Cetp片段的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及由6至20個(gè)氨基酸殘基組成并自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAWWLGIDQSIDFEIDSAI(SEQ?ID?No.23)衍生的肽和結(jié)合這些肽的抗體，其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID(SEQ?ID?No.24)。
【專利說(shuō)明】CETP片段
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及能影響CETP體內(nèi)活性的肽。
[0002]發(fā)明背景
[0003]與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病，如心血管疾病(CVD)以及中風(fēng)和周圍動(dòng)脈閉塞性疾病(peripheral arterial occlusion disease),是在美國(guó)、歐洲和亞洲大部分地區(qū)最主要的死亡起因。與1990年相比，CVD引起的死亡率在2020年將增加90%。
[0004]有多種風(fēng)險(xiǎn)因子對(duì)形成動(dòng)脈粥樣硬化損傷負(fù)責(zé)。循環(huán)中的脂蛋白譜、動(dòng)脈高血壓和濫用煙堿在此方面尤其具有重要性。
[0005]在綜合性流行病學(xué)研究中，可以證明血清膽固醇水平和冠心病發(fā)生之間的正向相關(guān)。較高的低密度脂蛋白膽固醇(LDLc)水平構(gòu)成較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)，并且直接與增加的動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。通常使用他汀類(Statins)如HMG-CoA還原酶抑制劑，其成功地降低循環(huán)中的LDLc水平。然而，盡管由于積極的他汀治療減少了冠心病事件，但相當(dāng)大的剩余心血管風(fēng)險(xiǎn)仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。如此，迫切需要新的治療學(xué)。
[0006]除了 LDL膽固醇以外，血管保護(hù)性高密度脂蛋白膽固醇(HDLc)的水平在估測(cè)心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)概況時(shí)也起著重要作用。流行病學(xué)研究已證明HDLc水平和動(dòng)脈粥樣硬化之間的反向關(guān)系。HDLc水平是獨(dú)立于LDLc值的強(qiáng)預(yù)測(cè)物。因此，假定HDLc水平具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)性效果。升高的HDLc水平因而是一個(gè)主要目的和另外的靶物。
[0007]使用他汀類的單一療法不有效升高HDLc水平，用此類型的藥理學(xué)化合物來(lái)治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化是不充分的。目前針對(duì)升高HDLc水平的選擇是貝特類(fibrates)和煙酸(niacin)。煙酸尤為有效，然而其使用受到不良作用的限制，該不良作用導(dǎo)致患者的低依從性。迫切需要用于通過(guò)他汀類升高HDLc水平以補(bǔ)償LDL降低的有效且安全的方法。在這一方面，將對(duì)CETP的抑制作為單一療法或作為附加療法是一個(gè)有吸引力的目標(biāo)。
[0008]膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)是負(fù)責(zé)包括膽固醇酯和甘油三酸酯(TG)在內(nèi)的中性脂質(zhì)在脂蛋白之間轉(zhuǎn)移的一種血漿糖蛋白。來(lái)自動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)性HDL的膽固醇酯被轉(zhuǎn)移至促動(dòng)脈粥樣硬化生成性載脂蛋白(apo)B脂蛋白(LDL和VLDL)以交換TG。這導(dǎo)致更低的HDL水平并升高LDL和VLDL的水平。
[0009]據(jù)假定，CETP (最可能依賴于代謝背景)是用于實(shí)現(xiàn)增加HDL血漿水平的目標(biāo)的有價(jià)值的治療性靶物。
[0010]許多物種不具有CETP。在易感于動(dòng)脈粥樣硬化的物種如家兔和人中，CETP活性較高。其它對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化為抗性的物種不具有CETP且具有較高的HDLc水平。
[0011]在使用家兔和倉(cāng)鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，用抗CETP單克隆抗體、反義寡核苷酸或CETP抑制劑對(duì)CETP的短暫抑制導(dǎo)致HDL水平增加。
