用于活性試劑穩(wěn)定化的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本文提供了用于活性試劑穩(wěn)定化的方法和組合物。所述活性試劑分布、混合或包埋于絲素蛋白基質(zhì)中，從而在儲存和/或運輸時維持所述活性試劑的生物活性。在一些實施方式中，本文還提供了穩(wěn)定儲存的疫苗-絲組合物。
【專利說明】用于活性試劑穩(wěn)定化的方法和組合物
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]根據(jù)35U.S.C § 119(e)，本申請要求2011年4月21日提交的美國臨時申請N0.61/477，737的優(yōu)先權(quán)，以引用的方式將其內(nèi)容整體并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生研究院授予的基金EB002520、以及由美國空軍授予的基金FA9550-07-1-0079的政府支持下完成的。美國政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明一般而言涉及用于活性試劑穩(wěn)定化的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0006]由于活性試劑通常是不穩(wěn)定的、并對周圍條件(例如溫度、濕度和/或光)的變化敏感，因此活性試劑的穩(wěn)定化是許多應(yīng)用中的重要特征。即使活性試劑被確定為對于給定反應(yīng)是有用的，其應(yīng)用也往往受到加工條件下缺乏長期穩(wěn)定性的束縛。
[0007]已對用于不同應(yīng)用的穩(wěn)定活性試劑(例如酶和治療性蛋白)的多種模式(由凍干至共價固定)進(jìn)行了研究。通常而言，許多固定化活性試劑顯出改善的穩(wěn)定性，這可能是由于降低了移動性(mobility),從而防止疏水水合作用(hydrophobic hydration)產(chǎn)生變化及因此聚集并失去活性。用于固定活性試劑(例如酶)的技術(shù)通常分為四類:(I)將酶非共價吸附至載體材料表面；(2)共價附著至材料表面；(3)物理包埋(entrapment)入材料基質(zhì)內(nèi)；以及(4)酶交聯(lián)以“鎖定(lock)”結(jié)構(gòu)。全部這些方法都是在維持高催化活性與實現(xiàn)上述優(yōu)點之間的折中。提供 特異性表面結(jié)合位點或相對親水性/疏水性的微環(huán)境來保持高負(fù)載和活性試劑的活性的材料的缺乏，限制了上述基于載體的固定方法的應(yīng)用。另外，對于許多應(yīng)用而言，載體材料需要為生物可降解的和生物相容的，以用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，這一點將多數(shù)合成聚合材料的使用排除在外。
[0008]近來，已經(jīng)開發(fā)了新型固定方法來對活性試劑(例如酶)的穩(wěn)定性和活性進(jìn)行改善。例如，所述載體材料的微環(huán)境可通過使用阻斷劑進(jìn)行工程化來減少非特異性結(jié)合位點。或者，可將親水性高分子引入至所述活性試劑附近、或在所述活性試劑和材料表面間使用親水性間隔物(spacer)。此外，已使用了溶膠-凝膠(sol-gel)材料來用于固定，并發(fā)現(xiàn)其由于微環(huán)境限制(microenvironmental confinement)效應(yīng)而使酶(例如脂肪酶)的活性提高至多達(dá)100倍。
[0009]另外，已將酶交聯(lián)法與蛋白質(zhì)結(jié)晶聯(lián)合，從而產(chǎn)生交聯(lián)的酶晶體(CLEC)，與天然酶相比，所述交聯(lián)的酶晶體具有提高的酶穩(wěn)定性和選擇性。盡管這一方法已被醫(yī)藥公司用于制備治療性蛋白質(zhì)藥物，然而蛋白質(zhì)結(jié)晶很復(fù)雜，并通常不可預(yù)測。交聯(lián)酶聚集體(CLEA)可通過沉淀蛋白質(zhì)、繼以使用戊二醛交聯(lián)獲得。來自青霉素?；D(zhuǎn)移酶的CLEA在合成氨芐青霉素方面與CLEC具有相同的活性。磁性納米粒子也被用于酶的共價固定，并因此用于增強酶的穩(wěn)定性。然而，在環(huán)境儲存條件(ambient storage conditions)(例如室溫)下提供長期穩(wěn)定性時，這些固定方法均不是生物相容的/生物可降解的、或者易于使用的。
