相比，綴合物的同時(shí)施用顯示穩(wěn)定模式的血糖水平(圖1)。比較在2型糖尿病的小鼠模型中一周一次同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物前后的空腹血糖水平。結(jié)果，與単一施用相比，同時(shí)施用顯示優(yōu)異的血糖水平改善(圖2)。另外，沒(méi)有觀察到由胰島素治療引起的體重増加，這表明同時(shí)施用減少了由于胰島素引起的體重増加的副作用(圖3)。
[0089]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“糖尿病”是指由胰島素的分泌或功能異常導(dǎo)致的代謝性疾病。執(zhí)行本發(fā)明的組合物對(duì)受試者的同時(shí)施用以控制血糖水平，從而治療糖尿病。
[0090]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指通過(guò)同時(shí)施用本發(fā)明的組合物限制或阻止糖尿病的發(fā)生的所有行為，并且術(shù)語(yǔ)“治療”是指通過(guò)同時(shí)施用本發(fā)明的組合物將糖尿病的癥狀變好或有利地改變的所有行為。治療糖尿病可以應(yīng)用于可能患有糖尿病的任何哺乳動(dòng)物，并且其實(shí)例包括人和靈長(zhǎng)類以及家畜諸如牛、豬、綿羊、馬、狗、和貓，而沒(méi)有限制，并且優(yōu)選是人。
[0091]如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“施用”是指將預(yù)定量的物質(zhì)通過(guò)特定的合適方法引入患者。組合物可以經(jīng)由任一常用途徑施用，只要其能夠到達(dá)期望的組織?？紤]多種施用模式，包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉、皮下、皮內(nèi)、ロ服、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)，但本發(fā)明不限于這些列舉的施用模式。然而，由于在ロ服施用時(shí)肽被消化，用于ロ服施用的組合物的活性成分應(yīng)當(dāng)被包衣或配制以保護(hù)免于在胃中的降解。優(yōu)選地，多聚體可以以可注射的形式施用。另外，藥物組合物可以使用能夠?qū)⒒钚猿煞州斔椭涟屑?xì)胞中的特定設(shè)備施用。
[0092]此外，本發(fā)明的藥物組合物可以由數(shù)個(gè)相關(guān)因素確定，包括待治療疾病的類型、施用途徑、患者的年齡、性別、體重和疾病嚴(yán)重性，以及用作活性成分的藥物的類型。
[0093]此外，本發(fā)明的藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體。如在本文中使用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指對(duì)有機(jī)體不導(dǎo)致顯著的刺激并且不會(huì)消除施用的化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。對(duì)于ロ服施用，藥學(xué)上可接受的載體可以包括粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、著色劑和風(fēng)味劑。對(duì)于可注射制劑，藥學(xué)上可接受的載體可以包括緩沖劑、防腐剤、止痛劑、增溶剤、等滲劑和穩(wěn)定劑。對(duì)于局部施用的制劑，藥學(xué)上可接受的載體可以包括基質(zhì)(base)、賦形劑、潤(rùn)滑劑和防腐剤。本發(fā)明的藥物組合物可以與上述的藥學(xué)上可接受的載體組合配制成多種劑型。例如，對(duì)于ロ服施用，藥物組合物可以被配制成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿或薄片(wafer)。對(duì)于可注射制劑，藥物組合物可以被配制成單位劑型，諸如多劑量容器或作為單劑量劑型的安瓿。藥物組合物也可以被配制成為溶液、混懸劑、片劑、丸剤、膠囊和長(zhǎng)效制劑。
[0094]另ー方面，適合于藥物制劑的載體、賦形劑和稀釋劑的實(shí)例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酷、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。另外，藥物制劑可以進(jìn)ー步包括填料、抗凝劑、潤(rùn)滑劑、保濕劑、風(fēng)味劑和殺菌劑。
[0095]在另ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療糖尿病的方法，包括向患有糖尿病或處于患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者施用包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的組合物的步驟。
[0096]所述施用步驟可以通過(guò)同時(shí)施用所述長(zhǎng)效胰島素綴合物和所述長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物進(jìn)行，但不限于同時(shí)、序貫或逆序地施用，并且以有效劑量的適宜組合同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物。
[0097]即使一周施用一次，本發(fā)明的包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物兩者的組合物顯示出優(yōu)異的血糖水平的改善并且不導(dǎo)致體重増加的副作用，并且因此可以用于糖尿病的預(yù)防或治療。
