用于預(yù)防和治療神經(jīng)變性的菊苣的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及包含菊苣、特別是烘烤的菊苣根的組合物，其用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性障礙和/或認(rèn)知能力損失。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于維持精神或認(rèn)知能力的非治療方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于預(yù)防和治療神經(jīng)變性的菊苣
發(fā)明領(lǐng)域:[0001]本發(fā)明涉及一種包含菊苣的組合物，其用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性障礙和/或認(rèn)知能力損失。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于維持精神或認(rèn)知能力的非治療方法。
[0002]發(fā)明背景:
[0003]神經(jīng)變性障礙特征在于神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)行性損失，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。在許多疾病例如阿爾茨海默病、帕金森病或亨延頓舞蹈病中，神經(jīng)變性過(guò)程是主要的有害組成部分，其調(diào)節(jié)疾病的過(guò)程。神經(jīng)變性疾病最大的風(fēng)險(xiǎn)因素是老化。這些疾病中的許多疾病都是遲發(fā)性的，這意味著隨著人變老有一些因素發(fā)生了改變。一個(gè)恒定不變的因素是，在每種疾病中，當(dāng)疾病隨著年齡進(jìn)展時(shí)神經(jīng)元逐漸喪失功能。這種持續(xù)的嚴(yán)重的神經(jīng)元功能的損失的進(jìn)一步結(jié)果是認(rèn)知能力的損失，正如在不同形式的癡呆中可見(jiàn)的那樣。因此，正常的認(rèn)知功能可以被例如記憶力、注意力或精神集中、語(yǔ)言和解決問(wèn)題的能力的損失影響。尤其是在神經(jīng)變性病癥的后期階段，受影響的人可能會(huì)在時(shí)間、地點(diǎn)和人物方面發(fā)生定向障礙。盡管神經(jīng)變性障礙在一定程度上常常是可治療的，但是其通常是由進(jìn)行性的和不可治愈的原因所導(dǎo)致的。在尋找預(yù)防和治療由進(jìn)行性神經(jīng)元變性導(dǎo)致的神經(jīng)變性障礙和認(rèn)知能力損失的解決方案(特別是對(duì)于衰老人群而言)方面存在明確的、持續(xù)性的需求。
[0004]發(fā)明概沭:
[0005]本發(fā)明的目的是為上述需求提供一種天然的解決方案，其可通過(guò)藥療法而被應(yīng)用或者作為食物被消耗，從而用于預(yù)防或治療這類(lèi)神經(jīng)變性障礙。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題而得以實(shí)現(xiàn)。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明的思想。
[0007]相應(yīng)地，在第一方面，本發(fā)明提供了一種包含菊苣的組合物，其用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性障礙和/或認(rèn)知能力損失。
[0008]“神經(jīng)變性障礙”在本文中被定義為以進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的遺傳性的或散發(fā)的病癥。這些障礙常常與受影響的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的萎縮相關(guān)。它們包括諸如以下疾病:阿爾茨海默病和其它癡呆、變性神經(jīng)疾病(degenerative nervedisease)、癲癇、遺傳性腦障礙(genetic brain disorder)、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS或Lou Gehrig病)、亨延頓舞蹈病和朊病毒疾病。
[0009]“認(rèn)知能力”在本文中被定義為個(gè)體憑借其意識(shí)、察覺(jué)或領(lǐng)會(huì)思想的智力過(guò)程。認(rèn)知能力包括認(rèn)知的質(zhì)量，其包括知覺(jué)、認(rèn)識(shí)、觀念、感知、思考、推理、記憶和成像的所有方面。認(rèn)知能力損失是在處理新的信息或情形或者對(duì)新的信息或情形作出反應(yīng)方面有困難。