[0012]已描述了數(shù)類CETP抑制劑，其中一些已經(jīng)處于后期臨床試驗(yàn)中(例如dalcetrapib(Stein EA,Eur Heart J.31 (4)(2010):480-8)anacetrapib(Cannon CP, NEngl J Med.363(25) (2010):2406-15 和 torcetrapib(Nissen SE, N Engl J Med.356(13)(2007):1304-16)。[0013]在US5，512，548和W093/011782中，描述了能抑制CETP的多肽及其類似物，所述CETP是催化膽固醇酯從HDL到VLDL和LDL的轉(zhuǎn)移，因此所述多肽及其類似物若對(duì)患者施用時(shí)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化活性。依照這些文獻(xiàn)，這類CETP多肽抑制劑衍生自各種來(lái)源的apoC-1，其中尤其是多個(gè)最長(zhǎng)至第36位氨基酸的N末端片段已鑒定為CETP抑制劑。
[0014]還有，在US5，880, 095A中披露了結(jié)合CETP的肽，其能抑制個(gè)體中CETP的活性。所述CETP抑制性蛋白質(zhì)包含豬apoC-1II的N末端片段。
[0015]在US2006/0276400和W096/034888中披露了自CETP衍生且包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位的肽。這些肽能在體內(nèi)誘導(dǎo)CETP特異性抗體的形成。
[0016]在US2004/0087481和US6, 410, 022B1中披露了由于誘導(dǎo)CETP特異性免疫應(yīng)答，能用于治療和預(yù)防心血管疾病諸如例如動(dòng)脈粥樣硬化的多種肽。這些肽包含并非衍生自CETP的T輔助細(xì)胞表位和至少一個(gè)來(lái)自CETP的B細(xì)胞表位，并且可以直接自后者衍生。T輔助細(xì)胞表位有利地自破傷風(fēng)類毒素衍生，并共價(jià)結(jié)合CETP的至少一個(gè)B細(xì)胞表位。通過(guò)使用對(duì)該生物體而言外來(lái)的T輔助細(xì)胞表位，可以在個(gè)體體內(nèi)誘導(dǎo)抗體，這些抗體針對(duì)由至少一個(gè)CETP-B細(xì)胞表位組成的肽部分。
[0017]在W02006/029982中，描述了要用于制備供治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的藥物的CETP模擬表位。
[0018]已有多個(gè)關(guān)于CETP的疫苗接種辦法建議。有人用含有自CETP的C末端衍生的肽作為抗原的疫苗來(lái)處理家兔。免疫后的家兔具有降低的CETP活性和改變的脂蛋白水平，具有增加的HDL和降低的LDL值。此外，動(dòng)脈粥樣硬化模型動(dòng)物經(jīng)處理還顯示出比對(duì)照動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化損傷減少(Rittershaus Cff, Arterioscler Thromb VascBiol20(2000):2106-12)。
[0019]由American Biotechnology Company Avant 用疫苗 CET1-1 實(shí)施的 II 期臨床研究的結(jié)果已被公開(kāi)(BioCentury Extra For Wednesday, 0ctober22, 2003)。在此 II 期研究中，與在先前I期研究中一樣，證實(shí)了非常好的安全性概況而沒(méi)有任何可疑的副作用，從而允許得出結(jié)論，即預(yù)期沒(méi)有因抗CETP疫苗接種法引起的副作用。然而，就功效而言，Avant疫苗令人失望，因?yàn)樗⒉槐劝参縿┲委熞痫@著更好的HDL水平增加。
[0020]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于降低個(gè)體中CETP活性的工具(means)和方法。
[0021]本發(fā)明涉及由6至20個(gè)氨基酸殘基組成并自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAffffLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID N0.23)衍生的肽，其中所述肽包含氨基酸序列WffLGID (SEQ ID N0.24)。
[0022]令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)包含氨基酸序列WffLGID的肽能誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物特別是小鼠中針對(duì)CETP的抗體。這些抗體能夠結(jié)合CETP，并且降低所述蛋白質(zhì)的活性。公知的是，在具有CETP活性的哺乳動(dòng)物中，通過(guò)例如接種疫苗(Thomaset al, Human Vaccines5 (2009):79-84)或小分子抑制劑(Luscher et al., EurHeart J33 (2012): 857-865; Krauss et al., J LipidRes53(2012):540-547)來(lái)降低此活性導(dǎo)致HDL水平的升高。哺乳動(dòng)物中HDL水平的升高導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和其它與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病(特別是心血管疾病)的減輕。
