治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥的制作方法
【專利摘要】一種用于治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥或用于治療痛性肥胖癥(AD)的方法，包括將來自患者或受試者的外周血施加于載有固體載體的成分血分離柱（apheresis?column），該載體包含能夠特異性地結(jié)合于趨化因子受體的一種或多種結(jié)合試劑，可選地直接或間接固定在載體上的趨化因子受體CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5，從而由患者或受試者的外周血中除去一種或多種趨化因子受體，可選地CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞。還描述了各種伴隨診斷方法以及有用的結(jié)合試劑。
【專利說明】治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的各種實(shí)施方式涉及用于治療炎性病癥的產(chǎn)品和方法，如與代謝綜合征相關(guān)的病癥，尤其是糖尿病、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三?；视蜐舛群透哐獕?。本發(fā)明還涉及用于治療痛性肥胖癥的產(chǎn)品和方法。還描述了伴隨診斷。
【背景技術(shù)】
[0002]國(guó)際糖尿病基金會(huì)(IDF)定義代謝綜合征如下:
[0003]對(duì)于被定義為患有代謝綜合征的人員而言，他們必須具有:
[0004]中心性肥胖(對(duì)于歐洲男性(Europid man)定義為腰圍≥94cm,以及對(duì)于歐洲女性(Europid woman) ≥80cm,并且針對(duì)其他組為種族特異性數(shù)值)
[0005]加上以下4種因素的任何兩種:
[0006]?升高的甘油三酯(TG)水平:≥150mg/dL(l.7mmol/L)，或針對(duì)這種脂質(zhì)異常的特異性治療
[0007].降低的高密度脂蛋白(HDL)膽固醇:在男性中<40mg/dL(l.03mmol/L*)，以及在女性中<50mg/dL(l.29mmol/L*)，或針對(duì)這種脂質(zhì)異常的特異性治療
[0008].升高的血壓(BP):收縮BP≥130或舒張BP≥85mm Hg,或先前診斷的高血壓的治療
[0009].升高的空腹血糖(FPG)≥100mg/dL(5.6mmol/L)，或先前診斷的2型糖尿病
[0010]如果高于5.6mmol/L或100mg/dL，則強(qiáng)烈推薦口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，但并不必須限定所述綜合征的存在。
[0011]雖然代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制及其元件的每一種是復(fù)雜的并且并未很好地了解，但中心性肥胖和胰島素抗性被認(rèn)為是重要的致病因素。
[0012]痛性肥胖癥或德卡姆病是罕見的進(jìn)行性病癥，其特征在于通常發(fā)生于肥胖的、絕經(jīng)后婦女的多發(fā)性、痛性、皮下脂肪瘤(Dercum FX.Three cases of a hithertounclassified affection resembling in its grosser aspects obesity, but associatedwith special symptoms:adiposis dolorosa.Am J Med Scil892; 104:521-35，全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)。
[0013]成分血分離(apheresis)是用于清除血液成分,如抗體、低密度脂蛋白(LDL)和血細(xì)胞的治療方法。白細(xì)胞去除法是成分血分離治療方法，其用于除去白細(xì)胞(white bloodcell)(白血球，leukocyte)。將患者連接于體外血液循環(huán)系統(tǒng)，從一個(gè)臂的靜脈抽取血液，通過柱裝置，然后返回至患者的另一個(gè)臂。W02010/029317描述了成分血分離柱，其可用于治療炎性病癥，包括固定在固體載體上的趨化因子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]趨化因子是一類細(xì)胞因子分子，其涉及在炎癥中的細(xì)胞募集和激活。趨化因子引起在免疫系統(tǒng)中細(xì)胞的各種亞群的趨化性和激活。主要通過緊密結(jié)合于它們?cè)诎准?xì)胞表面上的受體來介導(dǎo)趨化因子的活性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明是基于認(rèn)識(shí)到，在趨化因子和表達(dá)它們的受體的細(xì)胞之間的相互作用可以用來治療與代謝綜合征相關(guān)的特定炎性病癥。尤其是，與代謝綜合相關(guān)征的各種病癥，如糖尿病，尤其是2型糖尿病，、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三?；视蜐舛群透哐獕喊ㄑ仔猿煞帧１景l(fā)明的發(fā)明人已確定,將增加募集的特定的趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞靶向炎癥部位可以提供新的治療方式來治療所述疾病。此外，在所述疾病中，可以增加每種細(xì)胞上的趨化因子受體表達(dá)，從而再次提供用來治療所述疾病的治療方式。痛性肥胖癥(AD)或德卡姆病(Dercum’s disease)是罕見的進(jìn)行性病癥，其特征在于多發(fā)性、痛性、皮下脂肪瘤，其通常發(fā)生于肥胖的、絕經(jīng)后婦女(DercumFX.Three cases of a hitherto unclassified affection resembling in its grosseraspects obesity, but associated with special symptoms: adiposis dolorosa.Am J MedScil892; 104:521-35，全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)。按照本發(fā)明，可以治療和診斷AD，可選地作為與代謝綜合征相關(guān)的病癥。本文中表明，在AD患者中，CCR2表達(dá)白細(xì)胞尤其是B淋巴細(xì)胞的水平增加。本文中表明，在AD患者中，CCRl表達(dá)單核細(xì)胞的水平增加。按照本發(fā)明，這提供了用于白細(xì)胞去除法治療和診斷的靶。 [0015]本文還表明，利用適宜的趨化因子如MCP-1 (CCL2)，尤其是生物素化MCP-1，可以從糖尿病患者體內(nèi)清除促炎性CCR2表達(dá)單核細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)。這為發(fā)炎組織，如脂肪組織和肝組織，提供了機(jī)會(huì)來治愈和幫助防止胰島素抗性的發(fā)展。此外，本文中表明，在糖尿病患者中，CCR4和CCR5表達(dá)白細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞的水平增加，并且可以根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式加以清除。
[0016]因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明用來降低炎性白細(xì)胞(其以增加的水平表達(dá)特征性趨化因子受體，以及有可能表達(dá)特征性趨化因子受體)募集到與疾病相關(guān)聯(lián)的炎癥部位，如糖尿病，尤其是2型糖尿病、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三酰基甘油濃度、高血壓和AD。這是利用特異性結(jié)合試劑從患者中捕捉特定的趨化因子受體表達(dá)炎性白細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。因此，在某些實(shí)施方式中，在第一方面，本發(fā)明提供了用于治療與代謝綜合征相關(guān)病癥的方法，該方法包括將來自患者的外周血施加于加載有固體載體的成分血分離柱，所述載體包含能夠特異性地結(jié)合于直接或間接固定在載體上的一種或多種趨化因子受體，尤其是趨化因子受體CCR2、CCRU CCR3、CCR4和/或CCR5的一種或多種結(jié)合試劑，從而從患者的外周血中除去一種或多種趨化因子受體，尤其是一種或多種CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞。然后可以將從其中已除去趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞的外周血返回至患者以完成治療。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明可以依靠連續(xù)體外回路?？商鎿Q地，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明可以包括以下步驟:從患者體內(nèi)獲得外周血，將外周血施加于柱，隨后將從其中已除去趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞的外周血返回至患者。
[0017]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了用于治療痛性肥胖癥(AD)的方法，該方法包括將來自患者的外周血施加于加載有固體載體的成分血分離柱，所述載體包含能夠特異性地結(jié)合于直接或間接固定在載體上的一種或多種趨化因子受體，尤其是趨化因子受體CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5的一種或多種結(jié)合試劑，從而從患者的外周血中除去一種或多種趨化因子受體，尤其是一種或多種0^2、0^1、0^3、0^4和0^5表達(dá)細(xì)胞的。然后可以將從其中已除去趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞的外周血返回至患者以完成治療。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明可以依靠連續(xù)體外回路?？商鎿Q地，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明可以包括以下步驟:從患者體內(nèi)獲得外周血，將外周血施加于柱，隨后將從其中已除去趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞的外周血返回至患者。【具體實(shí)施方式】靶向CCR2表達(dá)細(xì)胞，尤其是CCR2表達(dá)B細(xì)胞。
[0018]如本文所述，可以直接或間接地，將適宜的結(jié)合試劑固定在固體載體上，以產(chǎn)生適用于捕捉相關(guān)趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞的成分血分離柱。在觀測(cè)到增加水平的趨化因子受體表達(dá)的情況下，可以利用本發(fā)明的各種實(shí)施方式的柱，從外周血中優(yōu)選地除去所述細(xì)胞。因此，本發(fā)明的各種實(shí)施方式的方法可以優(yōu)選靶向如本文定義的一種或多種CCR2h1、CCRlhi,CCR3h1、CCR4hi和CCR5hi細(xì)胞，以從外周血中除去?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)來確定“高”表達(dá)。可以相對(duì)于在取自健康受試者的細(xì)胞中的趨化因子受體的表達(dá)水平來測(cè)量所述水平。附圖15提供了選通策略的一個(gè)實(shí)例。
[0019]在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)合試劑，其能夠特異性地結(jié)合于一種或多種趨化因子受體，尤其是特異性地結(jié)合于趨化因子受體/趨化因子受體CCR2、CCRUCCR3、CCR4和/或CCR5，用于治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥，其中將一種或多種結(jié)合試劑直接或間接地固定在包含在成分血分離柱內(nèi)的固體載體上，對(duì)所述載體施加來自患者的外周血，從而從患者的外周血中除去一種或多種趨化因子受體/CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5表達(dá)細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了一種或多種結(jié)合試劑的應(yīng)用，所述結(jié)合試劑能夠特異性地結(jié)合于趨化因子受體/趨化因子受體CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5，用于制造成分血分離柱，用于治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥，其中將一種或多種結(jié)合試劑固定在包含在成分血分離柱內(nèi)的固體載體上，對(duì)其施加來自患者的外周血，從而從患者的外周血中除去一種或多種趨化因子受體/CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5表達(dá)細(xì)胞。