[0010]發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，菊苣提取物在體外神經(jīng)元老化模型中強(qiáng)烈地增加神經(jīng)元存活。因此，菊苣提取物可代表有吸引力的對(duì)抗神經(jīng)變性的藥物和/或營(yíng)養(yǎng)方案。
[0011]在進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試(例如在動(dòng)物研究中進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試)之前，具有潛在神經(jīng)保護(hù)活性的化合物或組合物典型地被首先在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行體外測(cè)試。這還使得可進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)理研究，例如用轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomic)和蛋白組學(xué)(proteomic)工具進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)理研究。這類(lèi)化合物或組合物對(duì)細(xì)胞存活的有益作用經(jīng)典地通過(guò)使用谷氨酸受體激動(dòng)劑(例如谷氨酸或者谷氨酸的鹽或酯、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)或紅藻氨酸)或氧化劑(例如過(guò)氧化氫，H2O2)用神經(jīng)毒刺激(neurotoxic insult)攻擊細(xì)胞培養(yǎng)物并且在有限的一段時(shí)間中、例如在幾天中測(cè)量所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和興奮毒性(excitotoxicity)來(lái)研究(Aksenova, M.V.等人，2005，Curr.Neurovas.Res.2，73-89; Nicholls, D.G.，2004, Curr.Mol.Med.4 (2)，149-177)。然后在經(jīng)處理的培養(yǎng)物與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物之間比較細(xì)胞存活。然而，在這類(lèi)有限的時(shí)間中攻擊細(xì)胞培養(yǎng)物很可能不能正確模擬在人或動(dòng)物中自然發(fā)生的緩慢的變性過(guò)程。因此，發(fā)明人利用了其中不用神經(jīng)毒刺激攻擊神經(jīng)元并且因此神經(jīng)元在長(zhǎng)得多的時(shí)間中、例如在數(shù)周中經(jīng)歷自然的進(jìn)行性老化的細(xì)胞培養(yǎng)物。該生物測(cè)定法更好地模擬了體內(nèi)所觀察到的實(shí)際過(guò)程。
[0012]因此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在培養(yǎng)基中孵育數(shù)周時(shí)，與DMSO對(duì)照樣品相比，多種不同的菊苣提取物顯著地增加了神經(jīng)細(xì)胞的存活。存活是用NeuN(神經(jīng)元核)免疫染色法(Mullen, R.J.等人，1992, Develop.116, 201-211 ;ffolf, H.K.等人，1996, Cytochem.44(10),1167-1171)評(píng)價(jià)的。這種對(duì)細(xì)胞存活的顯著作用通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察連接性的指示物、即PSD-95被進(jìn)一步確證(Colledge，Μ.等人，2003, Neuron40, 595-607)，當(dāng)與對(duì)照樣品相比時(shí)其也被顯著保存。
[0013]進(jìn)一步與陽(yáng)性對(duì)照樣品平行進(jìn)行菊苣提取物處理。該對(duì)照由抑制SIRT2 (AK-1)的合成化合物組成，其之前被證明在帕金森病模型中防止細(xì)胞死亡(Outeiro，Τ.M.等人，2007，Science317, 516-519)。令人驚奇的是，該陽(yáng)性對(duì)照樣品盡管對(duì)未處理的細(xì)胞具有顯著的陽(yáng)性作用，但是在改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)物生物學(xué)測(cè)定法中比菊苣提取物顯示出更小的神經(jīng)保護(hù)作用。這可以提示，菊苣的有益作用是通過(guò)更好的SIRT2抑制作用或者通過(guò)構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞的更大保護(hù)作用基礎(chǔ)的不同機(jī)制介導(dǎo)的。目前，菊苣提取物對(duì)這些細(xì)胞的作用機(jī)制是未知的。