[0010]特別而言，疫苗穩(wěn)定化已經(jīng)成為長期持續(xù)的挑戰(zhàn)，并且大量疫苗已經(jīng)由于不當(dāng)儲存而被損耗。盡管全球免疫(global immunization)目前每年挽救2百萬-3百萬兒童的生命，然而對于每年發(fā)生的1050萬例兒童死亡而言，250萬例是由于可通過疫苗預(yù)防的疾病導(dǎo)致的。麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)和風(fēng)疫(rubella)是三種常見的兒童疾病，分別由麻疫病毒、腿腺炎病毒(副粘液病毒(paramyxoviruses))和風(fēng)疫病毒(披膜病毒(togavirus))引起,這些疾病可能涉及嚴(yán)重的并發(fā)癥和/或死亡。例如，肺炎和腦炎是由麻疹引起的。腮腺炎與無菌性腦膜炎、耳聾和睪丸炎相關(guān)；并且懷孕期間的風(fēng)疹可能會導(dǎo)致受感染母親的嬰兒患有先天性風(fēng)疹綜合征。通過將使用疫苗前的給定年份中報道的麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹病例的最大數(shù)量與1995年報道的各疾病的病例數(shù)進(jìn)行比較，可以對麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹疫苗對于美國自然歷史上各疾病的影響進(jìn)行量化。對于麻疹，相比于1941年報道的894，134例病例，1995年報道了 288例，報道的病例數(shù)下降了 99.97% ;對于腮腺炎，相比于1968年報道的152，209例病例，1995年報道了 840例，報道的病例數(shù)下降了 99.45% ；以及對于風(fēng)疹，相比于1969年報道的57，686例病例，1995年報道了 200例，下降了 99.65%(Monthly Immunization Table,45MMWR24 (1996))。
[0011]疫苗是一種若變得過熱或過冷時可能很快失去其效力的生物物質(zhì)，尤其是在運輸和儲存期間。不慎冷凍(inadvertent freezing)、加熱至超過8°C或冷鏈(cold chain)的其它斷鏈可能導(dǎo)致失效或疫苗損耗。根據(jù)WH0，2006-2015年間，僅美國就將貢獻(xiàn)350億美元用于全球免疫接種計劃。約三分之一將花費在疫苗上，其余的將花費在疫苗遞送系統(tǒng)上。明了的是即使由于冷鏈?zhǔn)Ф鴮?dǎo)致1%的疫苗損耗，其總量也是可觀的。事實上，對于五個美國的州而言，平均損耗1%_5%將花費約600萬-3100萬美元。在世界的其它部分，疫苗損耗可達(dá)到10%。兩種最普遍的損耗形式涉及熱穩(wěn)定性和貯藏壽命(shelf life)，不慎冷凍也是另一個關(guān)鍵問題。因此， 對于穩(wěn)定儲存的活性試劑(例如穩(wěn)定儲存的疫苗)存在強烈需求，所述穩(wěn)定儲存的活性試劑具有可在多種穩(wěn)健(robust)的環(huán)境條件下(例如，不需要冷鏈合規(guī)(cold chain compliance))維持效力的更長的忙藏壽命。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本文所述的多個實施方式提供了穩(wěn)定儲存的組合物，所述組合物包含絲素蛋白(silk fibroin)基質(zhì)和分布于其中的活性試劑,其中，當(dāng)所述組合物經(jīng)受至少一個狀態(tài)變化循環(huán)(state-changing cycle)、和/或在規(guī)定條件下保存一段時間時,所述活性試劑維持其至少約30%的初始生物活性。在一個實施方式中，所述狀態(tài)變化循環(huán)為冷凍-解凍循環(huán)。在一個實施方式中，所述活性試劑保存的時間段為至少約24小時。在一些實施方式中，所述規(guī)定條件可以為活性試劑被儲存和/或運輸?shù)沫h(huán)境條件(environmentalcondition)。環(huán)境條件的非限制性實例包括溫度、氣壓、濕度、以及光照(light exposure)。在一些實施方式中，所述活性試劑為免疫原。在一些實施方式中，所述活性試劑為疫苗。
