用于降低抗體異質(zhì)性的方法和產(chǎn)生其抗體的方法
【專利摘要】本公開內(nèi)容涉及一種在培養(yǎng)期間降低抗體的異質(zhì)性的方法，其中該異質(zhì)性是由于抗體的電荷變體的比例。該公開內(nèi)容還包括一種在致使抗體具有降低的異質(zhì)性的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過將二價(jià)過渡金屬離子如鋅（Zn2+）添加至細(xì)胞培養(yǎng)基以降低抗體異質(zhì)性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過降低細(xì)胞培養(yǎng)基的同滲容摩以降低抗體異質(zhì)性。
【專利說明】用于降低抗體異質(zhì)性的方法和產(chǎn)生其抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本公開內(nèi)容涉及提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法，例如，大規(guī)模商業(yè)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)如抗體生產(chǎn)，使用包含細(xì)胞生長(zhǎng)階段和多肽產(chǎn)生階段的改良的細(xì)胞培養(yǎng)方法。該改良的細(xì)胞培養(yǎng)方法控制過程特征和操作參數(shù)以獲得具有改變的電荷變體/堿性變體的多肽產(chǎn)品。本公開內(nèi)容涉及降低抗體的異質(zhì)性。更具體地，該公開內(nèi)容包括在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)細(xì)胞的方法，該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過降低堿性變體的比例來降低電荷變體的異質(zhì)性。
【背景技術(shù)】
[0002]無論處于商用或開發(fā)中，大部分的生物技術(shù)產(chǎn)品都是蛋白質(zhì)治療劑。因此，對(duì)于在細(xì)胞培養(yǎng)物中例如在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)以及對(duì)于與該生產(chǎn)相關(guān)的改進(jìn)方法存在較大和增長(zhǎng)的需求。因此，大量的研究集中在可以優(yōu)化多肽產(chǎn)量的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件和方法上，即，支持高細(xì)胞密度與高效價(jià)的蛋白質(zhì)的條件和方法上。
[0003]在生物制藥學(xué)的單克隆抗體中通常觀察到C-端賴氨酸變體。單克隆抗體異質(zhì)性可以歸因于各種因素，如氨基端改變(例如，對(duì)于焦谷氨酸)、C-端的不完全處理、天冬酰胺脫酰胺、磷酸化、糖基化、氧化、突變等。這些種類的變異發(fā)生在許多類型的蛋白質(zhì)中并且在生物治療藥物方面可以影響它們的活性和穩(wěn)定性?？贵w的同質(zhì)性是重要的特征并且認(rèn)為其對(duì)于證明由FDA和其它管理機(jī)構(gòu)所要求的藥物安全性和功效是必不可少的。
[0004]重組單克隆抗體已經(jīng)顯示在C-端具有精氨酸(Arg)或賴氨酸(Iys)的C-端異質(zhì)性。當(dāng)使用羧肽酶B (—種外肽酶)處理MAb的這些C-端變體時(shí)，Arg和Lys從兩個(gè)抗體亞基的C-端斷裂，從而消除 C-端異質(zhì)性。
[0005]羧肽酶(CP)是催化肽和蛋白質(zhì)中的C-端肽鍵水解的酶。從多肽或蛋白質(zhì)的C-端除去一個(gè)或幾個(gè)氨基酸對(duì)該分子的生物學(xué)活性可以具有深遠(yuǎn)的影響。由于在從來自合成時(shí)的分子到來自從受試者中完全清除時(shí)的分子的時(shí)間范圍內(nèi)引入了各種修飾，因此MAb的異質(zhì)性是常見的。研究治療劑的修飾是重要的，由于該治療劑可能影響制劑的活性/安全性從而導(dǎo)致功效損失和不良副作用的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006]US專利號(hào)5，126，250公開了一種降低由抗體生產(chǎn)細(xì)胞分泌的抗體的異質(zhì)性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]因此，本公開內(nèi)容涉及一種降低通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得的抗體的異質(zhì)性的方法，所述方法包括將二價(jià)過渡金屬離子添加至抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基或改變培養(yǎng)基的同滲容摩(滲透壓摩爾濃度，osmolality)或它們的組合以獲得具有降低的異質(zhì)性的所述抗體；以及一種用于產(chǎn)生具有降低的異質(zhì)性的抗體的方法，所述方法包含以下步驟:(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生抗體，并將二價(jià)過渡金屬離子添加至培養(yǎng)基或改變培養(yǎng)基的同滲容摩或它們的組合，以及(b)從培養(yǎng)基中回收具有降低的異質(zhì)性的抗體。【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]為了可以容易地理解該公開內(nèi)容并且投入實(shí)際應(yīng)用，現(xiàn)在將參考示例性實(shí)施方式，如參照附圖示出的。附圖連同下文的詳細(xì)描述并入說明書中并且形成說明書的一部分，用來進(jìn)一步示出實(shí)施方式并說明各種原理和優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)本公開內(nèi)容，其中:
[0009]圖1示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第264h即第11天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0010]圖2a示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0011]圖2b示出了在存在和不存在鎂離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0012]圖3示出了在含有鋅離子的低同滲容摩(240-260m0sm/Kg)培養(yǎng)基和310-320m0sm/Kg的同滲容摩的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I)。
[0013]圖4示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體2 )。
[0014]圖5示出了在含有鋅離子的低同滲容摩(240-260m0sm/Kg)培養(yǎng)基和同滲容摩范圍(310-320m0sm/Kg)的生產(chǎn)培養(yǎng)基中堿性變體的％差異(抗體3)。
[0015]圖6示出了使用不同初始同滲容摩的培養(yǎng)基的總堿性變體的％差異(抗體I)。
[0016]圖7示出了在存在和不存在鋅離子(ImM)的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I)。
[0017]圖8示出了在存在和不存在鋅離子(0.5mM)的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I)。
[0018]圖9示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體3 )。
[0019]圖10示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體4)。
[0020]圖11示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0021]圖12示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第192h即第8天堿性變體的％差異(抗體3)。
[0022]注釋:在對(duì)照中，沒有添加鋅離子。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本公開內(nèi)容涉及一種降低通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得的抗體的異質(zhì)性的方法，所述方法包括將金屬離子添加至抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基或改變培養(yǎng)基的同滲容摩或它們的組合以獲得具有降低的異質(zhì)性的所述抗體。
[0024]在本公開內(nèi)容的實(shí)施方式中，該異質(zhì)性是由于抗體的電荷變體的比例；并且其中通過降低抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例來降低異質(zhì)性。
[0025]在本公開內(nèi)容的另一個(gè)實(shí)施方式中，針對(duì)比例在約75%至約100%的范圍內(nèi)的抗體通過進(jìn)行所述方法降低異質(zhì)性。
[0026]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是天然產(chǎn)生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
[0027]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，通過降低約3%至約30%的抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸以降低異質(zhì)性。
[0028]在本公開內(nèi)容的又 一個(gè)實(shí)施方式中，該二價(jià)過渡金屬離子是在約0.05mM至約
1.5mM濃度范圍內(nèi)的Zn+2。
[0029]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，改變培養(yǎng)基的同滲容摩以提供約240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內(nèi)的同滲容摩。
[0030]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，該培養(yǎng)是補(bǔ)料式分批培養(yǎng)(fed batchculturing);并且包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系培養(yǎng)。
[0031]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，首先在細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)階段然后在細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段進(jìn)行金屬離子的添加；或其中在細(xì)胞的所述培養(yǎng)之前的初始階段進(jìn)行金屬離子的添加。
