作為CXC4拮抗劑的β-發(fā)夾肽模擬物的制作方法
【專利摘要】二硫鍵在Cys4和Cys11之間的通式為環(huán)(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)的β-發(fā)夾肽模擬物及其可藥用鹽，其中Xaa3、Xaa7、Xaa8、Xaa13和Xaa14是說明書和權(quán)利要求書中定義的某些類型的氨基酸殘基，這些β-發(fā)夾肽模擬物具備有利的藥理學特性并且可以用于預防健康個體中的HIV感染或用于延緩并制止感染患者中的病毒進展；或用于其中癌癥由CXCR4受體活性介導或因其產(chǎn)生的情況；或用于其中免疫學疾病由CXCR4受體活性介導或因其產(chǎn)生的情況；或用于治療免疫抑制；或用于外周血干細胞的血漿分離置換采集期間和/或用作誘導干細胞動員以調(diào)節(jié)組織修復的物質(zhì)。這些肽模擬物可以通過基于混合固相和溶液相合成策略的方法制備。
【專利說明】作為CXC4拮抗劑的β -發(fā)夾肽模擬物
[0001]本發(fā)明提供了具有CXCR4拮抗活性并且由W02004/096840A1中的一般公開涵蓋，但是沒有在其中具體公開的β_發(fā)夾肽模擬物。
[0002]本發(fā)明的β -發(fā)夾肽模擬物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyr1-His2-Xaa3-CyS4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cysn-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)及其可藥用鹽，Xaa3是如下文所述的Ala、Tyr或Tyr (Me), Xaa7是如下文所述的DTyr、DTyr (Me)或DPro, Xaa8是如下文所述的Dab或Orn (iPr), Xaa13是Gln或Glu,并且Xaa14是如下文所述的 Lys (iPr)。
[0003]此外，本發(fā)明提供高效的合成方法，其中如果需要，這些化合物可以通過所述合成方法以平行文庫模式產(chǎn)生。這些β_發(fā)夾肽模擬物具有有利的藥理學特性，并且此外，顯示合適的血漿蛋白結(jié)合作用和適宜的清除率。因此可以將它們以微少量作為有效成分用于全部種類的藥物制劑，尤其延長釋放的藥物制劑。
[0004]許多醫(yī)學意義的生物學過程由總體上涉及趨化因子及其受體并且尤其涉及間質(zhì)衍生因子I (SDF-1/CXCL12)及其受體CXCR4的信號轉(zhuǎn)導介導。
[0005]CXCR4及其配體SDF-1參與B細胞、造血干細胞(HSC)和造血祖先細胞(HPC)的運輸。例如，CXCR4在⑶34+細胞上表達并且已經(jīng)涉及⑶34+細胞移行和歸巢過程(S.Μ.Watt, S.P.Forde, Vox sanguinis2008, 94，18-32)。還已經(jīng)顯示 CXCR4受體在干細胞和祖先細胞從骨髓釋放至外周血中發(fā)揮重要作用(L.M.Pelus, S.Fukuda, Leukemia2008, 22，466-473)。CXCR4的這種活性可能對于外周血干細胞 的高效血漿分離置換采集是非常重要的。在血液惡性腫瘤和實體瘤患者中施用大劑量化療或放療法后，自體外周血細胞提供自體移植后快速和持久的造血恢復(W.C.Liles等人，Blood2003, 102，2728-2730)。
[0006]最近，已經(jīng)展示SDF-1在損傷的動物模型中局部上調(diào)，所述損傷包括局部缺血發(fā)作、全腦性缺血、心肌梗死和后肢局部缺血，以及參與外周局部缺血后或肝、腎或肺損傷后的恢復(A.E.Ting, R.ff.Mays, M.R.Frey, ff.Van't Hof, S.Medicetty, R.Deans, Critical Reviews in 0ncology/Hematology2008, 65, 81-93and literature citedherein; F.Lin, K.Cordes, L.Li, L.Hood, ff.G.Couser, S.J.Shankland 等人，J.Am.Soc.Nephrol.2003, 14, 1188-1199;C.C.Dos Santos, Intensive Care Med.2008，34，619-630)。這些結(jié)果表明對于組織和器官修復/再生而言，SDF-1可能是CXCR4陽性干細胞的趨化劑(Μ.Z.Ratajczak, M.Kucia, R.Reca, M.Majka, A.Janowska-ffieczorek, J.Ratajczak, Leukemia2004, 18，29-40)。因此，通過CXCR4抑制劑調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4軸應當通過利用釋放的干細胞來調(diào)節(jié)組織修復而產(chǎn)生顯著的治療益處。
[0007]最近，已經(jīng)顯示，通過CXCR4抑制劑破壞CXCR4/SDF-1軸在從骨髓差異性動員祖先細胞如HPC、內(nèi)皮祖先細胞(EPC)和間質(zhì)祖先細胞(SPC)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用(S.C.Pitchford, R.C.Furze, C.P.Jones, A.M.ffegner, S.Μ.Rankin, Cell StemCell2009, 4，62)。此外，源自的骨髓CXCR4+極小胚樣干細胞(VSEL)在急性心肌梗死患者中動員，提不一種假定性代償機制(W.ffojakowski, M.Tendra, M.Kucia, E.Zuba-Surma, E.Paczkowska, J.Ciosek，M.Halasa，M.Krolj M.Kazmierski, P.Buszman, A.0chala，J.Ratajczak, B.Machalinski，M.Z.Ratajczak, J.Am.Coll.Cardiol.2009，53。
[0008]I).可以利用這些研究結(jié)果為組織再生提供有效的干細胞治療。
[0009]間充質(zhì)干細胞(MSC)是具有分化成多種組織如骨和軟骨的能力的非造血性袓先細胞(D.J.Prockop, Sciencel997，276，71)。由于小比例的MSC強烈地表達功能上有活性的CXCR4，因此調(diào)節(jié)CXCR4/SDF-1軸可以介導這些細胞的特異性移行和歸巢(R.F.Wynn, C.A.Hart, C.Corrad1-Perinij L 0’ Neill, C.A.Evans, J.E.Wraith, L J.Fairbaim，1.Bellantuono，Blood2004，104，2643)。
[0010]存在日益增加的以下證據(jù)，這些證據(jù)顯示總體上趨化因子并且尤其SDF-1/CXCR4相互作用在血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。趨化因子通過結(jié)合其內(nèi)皮細胞上的同族受體直接誘導血管生成或通過促進輸送其他生血管剌激的炎性細胞浸潤，間接地誘導血管生成。已經(jīng)顯示許多促炎趨化因子(包括白介素8(IL-8)、調(diào)節(jié)生長的癌基因、間質(zhì)細胞衍生因子l(SDF-l)、單核細胞趨化蛋白l(MCP-l)、嗜酸性粒細胞趨化因子I和1-309)充當血管生成的直接誘導物(X.Chen, J.A.Beutler, T.G.McCloud, A.Loehfelm, LYang, H.F.Dong, 0.Y.Chertov, R.Salcedo, J.J.0ppenheim，0.M.Howard.Clin.CancerRes.2003，9 (8)，3115-3123; R.Salcedo, J.J.0ppenheim, Microcirculation2003, (3-4)，359-370)o