[0098]在另ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療糖尿病的包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和促胰島素肽的藥物組合物。
[0099]長(zhǎng)效胰島素綴合物和促胰島素肽與上述相同。長(zhǎng)效胰島素綴合物可以與促胰島素肽諸如GLP-1激動(dòng)劑(例如，艾塞那肽、利拉魯肽(Liraglutide)或利西拉肽(Lixisenatide))同時(shí)施用。
[0100]在另ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療糖尿病的包括胰島素和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物的藥物組合物。
[0101]胰島素和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物與上述相同。長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物可以與胰島素諸如天然胰島素、胰島素衍生物或基礎(chǔ)胰島素同時(shí)施用。
[0102]實(shí)施本發(fā)明的方式
[0103]下文中，將參照下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅用于例證性目的，并且本發(fā)明不意欲限于此。
[0104]實(shí)施例1:長(zhǎng)效胰島素綴合物的制備
[0105]用5K PropionALD (3) PEG (具有三個(gè)丙醛基的PEG，N0F，日本)聚乙二醇化免疫球蛋白Fe區(qū)的N-末端，免疫球蛋白Fe區(qū)和PEG以1:2的摩爾比在4°C反應(yīng)4.5h，免疫球蛋白Fe濃度為10mg/mL。此時(shí)，反應(yīng)在IOOmM磷酸鉀(pH6.0)中進(jìn)行，并向其添加還原劑20mMSCB (NaCNBH3) o使用SOURCE 15Q (GE Healthcare)純化柱將單聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe從反應(yīng)混合物中純化。
[0106]為了制備在胰島素的P鏈的位置I處的苯丙氨酸(BlF)具有90%或更多修飾的胰島素-PEG-免疫球蛋白Fe綴合物，單聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe和胰島素以4:1的摩爾比制備，并且總蛋白濃度為20mg/mL，并且在4°C與彼此反應(yīng)20h。IOOmM磷酸鉀(pH6.0)用作反應(yīng)溶液，并且向其添加作為還原劑的20mM SCB0在終止反應(yīng)后，使用Sourcel5Q純化柱進(jìn)行反應(yīng)混合物的初步純化。然后，使用SourCe15ISO純化柱進(jìn)行第二次純化以獲得胰島素-PEG-免疫球蛋白Fe綴合物。
[0107]實(shí)施例2:長(zhǎng)效exendin-4綴合物的制備
[0108]使用咪唑并こ酸基exendin-4 (CA exendin-4, AP, USA)使3? 4k PropionALD (2)PEG與CA exendin-4的賴氨酸(Lys)反應(yīng)。在兩個(gè)Lys異構(gòu)體峰之間,最后一個(gè)異構(gòu)體峰(Lys27的位置異構(gòu)體)——其具有更多反應(yīng)并且容易與N-末端異構(gòu)體峰區(qū)分——用于偶聯(lián)反應(yīng)。
[0109]以肽:免疫球蛋白Fe為1:8的摩爾比在4°C下進(jìn)行反應(yīng)20h，并且蛋白的總濃度為60mg/mL。在IOOmM K-P (pH6.0)的溶液中進(jìn)行反應(yīng)，并且加入20mM SCB作為還原劑。偶聯(lián)反應(yīng)溶液通過(guò)兩個(gè)純化柱進(jìn)行純化。首先，SOURCE Q (XK16mL, Amersham Biosciences)用于去除大量的沒(méi)有參與偶聯(lián)反應(yīng)的免疫球蛋白Fe。使用具有鹽梯度的20mM Tris (pH7.5)和IM NaCl，具有相對(duì)弱的結(jié)合力的免疫球蛋白Fe被較早洗脫，并且然后洗脫exendin-4-免疫球蛋白Fe。通過(guò)該首次純化程序，在一定程度上去除了免疫球蛋白Fe，但由于免疫球蛋白Fe和exendin-4-免疫球蛋白Fe在離子交換柱中具有與彼此相似的結(jié)合力，它們不能被完全地彼此分開(kāi)。因此，利用兩種物質(zhì)中的每ー種的疏水性進(jìn)行第二次純化。使用在SOURCEISO (HR 16mL, Amersham Biosciences)中的 20mM Tris (pH7.5)和 1.5M 硫酸銨，偶聯(lián)第一次純化的樣品，并且通過(guò)逐漸降低硫酸銨的濃度洗脫該樣品。在HIC柱中，具有弱結(jié)合力的免疫球蛋白Fe被較早洗脫，并且然后具有強(qiáng)結(jié)合力的exendin-4-免疫球蛋白Fe樣品被洗脫。由于它們具有顯著不同的疏水性，因此它們可以比在離子交換柱中更容易地彼此分開(kāi)。
[0110]柱:SOURCEQ(XK16mL, Amersham Biosciences)
[0111]流速:2.0mL/min
[0112]梯度:A0->25%70minB(A:20mM Tris pH7.5, B:A+1M NaCl)
[0113]柱:SOURCEISO(HR16mL, Amersham Biosciences)
[0114]流速:7.0mL/min
[0115]梯度:B100— 0%60min B(A:20mM Tris pH7.5, B:A+1.5M硫酸銨)
[0116]實(shí)施例3:在STZ(鏈脲霉素)誘發(fā)的糖尿病中同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的功效測(cè)試