[0020]類似地，本發(fā)明的各種實(shí)施方式進(jìn)一步提供了結(jié)合試劑，其能夠特異性地結(jié)合于一種或多種趨化因子受體，尤其是特異性地結(jié)合于趨化因子受體/趨化因子受體CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5，用于治療AD，其中將一種或多種結(jié)合試劑直接或間接固定在包含在成分血分離柱內(nèi)的固體載體上，對(duì)其施加來自患者的外周血，從而從患者的外周血中除去一種或多種趨化因子受體/CCR2、CCRU CCR3、CCR4和/或CCR5表達(dá)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種或多種結(jié)合試劑的應(yīng)用，所述結(jié)合試劑能夠特異性地結(jié)合于趨化因子受體/趨化因子受體CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5，用于制造成分血分離柱，用于治療AD，其中將一種或多種結(jié)合試劑固定在包含在成分血分離柱內(nèi)的固體載體上，對(duì)其施加來自患者的外周血，從而從患者的外周血中除去一種或多種趨化因子受體/CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5表達(dá)細(xì)胞。
[0021]針對(duì)本發(fā)明的各種實(shí)施方式的治療方法所討論的所有實(shí)施方式適用于這些方面(在細(xì)節(jié)上作必要的修改)并且為簡(jiǎn)潔起見并不再重`復(fù)。因此，參照治療方法進(jìn)行的以下討論也適用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式的醫(yī)療應(yīng)用方面。
[0022]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明旨在治療與代謝綜合征相關(guān)的各種特定病癥。代謝綜合征表示一組危險(xiǎn)因素，其一起發(fā)生并增加冠狀動(dòng)脈病、卒中、和2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。通常，綜合征的風(fēng)險(xiǎn)因素與肥胖癥相關(guān)。兩個(gè)最重要的風(fēng)險(xiǎn)因素是中心性肥胖和胰島素抗性。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明，脂肪組織炎癥和其他炎性損傷，如針對(duì)器官，是治療的中心靶。按照本發(fā)明的方法，可以治療包括炎性成分的任何相關(guān)病癥。包括炎性成分的特定病癥可以選自糖尿病，尤其是2型糖尿病、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三?；视蜐舛群透哐獕?。還可以治療AD，如本文討論的。
[0023]治療是指，在患者的外周血中減少特定的趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞。減少可以包括減少細(xì)胞，在患者中其以增加的水平表達(dá)趨化因子受體，尤其是一種或多種CCR2、CCRUCCR3、CCR4和CCR5?；颊咄ǔＪ侨祟惢颊?，但術(shù)語患者可以包括人和非人動(dòng)物受試者(在一些實(shí)施方式中)。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式的情況下，這通常涉及在患者的外周血中減少一種或多種 CCR2、CCR1、CCR3、CCR4 和 CCR5 表達(dá)細(xì)胞的，如一種或多種“CCR2h1、CCRlh1、CCR3h1、CCR4hi和CCR5hi “表達(dá)細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中CCR2、CCRl、CCR3、CCR4或CCR5表達(dá)細(xì)胞包含單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞、基本上由其組成或由其組成?？梢蕴禺愋缘匕邢駽CR2表達(dá)單核細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞，用于治療糖尿病?？梢蕴禺愋缘匕邢駽CR4和CCR5表達(dá)白細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞，用于治療糖尿病患者。在AD治療的情況下，B淋巴細(xì)胞減少可以尤其是相關(guān)的?？梢园邢駽CR2表達(dá)B細(xì)胞。通過靶向CCRl表達(dá)單核細(xì)胞,還可以治療AD。
[0024]單核細(xì)胞是通過骨髓由造血干細(xì)胞前體產(chǎn)生，稱作成單核細(xì)胞。單核細(xì)胞可以分化成巨噬細(xì)胞或樹狀細(xì)胞。單核細(xì)胞以及它們的巨噬細(xì)胞和樹狀細(xì)胞子代在免疫系統(tǒng)中擔(dān)任許多功能，包括吞噬作用、抗原呈遞和細(xì)胞因子生產(chǎn)?？梢詤⒄占?xì)胞表面標(biāo)志物⑶14的表達(dá)，可選地連同⑶16—起，來表征單核細(xì)胞。可以通過⑶14細(xì)胞表面受體(⑶14++⑶16-單核細(xì)胞)的高水平表達(dá)來表征經(jīng)典的單核細(xì)胞。可以通過⑶14的低水平表達(dá)和⑶16受體(⑶14+⑶16++單核細(xì)胞)的另外的同時(shí)表達(dá)來表征非經(jīng)典的單核細(xì)胞?？梢酝ㄟ^⑶14的高水平表達(dá)和⑶16 (⑶14++⑶16+單核細(xì)胞)的低水平表達(dá)來表征中間單核細(xì)胞。巨噬細(xì)胞源自單核細(xì)胞并且負(fù)責(zé)保護(hù)組織免受外來物質(zhì)。它們的這樣的細(xì)胞，其具有較大的光滑核、大面積的細(xì)胞質(zhì)和用于處理外來物質(zhì)內(nèi)部囊泡。術(shù)語“巨噬細(xì)胞”可以指單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞，其表達(dá)以下細(xì)胞表面標(biāo)志的一種或多種:⑶14、⑶lib、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3和⑶68。術(shù)語巨噬細(xì)胞包括活化和未活化巨噬細(xì)胞?？梢酝ㄟ^一種或多種CD69、ENG、FCER2和IL2RA、HLA-DR、CD86的表達(dá)來表征活化巨噬細(xì)胞。未活化巨噬細(xì)胞還未收到激活信號(hào)，通過例如TLR受體，因而它們?cè)诩?xì)胞表面上表達(dá)較少激活標(biāo)志，這與較少成熟相關(guān)。可以通過一種或多種CD16+C`D32+CD64+和分泌物主要為IL-23和IL_1、TNF、IL_6的表達(dá)以及IL-12和另外效應(yīng)分子如iNOS和ROI的高水平，來表征Ml巨噬細(xì)胞。相對(duì)于M2巨噬細(xì)胞，Ml巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞毒性特征?？梢酝ㄟ^一種或多種SRA/B+CD163+MR+⑶14+的表達(dá)來表征M2巨噬細(xì)胞并表達(dá)TGFP、IL-10和IL_lRa。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和M2巨噬細(xì)胞共享許多特征并且被認(rèn)為是M2極化巨噬細(xì)胞。在單核細(xì)胞亞群中也可以發(fā)現(xiàn)MVM2形式，其中⑶14+CD16TXC3R1低單核細(xì)胞被認(rèn)為是“炎性，，亞群以及⑶14低⑶16+CXC3R1高是“常駐(resident)”單核細(xì)胞。
[0025]淋巴細(xì)胞的三種主要類型是T細(xì)胞、B細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞。術(shù)語“T淋巴細(xì)胞”包括CD4+T細(xì)胞如輔助T細(xì)胞(Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞)，和CD8+T細(xì)胞如細(xì)胞毒性T細(xì)胞。可以通過CCR5的表達(dá)和/或通過IFN-Y的生產(chǎn)來表征Thl細(xì)胞。可以通過CCR3的表達(dá)和/或IL-4的生產(chǎn)來表征Th2細(xì)胞。
[0026]表達(dá)在這些上述細(xì)胞上的CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5結(jié)合于趨化因子如單核細(xì)胞化學(xué)吸引物蛋白質(zhì)-1 (MCP-1、CCL2)或CCL5。MCP-1是單核細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的主要化學(xué)吸引物，通過它們結(jié)合于它的特異性細(xì)胞表面受體，CC-趨化因子受體-2。CCL5是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C-C基序)配體5的基因符號(hào)，還稱為RANTES。該基因的HGNC ID是10632。該基因位于染色體位置17qll.2_ql2處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是D17S136E、SCYA5、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子A5 (RANTES) 〃。該基因的同義詞包括〃 β -趨化因子RANTES"、MGC17164、RANTES、〃激活后調(diào)節(jié)的、正常T表達(dá)的、和推測(cè)分泌的〃、"SIS- δ 〃、SISd、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A(Cys-Cys)，成員5〃、〃T細(xì)胞特異性蛋白ρ288〃、〃Τ細(xì)胞特異性RANTES蛋白質(zhì)〃、和TCP228。CCL5的Genbank參考序列是AF043341.1。RANTES 結(jié)合于 CCR1、CCR3 或 CCR5。
[0027]CCRl是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)受體I的基因符號(hào)。該基因的HGNC ID是1602。該基因位于染色體位置3p21處。先前的符號(hào)和名稱是CMKBRl、SCYARl。該基因的同義詞包括 CD191、CKR_1、MIP1 a R。CCRl 的 Entrez Gene 參考序列是如于2011年6月13日可獲得的1230，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0028]CCR2是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)受體2的基因符號(hào)。該基因的HGNC ID是1603。該基因位于染色體位置3p21處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是 CMKBR2。該基因的同義詞包括 CC-CKR-2、CD192、CKR2、FLJ78302、MCP-1-R。NCBI參考序列是如于2011年6月13日可獲得的NM_001123041.2，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0029]CCR3是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)受體3的基因符號(hào)。該基因的HGNC ID是1604。該基因位于染色體位置3p21.3處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是CMKBR3。該基因的同義詞包括CC-CKR-3、CD193和CKR3。CCR3的Genbank參考序列是如于2011年6月13日可獲得的AF247361.1，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0030]CCR5是由HUGO基 因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)受體5的基因符號(hào)。該基因的HGNC ID是1605。該基因位于染色體位置3p21處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是CMKBR5。該基因的同義詞包括CC-CKR-5、CD195CKR-5、IDDM22和CKR5。CCR5的Entrez Gene參考序列是如于2011年6月13日可獲得的1234，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0031]CCR4是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)受體4的基因符號(hào)。該基因的HGNC ID是1605。該基因位于染色體位置3p24_p21.3處。該基因的同義詞包括 CC-CKR-4、CD194、ChemRl3, CKR4、CMKBR4、k5_5。CCR4 的 Genbank 參考序列是如于2011年6月13日可獲得的X85740.1，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0032]除基于結(jié)合于CCR2、CCRU CCR3、CCR4或CCR5的除去以外，本發(fā)明的方法的各種實(shí)施方式還可以涉及與這些另外的細(xì)胞表面標(biāo)志物的任何一種或多種的特異性結(jié)合相互作用?？梢灾苽溥m宜的結(jié)合試劑以特異性地結(jié)合于這些細(xì)胞表面標(biāo)志。因此，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5特異性結(jié)合試劑的論述是適用的(在細(xì)節(jié)上作必要的修改)。