[0011]最近獲得的結(jié)果 顯示，CXCR4受體參與癌細胞趨化活動，如乳腺癌轉(zhuǎn)移或參與以下癌的轉(zhuǎn)移:卵巢癌(A.Muller，B.Homey，H.Soto，N.Ge，D.Catron，M.E.Buchanan, T.Mc Clanahan，E.Murphey, W.Yuan, S.N.Wagner, J.L.Barrera, A.Mohar, E.Verastegui, A.Zlotnik，Nature2001，50，410 ；J.M.Hall, K.S.Korach,MolecularEndocrinology2003, 17，792-803)、非霍奇金淋巴瘤(F.Bertolini, C.Dell，Agnola，P.Manusco，C.Rabascio，A.Burl ini，S.Monestiroli，A.Gobbi,G.Pruneri，G.Martinelli,Cancer Research2002，62，3106-3112)、或肺癌(T.Kijima，G.Maulik，P.C.Maj E.V.Tibaldi，R.E.Turner, B.Rollins, M.Sattler，B.E.Johnson, R.Salgia，Cancer Research2002，62，6304-6311)、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、神經(jīng)母細胞瘤、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、肝細胞癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌和生殖細胞腫瘤(H.Tamamura等人，F(xiàn)EBS Letters2003，550，79-83，援引才參考文獻；Z.Wang，Q.Ma，Q.Liu，H.Yu，L.Zhao，S.Shen，J.Yao，British Journal ofCancer2008, 99，1695 ；B.Sung, S.Jhurani, K.S.Ahnj Y.Mastuo，T.Yij S.Guhaj M.Liu, B.Aggarwal, Cancer Res.2008，68，8938 ；H.Liu, Z.Pan, A.Li, S.Fuj Y.Lei, H.Sun, M.Wuj W.Zhou,Cellular and Molecular Immunology, 2008，5，373 ；C.Rubie，0.Kollmar，V.0.Frick, M.Wagner, B.Brittner，S.Graber, M.K.Schilling, Scandinavian Journal
of Immunology2008, 68，635 ；S.Gelmini，M.Mangoni，F(xiàn).Castiglioe, C.Beltrami, A.Pieralli，K.L.Andersson，M.Fambrini，G.1.Taddie，M.Serio，C.0rlando,Clin.Exp.Metastasis2009，26，261 ；D.C.Gilbert, 1.Chandler, A.McIntyre, N.C.Goddard, R.Gabej R.A.Huddart，J.Shipley, J.Pathol.2009，217，94)。用 CXCR4 抑制劑阻斷趨化活動應終止癌細胞移行和因此終止轉(zhuǎn)移。
[0012]CXCR4也已經(jīng)涉及實體瘤和白血病/淋巴瘤的生長和增殖。顯示CXCR4受體的激活對惡性神經(jīng)元腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤的生長均至關(guān)重要。另外，全身性施用CXCR4拮抗劑AMD3100抑制顱內(nèi)膠質(zhì)母細胞瘤和髓母細胞瘤異體移植物的生長，原因在于增加凋亡并減少腫瘤細胞的增殖(J.B.Rubin, A.L Kung, R.S Klein, J.A.Chan, Y.Sun, K.Schmidt, M.ff.Kieran, A.D.Luster, R.A.Segal, Proc Natl Acad Sci USA.2003，100 (23)，13513-13518 ；
S.Barbero, R.Bonavia, A.Bajetto, C.Porcile, P.Pirani, J.L.Ravetti, G.L.Zona, R.Spaziante, T.Florio, G.Schettini,Cancer Res.2003, 63(8), 1969-1974 ；T.Kijima,G.Maulik, P.C.Ma, Ε.V.Tibaldi, R.E.Turner, B.Rollins, M.Sattler, B.E.Johnson, R.Salgia.Cancer Res.2002，62 (21)，6304-6311)。CXCR4抑制劑也在以下癌中顯示有前景的體外和體內(nèi)功效:乳腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、前列腺癌以及慢性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤(J.A.Burger, A.Peled, Leukemia2009, 23，43-52及其中援引的文獻)。
[0013]充分確立了趨化因子參與許多炎性疾病并且它們中的一些在破骨細胞發(fā)育調(diào)節(jié)中顯示關(guān)鍵作用。在來自類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)樣品和骨關(guān)節(jié)炎(OA)樣品的滑膜和骨組織活組織檢查樣品上針對SDF-1 (CXCL12)的免疫染色已經(jīng)揭示出炎性病癥下趨化因子的表達水平強烈增加(F.Grassi, S.Cristino, S.Toneguzzi, A.Piacentini, A.Facchini, G.Lisignoli, J.Cell Physiol.2004; 199 (2)，244-251)。CXCR4 受體似乎可能在炎性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，多發(fā)性硬化，阿爾茨海默病，帕金森病，動脈粥樣硬化或眼病如糖尿病性腎病和年齡相關(guān)性黃斑變性中發(fā)揮重要作用(K.R.Shadidi等人，ScandinavianJournal of Immunology2003, 57, 192-198 ； J.A.Gonzalo, J.Tmmunol.2000, 165, 499-508 ；S.Hatse 等人，F(xiàn)EBS Letters2002, 527，255-262 及援引的文獻，A.T.ffeeraratna, A.Kalehua, 1.DeLeon, D.Bertak, G.Maher, M.S.Wade, A.Lustig, K.G.Becker, ff.Wood, D.G.Walker, T.G.Beach, D.D.Taub, Exp.Cell Res.2007, 313, 450 ；M.Shimoji, F.Pa gan, E.B.Healton, 1.Mocchetti, Neurotox.Res.2009, 16, 318 ；A.Zernecke, E.Shagdarsuren, C.Weber, Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.2008, 28, 1897 ；R.Lima e Silva, J.Shen, S.F.Hackett, S.Kachi, H.Akiyama 等人，F(xiàn)ASEB2007, 21，3219)。應當通過 CXCR4 抑制劑終止介導免疫細胞召集至炎癥部位。
[0014]迄今治療HIV感染的可用療法已經(jīng)在感染人群中引起癥狀的明顯改善和從疾病中恢復。雖然涉及逆轉(zhuǎn)錄酶/蛋白酶抑制劑組合的高度活性的抗轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)已經(jīng)大幅度改進AIDS或HIV感染個體的臨床治療，但是依舊存在幾個嚴重問題，包含多重耐藥、副作用明顯和成本高。特別需要在感染早期階段如病毒進入時阻斷HIV感染的抗HIV劑。近來已經(jīng)認識到，為了高效進入靶細胞中，人免疫缺陷病毒需要趨化因子受體CCR5和 CXCR4 以及主要受體 CD4 (N.Levy, Engl.J.Med.1996,335，1528-1530)。因此，可以阻斷CXCR4趨化因子受體的物質(zhì)應當在健康個體中防止感染并且在感染患者中減緩或制止病毒進展(J.Cohen, Sciencel997, 275，1261-1264)。
[0015]在不同類型的CXCR4 抑制劑當中(M.Schwarz, T.N.C.Wells, A.Ε.1.Proudfoot，Receptors and ChanneIs2001, 7, 417-428;Y.Lavrovsky,Y.A.1vanenkov, Κ.V.Balakin, D.A.Medvedewa, P.V.1vachtchenko, Mini Rev.Med.Chem.2008, 11，1075-1087)，一種新出現(xiàn)的類型基于源自鱟肽II的天然存在的陽離子肽類似物，所述陽離子肽類似物具有反平行β-折疊結(jié)構(gòu)和由兩個二硫鍵維持的β_ 發(fā)夾(H.Nakashima, M.Masuda, T.Murakami, Y.Koyanagi, A.Matsumoto, N.Fujii, N.Yamamoto, Antimicrobial Agents and Chemoth.1992, 36, 1249-1255;H.Tamamura, M.Kuroda, M.Masuda, A.0taka, S.Funakoshi, H.Nakashima, N.Yamamoto, M.Waki, A.Matsumotu, J.M.Lancelin, D.Kohda, S.Tate, F.1nagaki, N.Fujii, Biochim.Biophys.Actal993，209，1163;W095/10534A1)。