[0013]本文還提供了例如在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有用的試劑盒和遞送裝置。示例性的遞送裝置包括但不限于:注射器(syringe)、干粉注射器(dry powder injector)、鼻噴霧器(nasalspray)、霧化器(nebulizer)、以及植入物(implant)。此類試劑盒和裝置包含本文所述的穩(wěn)定儲存的組合物，并任選地包含藥學(xué)上可接受的溶液。在一個實施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于將本文所述的穩(wěn)定儲存的組合物給予受試者的至少一種遞送裝置，和/或消毒劑(disinfectant)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1示出了對于麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹，疫苗樣品的1gltl稀釋與Ct值之間的線性關(guān)系。N=3,誤差棒表不標(biāo)準(zhǔn)差。
[0015]圖2示出了在細(xì)胞接種前24小時、18小時、12小時和6小時在水中復(fù)溶(reconstituted)的MMR疫苗在25°C避光儲存的結(jié)果。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0016]圖3示出了儲存于9% (w/ν)絲膜(silk film)中超過3個月的麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹病毒的穩(wěn)定性。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0017]圖4為對添加了穩(wěn)定化添加劑MgCl2、MgS04和蔗糖時絲膜中的麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹病毒的初始回復(fù)效價(initial recovered potency)進(jìn)行比較的柱狀圖。N=3,誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0018]圖5示出了在細(xì)胞接種前24小時、18小時、12小時和6小時在70%蔗糖中復(fù)溶的
MMR疫苗在25 °C避光儲存的結(jié)果。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0019]圖6A-圖6D表示對在水中于4°C (圖6A)或37°C (圖6C)、或在70%蔗糖中于4°C(圖6B)或37°C (圖6D)的復(fù)溶MMR疫苗的殘余效價(residual potency)進(jìn)行的比較。在細(xì)胞接種前24小時、18小時、12小時和6小時，將疫苗在水中或70%蔗糖中復(fù)溶，在25 °C避光儲存。N=3,誤差棒表不標(biāo)準(zhǔn)差。
[0020]圖7示出了包封疫苗的絲膜的制造和感染性分析(infectivity assay)的示意圖。(I)凍干疫苗粉末在無菌水性絲溶液(silk solution)中復(fù)溶。(2a)通過將小份(aliquot)疫苗-絲混合物燒注至涂覆有聚四氟乙烯(Teflon)的表面、并在室溫下使其在無菌罩中避光干燥12小時，從而制備包封疫苗的絲膜。(3a)在適當(dāng)溫度下將單獨的干燥的膜儲存于Eppendorf管中，用于穩(wěn)定性研究。(2b)在凍干疫苗粉末在無菌水性絲溶液中復(fù)溶后，通過將小份疫苗-絲混合物澆注至96孔板中并凍干，從而制備凍干的包封疫苗的絲膜。(3b)從有孔板中移出單獨的凍干的膜,并將其轉(zhuǎn)移至玻璃血清瓶(serum vials)中，以凍干瓶塞(lyophilization stopper)蓋住并在氮氣和真空條件下招密封(alum seal)。