[0023]本發(fā)明的包含氨基酸序列WffLGID的肽是從具有氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAffffLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID N0.23)的肽 (其為人 CETP 的片段(Protein Data Bank 登錄號(hào)20BD_A G1:126031487))衍生的。具有氨基酸序列SEQ ID N0.23的肽包含成熟CETP蛋白的氨基酸殘基92至121。此CETP蛋白片段及其包含氨基酸序列WffLGID的截短變體誘導(dǎo)(如前文所述)特異性結(jié)合CETP的抗體的形成。然而，其它自CETP衍生的包含成熟CETP蛋白的氨基酸殘基47至55、152至165、290至300、300至316和403至415的片段盡管存在于全長(zhǎng)CETP蛋白表面，卻不導(dǎo)致針對(duì)(即結(jié)合)CETP蛋白的抗體的形成，盡管對(duì)哺乳動(dòng)物施用這類片段誘導(dǎo)路片段特異性抗體的形成。這是令人驚訝地，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員明顯地會(huì)預(yù)期暴露于CETP蛋白表面的各種CETP片段會(huì)是誘導(dǎo)針對(duì)CETP蛋白的抗體的形成所必需的。
[0024]本領(lǐng)域中公知更長(zhǎng)的肽更有可能包含一個(gè)或多個(gè)這類疫苗中不想要的T細(xì)胞表位。對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位(CD4和CD8)的激活能導(dǎo)致誘導(dǎo)出引起不想要的不良事件(AE)的自體反應(yīng)性T細(xì)胞。因此，熟練技術(shù)人員為了避免疫苗中不想要的表位，會(huì)使用盡可能短的肽作為抗原以誘導(dǎo)抗原特異性體液免疫應(yīng)答。因此優(yōu)選更短的肽-而且事實(shí)上化學(xué)合成更短的肽能容易得多。
[0025]在W002/098915中披露了具有少于100個(gè)氨基酸的多肽，其包含本發(fā)明的氨基酸序列SEQ ID N0.23。W002/098915的多肽用于生成針對(duì)CETP的抗體。由于W002/098915中披露的肽的長(zhǎng)度，還誘導(dǎo)了可能不能用于治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病的抗體，因?yàn)檫@類抗體可能特異于CETP的與其作用模式不相關(guān)的部分。
[0026]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“肽”指具有至少6個(gè)彼此通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合分子。
[0027]如在本發(fā)明的肽的背景中使用的，術(shù)語(yǔ)“自…衍生”意指本發(fā)明的肽是具有氨基酸序列SEQ ID N0.23的肽片段。因此，術(shù)語(yǔ)“自…衍生”可與“是…的片段”交換使用。
[0028]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，由6至20個(gè)氨基酸殘基組成且自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAffffLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID N0.23)衍生的肽可包含 6 至 16 個(gè)氨基酸殘基或由其組成。
[0029]依照本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽包含8至20，優(yōu)選8至16個(gè)氨基酸殘基。如果本發(fā)明的肽包含C和/或N末端半胱氨酸殘基，那么所述肽可包含9至21，優(yōu)選9至17，或10至22，優(yōu)選10至18個(gè)氨基酸殘基。
[0030]當(dāng)本發(fā)明的肽包含氨基酸序列SEQ ID N0.23的至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，那么所述肽優(yōu)選地包含氨基酸序列SEQ ID N0.10，SEQ ID N0.11，SEQID N0.18和/或SEQ IDN0.19，或由其組成。
[0031]依照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽的氨基酸序列選自下組:YTTAffffLGIDQS(SEQ ID N0.1), YGYTTAffffLGIDQSID (SEQ ID N0.7), TTAffffLGIDQS (SEQID N0.8), TAffffLGIDQS(SEQ ID N0.9), AffffLGIDQS(SEQ ID N0.10), WffLGIDQS(SEQ IDN0.11), YTTAffffLGIDQ(SEQ ID N0.13), YTTAffffLGID(SEQ ID N0.14), TTAffffLGIDQ (SEQID N0.18)和 TTAffffLGID (SEQ ID N0.19)，特別優(yōu)選選自下組:TAffffLGIDQS (SEQ IDN0.9), AffffLGIDQS(SEQ ID N0.10)和 WffLGIDQS(SEQ ID N0.11)。