[0016]結(jié)構(gòu)類似物的合成和借助核磁共振(NMR)譜的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)顯示這些陽離子肽采取充分限定的發(fā)夾構(gòu)象，原因在于I個或2個二硫鍵的約束效應(H.Tamamura, Μ.Sugioka, Y.0dagaki, A.0magari, Y.Kahn, S.0ishi, H.Nakashima, N.Yamamoto, S.C.Peiper, N.Hamanaka, A.0taka, N.Fujii, Bioorg.Med.Chem.Lett.2001, 359-362)。這些結(jié)果顯示β -發(fā)夾結(jié)構(gòu)在CXCR4拮抗活性中發(fā)揮重要作用。
[0017]其它的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)顯示這種拮抗活性也可能通過調(diào)節(jié)兩性結(jié)構(gòu)和藥效團加以影口向(H.Tamamura, A.0magari, K.Hiramatsu, K.Gotoh, Τ.Kanamoto, Y.Xu, Ε.Kodama, M.Matsuoka, T.Hattori, N.Yamamoto, H.Nakashima, A.0taka, N.Fujii, Bioorg.Med.Chem.Lett.2001, 11, 1897-1902 ；H.Tamamura, A.0magari, K.Hiramatsu, S.0ishi, H.Habashita, T.Kanamoto, K.Gotoh, N.Yamamoto, H.Nakashima, A.0taka N.Fujii, Bioorg.Med.Chem.2002, 10, 1417-1426 ；H.Tamamura, K.Hiramatsu, K.Miyamoto, A.0magari, S.0ishi, H.Nakashima, N.Yamamoto, Y.Kuroda, T.Nakagawa, A.0taki, N.Fujii, Bioorg.Med.Chem.Letters2002, 12, 923-928)。
[0018]二硫鍵在 Cys4 和 Cys11 之間的本發(fā)明化合物環(huán)(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cysn-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-),是環(huán)狀 β -發(fā)夾妝模擬物，其顯示高的CXCR4拮抗活性，可用于動員的外周血干細胞的高效血漿分離置換采集和/或使用這些動員的細胞來調(diào)節(jié)組織修復，和/或具有抗癌活性、抗炎活性和/或抗HIV活性。
[0019]環(huán)狀β -發(fā)夾構(gòu)象由D-氨基酸殘基Xaa7和D-氨基酸殘基11Pro15引起。該發(fā)夾構(gòu)象的進一步穩(wěn)定由位置4 和位置11處共同形成二硫鍵的氨基酸殘基Cys實現(xiàn)。
[0020]令人驚訝地，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyr1-His2-Xaa3-CYs4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cysn-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)的位置 14 處導入堿性氨基酸殘基Lys (iPr)，受可選在位置8導入Orn (iPr)支持，產(chǎn)生具備有利藥理學特性的β_發(fā)夾肽模擬物。這些特性，聯(lián)合合適的血漿蛋白結(jié)合作用和適宜的清除率，形成這樣的藥理學譜，其允許這些化合物以低量作為有效成分用于全部種類的藥物制劑，尤其延長釋放的藥物制劑。
[0021]本發(fā)明的β -發(fā)夾肽模擬物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的通式環(huán)(-Tyr1-His2-Xaa3-CyS4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cysn-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-) (I)的化合物及其可藥用鹽，
[0022]其中
[0023]Xaa3 是 Ala、Tyr 或 Tyr (Me)，后者是(2S) _2_ 氨基-(4-甲氧苯基)_3_ 丙酸，
[0024]Xaa7 是 DTyr、11Tyr (Me)，即(2R) _2_ 氨基-(4_ 甲氧苯基)_3_ 丙酸，或 DPro，
[0025]Xaa8 是 Dab,即(2S) _2，4_ 二氨基丁酸，或 Orn (iPr)，即(2S) _Νω_ 異丙基 _2，5_ 二氨基戊酸，[0026]Xaa13 是 Gln 或 Glu，
[0027]Xaa14 是 Lys (iPr)，即(2S) -N"-異丙基 _2，6_ 二氨基己酸。
[0028]在本發(fā)明的一個特定實施方案中，P -發(fā)夾肽模擬物是通式I的化合物及其可藥用鹽，其中Xaa13是Gin。
[0029]在本發(fā)明的另一個特定實施方案中，P -發(fā)夾肽模擬物是通式I的化合物及其可藥用鹽，其中其中 Xaa3 是 Tyr 或 Tyr(Me) ,Xaa7 是 DPro,Xaa8 是 Orn (iPr)并且 Xaa13 是 Gin。
[0030]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該化合物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-TYr1-HiS2-Ala3-CyS4-Ser5-Ala6-nTyr7-Dab8-Arg9-Tyr10-CyS11-Tyr12-Gln13-Lys (iPr) 14-DPro15-Pro16-)及其可藥用鹽。
[0031]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，該化合物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyr1-HiS2-Tyr3-CyS4-Ser5-Ala6-DPro7-0rn (iPr) 8-Arg9-Tyr10-CySll-Tyr12-Gln13-LyS (iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可藥用鹽。
[0032]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，該化合物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyr1-His2-Tyr (Me) 3-Cys4-Ser5-Ala6-DPro7-0:rn (iPr)8-Arg9-Tyr10-CySll-Tyr12-Gln13-LyS(iPr) 14-DPro15-Pro16-)及其可藥用鹽。
[0033]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，該化合物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyr1-His2-Ala3-Cys4-Ser5-Ala6-nTyr (Me) 7-0rn (iPr)8-Arg9-Tyr10-Cy Sll-Tyr12-Gln13-LyS(iPr) 14-DPro15-Pro16-)及其可藥用鹽。
[0034]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，該化合物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyr1-HiS2-Tyr3-CyS4-Ser5-Ala6-DTyr7-0rn (iPr) 8-Arg9-Tyr10-CySll-Tyr12-Gln13-LyS (iPr)14-DPro15-Pro16-)及其可藥用鹽。
[0035]在本發(fā)明的仍另一個優(yōu)選實施方案中，該化合物是二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyr1-His2-Tyr (Me) 3-CyS4-Ser5-Ala6-nTyr (Me) 7-0rn (iPr)8-Arg9-Tyr10-CyS11-Tyr12-GIn13-Lys (iPr) 14-DPro15-Pro16-)及其可藥用鹽。
[0036]根據(jù)本發(fā)明，這些P -發(fā)夾肽模擬物可以通過以下方法制備，所述方法包括