[0032]本公開內(nèi)容進(jìn)一步涉及一種用于產(chǎn)生具有降低的異質(zhì)性的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生抗體，并將二價(jià)過渡金屬離子添加至培養(yǎng)基或改變培養(yǎng)基的同滲容摩或者它們的組合，以及(b)從培養(yǎng)基中回收具有降低的異質(zhì)性的抗體。
[0033]在本公開內(nèi)容的實(shí)施方式中，在約0.5xl06細(xì)胞/ml至約0.6xl06細(xì)胞/ml的濃度范圍內(nèi)培養(yǎng)該細(xì)胞。
[0034]在本公開內(nèi)容的另一個(gè)實(shí)施方式中，在約36°C至約38°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0035]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是天然產(chǎn)生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
[0036]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，該異質(zhì)性是由于抗體的電荷變體的比例；并且其中通過降低抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例進(jìn)行降低異質(zhì)性。
[0037]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，針對(duì)比例在約75%至約100%的范圍內(nèi)的抗體通過進(jìn)行所述方法降低異質(zhì)性。
[0038]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，通過降低約3%至約30%的抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸降低異質(zhì)性。
[0039]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，該培養(yǎng)是補(bǔ)料式分批培養(yǎng)；并且包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系培養(yǎng)。
[0040]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，金屬離子是在約0.05mM至約1.5mM濃度范圍內(nèi)的Zn+2。
[0041]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，改變培養(yǎng)基的同滲容摩以提供約240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內(nèi)的同滲容摩。
[0042]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，在約30°C至約32°C的溫度范圍內(nèi)，首先在培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)階段然后在培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段進(jìn)行金屬離子的添加，或其中在細(xì)胞的所述培養(yǎng)之前的初始階段進(jìn)行金屬離子的添加。
[0043]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)階段具有約12xl06細(xì)胞/ml至約13xl06細(xì)胞/ml的范圍內(nèi)的細(xì)胞濃度，并且其中多肽生產(chǎn)階段具有約13xl06細(xì)胞/ml至約15xl06細(xì)胞/mL的范圍內(nèi)的細(xì)胞濃度。
[0044]在本公開內(nèi)容的實(shí)施方式中，優(yōu)選以七水合硫酸鋅的形式使用該二價(jià)鋅離子。其它鋅化合物可以包括，而不限于，ZnH2、Zn (OH) 2、Zn (NO3)2.6H20、和ZnCl2。
[0045]在本公開內(nèi)容的實(shí)施方式中，在沒有使用酶除去賴氨酸殘基的情況下，通過降低抗體的C-端上賴氨酸殘基的比例進(jìn)行降低異質(zhì)性。
[0046]本公開內(nèi)容克服了現(xiàn)有技術(shù)的局限性以提供用于降低抗體的異質(zhì)性的方法。本公開內(nèi)容的目的是提供用于提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方法，例如大規(guī)模的商業(yè)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)如抗體生產(chǎn)，使用包含細(xì)胞生長(zhǎng)階段和多肽生產(chǎn)階段的改良的細(xì)胞培養(yǎng)方法。
[0047]在本公開內(nèi)容的另一個(gè)目的中，通過添加金屬離子如Zn+2來降低抗體的堿性變體。
[0048]在公開內(nèi)容的又一個(gè)目的中，鋅離子的濃度是在0.05-1.5mM的范圍內(nèi)。
[0049]在本公開內(nèi)容的又一個(gè)目的中，通過降低生產(chǎn)培養(yǎng)基的同滲容摩降低抗體的堿性變體。
[0050]本公開內(nèi)容的又一個(gè)目的包括在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)細(xì)胞的方法，該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過提高主峰/0賴氨酸的形成降低電荷變體的異質(zhì)性，其中在抗體的任何鏈的C-端上基本上存在O個(gè)賴氨酸。
[0051]本公開內(nèi)容的又一個(gè)目的是細(xì)胞培養(yǎng)基中的堿性變體降低3-30%。