[0033]已經(jīng)表明，在糖尿病患者中，在單核細(xì)胞上的CCR2表達(dá)升高。此外，具有MCP-1的脂肪組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠具有巨噬細(xì)胞滲透進(jìn)入脂肪組織，增加的肝三?；视秃亢鸵葝u素抗性。當(dāng)與高脂肪喂養(yǎng)的野生型小鼠比較時(shí)，高脂肪飲食喂養(yǎng)的MCP-1-敲除小鼠具有顯著減少的巨噬細(xì)胞累積進(jìn)入脂肪組織和肝脂肪變性。在db/db小鼠中和在高脂肪喂養(yǎng)野生型小鼠中，通過MCP-1的顯性負(fù)突變體的急性表達(dá)來抑制MCP-1功能會(huì)改善胰島素抗性。此外，增加水平的血清MCP-1與代謝綜合征相關(guān)的病癥相關(guān)，包括肥胖癥、胰島素抗性、2型糖尿病、高血壓和增加的血清三酰基甘油濃度。本文中表明，在糖尿病受試者中，MCP-1可以用來降低CCR2-表達(dá)單核細(xì)胞水平。這對(duì)發(fā)炎組織，如脂肪組織和肝組織，提供了機(jī)會(huì)，來治愈和幫助防止胰島素抗性的發(fā)展。本文還表明，在患有AD的受試者中，MCP-1可以用來降低CCR2表達(dá)B細(xì)胞水平。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式的治療可以導(dǎo)致癥狀的減輕或改善，進(jìn)展的預(yù)防，病癥的消退，完全恢復(fù)。成功治療的可測(cè)量參數(shù)包括以下一種或多種、多達(dá)全部:中心性肥胖的減小(其可以參照腰圍加以定義)，糖化/糖基化血紅蛋白(HbAlC)的降低，甘油三酯的降低，葡萄糖(例如測(cè)得為FPG)的降低，或血的降低。成功治療的可測(cè)量參數(shù)還可以包括以下一種或多種、多達(dá)全部=HDL膽固醇增加，或改善的葡萄糖耐量，其可以通過OGTT加以測(cè)量。AD的成功治療的可測(cè)量參數(shù)可以包括疼痛癥狀的降低和/或皮下脂肪瘤(或脂肪沉積物)的程度和/或大小的降低。
[0035]在【具體實(shí)施方式】中，單次治療足以引起從患者的外周血中清除約10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、或高達(dá)80%、90%、95%或更高、或在這些數(shù)量之間并且包括這些數(shù)量的數(shù)值的任何范圍的，一種或多種特定的趨化因子受體，尤其是一種或多種CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞。在【具體實(shí)施方式】中，在單次治療中，實(shí)現(xiàn)至少約50%的清除。因此，成功治療可以參照清除一種或多種CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞加以定義。治療可以導(dǎo)致清除約100至500百萬個(gè)CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5表達(dá)細(xì)胞，如單核細(xì)胞(在某些實(shí)施方式中)，及更具體地講約100、150、200、250、300、350、400、450、或500百萬個(gè)CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5表達(dá)細(xì)胞。
[0036]通過結(jié)合于柱(通過結(jié)合試劑-趨化因子受體相互作用)來固定趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞。這些固定的細(xì)胞表達(dá)另外未偶聯(lián)的趨化因子受體，其可以具有與用于捕捉的那些趨化因子受體相同或不同的類型。這些另外的趨化因子受體可以允許從外周血中捕捉可以有助于炎性病癥的循環(huán)趨化因子。因此，循環(huán)(特定)趨化因子水平的降低可以提供成功治療的度量。
[0037]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易確定治療的持續(xù)時(shí)間，并且其將取決于多種因素如外周血的流速?？梢詫⒅委煹某掷m(xù)時(shí)間結(jié)合于監(jiān)測(cè)治療本身，其中在治療的可測(cè)量參數(shù)已達(dá)到限定的閾值以后則認(rèn)為治療完成。如本文討論的，可以采用任何適宜的參數(shù)。因此，例如，當(dāng)已實(shí)現(xiàn)一種或多種CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞減少，如一種或多種CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞減少50%時(shí)，可以認(rèn)為治療已完成。能夠以約10_80mL/分鐘的流率，或更具體地約20-70mL/分鐘，或約30-60mL/分鐘，來操作成分血分離系統(tǒng)。在【具體實(shí)施方式】中，進(jìn)行治療約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分鐘等，或在這些數(shù)量之間并且包括這些數(shù)量的數(shù)值的任何范圍。治療通常并不旨在除去在外周血中的所有表達(dá)趨化因子受體的細(xì)胞，因?yàn)槟切┘?xì)胞的基本水平是健康受試者所需要的。然而，已發(fā)現(xiàn)，僅需要將較低血液體積施加于本發(fā)明的各種實(shí)施方式的柱以實(shí)現(xiàn)趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞的有效清除水平。因此，在某些實(shí)施方式中，在單次治療中，將約10-80%或更具體地約
20、30、40或50%、或在這些數(shù)量之間并且包括這些數(shù)量的數(shù)值的任何范圍的患者血液施加于柱。循環(huán)通過成分血分離柱或系統(tǒng)的血液體積可以為約1000-3000ml，如約1000、1200、1400、1600、1800或2000ml、或在這些數(shù)量之間并且包括這些數(shù)量的數(shù)值的任何范圍。在已循環(huán)該體積血液以后，可以認(rèn)為治療已完成。在每個(gè)治療期以前，可以給予患者抗凝血?jiǎng)?。適宜的溶液，如無菌鹽水溶液，可選地包括抗凝血?jiǎng)┤绺嗡?，可以用來起?dòng)成分血分離(體外)系統(tǒng)。在每個(gè)治療期開始時(shí)，可以將另外體積的抗凝血?jiǎng)┘尤牖芈?，例如作為推注劑?br> [0038]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明依賴于能夠特異性地結(jié)合于趨化因子受體的結(jié)合試劑。當(dāng)血液通過在其上或其內(nèi)固定有結(jié)合試劑的固體載體時(shí)，這種特異性結(jié)合反應(yīng)允許從患者的外周血中除去表達(dá)趨化因子受體的細(xì)胞。感興趣的特定的趨化因子受體包括CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5，尤其是CCR2。結(jié)合試劑可以是能夠特異性地結(jié)合于所考慮受體的任何結(jié)合試劑。“特異性結(jié)合”是指這樣的結(jié)合試劑，其顯示足夠的結(jié)合特異性和適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親合力/動(dòng)力學(xué)，以允許從外周血中除去表達(dá)一種或多種CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的細(xì)胞。雖然并不排除結(jié)合試劑能夠結(jié)合于其他分子，如其他趨化因子受體，但結(jié)合試劑將優(yōu)選結(jié)合于表達(dá)一種或多種CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和CCR5的細(xì)胞，以及尤其是優(yōu)選結(jié)合于表達(dá)增加水平的一種或多種CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的細(xì)胞(如本文中進(jìn)一步定義的)。能夠特異性地結(jié)合于CCR2、CCRl、CCR3、CCR4或CCR5的結(jié)合試劑可以分別是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的激動(dòng)劑或拮抗劑。因?yàn)榧膊顟B(tài)依賴于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的表達(dá)上調(diào)或通過其發(fā)信號(hào)，所以在某些實(shí)施方式中，能夠特異性地結(jié)合于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的結(jié)合試劑分別是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的拮抗劑。趨化因子通常是，雖然不一定單獨(dú)地是(尤其是在截短或修飾形式的情況下)它們的同源受體的激動(dòng)劑并且用來激活表達(dá)相關(guān)受體的細(xì)胞，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的。針對(duì)相關(guān)趨化因子受體的抗體一般被認(rèn)為是拮抗劑，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的。結(jié)合試劑的具體實(shí)例包括蛋白質(zhì)或多肽，如抗體和受體配體，尤其是趨化因子。在某些實(shí)施方式中，結(jié)合試劑可以是核酸分子。在一些實(shí)施方式中，核酸是適體。核酸適體是長(zhǎng)度約15-40個(gè)核苷酸的多核苷酸?？梢岳肧ELEX方法(通過指數(shù)富集來系統(tǒng)進(jìn)化配體)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法來制備核酸適體。
[0039]在其他實(shí)施方式中，結(jié)合試劑可以是肽，以及在某些情況下，為肽適體。肽適體是人工識(shí)別分子，其由插入恒定支架蛋白的可變肽序列構(gòu)成(Baines IC, ColasP.Peptide aptamers as guides for small molecule drug discovery.Drug DiscovToday.2006; 11:334 - 341，以引用方式結(jié)合于本文)。許多方法，如噬菌體展示、核糖體展示和酵母菌雙雜交篩選系統(tǒng)，可用于篩選基于潛在肽的結(jié)合劑的文庫。類似地，基于結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)支架如纖連蛋白、錨蛋白重復(fù)序列、蛋白A、SH3結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、泛素可以用作結(jié)合劑。而且，許多技術(shù)如噬菌體展示、核糖體展示可用于篩選基于蛋白質(zhì)的結(jié)合劑的文庫。類似地，利用本領(lǐng)域中已知的適宜的篩選技術(shù)，在某些實(shí)施方式中，其可以是高通量篩選，針對(duì)特異性結(jié)合于相關(guān)趨化因子受可以篩選候選化合物的文庫體?？梢詫⒑蜻x結(jié)合劑固定在固體載體上并確定結(jié)合劑特異性地保留表達(dá)感興趣的趨化因子受體或標(biāo)記趨化因子受體的細(xì)胞的能力。可以將一系列細(xì)胞類型施加于固體載體以證實(shí)結(jié)合的特異性，或可替換地，可以將混合樣品(如外周血)施加于固體載體?？梢宰C實(shí)感興趣的細(xì)胞類型(表達(dá)適當(dāng)?shù)内吇蜃邮荏w)的保留以確定合適的結(jié)合劑。CCR-2的各種小分子拮抗劑描述于Xia M和 Sui Z 的Expert Opin Ther Pat.2009Mar;19(3):295-303-Recent developmentsin CCR2antagonists,并以 引用方式結(jié)合于本文。