[0037](a)用處于所需終產(chǎn)物中的位置16的Pro的適當N保護衍生物偶聯(lián)適當官能化的固相支持物；
[0038](b)從如此獲得的產(chǎn)物移除N保護基；
[0039](c)用處于所需終產(chǎn)物中的位置15的dPix)的適當N保護衍生物偶聯(lián)如此獲得的產(chǎn)物；
[0040](d)從步驟(C)獲得的產(chǎn)物移除N保護基；
[0041](e)使用其中在所需終產(chǎn)物中處于位置14至I位置的適當N保護的氨基酸衍生物實施基本上與步驟(C)和(d)相對應的步驟，可能存在于所述N-保護的氨基酸衍生物中的任何官能團同樣適當?shù)厥艿奖Ｗo；
[0042](f)如果需要，在位置4和位置11處的Cys殘基的側(cè)鏈之間形成二硫鍵；或可選地，如下文所述，在步驟(i)之后形成前述鍵；
[0043](g)使如此獲得的產(chǎn)物從固相支持物脫離；
[0044](h)環(huán)化從固相支持物切下的產(chǎn)物；
[0045](i)移除在氨基酸殘基鏈的任何組件的官能團上存在的任何保護基；以及[0046](j)如果需要，連接一個或多個異丙基
[0047](k)如果需要，移除在氨基酸殘基的任何組件的官能團上存在的任何保護基；和
[0048](I)如果需要，將如此獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成可藥用鹽或?qū)⑷绱双@得的藥學上可接受或不可接受的鹽轉(zhuǎn)化成相應的游離化合物或轉(zhuǎn)化成不同的可藥用鹽。
[0049]本發(fā)明的β -發(fā)夾肽模擬物可以例如通過遵循以下方法產(chǎn)生，所述方法包括在樹脂上合成線性肽，其中用攜帶異丙基的氨基酸殘基Orn(iPr)或LyS(iPr)將作為市售或事先合成的氨基酸結(jié)構(gòu)單元摻入；或通過遵循以下方法產(chǎn)生，所述方法包括通過采用正交保護基策略在樹脂上合成線性肽，其中例如認為不進行修飾的攜帶氨基的全部氨基酸殘基側(cè)鏈應當由ivDde等保護，從而可以通過在合成級聯(lián)的極晚階段偶聯(lián)異丙基在溶液中衍生化受酸不穩(wěn)定性保護基保護的攜帶氨基的氨基酸殘基側(cè)鏈，其中所述易酸解保護基適用于基于Fmoc的固相肽合成策略；或遵循包括前述方法之合適組合的方法產(chǎn)生。
[0050]恰當選擇官能化固相支持物(即固相支持物外加接頭分子)和環(huán)化位點在本發(fā)明的β_發(fā)夾肽模擬物的合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
[0051]官能化的固相支持物便利地衍生自與優(yōu)選1-5% 二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯；用聚乙烯間隔基包被的聚苯乙烯f「entagel?);和聚丙烯酰胺樹脂(D.0brecht, J.-M.ViIlalgordo，〃Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis ofSmall-Molecular-Weight Compound Libraries"，Tetrahedron Organic ChemistrySeries, Vol.17，Pergamonj Elsevier Science, 1998)。
[0052]固相支持物通過接頭來官能化，即，在一個末端上含有用于接合至固相支持物的錨定基團并且在另一個末端上含有選擇性可切割的用于后續(xù)化學轉(zhuǎn)化和裂解過程的官能團的雙官能間隔分子。出于 本發(fā)明目的，使用兩種類型的接頭:
[0053]I型接頭設(shè)計成在酸性條件下釋放酰胺基(H.Rink, TetrahedronLett.1987，28，3783-3790)。這種類型的接頭形成氨基酸羧基的酰胺；由這類接頭結(jié)構(gòu)官能化的樹脂的例子包括4-[(((2，4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)氨基甲基]PS樹脂、4-[(((2，4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)氨基甲基]_4_甲基-二苯甲基胺PS樹脂(Rink酰胺MBHA PS樹脂)和4- [ (((2，4- 二甲氧基-苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)氨基甲基]二苯甲基胺PS-樹脂(Rink酰胺BHA PS樹脂)。優(yōu)選地，支持物衍生自與最優(yōu)選地1-5% 二乙烯基苯交聯(lián)并借助4-(((2, 4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基)接頭官能化的聚苯乙烯。
[0054]2型接頭設(shè)計成在酸性條件下最終釋放羧基。這種類型的接頭與氨基酸的羧基形成酸不穩(wěn)定性酯，通常是酸不穩(wěn)定性芐酯、二苯甲基酯和三苯甲基酯；這類接頭結(jié)構(gòu)的例子包括2-甲氧基-4-羥甲基苯氧基(SasrinK接頭)、4_ (2，4- 二甲氧基-羥甲基))-苯氧基(Rink接頭)、4-(4-(羥甲基)-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB接頭)、三苯甲基和2-氯三苯甲基。優(yōu)選地，支持物衍生自與最優(yōu)選地1-5% 二乙烯基苯交聯(lián)并借助2-氯三苯甲基接頭官能化的聚苯乙烯。
[0055]當作為平行陣列合成實施時，本發(fā)明的方法可以有利地如下文所述那樣實施，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將立即清楚在需要合成本發(fā)明的一種單一化合物的情況下，將必需如何調(diào)整這些方法。
[0056]與待通過平行方法合成的化合物的總數(shù)相等的許多反應容器充以25至lOOOmg，優(yōu)選地60mg適宜的官能化固相支持物,優(yōu)選地I至3%交聯(lián)聚苯乙烯或Tentagel樹脂。
[0057]待使用的溶劑必須能夠溶脹該樹脂并且包括但不限于二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二噁烷、甲苯、四氫呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、三氟乙醇(TFE)、異丙醇等。含有極性溶劑作為至少一種組分的溶劑混合物(例如20%TFE/DCM、35%THF/NMP)有益于確保結(jié)合樹脂的肽鏈的高度反應性和溶劑化(G.B.FieIds，C.G.Fields, J.Am.Chem.Soc.1991，113，4202-4207)。
[0058]隨著開發(fā)出在溫和酸性條件下釋放C端羧酸基，不影響酸不穩(wěn)定性基團保護側(cè)鏈中官能團的多種接頭，已經(jīng)在合成受保護的肽片段方面取得巨大進展。2-甲氧基-4-羥基節(jié)醇衍生的接頭(SiiSfin?接頭，Mergler 等人，Tetrahedron Lett.1988, 294005-4008)是用稀釋的三氟乙酸(DCM中的0.5-l%TFA)可切割的并且對肽合成期間的Fmoc去保護條件穩(wěn)定，基于Boc/tBu的額外保護基與這種保護方案相容。適于本發(fā)明方法的其他接頭包括過于酸不穩(wěn)定性4-(2，4-二甲氧基-羥甲基)-苯氧基接頭(Rink接頭，
H.Rink, Tetrahedron Lett.1987，28，3787-3790)，其中肽的移除需要 DCM 中的 10% 乙酸或DCM中的0.2%三氟乙酸；4-(4-羥甲基-3-甲氧基酚)丁酸衍生的接頭(HMPB-接頭，F(xiàn)lorsheimer 和 Riniker, Peptidesl991, 1990131)，該接頭也用 1%TFA/DCM 切割以產(chǎn)生含有全部酸不穩(wěn)定性側(cè)鏈保護基的肽片段；和，此外，2-氯三苯甲基氯接頭(Barlos等人，Tetrahedron Lett.1989, 30, 3943-3946),該接頭允許使用冰醋酸/三氟乙醇/DCM (1:2:7)混合物30分鐘使肽脫離。
[0059]氨基酸的適合保護基及其殘基的適合保護基例如分別是
[0060]-對于氨基(如存在，例如也存在于賴氨酸或鳥氨酸的側(cè)鏈中)
[0061]Cbz節(jié)氧羰基
[0062]Boc叔丁氧羰基
[0063]Fmoc 9_荷基甲氧羰基
[0064]Alloc烯丙氧羰基
[0065]Teoc三甲基甲硅烷基乙氧羰基
[0066]Tcc三氯乙氧羰基
[0067]Nps鄰-硝基苯基磺酰；
[0068]Trt 三苯甲基(triphenymethyl)或三苯甲基(trityl)
[0069]ivDde (4，4_ 二甲基_2，6_ 二氧雜環(huán)己-1-亞基)_3_甲基丁基
[0070]-對于用醇組分轉(zhuǎn)化成酯的羧基(如存在，例如也存在于谷氨酸的側(cè)鏈中)