[0014]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明: [0015]圖1:從4周齡到(A) 6周齡和(B) 8周齡所描繪的具有神經(jīng)元死亡的皮層壽命模型。
[0016]圖2:第8周時(shí)用烘烤的菊苣根的提取物(樣本I)體外處理的細(xì)胞的NeuN計(jì)數(shù)，其在(A) 50 μ g/ml和(B) 100 μ g/ml下顯示出了神經(jīng)保護(hù)作用。
[0017]圖3:第8周時(shí)用烘烤的菊苣根的乙醇/水提取物(樣品2;A和B)或者用干燥的菊苣根的乙酸乙酯提取物(樣品4;C)或烘烤的菊苣根的乙酸乙酯提取物(樣品3;D)體外處理的細(xì)胞的NeuN計(jì)數(shù)。所述數(shù)據(jù)顯示了在㈧50 μ g/ml和⑶100 μ g/ml下烘烤的菊苣根的乙醇/水提取物(樣品2)的神經(jīng)保護(hù)作用。(C)干燥的菊苣根的乙酸乙酯提取物(樣品4)在50 μ g/ml下顯示出了神經(jīng)保護(hù)作用。(D)烘烤的菊苣根(樣品3)在100 μ g/ml下顯示出了神經(jīng)保護(hù)作用。
[0018]發(fā)明詳沭:
[0019]本發(fā)明涉及一種包含菊苣的組合物，其用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性障礙和/或認(rèn)知能力損失，其中所述菊苣是菊苣屬植物的根。優(yōu)選地，所述的根是干燥的或烘烤的。干燥的或烘烤的菊苣根是一種已經(jīng)現(xiàn)有的工業(yè)原料。因此，這具有優(yōu)勢(shì)，即菊苣根能以工業(yè)上最可獲得的形式、例如以干燥的根的形式或者以工業(yè)上提供用于生產(chǎn)特定飲料的烘烤的形式被使用。此外，就獲得用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性障礙或認(rèn)知能力損失的活性組合物而言，干燥的菊苣根、甚至更優(yōu)選地烘烤的菊苣根被證明是優(yōu)良的原料。
[0020]使用烘烤的菊苣根的優(yōu)勢(shì)是，與由未烘烤的菊苣屬植物材料生產(chǎn)的提取物相比，由此產(chǎn)生的提取物具有顯著增加的生物學(xué)活性。有可能是熱處理有助于釋放活性分子和/或?qū)⒁恍┓腔钚苑肿愚D(zhuǎn)化為活性分子。事實(shí)上，在烘烤過(guò)程中，許多分子發(fā)生了化學(xué)轉(zhuǎn)化。就收率和生物學(xué)活性而言，可以通過(guò)選擇適宜的溶劑和優(yōu)化提取方法而進(jìn)一步優(yōu)化提取方法。
[0021]使用烘烤的菊苣根的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是原料是工業(yè)上可獲得的；所述烘烤的根在微生物學(xué)上是安全的，并且能在工業(yè)條件下安全地儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間。
[0022]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的菊苣以提取物的形式被提供。一方面，這使得首先能濃縮菊苣的活性成分以便例如更有效地和更集中地給藥，另一方面，還使得能在例如分批生產(chǎn)模式中標(biāo)準(zhǔn)化和更好地控制樣品和它們的有效活性。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取物可由菊苣根的乙醇-水提取獲得。因此，首先將菊苣根切成片或塊，并且干燥。其后，將它們直接用乙醇和水的混合物提取或者在烘烤后用乙醇和水的混合物提取。離心或過(guò)濾后，將液體蒸發(fā)，得到提取物。使用乙醇和水進(jìn)行提取方法的優(yōu)勢(shì)在于能獲得食品級(jí)的粗提取物。該可獲得的提取物在水中或者在乙醇/水混合物中是可溶的。