[0040]在本發(fā)明的各種實(shí)施方式的情況下，術(shù)語“趨化因子”還包括生物素化或以其他方式標(biāo)記的趨化因子。術(shù)語“趨化因子”還包括趨化因子的修飾和截短的形式和趨化因子片段，條件是修飾或截短的形式保留它結(jié)合于它的同源受體的能力(并因而在本發(fā)明的各種實(shí)施方式的情況下保持功能)。趨化因子不一定需要保留生物活性，因?yàn)橹恍枰獙?duì)于CCR2、CCRl、CCR3、CCR4或CCR5的特異性結(jié)合親和力。在某些實(shí)施方式中，趨化因子缺乏生物活性，例如就(CCR2、CCRU CCR3、CCR4或CCR5)受體的激活而言?？梢赃M(jìn)行修飾以改善蛋白質(zhì)合成，例如產(chǎn)物和產(chǎn)量的均勻性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，示例性修飾可以包括對(duì)在趨化因子中的一種或多種氨基酸進(jìn)行氨基酸添加、替代、缺失或其他修飾。修飾可以包括用非天然氨基酸如正亮氨酸(NLeu)和衍生氨基酸如焦谷氨酸(pyroGlu)來替代野生型氨基酸?？梢赃M(jìn)行所述修飾以在本發(fā)明的各種實(shí)施方式的柱的儲(chǔ)存和使用期間使副產(chǎn)物形成降至最低?？梢赃M(jìn)行修飾以改善標(biāo)記，例如包括聚乙二醇(PEG)間隔物以有助于生物素化。以并不顯著影響受體結(jié)合能力的方式來進(jìn)行生物素化和/或與熒光染料或趨化因子的其他標(biāo)記基團(tuán)結(jié)合。位點(diǎn)特異性生物素化或其他標(biāo)記是優(yōu)選的，這是因?yàn)橼吇蜃拥姆沁x擇性標(biāo)記可以損害受體結(jié)合活性。通常優(yōu)選在蛋白質(zhì)C端或向著其進(jìn)行生物素化或其他標(biāo)記，這是因?yàn)楸景l(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在這區(qū)域的修飾通常是良好容忍的(就對(duì)受體結(jié)合能力的最小影響而言)?？梢栽谌魏芜m宜氨基酸處位點(diǎn)特異性地進(jìn)行生物素化。適宜氨基酸的實(shí)例包括賴氨酸、二氨基丙酸和鳥氨酸。通常，可以參見Natarajan S et al, Int.J.Pept.ProteinRes., 1992, 40, 567-74; Baumeister B, Int.J.Peptide Res.And Therapeutics, 2005, 11, 139-141;Bioconjugate techniques2nd edition, Greg T.Hermanson,全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0041 ] 截短可以涉及N或C端氨基酸的缺失(在適當(dāng)?shù)那闆r下)，或兩者。通常，截短形式將保留趨化因子進(jìn)行正確折疊所需要的殘基，例如保留趨化因子折疊結(jié)構(gòu)，其與以下要求一致:截短形式必須保留結(jié)合于相關(guān)受體(由白細(xì)胞(在表面上)表達(dá)的)的能力。趨化因子分子通常包括分別在第I和第3以及第2和第4半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的。在本 文中提供序列的情況下，假設(shè)這些二硫鍵將在折疊的蛋白質(zhì)中形成(除非另有說明)。在某些實(shí)施方式中，截短形式可以包含比野生型氨基酸序列少I至100個(gè)氨基酸，如1、2、3、4、5個(gè)氨基酸等。當(dāng)然，截短形式可以包含進(jìn)一步的修飾(如本文詳述的)。在某些實(shí)施方式中，相對(duì)于全長(zhǎng)野生型趨化因子，修飾或截短的形式可以具有40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更大總體氨基酸序列一致性(其中，缺失被算作氨基酸序列的差異)。在某些實(shí)施方式中，針對(duì)在分子之間的共同序列(即，沒有被刪除的氨基酸),可以存在 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 氨基酸序列一致性。可以利用可免費(fèi)獲得的已知算法，如BLAST或GAP分析(GCG程序)(采用默認(rèn)設(shè)置)，來確定序列一致性。趨化因子可以缺少在體內(nèi)合成過程中被切割掉的N端信號(hào)肽。
[0042]可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式用于結(jié)合于CCR2的特定趨化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5。MCP-1和MCP-5僅結(jié)合于趨化因子受體CCR2，所以在一些實(shí)施方式中這些趨化因子可以是優(yōu)選的。每種趨化因子能夠結(jié)合于涉及代謝綜合征相關(guān)疾病或病癥的趨化因子受體。更具體地，MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5各自用于從患者血液中除去CCR2表達(dá)細(xì)胞。在本發(fā)明中用于結(jié)合于CCR1、CCR3和/或CCR5的特定趨化因子包括RANTES。RANTES能夠結(jié)合于涉及代謝綜合征相關(guān)疾病或病癥的趨化因子受體。更具體地，RANTES可用于從患者血液中除去CCR1、CCR3和/或CCR5表達(dá)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式，可以各自應(yīng)用在本文中更詳細(xì)描述的趨化因子(參照相關(guān)的圖和氨基酸序列，如在SEQ ID NO中提出的)。CCL17 (TARC)和CCL22 (MDC)僅結(jié)合CCR4并且可以用于本發(fā)明的某些實(shí)施方式中。
[0043]根據(jù)本發(fā)明，可以各自應(yīng)用在本文中更詳細(xì)描述的修飾和截短的趨化因子(參考相關(guān)的氨基酸序列，如在SEQ ID NO和伴隨的實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例中提出的)。這樣的修飾形式可以指導(dǎo)技術(shù)人員關(guān)于可以適用于本發(fā)明的相同和其他趨化因子的另外的修飾形式。趨化因子顯示可變的序列同源性(小于20%至90%以上)，但均共享非常類似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其由以下各項(xiàng)組成:無序的N端、接著長(zhǎng)環(huán)(N環(huán))，其終止于310螺旋、3鏈β折疊和C端螺旋。通過二硫鍵來穩(wěn)定總體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。這種共同三級(jí)結(jié)構(gòu)是趨化因子蛋白家族的共同特征(Fernandez EJ annd Lolis E., Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol., 202, 42, 469-99;Allen SJet al, Annu.Rev.Tmmunol., 2007, 25, 787-820,以引用方式結(jié)合于本文)。
[0044]在該N端區(qū)內(nèi)的截短可以保持結(jié)合于受體，但可以導(dǎo)致功能的改變或喪失(例如，Zhang YJ et al, J.Biol.Chem., 1994, 269, 15918, ; Gong J-H and Clark-Lewis 1., J.Exp.Med., 1995, 181, 631-640 ; Fernandez EJ annd Lolis E., Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol., 202, 42, 469-99; Allen SJ et al, Annu.Rev.1mmunol.，2007，25，787-820,其各自以引用方式結(jié)合于本文)。還可以制備在趨化因子C端處的截短，并保持受體結(jié)合活性(Treating Inflammatory Disorders, Ola Winqvist and Graham Cotton, W02010/029317,全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)。
[0045]在其他實(shí)施方式中，趨化因子的片段和變體用于如本文公開的裝置和方法。更具體地講，所述片段和變體保留特異性地結(jié)合于它們的同源趨化因子受體的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，趨化因子共享特定的受體結(jié)合域，包括類似的單體折疊，例如其特征在于無序的氨基末端結(jié)構(gòu)域，接著保守核心區(qū)，其由所謂的“N環(huán)”、三個(gè)反向平行β-鏈、和羧基末端α-螺旋組成。雖然不受理論限制，但認(rèn)為，趨化因子-趨化因子受體相互作用是兩步機(jī)制，其中趨化因子的核心首先與由受體的胞外域形成的結(jié)合位點(diǎn)相互作用，同時(shí)在趨化因子N端和在受體上的第二結(jié)合位 點(diǎn)之間形成另一種相互作用，從而觸發(fā)受體激活。因此，“片段”，如趨化因子的功能片段，是指蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分，其保留針對(duì)它的同源受體的結(jié)合。片段可以包括，例如，單體折疊區(qū)、或其部分，如氨基末端結(jié)構(gòu)域、保守核心區(qū)和/或“N環(huán)”、反向平行β鏈、和/或羧基末端α-螺旋、或它們的組合和部分
[0046]另外，認(rèn)識(shí)到，可以顯著突變多肽，而沒有顯著改變多肽功能的一種或多種，例如，沒有改變蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合和/或折疊。眾所周知，遺傳密碼是簡(jiǎn)并的，因此不同的密碼子編碼相同的氨基酸。甚至在引入氨基酸替代的情況下，突變也可以是保守的并且對(duì)蛋白質(zhì)的基本功能沒有重大影響(參見例如，Stryer, Biochemistry4th Ed., W.Freeman&C0., New York, NY, 1995)。這包括,例如，蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)結(jié)合和相互作用的能力，如截短的趨化因子結(jié)合于它的同源受體。
[0047]在一些實(shí)施例中，可以刪除多肽鏈的一部分而沒有損害或消除所有它的功能。例如,在C和/或N端，約I至約20個(gè)氨基酸的缺失，如在C和/或N端，約1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個(gè)氨基酸的缺失，可以導(dǎo)致這樣的趨化因子，其保留功能，如特異性結(jié)合它的同源受體。這樣的截短可以保留整個(gè)蛋白質(zhì)的全部功能，和/或可以允許保留功能如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，如在配體-受體相互作用的情況下。缺失少量氨基酸，例如，小于約20%(如小于約18%、小于約15%、小于約10%、小于約8%、小于約5%、小于約2%、或小于約1%)野生型趨化因子氨基酸總數(shù)，的趨化因子也可以用于本文公開的方法和裝置。此外，可以在多肽鏈中進(jìn)行插入或添加，例如，添加表位標(biāo)簽，而沒有損害或消除它的功能(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreenePubl.Assoc, and ffiley-1ntersciences, 1998)。在沒有顯著損害多妝的一種或多種功能的情況下，可以進(jìn)行的其他修飾包括，例如，體內(nèi)或體外化學(xué)和生化修飾或摻入稀有氨基酸。在一些實(shí)施例中，趨化因子的功能片段可以由趨化因子氨基酸序列的約10或更多、約25或更多、約50或更多、約75或更多、約100或更多、約125或更多、約150、約175或更多、或約更多、或200或更多個(gè)氨基酸殘基組成。
[0048]在一些實(shí)施例中，趨化因子或其功能片段具有這樣的氨基酸，相比于參考序列，如本文詳細(xì)描述的那些(例如，利用NCBI Blast2.0gapped BLAST設(shè)定為默認(rèn)參數(shù))，在它的全長(zhǎng)上具有至少約60%或65%序列一致性，約70%或75%序列一致性，約80%或85%序列一致性，約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。還可以通過檢查來手工進(jìn)行比對(duì)。還可以在趨化因子氨基酸序列中進(jìn)行一種或多種保守氨基酸修飾，不管是添加、缺失或修飾，其并不顯著改變多肽的三維結(jié)構(gòu)或它結(jié)合于同源受體的能力。例如，保守氨基酸替代并不影響趨化因子特異性地結(jié)合它的同源受體的能力。提供功能類似氨基酸的保守替代表是本領(lǐng)域中眾所周知的。以下六組各自包含彼此是保守替代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。