[0071]tBu 叔丁基
[0072]Bn 芐基
[0073]Me 甲基
[0074]Ph 苯基
[0075]Pac苯甲酸甲基
[0076]烯丙基
[0077]Tse 二甲基甲娃烷基乙基
[0078]Tce三氯乙基；
[0079]ivDde (4, 4_ 二甲基_2，6_氧雜環(huán)己-1-亞基)~3~甲基丁基[0080]-對于胍基(如存在，例如存在于精氨酸的側(cè)鏈中)
[0081]Pmc2, 2，5，7，8_五甲基苯并二氫吡喃_6_磺?；?br> [0082]Ts甲苯磺酰基(即，對甲苯磺酰基)
[0083]Cbz節(jié)氧羰基
[0084]Pbf五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?br> [0085]-對于羥基(如存在，例如存在于絲氨酸的側(cè)鏈中)
[0086]tBu 叔丁基
[0087]Bn 芐基
[0088]Trt 三苯甲基
[0089]Alloc 烯丙氧羰基
[0090]-并且對于巰基(如存在，例如存在于半胱氨酸的側(cè)鏈中)
[0091]Acm 乙酰氨基甲基
[0092]tBu 叔丁基
[0093]Bn芐基
[0094]Trt 三苯甲基
[0095]Mtr 4-甲氧三苯甲基。
[0096]優(yōu)選地使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保護的氨基酸衍生物作為構(gòu)建本發(fā)明P -發(fā)夾環(huán)模擬物的結(jié)構(gòu)單元。對于去保護，即，切去Fmoc基團，可以使用DMF中的20%哌啶或DMF中的2%DBU/2%哌啶。
[0097]本領(lǐng)域已知異丙基與9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保護的氨基酸衍生物的攜帶氨基的側(cè)鏈連接，以形成(Fmoc)保護的氨基酸衍生物的異丙基化的攜帶氨基的側(cè)鏈。用于引入異丙基的過程可以例如通過還原性烷基化，例如在合適的還原劑如三乙酰氧基硼氫化鈉存在下用丙酮處理氨基酸結(jié)構(gòu)單元(例如Orn)的攜氨基側(cè)鏈的氨基來完成?？梢酝ㄟ^隨后在堿如碳酸氫鈉存在下與二碳酸二叔丁酯反應引入適用于(Fmoc)保護的氨基酸衍生物的異丙基化帶氨基的側(cè)鏈的保護基，例如Boc。
[0098]基于最初稱入反應管中的官能化固相支持物的毫當量/克(meq/g)載量,反應物(即氨基酸衍生物)的量通常I至20當量(通常，對于聚苯乙烯樹脂是0.1至2.85meq/g)。如果需要，可以使用額外當量的反應物，以驅(qū)動反應以合理時間完成。優(yōu)選的工作站(然而，不限于此)是 Labsource's Comb1-chem 工作站、Protein Technologies’ Symphony 和MultiSyn Tech’ s-Syro合成儀，后者在從固相支持物脫下完全保護的線性肽的過程期間額外地配備轉(zhuǎn)移單元和儲盒。全部合成儀均能夠提供受控環(huán)境，例如，反應可以在與室溫不同的溫度以及如果需要在惰性氣氛下完成。
[0099]酰胺鍵形成需要活化a-羧基用于?；襟E。當這種活化借助常使用的碳二亞胺如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC, Sheehan 和 Hess, J.Am.Chem.Soc.1955, 77, 1067-1068)或二異丙基碳二亞胺(DIC, Sarantakis 等人 Biochem.Biophys.Res.Commun.1976, 73, 336-342)實施時，所產(chǎn)生的二環(huán)己基脲和相應產(chǎn)生的二異丙基脲是不可溶的，并且分別可溶解于通常使用的溶劑中。在碳二亞胺方法的變例中，包含1-羥基苯并三唑(HOBt,Kdnig和Geiger, Chem.Ber.1970，103，788-798)作為偶聯(lián)混合物的添加劑。HOBt阻止脫水、抑制活化氨基酸的外消旋化并充當改善緩慢偶聯(lián)反應的催化劑。已經(jīng)使用某些磷鎗試劑作為直接偶聯(lián)試劑，如苯并二唑_1_基-氧-二(二甲基氨基)憐鐵六氟憐酸鹽(BOP,Castro 等人，Tetrahedron Lett.1975，14，1219-1222; Synthesisl976, 751-752)，或苯并三唑-1-基-氧-三-批咯烷基-磷鐵六氟磷酸鹽(Py-BOP, Coste等人，TetrahedronLett.1990，31，205-208)，或2-(1!1-苯并三唑-1-基)1，1,3, 3-四甲基脲鎗四氟硼酸鹽(TBTU)，或六氟磷酸鹽(HBTU, Knorr 等人，Tetrahedron Lett.1989，30，1927-1930);這些磷鎗試劑也適合于用保護的氨基酸衍生物原位形成HOBt酯。最近，也已經(jīng)使用酸二苯酯(DPPA)或0-(7-氮雜-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’ -四甲基脲鎗六氟硼酸鹽(TATU)或0-(7-氮雜-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’ -四甲基脲鎗六氟磷酸鹽(HATU)/7-氮雜-1-羥基苯并三唑(HOAt，Carpino 等人，Tetrahedron Lett.1994，35，2279-2281)或-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基-)-N，N, N’，N’ -1, 1，3，3-四甲基脲鎗六氟硼酸鹽(TCTU)或六氟憐酸鹽(HCTU, Marder, Shivo 和 Albericio:HCTU and TCTU:New CouplingReagents:Development and Industrial Applications, Poster Presentation, GordonConference February2002)作為偶聯(lián)試劑，以及1，1，3，3-雙(亞甲基)氯脲鐵六氟磷酸鹽(PyCIU,尤其用于偶聯(lián)N-甲基化氨基酸，J.Coste, E.Frerot, P.Jouin, B.Castro, Tetrahedron Lett.1991, 32, 1967)或五氣苯基雙苯基-次勝酸鹽(S.Chen, J.Xu, Tetrahedron Lett.1991, 32, 6711)。
[0100]歸因于近乎定量性偶聯(lián)反應是重要的事實，需要具有反應結(jié)束的實驗證據(jù)?？梢栽诿總€偶聯(lián)步驟后容易地和迅速進行茚三酮試驗(Kaiser等人，Anal.Biochemistry 1970，34，595),其中針對樹脂結(jié)合肽的等分試樣的陽性比色反應定性表示伯胺存在。當用堿釋放Fmoc發(fā)色團時，F(xiàn)moc化學允許Fmoc發(fā)色團的分光光度檢測(Meienhofer 等人,Int.J.Peptide Protein Res.1979, 13, 35-42)。
[0101]通過采用以下 兩種方法之一反復暴露于純?nèi)軇瑢⒚總€反應容器內(nèi)部樹脂結(jié)合的中間體洗滌至不含過量的遺留試劑、溶劑和副產(chǎn)物:
[0102]I)將反應容器填充以溶劑(優(yōu)選地5mL)，攪拌5至300分鐘，優(yōu)選地15分鐘，并排干以驅(qū)出溶劑；
[0103]2)將反應容器填充以溶劑(優(yōu)選地5mL)并排入接收器皿如試管或小瓶中。
[0104]上述兩種洗滌過程均重復至多到約50次(優(yōu)選地約10次)，通過多種方法，如TLC、GC或視檢洗出液，監(jiān)測移除試劑、溶劑和副產(chǎn)物的效率。
[0105]隨移除過量試劑、副產(chǎn)物和溶劑后，重復樹脂結(jié)合的化合物與試劑在反應管內(nèi)部反應的上述過程，伴以連續(xù)轉(zhuǎn)化，直至已經(jīng)獲得樹脂結(jié)合的充分保護的最終線性肽。
[0106]在這種充分保護的線性肽從固相支持物脫離之前的，在Cys4和Cys11之間的二硫鍵可能形成。
[0107]為了形成二硫鍵，優(yōu)選地，將10當量的碘溶液施加于DMF中或在CH2Cl2/Me0H混合物中1.5小時，其中在濾去碘溶液后采用新鮮的碘溶液，將前述過程重復另外3小時，或施加于DMSO和乙酸溶液的混合物中，其中所述混合物用5%NaHC03緩沖至pH5_6持續(xù)4小時，或通過攪拌施加于用氫氧化銨溶液調(diào)節(jié)至PH8后的水中持續(xù)24小時，或施加于NMP和三正丁基膦(優(yōu)選地50當量)的溶液中。
[0108]可選地，在Cys4和Cys11之間形成二硫鍵可以在如下文所述的工序方法2)之后通過下方式實施:在按體積計含有至多到15%DMS0的水中攪拌充分去保護并環(huán)化的粗制肽24小時，所述的水用5%NaHC03緩沖至pH5-6，或用乙酸銨緩沖至pH7_8或用氫氧化銨調(diào)節(jié)至pH8。在蒸發(fā)環(huán)(-Tyrl-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-SArg9-Tyr1c1-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-11Pro15-Pro16-)至干燥后，獲得Cys4和Cys11之間的二硫鍵作為終產(chǎn)物。