[0052]因此，本公開內(nèi)容提供了提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方法，例如大規(guī)模的商業(yè)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)如抗體生產(chǎn)，使用包括細(xì)胞生長(zhǎng)階段和多肽生產(chǎn)階段的改良的細(xì)胞培養(yǎng)方法。
[0053]本公開內(nèi)容進(jìn)一步描述了降低抗體的微異質(zhì)性(microheterogeneity)。更具體地，該公開內(nèi)容包括在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)細(xì)胞的方法，該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過降低堿性變體的形成降低電荷變體的異質(zhì)性。
[0054]本公開內(nèi)容涉及一種用于通過培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并從培養(yǎng)基或/和細(xì)胞中分離MAb來生產(chǎn)具有改變的堿性變體比例的單克隆抗體的方法。
[0055]在本公開內(nèi)容的實(shí)施方式中，通過添加0.05-1.5mM范圍內(nèi)的金屬離子如Zn+2和通過使用240-260m0sm/Kg的同滲容摩范圍內(nèi)的生產(chǎn)培養(yǎng)基降低抗體的堿性變體。
[0056]本公開內(nèi)容的又一個(gè)實(shí)施方式降低通常與標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)程序相關(guān)的抗體的堿性變體的％。有利地，該公開內(nèi)容通過較大量的含有期望質(zhì)量的產(chǎn)品尤其是生物仿制(biosimilar)抗體的回收提供了經(jīng)濟(jì)和商業(yè)效益。
[0057]術(shù)語定義
[0058]術(shù)語“抗體”包括抗體或抗體衍生物或它們的片段并且該抗體的規(guī)格還應(yīng)用于本公開內(nèi)容的抗體制備。在抗體片段中抗體的功能等價(jià)物或同源體包括含有免疫球蛋白結(jié)合域或模擬該結(jié)合域的肽以及Fe區(qū)或與Fe區(qū)同源的區(qū)或它的至少部分的任何多肽。包括含有免疫球蛋白結(jié)合域的嵌合分子或融合至另一個(gè)多肽的等價(jià)物。
[0059]示例性抗體分子是完整的免疫球蛋白分子和包含抗體結(jié)合部位(paratope)的免疫球蛋白分子的那些部分，包括稱為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fe、和F (v)、以及N-聚糖結(jié)構(gòu)的那些部分。
[0060] 抗體描述了血清的功能成分并且通常是指多個(gè)分子(多個(gè)抗體或多個(gè)免疫球蛋白、多個(gè)片段等)或一個(gè)分子(抗體分子或免疫球蛋白分子)。抗體分子能夠結(jié)合至特異的抗原決定簇(抗原或抗原表位)或與抗原決定簇(抗原或抗原表位)反應(yīng)，該抗體分子進(jìn)而可以致使誘導(dǎo)免疫學(xué)效應(yīng)機(jī)理。單個(gè)抗體分子通常被認(rèn)為是單特異性的，并且抗體分子的組合可以是單克隆的(即，由相同的抗體分子組成)或多克隆的(即，由與相同的抗原或明顯不同的抗原上的相同或不同的表位反應(yīng)的不同抗體分子組成)。該明顯不同的抗體分子組成的多克隆抗體可以被稱作“成員(member)”。每個(gè)抗體分子具有能夠特異性結(jié)合至其相應(yīng)抗原的唯一結(jié)構(gòu)，并且所有天然抗體分子都具有相同的整體基本結(jié)構(gòu)(兩個(gè)相同的輕鏈和兩個(gè)相同的重鏈)。
[0061]異質(zhì)性被定義為其中分泌抗體具有各種離散的生物化學(xué)形式的現(xiàn)象，例如，但不限于，抗體重鏈中的一個(gè)或兩個(gè)的羧基端上另外的一個(gè)或多個(gè)氨基酸或者由于氨基酸修飾而引起該抗體的整體電荷分布的差異。
[0062]如在本文中使用的，短語“多肽”或“多肽產(chǎn)物”分別與術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“蛋白產(chǎn)物”是同義的，并且，在本領(lǐng)域中通常理解為是指經(jīng)由連續(xù)的肽鍵連接的至少一個(gè)氨基酸鏈。在某些實(shí)施方式中，“感興趣的蛋白質(zhì)”或“感興趣的多肽”等是由已經(jīng)轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞的外源核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，其中已經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的外源DNA編碼“感興趣的蛋白質(zhì)”，外源DNA的核酸序列決定氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，“感興趣的蛋白質(zhì)”是由宿主細(xì)胞的內(nèi)源核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，使用外源核酸分子(該外源核酸分子可以，例如，包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列和/或編碼增強(qiáng)感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)的蛋白質(zhì))通過轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞改變這種感興趣的內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0063]如在本文中使用的，“抗體變體”是指具有不同于親本抗體的氨基酸序列的氨基酸序列的抗體。