(4)為了進(jìn)行感染性研究，將所述膜再溶解于不含核酸酶的無菌水中，并將該溶液直接加入至在24孔板中培養(yǎng)的于M199培養(yǎng)基中生長的VeiO細(xì)胞。所述細(xì)胞孵育3天以使病毒復(fù)制，隨后分離RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA，并使用實時PCR進(jìn)行定量。(5)使用TRIzoI/氯仿自所述Vero細(xì)胞分離RNA，純化所述RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA，用于實時RT-PCR。
[0021]圖8A-圖SC示出了凍干疫苗的麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹組分的殘余效價的圖，所述凍干疫苗在水中復(fù)溶不同時間，在`4°C (圖8A)、25°C (圖8B)以及37°C (圖8C)儲存。(?)麻疹、(〇)腮腺炎、(`風(fēng)疹。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0022]圖9A-圖9D示出了 MMR疫苗的麻疹病毒組分的穩(wěn)定性的圖，所述MMR疫苗在9%(w/ν)絲膜中在4°C (圖9A)、25°C (圖9B)、37°C (圖9C)和45°C (圖9D)儲存超過6個月。(?) MMR-絲膜、(□) MMR粉末。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0023]圖1OA-圖1OD示出了 MMR疫苗的腮腺炎病毒組分的穩(wěn)定性的圖，所述MMR疫苗在9% (w/v)絲膜中在 4°C (圖 10A)、25°C (圖 10B)、37°C (圖 10C)和 45°C (圖 10D)儲存超過6個月。絲膜、(D)MMR粉末。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0024]圖1lA-圖1ID示出了 MMR疫苗的風(fēng)疹病毒組分的穩(wěn)定性的圖，所述MMR疫苗在9%(w/ν)絲膜中在 4°C (圖 11A)、25°C (圖 11B)、37°C (圖 11C)和 45°C (圖 11D)儲存超過 6個月。絲膜、(O)MMR粉末。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0025]圖12A-圖12D示出了 MMR疫苗的麻疹病毒組分的穩(wěn)定性的圖，所述MMR疫苗在9%(w/v)凍干絲膜中在4°C (圖12A)、25°C (圖12B)、37°C (圖12C)和45°C (圖12D)儲存超過6個月。() MMR-凍干絲膜、(O)MMR粉末。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0026]圖13A-圖13D示出了 MMR疫苗的腮腺炎病毒組分的穩(wěn)定性的圖，所述MMR疫苗在9% (w/v)凍干絲膜中在 4°C (圖 13A)、25°C (圖 13B)、37°C (圖 13C)和 45°C (圖 13D)儲存超過6個月。(WMMR-凍干絲膜、(D)MMR粉末。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0027]圖14A-圖14D示出了 MMR疫苗的風(fēng)疹病毒組分的穩(wěn)定性的圖，所述MMR疫苗在9%(w/v)凍干絲膜中在4°C (圖14A)、25°C (圖14B)、37°C (圖14C)和45°C (圖14D)儲存超過6個月。() MMR-凍干絲膜、(O)MMR粉末。N=3，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。
[0028]圖15A-圖15C示出了疫苗的麻疹(圖15A)、腮腺炎(圖15B)和風(fēng)疹(圖15C)組分的降解速率作為絕對溫度倒數(shù)的函數(shù)的Arrhenius圖。()凍干絲膜、(O)絲膜、()粉末。