[0049]可以通過各種各樣的化學(xué)技術(shù)來修飾肽，如趨化因子及其片段，以產(chǎn)生這樣的衍生物，其具有與未修飾肽基本相同的活性或功能，如結(jié)合于同源受體，以及可選地具有其他所期望的性能。例如，蛋白質(zhì)的羧酸基團(tuán)，不管是羧基末端或側(cè)鏈，能夠以藥用陽離子的鹽形式提供，或被酯化以形成C1-C16酯，或被轉(zhuǎn)化為化學(xué)式NR1R2的酰胺，其中Rl和R2各自獨(dú)立地是H或C1-C16烷基，或被結(jié)合以形成雜環(huán)，如5或6元環(huán)。肽的氨基，不管是氨基末端或側(cè)鏈，可以為藥用酸加成鹽的形式，如HCl鹽、HBr鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、甲苯磺酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽和其他有機(jī)鹽，或可以被修飾至C1-C16烷基或二烷基氨基，或進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為酰胺。
[0050]利用公認(rèn)的技術(shù)，可以將肽側(cè)鏈的羥基轉(zhuǎn)化為C1-C16烷氧基或轉(zhuǎn)化為C1-C16酯?？梢杂靡环N或多種鹵素原子，如F、Cl、Br或I，或用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯、或所述羧酸的酰胺，來取代肽側(cè)鏈的苯基和苯酚環(huán)?？梢詫㈦膫?cè)鏈的亞甲基延伸成同系C2-C4亞烷基?？梢杂迷S多公認(rèn)的保護(hù)基團(tuán)的任何一種，如乙酰胺基團(tuán)，來保護(hù)巰基。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到用于將環(huán)狀結(jié)構(gòu)引入本公開肽的方法，以選擇和提供對(duì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象限制，其導(dǎo)致增強(qiáng)的穩(wěn)定性。例如，可以將C或N端半胱氨酸加入肽，從而當(dāng)被氧化時(shí)，肽將包含二硫鍵，從而產(chǎn)生環(huán)肽。其他肽環(huán)化方法包括形成硫醚以及羧基末端和氨基末端酰胺和酯。
[0051]肽模擬物和有機(jī)模擬物實(shí)施方式也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，由此所述肽模擬物和有機(jī)模擬物的化學(xué)成分的三維排列模擬肽主鏈和成分氨基酸側(cè)鏈的三維排列，從而導(dǎo)致本發(fā)明蛋白質(zhì)的所述肽模擬物和有機(jī)模擬物。對(duì)于計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用，藥效團(tuán)是針對(duì)生物活性的結(jié)構(gòu)要求的理想化的三維定義?？梢允褂媚壳暗挠?jì)算機(jī)建模軟件(利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)或CADD)設(shè)計(jì)肽模擬物和有機(jī)模擬物以配合每種藥效團(tuán)。參見Walters, “Computer-Assisted Modeling of Drugs，，，in Klegerman&Groves, eds., 1993,Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove,IL, pp.165174andPrinciples of Pharmacology Munson(ed.) 1995，Ch.102，for descriptions oftechniques used in CADD。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括利用所述技術(shù)制備的模擬物。
[0052]通過酰胺鍵(CONH)，通常將在肽、多肽、或蛋白質(zhì)中的氨基酸化學(xué)結(jié)合在一起。另外，可以通過其他化學(xué)鍵，將氨基酸結(jié)合在一起。例如，用于氨基酸或氨基酸類似物的鍵可以包括 CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(順式和反式)、-C0CH2-、-CH (OH)CH2-、和-CHH2S0-(這些和其他鍵可以參見 Spatola, in Chemistry and Biochemistryof Amino Acids, Peptides, and Proteins,B.Weinstein, eds., Marcel Dekker,NewYork, p.267 (1983) ; Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol.1, Issue3, PeptideBackbone Modifications (綜論)；Morley, Trends Pharm Sci pp.463-468，1980; Hudson, eta 1., Int J Pept Prot Resl4: 177-185, 1979; Spatola et a 1.LifeSci38:1243-1249，1986;Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314, 1982;Almquistet al.J.Med.Chem.23:1392-1398, 1980;Jennings-ffhite et al.TetrahedronLett23:2533, 1982;Holladay et al.Tetrahedron.Lett24:4401-4404, 1983 ；以及 HrubyLife Sci31:189-199, 1982)。
[0053]CCL2是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)配體2的基因符號(hào)，還稱為MCP-1。該基因的HGNC ID是10618。該基因位于染色體位置17qll.2_q21.1處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是SCYA2、“小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子A2(單核細(xì)胞趨化蛋白1，與小鼠Sig-je同源)”。該基因的同義詞包括⑶CF-2、HC11、MCP1、MGC9434、SMC-CF、“單核細(xì)胞化學(xué)吸引物蛋白質(zhì)-1"、"單核細(xì)胞趨化和激活因子"、"單核細(xì)胞趨化蛋白1，與小鼠Sig-je同源〃、〃單核細(xì)胞分泌性蛋白JE〃、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A(Cys-Cys)，成員2〃。CCL2的Genbank參考序列是如于2011年6月13日可獲得的BC009716.1，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0054]CCL8是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)配體8的基因符號(hào)，還稱為MCP-2。該基因的HGNC ID是10635。該基因位于染色體位置17qll.2處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是SCYA8、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A(Cys-Cys)，成員8(單核細(xì)胞趨化蛋白2)"。該基因的另一種同義詞是HC14。CCL8的Genbank參考序列是如于2011年6月13日可獲得的X99886.1，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0055]CCL7是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)配體7的基因符號(hào)，還稱為MCP-3。該基因的HGNC ID是10634。該基因位于染色體位置17qll.2_ql2處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是SCYA6、SCYA7、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子A7 (單核細(xì)胞趨化蛋白3)〃。該基因的同義詞包括？1(:、嫩1^、103-3、1033、從:28、〃單核細(xì)胞化學(xué)吸引物蛋白質(zhì)3"、"單核細(xì)胞趨化蛋白3"。CCL7的Genbank參考序列是如于2011年6月13日可獲得的AF043338，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0056]CCL13是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)配體13的基因符號(hào)，還稱為MCP-4。該基因的HGNC ID是10611。該基因位于染色體位置17qll.2處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是SCYA13、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A(Cys-Cys)，成員13〃。該基因的同義詞包括 CKblO、MCP-4、MGC17134、NCC-l、SCYLl。CCL13 的 Genbank 參考序列是如于2011年6月13日可獲得的AJ001634，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0057]MCP-5是CC趨化因子家族中的小鼠趨化因子。它還被稱為趨化因子(C_C基序)配體12 (CCL12)，并且，由于它與人趨化因子MCP-1的相似性，有時(shí)它被稱為MCP-1相關(guān)趨化因子。MCP-5的基因存在于在小鼠染色體11上的一組CC趨化因子中。CCL12的NCBI參考序列是NC_000077.5。MCP-5的先前的符號(hào)是SCYA12。CCL12的NCBI參考序列是如于2011年6月13日可獲得的NC_000077.5，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0058]CCL5是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)配體5的基因符號(hào)，還稱為RANTES。該基因的HGNC ID是10632。該基因位于染色體位置17qll.2_ql2處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是D17S136E、SCYA5、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子A5 (RANTES)"。該基因的同義詞包括〃 β -趨化因子RANTES"、MGC17164、RANTES、〃激活后調(diào)節(jié)的，正常T表達(dá)的，和推測(cè)分泌的〃、"SIS- δ 〃、SISd、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A(Cys-Cys)，成員5〃、〃T細(xì)胞特異性蛋白ρ288〃、〃Τ細(xì)胞特異性RANTES蛋白質(zhì)〃、TCP228。CCL5的Genbank參考序列是如于2011年6月13日可獲得的AF043341.1，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0059]CCL17是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)配體17的基因符號(hào)。該基因的HGNC ID是10615。該基因位于染色體位置16ql3處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是SCYA17、〃小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A(Cys-Cys)，成員17"。該基因的同義詞包括AB⑶-2、TARC。CCL17的Genbank參考序列是如于2011年6月13日可獲得的D43767.1，其全部?jī)?nèi)容以引 用方式結(jié)合于本文。
[0060]CCL21是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的用于趨化因子(C_C基序)配體21的基因符號(hào)。該基因的HGNC ID是10620。該基因位于染色體位置9pl3處。該基因的先前的符號(hào)和名稱是SCYA21、"小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A(Cys-Cys)，成員21〃。該基因的同義詞包括6Ckine、〃 β趨化因子exodus-2〃、CKb9、ECL, 〃用于淋巴細(xì)胞的高效的化學(xué)吸引物〃、exodus-2、〃次級(jí)淋巴樣組織趨化因子〃、SLC、TCA4。CCL21的Genbank參考序列是如于2011年6月13日可獲得的AB002409.1，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。