優(yōu)選地 變體必然具有低于100%的序列一致性或者相似于親本抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該抗體變體將具有約75%至低于100%、更優(yōu)選約80%至低于100%、更優(yōu)選約85%至低于100%、更優(yōu)選約90%至低于100%、以及最優(yōu)選約95%至低于100%的氨基酸序列同一于或相似于親本抗體的任一重鏈或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的氨基酸序列。相對(duì)于該序列的同一性或相似性在本文中定義為候選序列中的氨基酸殘基與親本抗體殘基同一(即，相同的殘基)的百分比，在對(duì)齊序列并且引入間隔后，如果需要，以達(dá)到最大百分比序列同一'I"生。
[0064]如在本文中使用的術(shù)語“培養(yǎng)介質(zhì)”、“細(xì)胞培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”是指包含滋養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物的溶液，并且也可以指與細(xì)胞結(jié)合的培養(yǎng)基。(通常可以使用的商用培養(yǎng)基如培養(yǎng)基 Hyclone CDM4NS0、Hyclone CDM4Mab、Invitrogen CDOptiCHO和 Lonza Power CHO)。
[0065]優(yōu)選的哺乳動(dòng)物宿主是CHO細(xì)胞并且優(yōu)選的發(fā)酵模式是補(bǔ)料式分批。其它細(xì)胞系的實(shí)例是NSO (非分泌型)和BHK (幼倉(cāng)鼠腎臟)。
[0066]用于基因改造的(genetically engineering)細(xì)胞和/或細(xì)胞系以表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的方法和載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的?；蚬こ碳夹g(shù)包括，但不限于，表達(dá)載體、靶同源重組和基因激活?？蛇x地，在異源控制元件(如，例如，不天然引導(dǎo)該多肽產(chǎn)生的啟動(dòng)子)的控制下表達(dá)該蛋白質(zhì)。例如，該啟動(dòng)子可以是引導(dǎo)哺乳動(dòng)物多肽表達(dá)的強(qiáng)病毒性啟動(dòng)子(例如，CMV，SV40)。該宿主細(xì)胞可以或不可以正常地產(chǎn)生該蛋白質(zhì)。例如，該宿主細(xì)胞可以是已經(jīng)基因改造的CHO細(xì)胞以產(chǎn)生蛋白質(zhì)，是指編碼蛋白質(zhì)的核酸已經(jīng)被引入CHO細(xì)胞中。
[0067]本領(lǐng)域技術(shù)人員將確認(rèn)應(yīng)當(dāng)培養(yǎng)特定細(xì)胞系的溫度和/或濃度。例如，大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，CHO細(xì)胞，在約35°C至39°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在37°C生長(zhǎng)良好，然而通常在27°C培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞。
[0068]在公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方式中，使用本公開內(nèi)容的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是抗體或其抗原結(jié)合片段。如在本文中使用的，術(shù)語“抗體”包括含有至少一個(gè)并且通常兩個(gè)VH區(qū)或其部分、和/或至少一個(gè)并且通常兩個(gè)VL區(qū)或其部分的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，抗體是兩個(gè)重免疫球蛋白鏈和兩個(gè)輕免疫球蛋白鏈的四聚體，其中重免疫球蛋白鏈和輕免疫球蛋白鏈?zhǔn)峭ㄟ^例如二硫鍵互相連接的?？贵w或其部分可以獲自任何來源，包括，但不限于，嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(例如，人類和非人類靈長(zhǎng)類)、鯊魚等，或者它們可以是重組產(chǎn)生的，例如，嵌合、人化等，和/或體外產(chǎn)生，例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法。