[0024]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取物可由菊苣根的乙酸乙酯提取獲得。因此，將干燥的或烘烤的菊苣根的片或塊研磨后，將所得的粉末用己烷提取以除去脂質(zhì)，然后干燥。將該干燥的無(wú)脂質(zhì)的粉末用沸騰的鹽酸溶液處理，將其進(jìn)一步用乙酸乙酯提取。將有機(jī)相分離并蒸發(fā)，得到乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取的優(yōu)勢(shì)在于所獲得的提取物濃度高得多。乙酸乙酯提取具有高得多的選擇性，使得能更好地富集活性成分。然而，所得的提取物通常在水中不可溶，并且這種形式不能被認(rèn)為可直接用在例如食物產(chǎn)品中。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性障礙，其中所述神經(jīng)變性障礙是阿爾茨海默病、帕金森病、亨延頓舞蹈病、癡呆或癲癇。急性和慢性神經(jīng)病學(xué)障礙(包括阿爾茨海默病(AD)、癲癇、創(chuàng)傷、中風(fēng)和帕金森病(PD))特征在于神經(jīng)變性常常導(dǎo)致神經(jīng)病學(xué)缺陷。所述神經(jīng)病學(xué)缺陷可能非常嚴(yán)重以致于患者應(yīng)對(duì)日常生活的能力大大受損，這因此降低了患者的生活質(zhì)量。因此，已經(jīng)致力于鑒定預(yù)防、延遲或減慢神經(jīng)變性和作為結(jié)果預(yù)防、延遲或減慢認(rèn)知功能減退(cognitive decline)的策略。已經(jīng)證明鑒定能調(diào)節(jié)或停止細(xì)胞死亡途徑并因此保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生神經(jīng)變性的物質(zhì)是困難的。用本發(fā)明靶向于健康的或受損的神經(jīng)元能改善神經(jīng)元應(yīng)對(duì)或者甚至經(jīng)受住神經(jīng)毒性刺激(例如氧化應(yīng)激)的能力，并且作為結(jié)果改善神經(jīng)元的存活。這種對(duì)神經(jīng)元存活的改善和相關(guān)的神經(jīng)變性的減少可能也調(diào)節(jié)神經(jīng)病學(xué)缺陷的過(guò)程。
[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或治療認(rèn)知能力損失，其中所述的認(rèn)知能力損失是記憶力、注意力、語(yǔ)言、推理能力的損失和/或認(rèn)知功能障礙。
[0027]本發(fā)明的組合物可以是藥劑、食物產(chǎn)品或食物產(chǎn)品的補(bǔ)充劑。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物旨在用于被人、優(yōu)選成年人消耗。許多神經(jīng)變性障礙或認(rèn)知功能障礙隨著個(gè)體年齡的進(jìn)展而發(fā)生。因此臨床表現(xiàn)常常只在成年階段或在已經(jīng)高齡時(shí)才被察覺(jué)到。因此，本發(fā)明優(yōu)選旨在在所述神經(jīng)變性障礙或認(rèn)知能力損失發(fā)作的同時(shí)或之前用于成年人。因此，有利的是，及早治療所述障礙或認(rèn)知功能障礙，以便限制或減少神經(jīng)元細(xì)胞變性的進(jìn)一步進(jìn)展。甚至理想的是，這類(lèi)變性的發(fā)作能由于在成年階段(此時(shí)個(gè)體仍然是健康的并且具有完整的認(rèn)知能力)早應(yīng)用而被延遲或減少。
[0029]在一個(gè)作為替代選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物旨在被動(dòng)物、優(yōu)選貓或狗消耗。與人類(lèi)似，神經(jīng)變性也能在動(dòng)物中、特別是在農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物和作為寵物飼養(yǎng)的動(dòng)物中觀察到。因此，對(duì)于貓或狗的主人而言，看到他們親愛(ài)的伴侶動(dòng)物隨著動(dòng)物年齡的進(jìn)展而受到神經(jīng)變性障礙或認(rèn)知能力損失的影響是特別困難的和令人心碎的。有利的是，本發(fā)明提供了一種解決方案，其也能由其主人提供給伴侶動(dòng)物。[0030]本發(fā)明的組合物優(yōu)選旨在用于歷經(jīng)延長(zhǎng)的一段時(shí)間、優(yōu)選歷經(jīng)數(shù)年的消耗方案。神經(jīng)變性障礙和認(rèn)知能力損失是緩慢的過(guò)程，其只能逐漸地、但歷經(jīng)很多年進(jìn)展性地發(fā)生，并且最后可導(dǎo)致受影響的個(gè)體死亡。典型地，受這類(lèi)變性障礙影響的人可以被影響并且存活5、10、15、20年或更長(zhǎng)時(shí)間，這取決于該疾病的性質(zhì)。因此，有利的是，本發(fā)明的組合物用于整個(gè)該時(shí)期或者優(yōu)選地甚至在這類(lèi)障礙在個(gè)體中發(fā)作之前已經(jīng)開(kāi)始使用，以便是最有效的。