[0032]本發(fā)明的肽可通過(guò)本領(lǐng)域中公知的方法化學(xué)合成。當(dāng)然還可以使用重組方法生成本發(fā)明的肽。所述肽可在微生物如細(xì)菌、酵母或真菌中生成，在真核生物細(xì)胞如哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞中生成，或在重組病毒載體如腺病毒、痘病毒、皰疹病毒、Simliki森林病毒(forest virus)、桿狀病毒、卩遼菌體、辛德比斯病毒(sindbis virus)或仙臺(tái)病毒(sendaivirus)中生成。用于生成所述肽的合適細(xì)菌包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或任何其它能表達(dá)這類肽的細(xì)菌。用于表達(dá)本發(fā)明的肽的合適的酵母細(xì)胞包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、假絲酵母(Candida)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或任何其它能表達(dá)肽的酵母。相應(yīng)的工具和方法是本領(lǐng)域中公知的。還有，用于純化并分離重組生成的肽的方法是本領(lǐng)域中公知的，且包括例如凝膠過(guò)濾、親和層析、離子交換層析等。
[0033]為了有助于純化本發(fā)明的肽，可以制備融合多肽，其中將所述肽翻譯性地融合(共價(jià)連接)至異源多肽，其使得能夠通過(guò)親和層析來(lái)進(jìn)行分離。典型的異源多肽是His標(biāo)簽(例如His6 ；6組氨酸殘基)、GST標(biāo)簽(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)等。融合多肽不僅幫助肽純化，還能預(yù)防純化步驟期間肽的降解。如果期望在純化后移除異源多肽，那么該融合多肽可在肽和異源多肽之間的接合處包含切割位點(diǎn)。所述切割位點(diǎn)可由用酶切割的氨基酸序列組成，所述酶對(duì)于該位點(diǎn)處的氨基酸序列是特異性的(例如蛋白酶)。
[0034]本發(fā)明的肽還可在其N和/或C末端包含與其結(jié)合的半胱氨酸殘基。
[0035]提供在肽的N和/或C末端處的半胱氨酸殘基可以促進(jìn)其對(duì)載體的偶聯(lián)和/或可以增強(qiáng)肽的免疫原性。如果向本發(fā)明的肽的C和/或N末端添加半胱氨酸殘基，那么本文中提述的氨基酸殘基的數(shù)目明顯增加I或2個(gè)氨基酸殘基。因此，所述由6至20個(gè)氨基酸殘基組成并且自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAffffLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID N0.23)衍生的肽(其中所述肽包含氨基酸序列 WffLGID(SEQ ID N0.24))可以由7至21個(gè)或8至22個(gè)氨基酸殘基組成。
[0036]本發(fā)明的特別優(yōu)選的具有C或N末端半胱氨酸殘基的肽選自下組:C-YTTAffffLGIDQS, C-YGYTTAffffLGIDQSID, C-TTAffffLGIDQS, C-TAffffLGIDQS, C-AffffLGIDQS, C-ffffLGIDQS, C-YTTAffffLGIDQ, C-YTTAWWLGID, C-TTAffffLGIDQ 和 TTAffffLGID-C。
[0037]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽用于預(yù)防和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化和與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病。
[0038]如上文列出的，本發(fā)明的肽能誘導(dǎo)抗體的形成，所述抗體能特異性結(jié)合尤其在人中存在的CETP。這些抗體對(duì)CETP的結(jié)合導(dǎo)致CETP在體內(nèi)活性的降低。其結(jié)果是HDL的水
平升高。
[0039]優(yōu)選地，與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病選自下組:周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、冠心病、中風(fēng)性腦發(fā)作(apoplectic cerebral insultus)和中風(fēng)。
[0040]術(shù)語(yǔ)“與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病”指作為動(dòng)脈粥樣硬化的結(jié)果的疾病。這些疾病包括周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、冠心病和中風(fēng)性腦發(fā)作(參見(jiàn)例如Steinberg D.，J.LipidRes.46 (2005):179-190;Steinberg D et al., J.Lipid Res.47(2006):1339-1351)。