[0061]包含修飾和/或截短并且特別適用于本發(fā)明的本發(fā)明的各種實(shí)施方式的適宜的修飾趨化因子的實(shí)例詳細(xì)描述于本文。MCP-1已被產(chǎn)生為具有殘基75，其可以是賴氨酸，作為在趨化因子上的生物素化位點(diǎn)(編號(hào)是基于具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的成熟蛋白)。生物素化允許將MCP-1固定在載體上(通過生物素-親和素相互作用)。MCP-1的基本氨基酸序列，包括23個(gè)氨基酸前導(dǎo)序列，被提出為SEQ ID NO:1。成熟蛋白的氨基酸序列被提出為SEQ ID N0:2。本發(fā)明的發(fā)明人已確定了，趨化因子可以顯示改善的結(jié)合性能，其中趨化因子通過間隔基團(tuán)被生物素化。間隔物可以防止生物素基團(tuán)影響趨化因子的結(jié)合親合力?？梢圆捎萌魏芜m宜的間隔基團(tuán)。進(jìn)一步的修飾可以為分子提供有利的性能。本發(fā)明還涉及截短MCP-1趨化因子的衍生物。截短形式的氨基酸序列被提出為SED ID N0:3。
[0062]因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了修飾的MCP-1趨化因子，其包含提出為SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其組成或由其組成，其中已進(jìn)行一種或多種以下修飾:
[0063]a) SEQ ID NO: 2的谷氨酰胺殘基I已被焦谷氨酰胺替換
[0064]b)C端被產(chǎn)生為酰胺衍生物(這可以通過在酰胺接頭上的合成來實(shí)現(xiàn))
[0065]c)在 SEQ ID NO:1 的位置 98 或 SEQ ID NO: 2 的位置 75 或 SEQ ID NO: 3 位置 67處的(C端區(qū))殘基，其可以是賴氨酸或鳥氨酸殘基，被生物素化，可選地通過間隔基團(tuán)被生物素化，以允許將趨化因子固定在固體載體上；和/或
[0066]d)在 SEQ ID NO:1 的位置 87 或 SEQ ID NO: 2 的位置 64 或 SEQ ID NO: 3 的位置
56處的甲硫氨酸殘基 已被正亮氨酸替換。
[0067]在SEQ ID NO:1 的位置 98 或 SEQ ID NO: 2 的位置 75 或 SEQ ID NO: 3 的位置 67處的(C端區(qū))氨基酸，其可以是賴氨酸殘基或功能等效物，可以通過適宜的間隔基團(tuán)，如聚乙二醇(PEG)間隔基團(tuán)進(jìn)行生物素化，以允許將趨化因子固定在固體載體上。在【具體實(shí)施方式】中，PEG間隔物是3，6- 二氧氨基辛酸。本發(fā)明的修飾MCP-1趨化因子的序列和生物素化分別示于圖7至9。修飾的MCP-1趨化因子可以是CCR2活性的激動(dòng)劑或拮抗劑?？梢栽谶m宜的測(cè)定，如基于細(xì)胞的測(cè)定中測(cè)試它們的活性。尤其是，可以在針對(duì)人CCR2受體基于功能細(xì)胞的測(cè)定中確定激動(dòng)劑和拮抗劑性能。
[0068]MCP-5僅結(jié)合CCR2，因而將選擇性地除去CCR2表達(dá)細(xì)胞。全長(zhǎng)氨基酸序列，包括信號(hào)肽，被提出為SEQ ID N0:4。N端加工的MCP-5趨化因子的氨基酸序列的長(zhǎng)度是82個(gè)氨基酸，并且被提出為SEQ ID N0:5。氨基酸序列比對(duì)表明，當(dāng)與MCP-1的氨基酸序列相比時(shí)，MCP-5具有C端延伸部分。這種比對(duì)的結(jié)果示于圖10。因此可以合成MCP-5的C端截短形式。這種截短形式將包含提出為SEQ ID N0:6的MCP-5殘基1-76、基本上由其組成或由其組成。
[0069]因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了修飾的MCP-5趨化因子，其包含提出為SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID N0:6 的氨基酸序列，其中在 SEQ ID N0:4 的位置 97處的、或在SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6的位置75處的異亮氨酸殘基已被賴氨酸替換。在某些實(shí)施方式中，修飾的MCP-5趨化因子包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、基本上由其組成或由其組成。在SEQ ID NO:4的位置97、或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的位置75處的賴氨酸(或功能等效物)殘基處，修飾的MCP-5趨化因子可以被生物素化。生物素化可以通過適宜的間隔基團(tuán)。間隔基團(tuán)的具體實(shí)例包括PEG間隔物，可選地3，6-二氧氨基辛酸。在一些實(shí)施方式中，C端被產(chǎn)生為酰胺衍生物。這可以通過在酰胺接頭上合成來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方式中，修飾的MCP-5趨化因子包含圖11所示的序列和生物素化、基本上由其組成或由其組成。修飾的MCP-5趨化因子可以是CCR2活性的激動(dòng)劑或拮抗劑?？梢栽谶m宜的測(cè)定，如基于細(xì)胞的測(cè)定中，測(cè)試它們的活性。尤其是，可以在針對(duì)人CCR2受體的基于功能細(xì)胞的測(cè)定中確定激動(dòng)劑和拮抗劑性能。
[0070]包含修飾并且特別適用于本發(fā)明的本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子的另外的實(shí)例詳細(xì)描述于本文(參見以下實(shí)施例)。修飾CCL2(MCP-1)對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)成熟蛋白的殘基I至76 (并且缺少被切割掉的23個(gè)氨基酸的N端信號(hào)肽)，因此保留趨化因子折疊。在蛋白質(zhì)的N端處的Gln(Glnl)由焦谷氨酰胺取代以防止產(chǎn)生N端Gln和pyroGlu的混合物質(zhì)。通過柱制造和使用，這提高了合成產(chǎn)量并確保均勻趨化因子制備。加入FmocLys (ivDde) -OH作為殘基75，以促進(jìn)在蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 10)的該位置處位點(diǎn)特異性標(biāo)記。可以將合適的間隔物，如PEG間隔物，加入在ε_(tái)氨基官能團(tuán)和生物素之間。生物素化形式包含SEQ IDNO: 11的氨基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
[0071]因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及修飾趨化因子，其包含以下的氨基酸序列、基本上由其組成或由其組成:
[0072]SEQ ID NO:9:
[0073]XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKffVQDSMDHLDKQTQTPKT
[0074]X=pyroGlu 或 Gln
[0075]和/ 或 SEQ ID NO: 11:
[0076]XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKffVQDSMDHLDKQTQTPXT
[0077]Xl=pyroGlu 或 Gln
[0078]Χ75是可以被生物素化的氨基酸殘基，如賴氨酸、鳥氨酸或二氨基丙酸，以及可選地被生物素化，可選地通過間隔分子如PEG，可選地K (PEG-生物素)被生物素化
[0079]包含修飾并且特別適用于本發(fā)明的本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子的另外的實(shí)例詳細(xì)描述于本文(參見以下實(shí)施例4)。修飾CCL5 (RANTES)對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)成熟蛋白的殘基I至68 (并且缺少被切割掉的23個(gè)氨基酸的N端信號(hào)肽)，因而保留趨化因子折疊。在該序列內(nèi)的單個(gè)甲硫氨酸(Met67)被突變?yōu)橘嚢彼?，以在鏈裝配(SEQ ID NO: 12)期間減輕該殘基的氧化。這種Met至Lys的替代可以提供在位置67處的賴氨酸，其可以通過生物素化來修飾。加入FmocLys (ivDde)-OH作為殘基67以促進(jìn)在蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 13)的該位置處位點(diǎn)特異性標(biāo)記。生物素化形式包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列、基本上由其組成或由其組成:
[0080]因此，在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及修飾趨化因子，其包含以下SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成:
[0081] SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKN RQVCANPEKKffVREYINSLEXS
[0082]X是可以被生物素化的氨基酸殘基，如賴氨酸、鳥氨酸或二氨基丙酸，以及可選地被生物素化，可選地通過間隔分子如PEG(例如K(生物素))被生物素化
[0083]包含修飾并且特別適用于本發(fā)明的本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子的另外的實(shí)例詳細(xì)描述于本文(參見以下實(shí)施例3)。修飾的CCL8(MCP-2)對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)成熟蛋白的殘基I至76 (以及缺少被切割掉的23個(gè)氨基酸的N端信號(hào)肽)，因而保留趨化因子折疊。在生理?xiàng)l件下，在蛋白質(zhì)的N端處的Gln經(jīng)歷pyroGlu形成。因此，序列Glnl由焦谷氨酰胺取代以防止產(chǎn)生N端Gln和pyroGlu的混合物質(zhì)(SEQ ID NO: 15)。通過柱制造和使用，這提高了合成產(chǎn)量并確保均勻趨化因子制備。加入FmocLys (ivDde)-OH作為殘基75以促進(jìn)在蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 16)的該位置處位點(diǎn)特異性標(biāo)記。通過生物素來修飾在位置75處的自然發(fā)生的賴氨酸。可以將合適的間隔物，如PEG間隔物，加入在ε-氨基官能團(tuán)和生物素(SEQ ID NO: 17)之間:
[0084]因此，在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及修飾趨化因子，其包含以下SEQ ID NO: 17的氨基酸序列，基本上由其組成或由其組成:
[0085]XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP
[0086]Xl=pyroGlu(但在一些實(shí)施方式中可以保持為Gln)
[0087]X75=可以被生物素化的氨基酸殘基，如賴氨酸、鳥氨酸或二氨基丙酸，以及可選地被生物素化,可選地通過間隔物分子如PEG，例如K (PEG-生物素)被生物素化。
[0088]可以通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的方式來合成可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子。優(yōu)選地，化學(xué)合成趨化因子，因?yàn)檫@有助于修飾和標(biāo)記等。然而，還可以采用基于重組DNA的方式，與適當(dāng)?shù)臉?biāo)記和修飾技術(shù)結(jié)合(根據(jù)需要)。因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了核酸分子，其編碼本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及包含所述核酸分子的載體以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。載體可以另外包含適宜的啟動(dòng)子，其可操作地連接于核酸分子，以促進(jìn)相應(yīng)的mRNA分子轉(zhuǎn)錄。通過編碼本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子的核酸分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，宿主細(xì)胞可以能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0089]可以通過本領(lǐng)域中已知的方法(如描述于W000/50088A2，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)來生物素化可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子。如上面所指出的，本發(fā)明的各種實(shí)施方式的趨化因子的位點(diǎn)特異性標(biāo)記是優(yōu)選的，雖然可以采用并不顯著影響趨化因子的受體結(jié)合能力的任何標(biāo)記技術(shù)。各種位點(diǎn)特異性地生物素化趨化因子和天然趨化因子是市售的，例如來自Almac, Craigavon, UK。在【具體實(shí)施方式】中,通過間隔基團(tuán),來生物素化一種或多種趨化因子?？梢允褂瞄g隔物來防止生物素基團(tuán)影響趨化因子的活性，尤其是趨化因子與它的同源受體的結(jié)合。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，可以采用有助于保留趨化因子的受體結(jié)合性能的任何適宜的間隔物。因此，在以上描述的【具體實(shí)施方式】中，在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以采用不同于PEG間隔物的間隔物。在【具體實(shí)施方式】中，間隔物是聚乙二醇(PEG)間隔物。PEG已被表明是有效間隔物，其允許將生物素連接于趨化因子(然后通過與鏈霉親合素的相互作用，可以將其固在固體載體上)而沒有損害受體結(jié)合能力。