[0031]本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于維持個(gè)體的精神或認(rèn)知能力的非治療方法，該方法包括給所述個(gè)體施用包含菊苣的組合物。本發(fā)明的非治療方法的優(yōu)勢(shì)是用于未被診斷為神經(jīng)變性障礙或不具有神經(jīng)變性障礙的即時(shí)風(fēng)險(xiǎn)的健康個(gè)體。因此，健康個(gè)體能在任何疾病或障礙狀態(tài)顯現(xiàn)之前預(yù)防或停止已經(jīng)存在的非常輕微的神經(jīng)變性作用。因此，這些個(gè)體的精神或認(rèn)知能力能被維持或者甚至改善。
[0032]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的非治療方法涉及精神或認(rèn)知能力，其選自精神集中(mental concentration)、持續(xù)的注意力(sustained attention)、有保持力的記憶力(retentive memory)、精神警覺(jué)性(mental alertness)、學(xué)習(xí)能力、執(zhí)行功能、推理能力、情緒和對(duì)應(yīng)激的耐受性(resistance to stress)。
[0033]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，它們能自由地組合本文所公開(kāi)的本發(fā)明的所有特征。具體地，針對(duì)本發(fā)明的組合物所描述的特征可以與本發(fā)明的非治療方法組合，反之亦然。另外，針對(duì)本發(fā)明的不同實(shí)施方案所描述的特征可以被組合。本發(fā)明的另外的優(yōu)點(diǎn)和特征根據(jù)附圖和實(shí)施例而變得顯而易見(jiàn)。
[0034]實(shí)施例:
[0035]實(shí)施例1:由烘烤的菊苣根制備乙醇/水提取物
[0036]將菊苣根切成片并以工業(yè)規(guī)模于160°C烘烤80分鐘。烘烤后，將根磨成粉末(0.5mm篩)，用乙醇/水(50/50)混合物(2.5L乙醇/水溶液/500g菊苣根粉末)在攪拌下提取2h。于20°C在6000 rpm下離心10分鐘后，蒸發(fā)掉乙醇(于46°C用Rotavapor)。將剩余的水相冷凍干燥，得到提取物。該提取物的收率是:585g提取物/Ikg初始的菊苣粉末。
[0037]實(shí)施例2:由烘烤的菊苣根制備乙酸乙酯提取物
[0038]如實(shí)施例1中那樣將菊苣根切成片并烘烤。烘烤后，將根磨成粉末(0.5mm篩)，用己烷提取3次，每次提取I小時(shí)。棄去己烷相，將渣滓(ground)于室溫干燥過(guò)夜。然后將該干燥的渣滓用IN HCl溶液于100°C水解I小時(shí)30分鐘(850ml HCL 1N/100g粉末)。I小時(shí)30分鐘后，將酸性水性級(jí)分用500ml乙酸乙酯萃取3次。將三個(gè)乙酸乙酯相結(jié)合，用水洗滌以降低酸度，然后蒸發(fā)，得到乙酸乙酯級(jí)分。收率是:76g提取物/Ikg初始的菊苣粉末。
[0039]實(shí)施例3:原代皮層神經(jīng)元老化模型
[0040]用于研究化合物對(duì)神經(jīng)元老化的作用的原代皮層培養(yǎng)物系統(tǒng)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于研究菊苣對(duì)神經(jīng)元存活的作用。該細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)為神經(jīng)元老化模型，以便模擬在沒(méi)有神經(jīng)毒性攻擊的情況下在神經(jīng)元的正常老化期間發(fā)生的過(guò)程。利用該模型，能研究對(duì)抗老化期間生理學(xué)神經(jīng)變性的有益作用，并且能鑒定增加神經(jīng)元存活的化合物。這是一種與現(xiàn)有技術(shù)所述的模型不同的方法，在現(xiàn)有技術(shù)所述的模型中用神經(jīng)毒性刺激攻擊細(xì)胞以便誘導(dǎo)不同程度的神經(jīng)變性。使用抗原NeuN(神經(jīng)核)(其是神經(jīng)變性的一種敏感標(biāo)記物)的免疫-細(xì)胞化學(xué)分析，已經(jīng)建立了一種可靠的用于檢查培養(yǎng)物中皮層神經(jīng)元的壽命的方法。NeuN的靈敏性可歸因于隨著神經(jīng)元變性而發(fā)生的其表達(dá)密度的穩(wěn)定減少，這不同于許多其表達(dá)僅區(qū)分為活神經(jīng)元和死神經(jīng)元的抗原。在鋪板后4周至6周之間，皮層神經(jīng)元開(kāi)始變性，從而導(dǎo)致在這段期間中NeuN計(jì)數(shù)的非顯著性趨勢(shì)(圖1A)。到第8周，與第4周相比NeuN計(jì)數(shù)的減少是顯著性的(圖1B)，這表明在數(shù)周中存在神經(jīng)元的逐漸損失，從而提供了篩選具有降低該神經(jīng)元老化的斜率的能力的營(yíng)養(yǎng)性化合物的長(zhǎng)期窗。所有測(cè)試都被固定在6周至8周之間的時(shí)間點(diǎn)。