[0117]為了進(jìn)行對(duì)包括在實(shí)施例1和2中制備的長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的組合物的施用或長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的同時(shí)施用的體內(nèi)功效測(cè)試，使用STZ (鏈脲霉素)誘發(fā)的糖尿病小鼠檢查血糖水平變化。
[0118]在禁食16h的7周齡C57BL/6小鼠中連續(xù)5天通過(guò)腹膜內(nèi)注射在IOmM檸檬酸緩沖液(pH4.5)中的STZ(50mg/kg，lmg/mL)誘發(fā)糖尿病。2天后，使用26G注射器從尾靜脈取1-2滴血，并且使用血糖儀(OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA)測(cè)量血糖。通過(guò)測(cè)量的血糖(350-600mg/dL)確定糖尿病誘發(fā)。
[0119]將誘發(fā)糖尿病的小鼠分成5組，每組5只小鼠:G1, G2，G3，G4和G5。
[0120]將所述組分為未治療對(duì)照組(載體)、長(zhǎng)效exendin-4綴合物治療的組(5mcg/kg)、長(zhǎng)效胰島素綴合物治療的組(100mcg/kg)、長(zhǎng)效exendin-4綴合物(5mcg/kg)和長(zhǎng)效胰島素綴合物(50mcg/kg)治療的組、以及長(zhǎng)效exendin-4綴合物(5mcg/kg)和長(zhǎng)效胰島素綴合物(lOOmcg/kg)治療的組。在上述測(cè)試材料治療后，每天在每組中測(cè)量血糖水平變化。
[0121]結(jié)果，與單ー施用長(zhǎng)效exendin-4綴合物或長(zhǎng)效胰島素綴合物相比，長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的同時(shí)治療顯示穩(wěn)定的血糖水平和持續(xù)的降血糖效應(yīng)(圖1)，并且顯示顯著較低的血糖水平。
[0122]這些結(jié)果指示同時(shí)施用本發(fā)明的長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物顯示穩(wěn)定和持續(xù)的降血糖效應(yīng)，并且因此顯著地減少施用劑量，導(dǎo)致exendin-4的副作用諸如嘔吐和惡心的減少并防止由胰島素治療引起的體重增加。
[0123]實(shí)施例4:同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物引起的空腹血糖(A FBG)和體重(A Bff)的變化
[0124]為了進(jìn)行對(duì)包括在實(shí)施例1和2中制備的長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的組合物的施用或長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的同時(shí)施用的體內(nèi)功效測(cè)試，使用2型糖尿病db/db小鼠檢查血糖水平的改善和體重増加的抑制。
[0125]將2型糖尿病db/db小鼠分成長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的單一施用組和同時(shí)施用組。單ー施用組分別用430nmol/kg長(zhǎng)效胰島素綴合物和2.3nmol/kg長(zhǎng)效exendin-4綴合物通過(guò)皮下注射一周一次進(jìn)行治療。同時(shí)施用組用108nmol/kg和216nmol/kg的長(zhǎng)效胰島素綴合物和2.3nmol/kg的長(zhǎng)效exendin-4綴合物通過(guò)皮下注射一周一次進(jìn)行治療。測(cè)試進(jìn)行28天，并且在初次藥物治療前和實(shí)驗(yàn)的最后一天將動(dòng)物禁食8h，并且然后測(cè)定藥物治療前和實(shí)驗(yàn)的最后一天的空腹血糖(AFBG)和體重(ABW)的變化并且作為最終的測(cè)試項(xiàng)目計(jì)算。
[0126]A FBG和A Bff的測(cè)量結(jié)果顯不一周一次同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物顯示出與長(zhǎng)效胰島素綴合物的単一施用相比，在四分之一的胰島素劑量(108nmol/kg)下改善血糖水平(圖2)和抑制體重増加(圖3)的優(yōu)異效應(yīng)。這些結(jié)果顯示同時(shí)施用長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效CA exendin-4綴合物的優(yōu)勢(shì)是降低低血糖癥的風(fēng)險(xiǎn)并通過(guò)減少胰島素的劑量抑制體重増加，表明即使一周進(jìn)行一次同時(shí)施用，與胰島素和GLP-1激動(dòng)劑的每天注射相比，其顯示出優(yōu)異的降血糖效應(yīng)，并且還顯示比単一施用更好的優(yōu)異的血糖控制，并且其減少對(duì)胰島素的需求，從而降低了胰島素引起的低血糖癥和體重増加的風(fēng)險(xiǎn)。
[0127]這些結(jié)果支持，即使一周施用一次，本發(fā)明的包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效exendin-4綴合物的組合物顯示優(yōu)異的血糖控制并且不誘發(fā)由胰島素治療引起的體重增加，同時(shí)其顯著地減少由已知的胰島素肽和exendin-4的単一施用所導(dǎo)致的副作用。
【權(quán)利要求】