[0041]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽以每次免疫0.5至500 μ g，優(yōu)選I至100 μ g的量對(duì)個(gè)體施用。然而，本發(fā)明的肽或可以每kg體重0.1ng至IOmg,優(yōu)選IOng至Img,特別是IOOng至300 μ g的量對(duì)個(gè)體施用。
[0042]可與載體材料組合以產(chǎn)生單劑形式的肽的量將根據(jù)所治療的宿主和特定施用模式而有不同。疫苗的劑量可依照多種因素如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和重量，和抗體在個(gè)體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力而有不同。可以調(diào)整劑量方案以提供最優(yōu)治療性應(yīng)答。例如，可以每日施用數(shù)個(gè)分開(kāi)的劑量，或者劑量可以成比例降低，如由治療情況的緊急性所指示的。還可以根據(jù)情況改變疫苗的劑量以提供最優(yōu)預(yù)防性劑量應(yīng)答。例如，可以總是根據(jù)針對(duì)CETP的抗體水平，以數(shù)天、一周或兩周、或甚至數(shù)月為時(shí)間間隔對(duì)個(gè)體施用本發(fā)明的肽和疫苗。
[0043]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽/疫苗應(yīng)用2至10次，優(yōu)選2至7次，甚至更優(yōu)選多達(dá)5次，且最優(yōu)選多達(dá)3次。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，后續(xù)疫苗接種之間的時(shí)間間隔選定為2周至5年或更長(zhǎng)，優(yōu)選為I個(gè)月至長(zhǎng)達(dá)3年，更優(yōu)選2個(gè)月至1.5年。本發(fā)明肽/疫苗的重復(fù)施用可以將治療型疫苗接種的最終效果最大化。
[0044]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含至少一種如上文限定的肽的疫苗，所述肽包含6至30個(gè)氨基酸殘基且自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAffffLGIDQSIDFEIDSAI (SEQ ID N0.23)衍生，其中所述肽包含氨基酸序列WWLGID (SEQ ID N0.24)。
[0045]本發(fā)明的疫苗可包含一種或多種，優(yōu)選2，3，4，5，6，7，8，9或10種選自下組的肽:YTTAWWLGIDQS(SEQ ID N0.1), YGYTTAffffLGIDQSID(SEQID N0.7)，TTAffffLGIDQS(SEQID N0.8),TAffffLGIDQS(SEQ ID N0.9), AffffLGIDQS(SEQ ID N0.10), WffLGIDQS(SEQ IDN0.11), YTTAffffLGIDQ(SEQ ID N0.13), YTTAffffLGID(SEQ ID N0.14), TTAffffLGIDQ(SEQ IDN0.18)和 TTAffffLGID(SEQ ID N0.19)。
[0046]肽的特別優(yōu)選的組合包括:SEQ ID N0.10和11; SEQ ID N0.8和9; SEQID N0.8和10;SEQ ID N0.8和 11;SEQ ID N0.9和 10;SEQ ID N0.9和 11;SEQID N0.8，9和 10;SEQ IDN0.8，9 和 11; SEQ ID N0.8，9，10 和 11; SEQ ID N0.10，11 和 18; SEQ ID N0.8，9 和 18; SEQID N0.8，10 和 18; SEQ I D N0.8，11 和 18; SEQ ID N0.9，10 和 18; SEQ ID N0.9，11 和 18; SEQID N0.8，9，10 和 18; SEQ ID N0.8，9，11 和 18; SEQ ID N0.8, 9, 10, 11 和 18; SEQ ID N0.8 和18;SEQ ID N0.9 和 18;SEQ ID N0.10 和 18;SEQ ID N0.11 和 18。
[0047]本發(fā)明的疫苗還可包含CETP的其它肽片段或其變體或任何能誘導(dǎo)針對(duì)CETP (特別是人CETP)的抗體的體內(nèi)形成的其它肽。尤其合適的是在W02009/021254中披露的肽。其中披露的肽具有氨基酸序列FX8(F) JX9HXltlX11X12DX2X3X4X5X6X7，其中X8選自下組:G、A、F、Y和K，X9選自下組:E、Y、A、Q、K和S，Xltl選自下組:H、V、L、F和I，X11選自下組:L、W、S、1、F和Y，X12是V、T、F或I，X2是選自下組的氨基酸殘基:F、A、W、R、S、L、Q、V和M，X3是選自下組的氨基酸殘基:L、A、S、W、E、R、I和H，X4是選自下組的氨基酸殘基:Q、A、H、D、K、R、S和E，&是3或Y，乂6是1^、八或I，X7是S、N或1\且0是0或I。