[0029]圖16A-圖16C示出了作為溫度的函數(shù)的麻疹(圖16A)、腮腺炎(圖16B)和風(fēng)疹(圖16C)病毒組分的預(yù)測半衰期，以及所述半衰期相應(yīng)的上下限的圖。所述預(yù)測半衰期表示預(yù)計所述病毒組分降解至初始值的50%所需的時間。()凍干絲膜、(O)絲膜、()粉末。
[0030]圖17示出了差示掃描量熱法，固態(tài)DSC的圖。凍干絲膜的固態(tài)DSC顯示178°C處產(chǎn)生玻璃化轉(zhuǎn)變(Tg)。制造商提供的MMR疫苗粉末(含有各種各樣的賦形劑和穩(wěn)定劑)的Tg為68.9°C。凍干的MMR-絲膜示出了 89.2°C處的Tg，表明將絲添加至MMR粉末增強了疫苗穩(wěn)定性，這由Tg升高得以反映。然而，MMR-凍干絲膜曲線在116.6°C和164.8°C處顯示出兩個峰,可能表示Tm和Td,描述了疫苗組分的解折疊(unfolding)或降解。
[0031]圖18示出了 nano差示掃描量熱法，nano-DSC的圖。純化病毒粒子的Tm顯示為約16.80C。絲的存在將病毒粒子的Tm提高至68.3°C。Tm后的迅速下降是放熱事件，該事件很可能源自Tm處的蛋白質(zhì)解折疊導(dǎo)致的聚集作用。絲的Tg為約178°C,因此升高的Tg值歸結(jié)于絲對所包封的病毒蛋白產(chǎn)生的影響。
[0032]圖19示出了對在水中的純化病毒粒子和在絲溶液中的純化病毒粒子的動態(tài)光散射進(jìn)行比較的圖。MMR病毒粒子的平均有效直徑的平均數(shù)(average mean effectivediameter)為約250nm。純化的MMR溶液的平均有效直徑在16°C附近開始增加，表明病毒粒子由于熱輸入增加而產(chǎn)生的聚集。MMR-絲溶液直至70°C都未顯示出聚集的跡象，表明絲提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而阻止了病毒蛋白質(zhì)的聚集。
[0033]圖20A-圖20B示出了 MMR由絲膜(圖20A)和凍干絲膜(圖20B)釋放的圖。N=3，
誤差棒表不標(biāo)準(zhǔn)差。
[0034]圖2IA-圖21B示出了 MMR由絲水凝膠(圖21A)和絲微球(圖21B)釋放的圖。N=3，
誤差棒表不標(biāo)準(zhǔn)差。
[0035]圖22A-圖22D示出了示意圖。圖22A，麻疹和腮腺炎屬于副粘液病毒科(Paramyxoviridae family),并且它們的結(jié)構(gòu)由封入脂質(zhì)雙分子層中的核殼體內(nèi)的單鏈反義RNA構(gòu)成。病毒包膜由基質(zhì)蛋白(M)、血凝素(haemaglutinin)蛋白(H)和融合蛋白(F)形成。結(jié)構(gòu)完整的H和F蛋白負(fù)責(zé)將病毒粒子結(jié)合并融合至動物細(xì)胞。圖22B，通過聯(lián)合疏水相互作用和受限的鏈移動性，絲包埋的病毒粒子在升高的溫度下維持其結(jié)構(gòu)活性。圖22C，F(xiàn)和H蛋白結(jié)合至受體⑶46和⑶150 (統(tǒng)稱為SLAM)，從而得以進(jìn)入細(xì)胞，以開始病毒復(fù)制。圖22D,表面蛋白的變性可導(dǎo)致所述病毒粒子產(chǎn)生聚集。蛋白質(zhì)的變動(perturbation)可使得其不能被細(xì)胞所識別并被拒絕進(jìn)入。
【具體實施方式】
[0036]應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不限于本文所描述的特定的方法學(xué)、方案和試劑等，并且上述這些都可以改變。本文所使用的術(shù)語其目的僅在于描述特定的實施方式，并非用來限定本發(fā)明的范圍，而本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求進(jìn)行限定。
[0037]除非上下文另有明確指示，在本文及權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式也包含復(fù)數(shù)含義，反之亦然。除了在操作實施例中或另有指示的情況外，本文所用的表示成分的量或反應(yīng)條件的全部數(shù)值在所有情況下都應(yīng)該被理解為由術(shù)語“約”修飾。