[0109]通過使加載的樹脂暴露用于裂解的試劑溶液(優(yōu)選地3至5mL)實現(xiàn)從固相支持物脫離充分保護的線性肽。如上文所述實施溫度控制、攪拌和反應監(jiān)測。借助轉(zhuǎn)移裝置，反應容器與含有儲管以高效收集已切割產(chǎn)物溶液的儲盒連接。留在反應容器中的樹脂隨后如上所述用3至5mL適宜溶劑洗滌2至5次以提取(洗脫)盡可能多的脫離產(chǎn)物。將如此獲得的產(chǎn)物溶液合并，小心避免交叉混合。隨后根據(jù)需要操作各份溶液/提取物以分離最終化合物。常見的操作包括但不限于蒸發(fā)、濃縮、液體/液體提取、酸化、堿化、中和或溶液中的額外反應。
[0110]將含有充分保護的線性肽衍生物的溶液蒸發(fā)，其中所述線性肽衍生物已經(jīng)從固相支持物切下并用堿中和。隨后在溶液中使用溶劑如DCM、DMF、二噁烷、THF等實現(xiàn)環(huán)化。前文提到的多種偶聯(lián)試劑可以用于環(huán)化。環(huán)化的持續(xù)時間是約6-48小時，優(yōu)選地約16小時。跟蹤反應進程，例如通過RP-HPLC (反相高效液相色譜)。隨后通過蒸發(fā)除去溶劑，充分保護的環(huán)狀肽衍生物溶解于不可溶混于水的溶劑(如DCM)中，并且該溶液用水或水-可溶混溶劑的混合物提取，以便除去任何過量的偶聯(lián)試劑。
[0111]最后，將充分保護的肽衍生物用95%TFA、2.5%H20、2.5%TIS或用于實現(xiàn)裂解保護基的另一種清除劑組合處理。裂解反應時間常見地是30分鐘至12小時，優(yōu)選地約2.5小時。
[0112]可選地，可以在玻璃容器中手工地實現(xiàn)充分保護的肽從固相支持物的脫離和徹底去保護。
[0113]在完全去保護后，例如，以下方法可以用于進一步工序:
[0114]I)將揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā)至干燥，并且將粗制肽溶解于水中的20%Ac0H內(nèi)并用異丙基醚或適用的其他溶劑提取。將水層收集并蒸發(fā)s至干燥，并且獲得充分去保護的肽，二硫鍵在 Cys4 和 Cys11 之間的環(huán)(-Tyrl-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-DPro15-Pro16-)，作為終產(chǎn)物；
[0115]2)在真空下濃縮去保護混合物。在二乙醚中、優(yōu)選地在0°C沉淀充分去保護的肽后，將固體洗滌至多約10次，優(yōu)選地3次，干燥，并且如果已經(jīng)如本文以上所述在固相支持物上在Cys4和Cys11之間形成二硫鍵，則獲得充分去保護的肽，即二硫鍵在Cys4和Cys11之間的環(huán)(-Tyrl-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyric1-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-Dpro15-Pro16-)，作為終產(chǎn)物。
[0116]如果已經(jīng)遵循上文提到在溶液中引入一個或多個異丙基的正交保護基策略，則氨基酸殘基側(cè)鏈的全部氨基仍受非酸不穩(wěn)定性保護基保護，而以前受酸不穩(wěn)定性保護基保護的氨基氨基酸殘基已經(jīng)在合成級聯(lián)的這個階段釋放。因此，如果需要，可以偶聯(lián)異丙基。優(yōu)選地，ivDde等是攜帶氨基的側(cè)鏈的酸穩(wěn)定性保護基，所述側(cè)鏈在異丙基與釋放的氨基偶聯(lián)期間保持未修飾。這種偶聯(lián)可以使用丙酮在適合的還原劑例如氰基硼氫化鈉存在下，利用例如還原性烷基化完成。因而，例如，將肽溶解于含有乙酸(0.2M)的MeOH(4.4mM)中。在添加過量丙酮(780當量)后，將反應混合物用氰基硼氫化鈉在MeOH中的溶液(0.6M；1.3當量/需要引入的異丙基)完成并且在室溫劇烈振搖。在LC-MS監(jiān)測的轉(zhuǎn)化完成后，添加水并蒸發(fā)溶劑。將含有肽的殘余固體溶解于DMF (0.01M)中并且將5%肼在DMF中的溶液用來最終除去ivDde保護基。
[0117]如稍早提到，如果需要，此后可以是將如此獲得的充分去保護的環(huán)狀產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成可藥用鹽或?qū)⑷绱双@得的藥學上可接受或不可接受的鹽轉(zhuǎn)化成相應的游離化合物或轉(zhuǎn)化成不同的可藥用鹽。這些操作的任一者可以通過本領(lǐng)域熟知的方法實施。
[0118]本發(fā)明的β_發(fā)夾肽模擬物可以在廣泛類型的應用中使用，以便預防健康個體中的HIV感染或延緩并制止感染患者中的病毒進展；或用于其中癌癥由CXCR4受體活性介導或因其產(chǎn)生的情況；或用于其中免疫學疾病由CXCR4受體活性介導或因其產(chǎn)生的情況；或這些β_發(fā)夾肽模擬物可以用來治療免疫抑制；或它們可以在外周血干細胞的血漿分離置換采集期間使用和/或用作誘導干細胞動員以調(diào)節(jié)組織修復的物質(zhì)。
[0119]本發(fā)明的β_發(fā)夾肽模擬物可以原樣施用或可以作為適宜制劑連同本領(lǐng)域熟知的載體、稀釋劑或賦形劑一起施用。
[0120]當用來治療或預防HIV感染或癌癥如乳腺癌、腦癌、前列腺癌、肝細胞癌、結(jié)直腸癌、肺癌、腎癌、神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、生殖細胞腫瘤、眼部癌癥、多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌、胃癌、橫紋肌肉瘤、黑色素瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤；轉(zhuǎn)移、血管生成和造血組織；或炎性疾病如哮喘、過敏性鼻炎、超敏反應肺病、過敏性肺炎、嗜酸性粒細胞性肺炎、遲發(fā)型超敏反應、間質(zhì)性肺病(ILD)、特發(fā)性肺纖維化、與類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的ILD、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、全身性硬化癥、Sjogren綜合征、全身過敏或超敏反應應答、藥物變態(tài)反應、類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、動脈粥樣硬化、重癥肌無力、青少年發(fā)作糖尿病、 腎小球腎炎、自身免疫甲狀腺炎、移植排斥，包括同種異體移植排斥或移植物抗宿主病、炎性腸病和炎性皮膚??；或用來治療眼病如青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和年齡相關(guān)黃斑變性；或用來治療治療局部缺血性發(fā)作、全腦性缺血、心肌梗死、后肢局部缺血或外周局部缺血；或用來治療肝、腎或肺的損傷；或用來治療免疫抑制，包括由化療、放療或移植物/移植排異引起的免疫抑制時，本發(fā)明的β -發(fā)夾肽模擬物可以單獨施用、作為幾種β -發(fā)夾肽模擬物的混合物、與其他抗HIV劑或抗微生物劑或抗癌藥或抗炎藥組合、或與其他藥物活性物質(zhì)組合施用。本發(fā)明的β_發(fā)夾肽模擬物可以其本身或作為藥物組合物施用。
[0121]包含本發(fā)明的β -發(fā)夾肽模擬物的藥物組合物可以通過常規(guī)混合、溶解、造粒、衣片劑制造、粉碎、乳化、封膠、夾持(entrapping)或凍干方法制造。藥物組合物可以使用一種或多種促進活性β-發(fā)夾肽模擬物加工成制品的生理可接受載體、稀釋劑、賦形劑或賦形劑以常規(guī)方式配制，其中可以藥學地使用所述制品。正確的制劑取決于所選的施用方法。
[0122]對于局部施用，本發(fā)明的發(fā)夾肽模擬物可以配制為溶液、凝膠劑、油膏劑、乳膏劑、混懸劑、散劑等，如本領(lǐng)域公知。
[0123]全身性制劑包括設(shè)計成通過注射例如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)注射施用的那些，以及設(shè)計成透皮、透粘膜、口服或肺施用的那些。
[0124]對于注射劑，本發(fā)明的發(fā)夾肽模擬物可以在充足的溶液中、優(yōu)選地在生理相容性緩沖液如Hink溶液、Ringer溶液或生理鹽水中配制。所述溶液可以含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x地，本發(fā)明的β_發(fā)夾肽模擬物可以處于粉末狀形式，以便在使用前與合適的溶媒(例如無菌無熱原的水)組合。[0125]對于透黏膜施用，在制劑中使用適合待滲透的屏障的滲透劑，如本領(lǐng)域已知。