1.ー種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物，其中通過(guò)將胰島素或促胰島素肽與免疫球蛋白Fe區(qū)經(jīng)由非肽基連接體連接制備所述長(zhǎng)效胰島素綴合物和所述長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物中的每ー個(gè)，所述非肽基連接體選自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、生物可降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸及其組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述胰島素是天然胰島素，基礎(chǔ)胰島素，通過(guò)天然胰島素的氨基酸序列的置換、添加、缺失、修飾或其組合中的任一種而制備的胰島素變體，胰島素衍生物或其片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述胰島素用非肽基聚合物修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述非肽基聚合物選自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、生物可降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸及其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述促胰島素肽選自:GLP-l、eXendin-3、exendin-4、其激動(dòng)劑、其衍生物、其片段、其變體及其組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述促胰島素肽通過(guò)用選自脫氨基組氨?；⒍谆M氨?；?6-羥基咪唑并丙?；?-咪唑并こ?；?6-羧基咪唑并丙?；奈镔|(zhì)置換促胰島素肽的N-末端組氨酸殘基而制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述促胰島素肽選自天然exendin-4、通過(guò)缺失N-末端胺基制備的exendin-4衍生物、通過(guò)用羥基置換N-末端胺基制備的exendin-4衍生物、通過(guò)用二甲基修飾N -末端胺基制備的exendin-4衍生物、通過(guò)缺失exendin-4的第一個(gè)氨基酸(組氨酸)的a -碳制備的exendin-4衍生物、通過(guò)用絲氨酸置換exendin-4的第12個(gè)氨基酸(賴氨酸)制備的exendin-4變體以及通過(guò)用精氨酸置換exendin-4的第12個(gè)氨基酸(賴氨酸)制備的exendin-4變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是無(wú)糖基化的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)由選自CHl、CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域的1-4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)還包含鉸鏈區(qū)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是來(lái)源于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fe區(qū)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)的每個(gè)結(jié)構(gòu)域是選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的不同來(lái)源的雜合結(jié)構(gòu)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是由相同來(lái)源的單鏈免疫球蛋白構(gòu)成的二聚體或多聚體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包括藥學(xué)上可接受的載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述長(zhǎng)效胰島素綴合物和所述長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物被同時(shí)、序貫或逆序施用。
16.ー種用于預(yù)防或治療糖尿病的方法，其包括向患有糖尿病或處于患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者施用權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的組合物的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述施用步驟通過(guò)同時(shí)施用所述長(zhǎng)效胰島素綴合物和所述長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述同時(shí)施用通過(guò)同時(shí)、序貫或逆序地施用所述長(zhǎng)效胰島素綴合物和所述長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物進(jìn)行。
19.ー種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括長(zhǎng)效胰島素綴合物和促胰島素肽。
20.ー種用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括胰島素和長(zhǎng)效促胰島素肽綴合物。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK103596595SQ201280026982
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月2日
【發(fā)明者】禹姈銀, 張明賢, 樸永振, 樸榮敬, 林昌基, 權(quán)世昌 申請(qǐng)人:韓美科學(xué)株式會(huì)社