[0038]出于描述和公開的目的，在此以引用的方式清楚地將本發(fā)明指明的所有專利和其它出版物并入，例如，在此類出版物中描述的可用于本發(fā)明的方法學(xué)。提供此類出版物僅僅是因為它們的公開早于本申請的申請日。在這點上，不應(yīng)將任何事物視為發(fā)明人無權(quán)根據(jù)在先發(fā)明或因任何其它原因使本發(fā)明的內(nèi)容早于這些公開內(nèi)容的認(rèn)定。所有關(guān)于日期的陳述或關(guān)于此類文件內(nèi)容的表達(dá)都是基于 申請人:可得的信息，并不構(gòu)成對此類文件的日期或內(nèi)容的正確性的任何認(rèn)定。
[0039]除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。雖然本發(fā)明的實施操作或測試中可使用任何已知的方法、裝置和材料，在這方面，本文仍對所述方法、裝置和材料進(jìn)行了描述。
[0040]本文提供的一個方面涉及維持或穩(wěn)定活性試劑的生物活性的方法和組合物。所述方法包括保存組合物，其中所述組合物包含絲素蛋白基質(zhì)和分布、混合或包埋(embedded)于其中的至少一種活性試劑，其中，當(dāng)所述組合物經(jīng)受規(guī)定條件一段時間時，所述至少一種活性試劑維持或穩(wěn)定其至少約30%的初始生物活性，所述規(guī)定條件抑制或降低所述活性試劑的生物活性。此類條件可包括但不限于:狀態(tài)變化循環(huán)、溫度、氣壓、濕度、以及光照。在一個實施方式中，所述狀態(tài)變化循環(huán)為冷凍-解凍循環(huán)。
[0041]本文所述的多個方面的實施方式提供穩(wěn)定化的活性試劑，其中活性試劑的穩(wěn)定化通過將活性試劑分布、混合或包埋于絲素蛋白基質(zhì)中而實現(xiàn)。所述絲素蛋白基質(zhì)可以為絲素蛋白溶液或固態(tài)絲素蛋白基質(zhì)。這一方法使`得所述活性試劑得以維持生物活性，而不必考慮儲存和/或運輸所述活性試劑的環(huán)境條件和/或冷鏈。示例性的環(huán)境條件包括但不限于:溫度、氣壓、濕度、以及光照。例如，所述冷鏈為藥物工業(yè)上用于穩(wěn)定活性試劑的標(biāo)準(zhǔn)實踐:維持所述冷鏈確保直至使用之時，均根據(jù)制造商推薦的溫度范圍(例如，2°C _8°C或者零下的溫度)運輸和儲存活性試劑。
[0042]在某些實施方式中，本文所述的活性試劑為免疫原。在一個實施方式中，所述免疫原為疫苗。多數(shù)疫苗對于其儲存和/或運輸?shù)沫h(huán)境條件是敏感的。例如，冷凍可提高反應(yīng)原性(reactogenicity)(例如，引發(fā)免疫反應(yīng)的能力)和/或一些疫苗(例如，HepB以及DTaP/IPV/HIB)的效價損失，或者致使容器產(chǎn)生毛細(xì)裂紋，從而導(dǎo)致污染(contamination)。另外，一些疫苗(例如，BCG、水痘(Varicella)、以及MMR)對熱敏感。許多疫苗(例如，BCG、MMR、水痘、腦膜炎球菌C綴合物、以及多數(shù)含有DTaP的疫苗)對光敏感。參見，例如，Galazka等，Thermostability of vaccines, Global Programme for Vaccines&Immunization(世界衛(wèi)生組織，日內(nèi)瓦，1998) ;Peetermans 等，Stability of freeze-dried rubellavirus vaccine(Cendehi11 strain)at various temperatures, 1J.BiologicalStandardizationl79 (1973)。因此,本文所述的組合物和方法還提供疫苗的穩(wěn)定化,而不必考慮冷鏈和/或其它環(huán)境條件。
[0043]活性試劑的穩(wěn)定化
[0044]本文所使用的術(shù)語“穩(wěn)定/穩(wěn)定化/穩(wěn)定性(stabilizing/stabilize/stability/stabilization)”涉及保存或維持絲素蛋白基質(zhì)中的至少一種活性試劑的生物活性。本文所使用的短語“活性試劑的穩(wěn)定化”是指分布、混合或包埋于絲素蛋白基質(zhì)中的一種或多種活性試劑維持其至少約30%的初始生物活性，包括至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%的初始生物活性或更高的初始生物活性。關(guān)于活性試劑的生物活性的術(shù)語“穩(wěn)定”和“維持”在本文中可互換使用。