[0041]原代?養(yǎng)物制備:
[0042]來(lái)自E16大鼠的紋狀體和皮層培養(yǎng)物是根據(jù)之前描述的操作(Zala等人,2005, Neurobiol.Dis.20 (3), 785-798)制備的。將懷孕的 Sprague-Dawley 大鼠(Charles River Laboratories,法國(guó))通過(guò)CO2吸入處死。在冰上收集胚胎并在含有無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水、0.6%D-葡萄糖、1%青霉素-鏈霉素(10，000U/ml)和IOmMHEPESdnvitrogen AG,瑞士)的介質(zhì)中用立體顯微鏡解剖。將分開(kāi)的腦區(qū)用鑷子切碎，除去解剖介質(zhì)，將組織通過(guò)在含有1%牛血清白蛋白(Fluka，瑞士)的DMX中反復(fù)抽吸進(jìn)行勻化。離心(4°C , 5min, 1000 Xg)并在 Neurobasal? 培養(yǎng)基(Invitrogen AG,瑞士)中再混懸后，將細(xì)胞以50000個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪在用0.lmg/ml聚賴(lài)氨酸(MW: 30000-70000，Sigma，瑞士)包被的96孔培養(yǎng)皿(COSTAR?, Corning Incorporate, USA)中。將細(xì)胞于37°C /5%C02下在補(bǔ)充了 IX B-27添加劑、IX青霉素/鏈霉素、500 μ M L-谷氨酰胺和15mMKCl的Neurobasal?培養(yǎng)基中孵育，直至第8周進(jìn)行神經(jīng)元存活分析。
[0043]NeuN免瘡染色:
[0044]將神經(jīng)元用4%低聚甲醛/PBS(4°C，IOmin)固定(在體外于6_8周)，然后用IXPBS清洗三次。將含有具有10%正常山羊血清和0.l%Triton-X的PBS的封閉溶液應(yīng)用于神經(jīng)元(RT, Ih,溫和振搖)，然后將細(xì)胞與抗-NeuN(1:400;Chemicon,德國(guó))一起在含有5%正常山羊血清和0.l%Triton-X的PBS中孵育(4°C，過(guò)夜，輕微搖擺)。然后將神經(jīng)元用IXPBS清洗三次，然后與抗小鼠Cy?3-軛合的AffiniPure F(ab’)2片段二級(jí)抗體(1: 800; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., UK) 一起在用招箔覆蓋的情況下孵育(RT，2h，溫和振搖)。然后將培養(yǎng)物用IXPBS清洗三次并且在此期間避光，然后進(jìn)行分析。除了固定是在100%甲醇中(_20°C，IOmin)以外，PSD-95標(biāo)記是相同的。抗-PSD-95 (ABR-Affinity Bioreagents)以1:500的濃度使用。NeuN細(xì)胞計(jì)數(shù)的評(píng)估是用 BD Pathway?855High-Content Bioimager(BD Biosciences,比利時(shí))進(jìn)行的。每個(gè)孔的自動(dòng)化圖片是用相同的參數(shù)得到的，以便在各條件之間進(jìn)行無(wú)偏比較。通過(guò)用內(nèi)置圖像增強(qiáng)插件將所有圖像轉(zhuǎn)換成堆棧(stack)并且分析滿足被認(rèn)為是神經(jīng)核的剛性大小(0.0014-0.028方形像素)和圓度(0.5-1.0)要求的熒光實(shí)體的數(shù)量用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。用于整合的像素密度測(cè)量的PSD-95圖像是以與NeuN相同的方式獲取的。使用Microsoft? Excel用單尾t-檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)對(duì)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。使用從0.05開(kāi)始的α -水平來(lái)確定顯著性。P值代表星號(hào)，表示為*_ρ〈0.05。
[0045]實(shí)施例4:(實(shí)施例1的)菊苣提取物對(duì)(實(shí)施例3的)神經(jīng)元老化模型的活性