[0069]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容的細(xì)胞培養(yǎng)是在搖瓶(30ml工作容積)和/或生物反應(yīng)器(1L/50L)中進(jìn)行的，并且使用補(bǔ)料式分批模式。在補(bǔ)料式分批培養(yǎng)中，最初提供具有300-3lOmOsm/Kg的同滲容摩的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基并且定期供給營(yíng)養(yǎng)物(氨基酸、葡萄糖和維生素)。在37±1°C使用0.5-0.6xl06細(xì)胞/ml的初始細(xì)胞計(jì)數(shù)開始進(jìn)行產(chǎn)物發(fā)酵，第一個(gè)3-4天用于生長(zhǎng)細(xì)胞。下一步包括降低溫度至31 ± I°C并且兩次間歇地添加鋅離子，使得添加的總量達(dá)到0.05-1.5mM (一次在生長(zhǎng)階段的第3天/第4天注射并且另一次在生產(chǎn)階段的第6/7/8天注射)。根據(jù)本公開內(nèi)容的實(shí)施方式的抗體制備，優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的修飾抗體、其衍生物或片段缺少C-端賴氨酸殘基，尤其是取決于重鏈(其通?？梢园嚢彼?的總數(shù)。由于抗體可以具有多個(gè)潛在地包含C-端賴氨酸的鏈,應(yīng)理解缺少賴氨酸的數(shù)量百分比涉及潛在地具有C-端賴氨酸的所有鏈。顯示了單克隆 抗體在C-端賴氨酸的存在下是異質(zhì)的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容的細(xì)胞培養(yǎng)是在搖瓶(30ml工作容積)和/或生物反應(yīng)器(1L/50L)中進(jìn)行的，并且使用補(bǔ)料式分批模式。在優(yōu)選的補(bǔ)料式分批培養(yǎng)中，最初提供具有240-260m0sm/Kg的降低的同滲容摩的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基，并且定期供給營(yíng)養(yǎng)物(氨基酸、葡萄糖和維生素)。通過使用MilliQ/WFI稀釋培養(yǎng)基降低培養(yǎng)基的同滲容摩。在37±1°C使用0.5-0.6xl06細(xì)胞/ml的初始細(xì)胞計(jì)數(shù)開始進(jìn)行產(chǎn)物發(fā)酵，第一個(gè)3-4天用于生長(zhǎng)細(xì)胞。下一步包括降低溫度至31 ± I °C并且兩次間歇地添加0.1mM的濃度的鋅離子(一次在生長(zhǎng)階段的第3/4天注射并且另一次在生產(chǎn)階段的第5/6/7/8天注射)。根據(jù)本公開內(nèi)容的實(shí)施方式的抗體制備，優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%的修飾的抗體、或衍生物其片段缺少C-端賴氨酸殘基，尤其是取決于重鏈(其通?？梢园嚢彼?的總數(shù)。由于抗體可以具有多個(gè)潛在地包含C-端賴氨酸的鏈,應(yīng)理解缺少賴氨酸的數(shù)量百分比涉及潛在地具有C-端賴氨酸的所有鏈。顯示了單克隆抗體在C-端賴氨酸的存在下是異質(zhì)的。
[0070]為了說明和描述的目的，提出了本公開內(nèi)容的【具體實(shí)施方式】的上述描述。不意圖將該公開內(nèi)容窮盡或限制為公開的精確形式。鑒于上文的教導(dǎo)各種變型和改變都是可以的。此外，可以進(jìn)行許多變型以使具體情形、材料、物質(zhì)的組合、過程、一個(gè)或多個(gè)處理步驟適應(yīng)本公開內(nèi)容的目的、精神和范圍。所有這些變型都在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0071]借助于以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明了本申請(qǐng)的技術(shù)。然而，該實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本公開內(nèi)容的范圍。
[0072]實(shí)施例:
[0073]本公開內(nèi)容公開了具有降低的異質(zhì)性的抗體的生產(chǎn)?？贵w-1是抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A (VEGF-A)的人化單克隆抗體?？贵w-2是干擾HER2/neu受體(抗her2抗體)的單克隆抗體?？贵w-3是抑制TNF的人化單克隆抗體，抗體-4是抗CD6。
[0074]實(shí)施例1:
[0075]使用鋅離子以降低抗體-1的堿性變體或提高抗體-1的主峰/0賴氨酸
[0076]提供具有300-310m0sm/Kg的同滲容摩的培養(yǎng)基并且使用0.5-0.6xl06/ml濃度的細(xì)胞接種并且使其生長(zhǎng)。在細(xì)胞計(jì)數(shù)在第4天達(dá)到12-13xl06/ml之后，將溫度從37°C轉(zhuǎn)變至31°C。以0.1mM的濃度提供鋅的第一次注射。在第8天時(shí)，當(dāng)細(xì)胞計(jì)數(shù)是13-15xl06/ml時(shí)，以0.1mM的濃度提供鋅的另一次注射。使得進(jìn)行直到第11天。觀察到的異質(zhì)性列在以下表中。
[0077]表-1
【權(quán)利要求】
1.一種降低通過細(xì)胞培養(yǎng)所獲得的抗體的異質(zhì)性的方法，所述方法包括將二價(jià)過渡金屬離子添加至產(chǎn)生所述抗體的培養(yǎng)基中或改變所述培養(yǎng)基的同滲容摩或者它們的組合以獲得具有降低的異質(zhì)性的所述抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述異質(zhì)性是由于所述抗體的電荷變體的比例；并且其中，所述異質(zhì)性的降低是通過降低所述抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例進(jìn)行的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，針對(duì)約75%至約100%范圍內(nèi)的抗體比例，通過進(jìn)行所述方法降低所述異質(zhì)性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體是天然產(chǎn)生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，通過降低約3%至約30%的所述抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸以降低所述異質(zhì)性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述金屬離子是在約0.05mM至約1.5mM濃度范圍內(nèi)的Zn+2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，改變所述培養(yǎng)基的同滲容摩以提供約240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內(nèi)的同滲容摩。