[0045]當(dāng)涉及組合物或活性試劑時，本文所使用的術(shù)語“保存/維持(maintaining/maintain/maintenance)^是指當(dāng)活性試劑經(jīng)受某些條件時,保留、保持或維持絲素蛋白基質(zhì)中至少一種活性試劑的生物活性。在一些實施方式中，分布于絲素蛋白基質(zhì)中的一種或多種活性試劑維持其至少約30%的初始生物活性，包括至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%的初始生物活性或更高的初始生物活性。
[0046]本文所使用的關(guān)于活性試劑的術(shù)語“生物活性”通常是指活性試劑與生物靶標(biāo)相互作用的能力和/或?qū)ι锇袠?biāo)產(chǎn)生影響的能力。例如，生物活性可不受限制地包括在生物靶標(biāo)中誘發(fā)刺激、抑制、調(diào)節(jié)、毒性或致死響應(yīng)。所述生物靶標(biāo)可以是分子或細(xì)胞。例如，生物活性可以指活性試劑的以下能力:調(diào)節(jié)酶的作用/活性、阻斷受體、刺激受體、調(diào)節(jié)一種或多種基因的表達(dá)水平、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)，或上述能力的任意組合。在某些情況下，生物活性可以指化合物在細(xì)胞中產(chǎn)生毒性效應(yīng)的能力。
[0047]生物活性可以通過分析細(xì)胞響應(yīng)而測定。示例性的細(xì)胞響應(yīng)包括但不限于:裂解、細(xì)胞凋亡、生長抑制和生長促進(jìn)；細(xì)胞對蛋白質(zhì)或其它感興趣的分子的制造、分泌和表面暴露；膜表面分子活化，包括受體活化；跨膜離子轉(zhuǎn)運；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；細(xì)胞存活力的變化；細(xì)胞形態(tài)的變化；細(xì)胞內(nèi)部組分的存在或表達(dá)的變化；細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的核酸的存在或表達(dá)的變化；細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的酶的活性的變化；以及受體的存在或表達(dá)的變化。用于分析不同細(xì)胞響應(yīng)的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是周知的，例如，用于對細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)的存在或表達(dá)的變化進(jìn)行測定的蛋白質(zhì)印跡法、或用于監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)對活性試劑的響應(yīng)的顯微鏡檢查。
[0048]對于 抗體，術(shù)語“生物活性”包括但不限于:表位或抗原結(jié)合親和力、抗體的體內(nèi)和/或體外穩(wěn)定性、抗體的免疫原性(例如當(dāng)給予人類受試者時)、和/或在體內(nèi)或體外中和或拮抗目標(biāo)分子生物活性的能力?？墒褂帽绢I(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)觀測或測量上述特性或特征，所述技術(shù)包括但不限于:鄰近閃爍分析法(scintillation proximity assays)、ELISA、ORIGEN免疫分析(IGEN)、熒光猝滅(quenching)、熒光ELISA、競爭性ELISA、SPR分析(包括但不限于:使用BIAcore生物傳感器的SPR分析)、體內(nèi)和體外中和分析(參見，例如，國際
【發(fā)明者】戴維·L·卡普蘭, 菲奧倫佐·奧米內(nèi)托 申請人:塔夫茨大學(xué)信托人