[0090]在本發(fā)明的各種實(shí)`施方式的上下文下，術(shù)語“抗體”包括所有免疫球蛋白或?qū)τ谙嚓P(guān)的趨化因子受體具有特異性結(jié)合親和力的免疫球蛋白樣分子(通過舉例方式，但非限制性地包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、它們的組合、以及在任何脊椎動(dòng)物中在免疫反應(yīng)期間產(chǎn)生的類似分子，例如，在哺乳動(dòng)物中如人類、山羊、兔和小鼠)。可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式的具體的免疫球蛋白包括IgG同種型?？捎糜诒景l(fā)明的各種實(shí)施方式的抗體可以是單克隆或多克隆起源，但通常是單克隆抗體。抗體可以是人抗體、非人抗體、或非人抗體的人源化形式、或嵌合抗體。用于抗體人源化的各種技術(shù)是眾所周知的并且可以采用任何適宜的技術(shù)。術(shù)語“抗體”還指多肽配體，該多肽配體至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)，其特異性地識(shí)別和結(jié)合抗原的表位，并且它延伸到保留特異性地結(jié)合于相關(guān)趨化因子受體能力的所有抗體衍生物和片段。這些衍生物和片段可以包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、單鏈抗體、單域抗體、Fe片段等。術(shù)語抗體包括這樣的抗體，其包括重鏈和輕鏈，但還包括(僅)重鏈抗體。在【具體實(shí)施方式】中，可以設(shè)計(jì)抗體以對(duì)一種以上的趨化因子受體具有特異性，例如雙特異性以允許結(jié)合于兩種不同的趨化因子受體。在以下表1中列出結(jié)合于感興趣的趨化因子受體的合適的市售抗體。它們可以標(biāo)記或未標(biāo)記。一般性參考可以參見“Antibodies a laboratory manual:By E Harlow and D Lane.pp726.Cold SpringHarbor Laboratory.1988”,其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。抗CCR2抗體例如描述于W02010/021697,以引用方式結(jié)合于本文。潛在有用的抗體的進(jìn)一步的實(shí)例包括MLN-1202，一種抗CCR2單克隆抗體，其目前正進(jìn)行臨床試驗(yàn)(Millennium Pharmaceuticals)。
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥或用于治療痛性肥胖癥(AD)的方法，包括將來自患者或受試者的外周血施加于載有固體載體的成分血分離柱，所述載體包含能夠特異性地結(jié)合于趨化因子受體的一種或多種結(jié)合試劑，可選地為直接或間接固定在所述載體上的趨化因子受體CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5，從而由所述患者或受試者的所述外周血中除去一種或多種趨化因子受體，可選地為CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述與代謝綜合征相關(guān)的病癥選自糖尿病、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三酰基甘油濃度和高血壓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，能夠特異性地結(jié)合于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的所述結(jié)合試劑分別是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的激動(dòng)劑或拮抗劑。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，能夠特異性地結(jié)合于CCR2、CCRUCCR3、CCR4或CCR5的所述結(jié)合試劑選自抗體和趨化因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述趨化因子選自MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5以及可選地所述趨化因子受體是CCR2，或其中所述趨化因子是RANTES以及可選地所述趨化因子受體選自CCR1、CCR3和CCR5，或其中所述趨化因子選自CCL17(TARC)和CCL22 (MDC)以及所述趨化因子受體是CCR4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述趨化因子是MCP-1或MCP-5。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5表達(dá)細(xì)胞是用于治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥的單核細(xì)胞，可選地為CCR2表達(dá)單核細(xì)胞，其中治療糖尿??；或用于治療AD的(CCR2表達(dá))B淋巴細(xì)胞，或CCRl表達(dá)單核細(xì)胞，其中治療AD，或CCR4或CCR5表達(dá)T細(xì)胞，其中治療糖尿病。`
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，基于在獲自所述患者或受試者的樣品中檢測(cè)CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的水平增加，CCR2、CCRUCCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的表達(dá)水平增加，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞水平增加，來選擇所述患者或受試者以進(jìn)行治療。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在單次治療中，將約20-50%的所述患者的血液施加于所述柱。
10.一種結(jié)合試劑，能夠特異性地結(jié)合于趨化因子受體，可選地趨化因子受體CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5用于治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥或用于治療痛性肥胖癥(AD)，其中，將所述結(jié)合試劑固定在包含在成分血分離柱內(nèi)的固體載體上，對(duì)所述成分血分離柱施加來自患者的外周血，從而由所述患者的所述外周血中除去趨化因子受體，可選地為CCR2、CCR1、CCR3、CCR4 或 CCR5 表達(dá)細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合試劑，其中，所述與代謝綜合征相關(guān)的病癥選自糖尿病、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三酰基甘油濃度和高血壓。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的結(jié)合試劑，其中，能夠特異性地結(jié)合于CCR2、CCRUCCR3、CCR4或CCR5的所述結(jié)合試劑分別是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的拮抗劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的結(jié)合試劑，其中，能夠特異性地結(jié)合于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的所述結(jié)合試劑選自抗體和趨化因子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的結(jié)合試劑，其中，所述趨化因子選自MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5以及可選地所述趨化因子受體是CCR2，或其中所述趨化因子是RANTES以及可選地所述趨化因子受體選自CCR1、CCR3或CCR5，或其中所述趨化因子選自CCL17 (TARC)和CCL22 (MDC)以及所述趨化因子受體是CCR4。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的結(jié)合試劑，其中，所述趨化因子是MCP-1或MCP-5。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至15中任一項(xiàng)所述的結(jié)合試劑，其中，所述CCR2、CCRUCCR3、CCR4或CCR5表達(dá)細(xì)胞是用于治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥的單核細(xì)胞，可選地為CCR2表達(dá)單核細(xì)胞，其中治療糖尿病；或用于治療AD的(CCR2-表達(dá))B淋巴細(xì)胞，或CCRl表達(dá)單核細(xì)胞，其中治療AD，或CCR4或CCR5表達(dá)T細(xì)胞，其中治療糖尿病。
17.根據(jù)權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)所述的結(jié)合試劑，其中，基于在獲自所述患者的樣品中檢測(cè)CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5表達(dá)細(xì)胞的水平增加，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的表達(dá)水平增加，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4或CCR5的高表達(dá)的細(xì)胞水平增加，來選擇所述患者或受試者以進(jìn)行治療。
18.根據(jù)權(quán)利要求10至17中任一項(xiàng)所述的結(jié)合試劑，其中，在單次治療中，將20-50%的所述患者的血液施加于所述柱。
19.一種用于診斷、監(jiān)測(cè)與代謝綜合征相關(guān)的病癥或痛性肥胖癥(AD)的進(jìn)展、或用于監(jiān)測(cè)與代謝綜合征相關(guān)的病癥或痛性肥胖癥(AD)的治療的方法，包括在獲自受試者的樣品中確定 a)趨化因子受體CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的水平 b)CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的表達(dá)水平；和/或 c)具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞水平 其中CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的高水平，CCR2、CCRUCCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)水平，或具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞的高水平，或與對(duì)照相比較CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的增加的水平，或與對(duì)照相比較CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的增加的表達(dá)水平，或與對(duì)照相比較具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞的增加的水平，表明與代謝綜合征相關(guān)的病癥或痛性肥胖癥(AD)的存在或進(jìn)展。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述與代謝綜合征相關(guān)的病癥選自糖尿病、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三?；视蜐舛群透哐獕?。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是外周血樣品，可選地其中所述細(xì)胞是CCR2表達(dá)B細(xì)胞、CCRl表達(dá)單核細(xì)胞、或CCR4或CCR5表達(dá)T淋巴細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的較高水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的較高表達(dá)水平和/或具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞的較高水平，與更加活動(dòng)性的疾病相關(guān)。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種 的較低水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的較低表達(dá)水平，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞的較低水平，與無活動(dòng)性疾病或較低活動(dòng)性疾病相關(guān)。