[0126]對于口服施用，該化合物可以通過將本發(fā)明的活性P -發(fā)夾肽模擬物與本領(lǐng)域熟知的可藥用載體組合來輕易地配制。這類載體使本發(fā)明的(6-發(fā)夾肽模擬物可能配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑、散劑等，以便由待治療的患者口服攝入。對于口服制劑，例如散劑、膠囊劑和片劑，合適的賦形劑包括填料如糖，如乳糖、蔗糖、甘露糖和山梨糖；纖維素制品如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠，甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP);造粒劑和粘合劑。如果需要，可以添加崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。如果需要，可以使用標準技術(shù)將固體劑型進行糖包衣或腸溶包衣。
[0127]對于口服液體制品例如混懸劑、酏劑和溶液劑，合適的載體、賦形劑或稀釋劑包括水、乙二醇、油、醇等。另外，可以添加矯味劑、防腐劑、著色劑等。
[0128]對于頰部施用，組合物可以采取如常規(guī)那樣配制的片劑、錠劑等形式。
[0129]化合物也可以與適宜的栓劑基料如可可脂或其他甘油酯一起配制于直腸或陰道組合物如栓劑中。
[0130]除上文描述的制劑之外，本發(fā)明的(6-發(fā)夾肽模擬物也可以配制為長效制劑。這種長效制劑可以通過(例如皮下或肌內(nèi))埋植或通過肌內(nèi)注射施用。為制造這類長效制劑，本發(fā)明的(6-發(fā)夾肽模擬物可以用合適的聚合材料或疏水材料(例如，作為可接受油中的乳液)或離子交換樹脂配制，或配制為微溶性鹽。
[0131]此外，可以使用其他藥物遞送系統(tǒng)，如本領(lǐng)域熟知的脂質(zhì)體和乳液。也可以使用某些有機溶劑如二甲基亞砜。額外地，本發(fā)明的(6-發(fā)夾肽模擬物可以使用持續(xù)釋放系統(tǒng)(如含有治療劑的固體聚合物 的半透性基質(zhì)(例如用于涂覆的支架))遞送。各種持續(xù)釋放材料已經(jīng)是確立的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。取決于它們的化學本質(zhì)，持續(xù)釋放膠囊劑可以釋放所述化合物持續(xù)幾周直至超過100天。根據(jù)治療劑的化學本質(zhì)和生物學穩(wěn)定性，可以使用額外的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化策略。
[0132]由于本發(fā)明的0-發(fā)夾肽模擬物含有帶電荷殘基，因此它們可以原樣或作為可藥用鹽包括于前述任一種制劑中。可藥用鹽傾向于比相應的游離形式更多可溶于含水溶劑和其他質(zhì)子溶劑中。特別合適的可藥用鹽包括與以下酸的鹽:羧酸、膦酸、磺酸和氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、乙醇酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、氨基酸、如谷氨酸或天冬氨酸、馬來酸、羥基馬來酸、甲基馬來酸、環(huán)己烷羧酸、金剛烷羧酸、苯甲酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、酞酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲磺酸或乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、2-苯磺酸、1，5-萘二磺酸、2-、3_或4-甲基苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-環(huán)己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基或N-丙基氨基磺酸和其他有機質(zhì)子酸，如抗壞血酸。合適的無機酸是例如氫鹵酸(如氫氯酸)、硫酸和磷酸。
[0133]本發(fā)明的(6-發(fā)夾肽模擬物或其組合物通常將以有效實現(xiàn)預期目的量使用。應當理解所用的量將取決于具體的應用。
[0134]對于局部施用以治療或預防HIV感染，治療性有效劑量可以使用例如實施例中提供的體外測定法確定。治療可以在HIV感染明顯時施加，或甚至當它不明顯時也可以施加。普通技術(shù)人員將能夠在無需過多實驗的情況下確定治療局部HIV感染的治療有效量。[0135]對于全身性施用，可以最初從體外測定法初步估計治療有效劑量。例如，可以在動物模型中配制某個劑量以實現(xiàn)包括如細胞培養(yǎng)物中所測定的IC5tl的循環(huán)β -發(fā)夾肽模擬物濃度范圍。這類信息可以用來更精確地確定用于人類中的劑量。
[0136]也可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，從體內(nèi)數(shù)據(jù)(如動物模型)估計初始劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以基于動物數(shù)據(jù)容易地優(yōu)化向人類的施用?？梢哉{(diào)節(jié)單獨作為抗HIV劑應用的劑量數(shù)量以提供足以維持治療效果的本發(fā)明β_發(fā)夾肽模擬物的血漿水平。治療性有效的血清水平可以通過每日施用多個劑量實現(xiàn)。
[0137]在局部施用或選擇性攝入的情況下，本發(fā)明β -發(fā)夾肽模擬物的有效局部濃度可以與血漿濃度不相關(guān)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠在無需過多實驗的情況下優(yōu)化治療有效的局部劑量。
[0138]當然，施用的β_發(fā)夾肽模擬物的量將取決于正在治療的受試者、該受試者的體重、疾患的嚴重性、施用方式和處方醫(yī)師的判斷。
[0139]在感染可檢測或甚至當它們不可檢測時，可以間斷地重復抗HIV療法。該療法可以單獨地或與其他藥物(如例如其他抗HIV劑或抗癌藥或其他抗微生物劑)組合時提供。
[0140]正常情況下，本文所述的發(fā)夾肽模擬物的治療有效劑量將在不造成明顯毒性的情況下提供治療益處?？梢酝ㄟ^細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械臉藴仕帉W方法確定本發(fā)明β -發(fā)夾肽模擬物的毒性，例如，通過確定LD5tl (對50%群體致死的劑量)和LDiqq (對100%群體致死的劑量)。毒性 效果和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的化合物。從這些細胞培養(yǎng)測定法和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用于形成在人類中使用時無毒的劑量范圍。本發(fā)明的β_發(fā)夾肽模擬物的劑量優(yōu)選地處于在毒性低或無毒情況下包括有效劑量的一系列循環(huán)濃度內(nèi)。該劑量可以根據(jù)所用的劑型和所用的施用途徑在這個范圍內(nèi)變動。確切制劑、施用途徑和劑量可以由各位醫(yī)師就患者狀況來選擇(見，例如Fingl等人.1975, In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,第 I 章，第 I 頁)。
[0141]本發(fā)明也可以包括化合物，其與二硫鍵在Cys4和Cys11之間的以下通式的化合物-環(huán)(-Tyrl-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyric1-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-Dpr
O15-Pro16-)相同，差異在于一個或多個原子由具有與自然界中通常存在的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同的原子質(zhì)量數(shù)或質(zhì)量的原子替換，例如2H(D)、3H、nC、14C、129I等富集的化合物。將這些同位素類似物和它們藥用鹽和制劑視為在治療和/或診斷中可用的物質(zhì)，例如，但不限于，其中精細調(diào)節(jié)體內(nèi)半壽期可能導致優(yōu)化劑量方案的情況。
[0142]以下實施例說明本發(fā)明，但是無論如何將不得解釋為限制其范圍。
實施例
[0143]1.肽合成
[0144]第一保護的氨基酸殘基與樹脂的偶聯(lián)