8.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)是補(bǔ)料式分批培養(yǎng)；并且包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，首先在所述細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)階段以及其次在所述細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段進(jìn)行所述二價(jià)過渡金屬離子的添加；或者其中，在所述細(xì)胞的所述培養(yǎng)之前的初始階段進(jìn)行所述金屬離子的添加。
10.一種用于生產(chǎn)具有降低的異質(zhì)性的抗體的方法，所述方法包括以下步驟: Ca)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞，并且將二價(jià)過渡金屬離子添加至所述培養(yǎng)基或改變所述培養(yǎng)基的同滲容摩或者它們的組合；以及 (b)從所述培養(yǎng)基中回收具有降低的異質(zhì)性的所述抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求11(a)所述的方法，其中，在約0.5xl06細(xì)胞/ml至約0.6xl06細(xì)胞/ml的濃度范圍內(nèi)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11(a)所述的方法，其中，在約36°C至約38°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行所述培養(yǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述抗體是天然產(chǎn)生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述異質(zhì)性是由于所述抗體的電荷變體的比例；并且其中，所述異質(zhì)性的降低是通過降低所述抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例進(jìn)行的。
15.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，針對(duì)約75%至約100%范圍內(nèi)的抗體比例，通過進(jìn)行所述方法降低所述異質(zhì)性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，通過降低約3%至約30%的所述抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸以降低所述異質(zhì)性。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述培養(yǎng)是補(bǔ)料式分批培養(yǎng)；并且包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系培養(yǎng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述金屬離子是在約0.05mM至約1.5mM濃度范圍內(nèi)的Zn+2。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，改變所述培養(yǎng)基的同滲容摩以提供約.240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內(nèi)的同滲容摩。
20.根據(jù)權(quán)利要求11(b)所述的方法，其中，在約30°C至約32°C范圍內(nèi)的溫度下，首先在所述培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)階段以及其次在所述培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段進(jìn)行所述二價(jià)過渡金屬離子的添加；或者其中，在所述細(xì)胞的所述培養(yǎng)之前的初始階段進(jìn)行所述金屬二價(jià)過渡離子的添加。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述細(xì)胞生長(zhǎng)階段具有約12xl06細(xì)胞/ml至約13xl06細(xì)胞/ml范圍內(nèi)的細(xì)胞濃度；并且其中，所述多肽生產(chǎn)階段具有約13xl06細(xì)胞/ml至約15xl06細(xì)胞/mL的范圍內(nèi)的細(xì)胞濃度。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104024423SQ201280031457
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月29日
【發(fā)明者】魯吉卡·斯里瓦斯塔瓦, 斯奈哈·拉克什曼達(dá)斯·赫姆德維, 安庫(kù)爾·巴特納格爾, 薩拉瓦南·德桑, 安努杰·格爾, 哈里什·耶爾 申請(qǐng)人:拜康研究有限公司