[0046]上文所述的菊苣提取物在體外皮層培養(yǎng)物老化模型中顯示出了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。將細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行處理。在第11天將一半體積的培養(yǎng)基替換為正常培養(yǎng)基，在第17天通過(guò)將一半培養(yǎng)基替換為媒介物DMSO (對(duì)照)或者需要量的提取物之一以達(dá)到所需的終濃度。每周用含有等量的媒介物或提取物的培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基以達(dá)到所需的終濃度，以便維持細(xì)胞的生存力。將所有處理?xiàng)l件與用等濃度的DMSO或水媒介物處理的培養(yǎng)物進(jìn)行比較。用上文所述的NeuN計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力。用NeuN僅能評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力，因此為了關(guān)聯(lián)提取物另外對(duì)神經(jīng)元功能的作用，使用了另一種標(biāo)記物，即PSD-95，其是神經(jīng)元連接性的指示物。該輔助性讀數(shù)給出了神經(jīng)元健康的另一種量度。通過(guò)在體外聚谷氨酰胺疾病的皮層神經(jīng)元模型中將PSD-95陽(yáng)性突觸的減少與簇狀放電(burst firing)活動(dòng)的減少相關(guān)聯(lián)驗(yàn)證了 PSD-95與神經(jīng)元放電行為的關(guān)系。因此，我們確證了該測(cè)定法包括了我們的原代培養(yǎng)物中神經(jīng)元功能的有意義的且相關(guān)的輔助性測(cè)試。
[0047]烘烤的菊苣根的提取物(樣品I)在50 μ g/ml (400%,圖2A)和100 μ g/ml (650%,圖2B)下均產(chǎn)生了比相應(yīng)的DMSO對(duì)照顯著更高的NeuN計(jì)數(shù)。
[0048]另一些菊苣提取物的測(cè)試確證了菊苣提取物的神經(jīng)保護(hù)作用(圖3)。烘烤的菊苣根的水/乙醇提取物(樣 品2)在50 μ g/ml (~130%,圖3A)和100 μ g/ml (~170-180%,圖3B)下均具有神經(jīng)保護(hù)作用。在酸性水解后通過(guò)乙酸乙酯提取制備的烘烤的菊苣的提取物(樣品3)在100 μ g/ml下也顯示出了神經(jīng)保護(hù)作用(~300%，圖3D)。另一種來(lái)自干燥的根的、但是是通過(guò)酸性水解、然后進(jìn)行甲醇和乙酸乙酯提取制備的提取物(樣品4)在50 μ g/ml下具有強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用(~330%，圖3C)。
【權(quán)利要求】
1.包含烘烤的菊苣根的組合物，其用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性障礙和/或認(rèn)知能力損失。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述菊苣以提取物的形式被提供。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述提取物可由菊苣的乙酸乙酯提取或乙醇/水提取獲得。
4.以上權(quán)利要求之一的組合物，其中所述神經(jīng)變性障礙是阿爾茨海默病、帕金森病、亨延頓舞蹈病、癡呆或癲癇。
5.以上權(quán)利要求之一的組合物，其中所述認(rèn)知能力損失是記憶力、注意力、語(yǔ)言、推理能力的損失和/或認(rèn)知功能障礙。
6.以上權(quán)利要求之一的組合物，其是藥劑、食物產(chǎn)品或食物產(chǎn)品的補(bǔ)充劑。
7.以上權(quán)利要求之一的組合物，其旨在用于被人、優(yōu)選成年人消耗。
8.權(quán)利要求1至6之一所述的組合物，其旨在用于被動(dòng)物、優(yōu)選貓或狗消耗。
9.以上權(quán)利要求之一的組合物，其旨在用于歷經(jīng)延長(zhǎng)的一段時(shí)間、優(yōu)選歷經(jīng)數(shù)年的消耗方案。
10.用于維持個(gè)體的精神或認(rèn)知能力的非治療方法，該方法包括給所述個(gè)體施用包含烘烤的菊苣根的組合物。
11.權(quán)利要求10的非治療方法，其中所述精神或認(rèn)知能力選自精神集中、持續(xù)的注意力、有保持力的記憶力、精神警覺(jué)性、學(xué)習(xí)能力、執(zhí)行功能、推理能力、情緒和對(duì)應(yīng)激的耐受性。
【文檔編號(hào)】A61K36/28GK103702676SQ201280033764
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月6日
【發(fā)明者】J·杜爾加, T·昆茨, C·伊馮, D·庫(kù)爾圖瓦, J·于松, R·洛蒂-卡特, D·泰勒 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司