[0145]將lg(1.4mMol)2-氯三苯甲基氯樹脂(1.4mMol/g ; 100-200目，共聚(苯乙烯 _1%DVB)聚合物母體；Barlos 等人，Tetrahedron Lett.1989, 30, 3943-3946)填充至干燥的燒瓶中。使樹脂懸浮于CH2Cl2 (5mL)中并且允許在室溫在恒定振搖下溶脹30分鐘。添加與960 μ I (4當量)二異丙基乙胺(DIEA)混合的第一適當保護的氨基酸殘基在CH2Cl2 (5mL)中的0.98mMol (0.7當量)溶液(見下文)。在25°C將反應混合物振搖4小時后，將樹脂濾出并且用 CH2Cl2(Ix)、DMF(Ix)和 CH2Cl2(Ix)依次洗滌。將 CH2Cl2/MeOH/DIEA(17/2/l，10 mL)的溶液添加至樹脂并且將懸液振搖30分鐘。在過濾后、將樹脂按以下順序用CH2Cl2(Ix)、DMF(Ix)、CH2Cl2 (Ix)、MeOH(Ix)、CH2Cl2 (Ix)、MeOH(Ix)、CH2Cl2 (2x)、Et2O (2x)洗滌并且在真空下干燥6小時。
[0146]載量通常地是0.6-0.7 mMol/g。
[0147]制備以下預加載的樹脂:Fmoc-Pro-2-氯三苯甲基樹脂。
[0148]使用Syro-肽合成儀(MultiSynTech)使用24_96個反應容器實施合成。在每個容器中，安置0.04 mMol以上樹脂并且使得樹脂在CH2Cl2和DMF中分別溶脹15分鐘。將以
下反應循環(huán)編程并實施:
[0149]
【權(quán)利要求】
1.一種處于游離形式或處于可藥用鹽形式的具有下式的由16個氨基酸殘基產(chǎn)生的主鏈環(huán)化肽化合物， 環(huán)(-TYr1-Hi S2-Xaa3-CyS4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-CyS11-Tyr12-Xaa13-Xaa14-nPro15-Pro16-) (I), 其中
Xaa3 是 Ala ；Tyr 或 Tyr (Me), Tyr(Me)是(2S)-2-氨基-(4-甲氧苯基)_3_丙酸，
Xaa7 是 Tyr ；DTyr (Me);或 DPro, DTyr (Me)是(2R) -2-氨基-(4-甲氧苯基)~3~丙酸，或，
Xaa8 是 Dab 或 Orn (iPr)， Dab 是(2S)_2, 4_ 二氨基丁酸， Orn (iPr)是(2S) _Νω_異丙基-2，5-二氨基戊酸，
Xaa13 是 Gln 或 Glu,
Xaa14 是 Lys (iPr)， Lys (iPr)是(2S) _Νω_異丙基-2，6-二氨基己酸， 沒有明確指明為D-氨基酸殘基的全部氨基酸殘基均為L-氨基酸殘基，并且 兩個L-半胱氨酸殘基Cys4和Cys11中的兩個-SH基由I個_S_S_基替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中Xaa13是 Gin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中 Xaa3 是 Tyr 或 Tyr (Me)，Xaa7 是 DPro, Xaa8 是 Orn (iPr)并且 Xaa13 是 Gin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中 Xaa3 是 Ala, Xaa7 是 DTyr, Xaa8 是 Dab,并且 Xaa13 是 Gin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中Xaa3 是 Tyr, Xaa7 是 DPro, Xaa8 是 Orn (iPr)并且 Xaa13 是 Gin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中Xaa3 是 Tyr (Me), Xaa7 是 DPro, Xaa8 是 Orn (iPr)并且 Xaa13 是 Gin。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中 Xaa3 是 Ala, Xaa7 是 11Tyr (Me)，Xaa8 是 Orn (iPr)，并且 Xaa13 是 Gin。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中 Xaa3 是 Tyr, Xaa7 是 DTyr, Xaa8 是 Orn (iPr)，并且 Xaa13 是 Gin。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，其中 Xaa3 是 Tyr (Me)，Xaa7 是 DTyr (Me)，Xaa8 是 Orn (iPr)，并且 Xaa13 是 Gin。
10.根據(jù)權(quán)利要求書I至9中任一項所限定的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物，用作藥物活性物質(zhì)，特別地用作具有CXCR4拮抗、抗癌活性和/或抗炎活性和/或干細胞動員活性的物質(zhì)。
11.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物和藥學惰性載體，特別地處于合適口服、局部、經(jīng)皮、注射、經(jīng)頰或透粘膜施用的形式，如片劑、錠劑、膠囊劑、溶液劑、液體劑、凝膠劑、糊劑、乳膏劑、油膏劑、糖漿劑、漿液劑、混懸劑、散劑或栓劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物的用途，用作具有CXCR4拮抗、抗癌活性和/或抗炎活性和/或干細胞動員活性的藥物，特別地用于預防健康個體中的HIV感染；用于延緩或停頓HIV感染患者中的病毒進展；用于治療或預防由CXCR4受體活性介導或因其產(chǎn)生的癌癥或免疫??；用于治療免疫抑制；用于伴隨外周血干細胞的血漿分離置換采集；或用于誘導干細胞的動員以調(diào)節(jié)組織修復。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的處于游離形式或處于可藥用鹽形式的式I化合物的用途，用于制造藥物，所述藥物具有CXCR4拮抗、抗癌活性和/或抗炎活性和/或干細胞動員活性，特別地用于預防健康個體中的H1V感染；用于延緩或停頓HIV感染患者中的病毒進展；用于治療或預防由CXCR4受體活性介導或因其產(chǎn)生的癌癥或免疫?。挥糜谥委熋庖咭种?；用于伴隨外周血干細胞的血漿分離置換采集；或用于誘導干細胞的動員以調(diào)節(jié)組織修復。
14.用于制造如權(quán)利要求1至10中任一項所述的式I化合物的方法，包括步驟 (a)用N保護的氨基酸Pro偶聯(lián)官能化的固相支持物，所述Pro在式I化合物的位置16中形成氨基酸殘基的基礎(chǔ)； (b)從步驟(a)的產(chǎn)物移除N保護基； (c)用N保護的氨基酸dP1x)偶聯(lián)步驟(b)的產(chǎn)物，所述11Pro在式1化合物的位置15中形成氣基酸殘基的基礎(chǔ)； (d)從步驟(c)的產(chǎn)物移除N保護基； (e)以類似于步驟(C)和(d)中所述的方式，在式I化合物的位置14至1中一個接一個添加每種所需的氨基酸殘基至每種情況下于正在增長的肽鏈游離末端處的氨基酸殘基的游離氨基，所述肽鏈與固相支持物偶聯(lián)，在類似于步驟(C)的偶聯(lián)步驟中使用的所需氨基酸在每種情況下是N保護的，并且除a氨基部分的羧基之外，在所述所需氨基酸中存在的任何官能團也均受保護； (f)將步驟(e)的產(chǎn)物中的兩個Cys殘基中的兩個-SH基團替換為1個-S-S-基團，除非這個-S-S-基團在步驟(j)中形成； (g)使所述十六肽從固相支持物脫離； (h)使所述十六肽的位置1中的氨基酸殘基與所述十六肽的位置16中的氨基酸殘基偶聯(lián)； a)使步驟(h)的產(chǎn)物中存在的任何保護的官能團去保護； (j)將步驟a)的產(chǎn)物中的兩個Cys殘基中的兩個-SH基團替換為1個-S-S-基團，除非這個-S-S-基團在步驟(f)中形成； (k)如果需要，使一個或幾個異丙基取代基與步驟(j)的產(chǎn)物連接； (I)使步驟(k)的產(chǎn)物中存在的任何保護的官能團去保護；并且 (m)如果所述方法的所需產(chǎn)物是可藥用鹽形式的式1化合物，則將游離形式的式I化合物轉(zhuǎn)化成相應的可藥用鹽形式的式I化合物，或者如果所述方法的所需產(chǎn)物是游離形式的式I化合物，則將可藥用鹽形式的式I化合物轉(zhuǎn)化成相應的游離形式的式I化合物，或者如果所述方法的所需產(chǎn)物是不同可藥用鹽形式的式I化合物，則將可藥用鹽形式的式I化合物轉(zhuǎn)化成相應的不同可藥用鹽 形式的式I化合物。
【文檔編號】A61K38/04GK103703018SQ201280027783
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月7日
【發(fā)明者】D·歐伯萊徹特, F·O·侯姆博特, J·吉莫曼 申請人:波利弗爾股份公司