優(yōu)選的組合包含本發(fā)明的肽和一種或多種選自下組的肽:FGFPEHLLVDFLQSLS, FPEHLLVDFLQSL, AGFPEHLLVDFLQSLS, FAFPEHLLVDFLQSLS, FGAPEHLLVDFLQSLS, FGFAEHLLVDFLQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPEALLVDFLQSLS, FGFPEHALVDFLQSLS, FGFPEHLAVDFLQSLS, FGFPEHLLADFLQSLS, FGFPEHLLVAFLQSLS, FGFPEHLLVDALQSLS, FGFPEHLLVDFAQSLS, FGFPEHLLVDFLASLS, FGFPEHLLVDFLQALS, FGFPEHLLVDFLQSAS, FGFPEHLLVDFLQSLA, FAFPAHLLVDFLQALA, FGFPGHLIWDSLHSLS, FGFPYHHLVDQLHSLS, FGFPYHVQVDVLQSLS, FGFPSHHLQDSLQSLS, FGFPLHFRSDRIQSLS, FGFPKHLYADMSQSLS, FGFPAHLSRDLRQSLS, FGFPFHFAQDSWQSLS, FGFPQHLTTDRAQSLS, FGFPQHLTTDWAQSLS, FGFPQHLTTDRLQSLS, FGFPQHLTTDWLQSLS, ATPSHLIIDRAQ, ATPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDffAQSLS,FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQLLS, FGFPAHVSIDffLQWLS, FGFPAHVSIDWLQNLS, FGFPAHVSIDWLQTLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHVSIDffLQSIS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVSIDWLQSLY, FAFPAHVSIDWLQALA, FGFPAHVSIDRAQSLS, FGFPTHVSIDffLQSLS, FGFPFHVSIDWLQSLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHLTTDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHVSLDWLQSLS, FGFPAHVSADffLQSLS, FGFPAHVffIDffLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPAHVSFDffLQSLS, FGFPEHVFIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, FGFPKHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDffSQSLS, FGFPAHVSIDFSQSLS, FGFPSHIIIDffLQSLS, FGFPSHLIIEWLQSLS, FAFPAHVFIDffLQSLS, FGFPAHVFIDWLQALS, FGFPAHVFIDWLQSLA, FAFPAHVFIDWLQALA, FGFPEHLFVDFLQSLS, FGFPAHVHIDWLQSLS, FGFPAHVPIDWLQSLS, FGFPSHLFIDffAQSL
S,FGFPAHVYIDffLQ和 FGFPAHVFIDWLQ。
[0048]本發(fā)明的疫苗還可包含自其它與調(diào)節(jié)人體內(nèi)LDL和/或HDL水平有關(guān)的蛋白質(zhì)衍生的抗原。例如，本發(fā)明的CETP片段可組合從PCSK9(蛋白質(zhì)原轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin第 9 型)衍生的表位，如 W02008/125623、W02010/057242 和 W02011/027257 所述。
[0049]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述至少一種肽偶聯(lián)或融合至藥學(xué)可接受的載體，優(yōu)選為KLH(匙孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin))。
[0050]依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述肽偶聯(lián)或融合至藥學(xué)可接受的載體，優(yōu)選為KLH(匙孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白)、破傷風(fēng)類毒素、結(jié)合清蛋白的蛋白質(zhì)、乙肝核心抗原、牛血清清蛋白、dendrimer(MAP)、肽接頭(或側(cè)翼區(qū))或CRM，優(yōu)選為CRM197，以及與Singhet al.，Nat.Biotech.17(1999): 1075-1081 (特別是在該文獻(xiàn)表 I 中的那些)，和 O，Haganet al., Nature Reviews, Drug Discovery2 (9) (2003): 727-735 (特別是其中描述的內(nèi)源性免疫加強(qiáng)化合物和投遞系統(tǒng))中描述的佐劑物質(zhì)或其混合物組合。此背景中的偶聯(lián)化學(xué)(例如經(jīng)由異型雙功能化合物如GMBS,以及當(dāng)然還有其他的如在"BioconjugateTechniques", Greg T.Hermanson中描述的化合物)可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的反應(yīng)。