24.根據(jù)權(quán)利要求19至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的降低的水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的降低的表達(dá)水平，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞的降低的水平，與成功治療相關(guān)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述治療如在權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述。
26.根據(jù)權(quán)利要求19至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的增加的水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的增加的表達(dá)水平，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞的增加的水平，表示疾病的進(jìn)展。
27.一種用于選擇適合治療與代謝綜合征相關(guān)的病癥或痛性肥胖癥(AD)的方法，包括在猶自受試者的樣品中確定 a)趨化因子受體CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的水平 b)CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的表達(dá)水平；和/或 c)具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞水平 其中，CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的較高水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的較高表達(dá)水平，或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高表達(dá)的細(xì)胞的較高水平，或與對(duì)照相比較CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表達(dá)細(xì)胞的一種或多種的增加的水平，與對(duì)照相比較CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的增加的表達(dá)水平，或與對(duì)照相比較具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一種或多種的高 表達(dá)的細(xì)胞的增加的水平，導(dǎo)致選擇如在權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所限定的治療，用于治療所述與代謝綜合征相關(guān)的病癥或痛性肥胖癥(AD)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述與代謝綜合征相關(guān)的病癥選自糖尿病、肥胖癥、胰島素抗性、增加的血清三?；视蜐舛群透哐獕骸?br> 29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，所述樣品是外周血樣品，可選地其中所述細(xì)胞是CCR2表達(dá)B細(xì)胞、CCRl表達(dá)單核細(xì)胞、或CCR4或CCR5表達(dá)T淋巴細(xì)胞。
30.一種修飾的 MCP-1 趨化因子，包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 所列出的氨基酸序列，其中進(jìn)行以下修飾的一種或多種: a)在SEQID NO:2的位置I處的谷氨酰胺殘基被焦谷氨酰胺替換 b)C端被產(chǎn)生為酰胺衍生物 c)在SEQID NO:1的位置98處或在SEQ ID NO: 2的位置75處或在SEQ ID NO: 3的位置67處的賴氨酸殘基，所述賴氨酸殘基可以被適宜的可替代的氨基酸如二氨基丙酸或鳥氨酸替換，被生物素化，可選地通過間隔基團(tuán)被生物素化，以允許將所述趨化因子固定在固體載體上 d)在SEQID NO:1的位置87處或在SEQ ID NO: 2的位置64處或在SEQ ID NO: 3的位置56處的甲硫氨酸殘基被正亮氨酸替換。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的修飾的MCP-1趨化因子，其中，在SEQID NO:1位置98處或在SEQ ID NO:2的位置75處或在SEQ ID NO:3的位置67處的賴氨酸殘基，通過聚乙二醇(PEG)間隔基團(tuán)來生物素化，以允許將所述趨化因子固定在固體載體上。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的修飾的MCP-1趨化因子，其中，所述PEG間隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)所述的修飾的MCP-1趨化因子，具有圖7至9中任一個(gè)所示的結(jié)構(gòu)。
34.根據(jù)權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)所述的修飾的MCP-1趨化因子，其是CCR2活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。
35.一種修飾的 MCP-5 趨化因子，包含 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 所列出的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:4的位置97處或在SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的位置75處的異亮氨酸殘基被賴氨酸或可替代的氨基酸如二氨基丙酸或鳥氨酸替換，這允許生物素化。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的修飾的MCP-5趨化因子，其包含SEQID NO: 7的氨基酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的修飾的MCP-5趨化因子，其在SEQID NO: 4的位置97處或在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的位置75處的賴氨酸殘基，被生物素化。
38.根據(jù)權(quán)利要求35至37中任一項(xiàng)所述的修飾的MCP-5趨化因子，其中，生物素化是通過間隔基團(tuán)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的修飾的MCP-5趨化因子，其中，所述間隔基團(tuán)是PEG間隔物，可選地為3，6- 二氧氨基辛酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求35至39中任一項(xiàng)所述的修飾的MCP-5趨化因子，其中，C端被產(chǎn)生為酰胺衍生物。
41.根據(jù)權(quán)利要求35至40中任一項(xiàng)所述的修飾的MCP-5趨化因子，具有圖11所示的結(jié)構(gòu)。
42.根據(jù)權(quán)利要求35至41中任一項(xiàng)所述的修飾的MCP-5趨化因子，其是CCR2活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。
43.一種載有固體載體的成分血分離柱，所述載體包含能夠特異性地結(jié)合于直接或間接固定在所述載體上的趨化因子受體，以允許由患者的外周血中除去表達(dá)所述趨化因子受體的細(xì)胞的結(jié)合試劑，其中所述結(jié)合試劑不是趨化因子。
44.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱，其中，能夠特異性地結(jié)合于所述趨化因子受體的所述結(jié)合試劑是所述趨化因子受體的激動(dòng)劑或拮抗劑。
45.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的柱，其中，能夠特異性地結(jié)合于所述趨化因子受體的所述結(jié)合試劑選自抗體和化合物。
46.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的柱，如由權(quán)利要求1至42中的任何一個(gè)或多個(gè)特征所進(jìn)一步限定。
47.一種用于治療炎性病癥的方法，包括將來自患者的外周血施加于如在權(quán)利要求43至46中任一項(xiàng)所限定的成分血分離柱，從而由所述患者的所述外周血中除去趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，如由權(quán)利要求1至42中的任何一個(gè)或多個(gè)特征所進(jìn)一步限定。
49.一種結(jié)合試劑，能夠特異性地結(jié)合于趨化因子受體，用于治療炎性病癥，其中將所述結(jié)合試劑固定在包含在如在權(quán)利要求43至46中任一項(xiàng)所述的成分血分離柱內(nèi)的固體載體上,對(duì)所述成分血分離柱施加來自患者的外周血,從而由所述患者的所述外周血中除去趨化因子受體表達(dá)細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的結(jié)合試劑，如由權(quán)利要求1至42中的任何一個(gè)或多個(gè)特征所進(jìn)一步限定。
51.一種修飾的CCL8(MCP-2)趨化因子，包含SEQ ID NO: 17所列出的氨基酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的修飾的CCL8趨化因子，其中，在SEQID NO: 17的位置75處的殘基通過聚乙二醇(PEG)間隔基團(tuán)來生物素化，以允許將所述趨化因子固定在固體載體上。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的修飾的CCL8趨化因子，其中，所述PEG間隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
54.根據(jù)權(quán)利要求51至53中任一項(xiàng)所述的修飾的CCL8趨化因子，包含SEQID NO: 15的氨基酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求51至54中任一項(xiàng)所述的修飾的CCL8趨化因子，其是CCR5活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。
56.一種修飾的CCL5趨化因子，包含SEQ ID NO: 14所列出的氨基酸序列。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的修飾的CCL5趨化因子，其中，在位置67處的殘基被生物素化。
58.根據(jù)權(quán)利要求56或`57所述的修飾的CCL5趨化因子，其包含SEQID NO:8或SEQID NO: 12的氨基酸序列。
59.根據(jù)權(quán)利要求56至58中任一項(xiàng)所述的修飾的CCL5趨化因子，其是CCR5活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。
60.一種修飾的CCL2趨化因子，包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】A61M1/36GK103796693SQ201280039642
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月13日
【發(fā)明者】格雷厄姆·科頓, 奧拉·溫奎斯特 申請(qǐng)人:Ith免疫治療控股股份公司