此外，疫苗組合物可 與佐劑，優(yōu)選低可溶性鋁組合物，特別是氫氧化鋁一起配制。當(dāng)然，可以使用其他佐劑如MF59磷酸鋁、磷酸鈣、細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、皂苷類(例如QS21)、MDP衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、MPL、聚磷腈(poIyphosphazene)、乳劑(例如弗氏(Freund’ S)、SAF)、脂質(zhì)體、脂肽、病毒顆粒、iscoms、cochleate、PLG微粒、泊洛沙姆(poloxamer)顆粒、病毒樣顆粒、熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、突變體毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和/或聚合的脂質(zhì)體。
[0051]優(yōu)選地，本發(fā)明的肽經(jīng)由接頭結(jié)合載體或佐劑，所述接頭選自下組-MHS-聚(氧化乙烯)(PEO)(例如NHS-PE04-馬來(lái)酰亞胺)。
[0052]包含本發(fā)明的肽和藥學(xué)可接受的載體的疫苗可通過(guò)任何合適的應(yīng)用模式例如皮內(nèi)(1.d.)、靜脈內(nèi)(1.V.)、腹膜內(nèi)(1.p.)、肌內(nèi)(1.m.)、鼻內(nèi)、口腔、皮下(s.c.)等并在任何合適的投遞裝置中施用(O，Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery2 (9)(2003):727-735)。優(yōu)選地，將本發(fā)明的化合物配制用于s.c.、1.d.或1.m.施用(參見(jiàn)例如"Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRCPress Inc, 2004)。
[0053]依照本發(fā)明的疫苗包含至少一種肽，其優(yōu)選地配制為用于1.d.、s.c.或1.m.施用。
[0054]優(yōu)選地，疫苗中的至少一種肽與佐劑(優(yōu)選為氫氧化鋁)一起配制。
[0055]通常地,疫苗以0.5至500 μ g,優(yōu)選I至100 μ g,或者0.1ng至IOmg,優(yōu)選IOng至Img,特別是IOOng至100 μ g,或者例如IOOfmol至10 μ mol,優(yōu)選IOpmol至I μ mol，特別是IOOpmol至IOOnmol的量含有依照本發(fā)明的肽。優(yōu)選地，所述疫苗還可以含有輔助性物質(zhì)，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑等。
[0056]依照本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述疫苗可包含以下組分中的兩種或更多種:
【權(quán)利要求】
1.由6至20個(gè)氨基酸殘基組成并自氨基酸序列VFKGTLKYGYTTAffffLGIDQSIDFEIDSAI(SEQ ID N0.23)衍生的肽，其中所述肽包含氨基酸序列WffLGID (SEQ ID N0.24)。
2.依照權(quán)利要求1的肽，其特征在于所述肽的氨基酸序列選自下組:YTTAffffLGIDQS(SEQ ID N0.1), YGYTTAffffLGIDQSID (SEQ ID N0.7), TTAffffLGIDQS (SEQID N0.8), TAffffLGIDQS(SEQ ID N0.9), AffffLGIDQS(SEQ ID N0.10), WffLGIDQS(SEQ IDN0.11), YTTAffffLGIDQ(SEQ ID N0.13), YTTAffffLGID(SEQ ID N0.14), TTAffffLGIDQ(SEQ IDN0.18)和 TTAffffLGID(SEQ ID N0.19)。
3.依照權(quán)利要求1或2的肽，其特征在于所述肽在其C和/或N末端包含半胱氨酸殘基。
4.依照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的肽，其用于預(yù)防和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化和與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病。
5.依照權(quán)利要求4的肽，其特征在于所述與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病選自下組:周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、冠心病、中風(fēng)性腦發(fā)作和中風(fēng)。
6.依照權(quán)利要求4或5的肽，其特征在于所述肽以每次免疫0.5至500 μ g，優(yōu)選I至IOOyg的量對(duì)個(gè)體施用。
7.包含至少一種依照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的肽的疫苗。
8.依照權(quán)利要求7的疫苗，其特征在于至少一種肽偶聯(lián)或融合至藥學(xué)可接受的載體，優(yōu)選為KLH (匙孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白)。
9.依照權(quán)利要求7或8的疫苗，其特征在于將至少一種肽配制成用于皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用。
10.依照權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于將至少一種肽與佐劑一起配制，所述佐劑優(yōu)選為氫氧化鋁。
11.依照權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于所述疫苗以每次免疫0.5至500 μ g，優(yōu)選為I至100 μ g的量包含所述至少一種多肽。
12.依照權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)的疫苗，其用于預(yù)防和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化和與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病。
13.依照權(quán)利要求12的疫苗，其特征在于所述與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病選自下組:周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、冠心病、中風(fēng)性腦發(fā)作和中風(fēng)。
14.結(jié)合依照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的肽的抗體。
15.依照權(quán)利要求14的抗體，其特征在于所述抗體包含重鏈可變("VH")區(qū)和抗體輕鏈可變(〃VL〃)區(qū)，每個(gè)區(qū)包含互補(bǔ)決定區(qū)，其中所述VH區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有以下一種或多種氨基酸序列:
NVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGHSITSDYAffNWIRQFPGNKLEWMGYITNSGSTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTRGGPYWGQGTLVTVSA(SEQ ID N0.104)，
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFTFSTYAMSWFRLTPERRLEWVAAISNGGSQNSYPDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCSRNGNYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID N0.105)，
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTTYNPSLKSRISITRHTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCTRLGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID N0.106)或
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDCSMHWVKQAPGQGLKWMGWINTKTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINILKNEDSATYFCAAHSGKDYAIDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID N0.107)， 且VL區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有以下一或多種氨基酸序列: DIVMTQSQKFMSTSV⑶RVSITCKASQNVGTAVVWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID Nol08),
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGSGTKLEIK(SEQ ID N0.109)，
DIVMTQSPASLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLSSKNQKNFLAWYQQKPGQSPKVLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQQYNTPLTFGAGTKLELK(SEQ ID N0.110)或
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAQDLGVYFCF`QGSRVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID N0.111)。
【文檔編號(hào)】A61K38/10GK103635204SQ201280028674
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月10日
【發(fā)明者】S.布倫納, M.格布哈特, E.比爾齊科瓦, C.朱諾, P.林茨邁耶-赫特, B.舒 申請(qǐng)人:阿費(fèi)里斯股份公司