從山藥分離出的新穎生物活性蛋白及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了分離自山藥薯蕷的蛋白，其在體外和在體內(nèi)刺激雌激素和孕酮釋放，但是不會(huì)刺激乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖。所述蛋白在體內(nèi)表現(xiàn)出抗骨質(zhì)疏松活性。也公開了用于分離和純化所述蛋白的程序和所述蛋白的N端氨基酸序列，以及所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物用于在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的治療用途，用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受體(FSHR)的表達(dá)水平的治療用途，和用于治療絕經(jīng)期綜合征的治療用途。
【專利說明】從山藥分離出的新穎生物活性蛋白及其用途
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2011年8月17日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/524,477的權(quán)益，其特此通過引用整體并入。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及源自山藥的生物活性蛋白及其用于增加血清雌激素和孕酮水平以及用于治療骨質(zhì)疏松癥、絕經(jīng)期綜合征和伴隨的認(rèn)知減退的用途。
【背景技術(shù)】
[0003]絕經(jīng)是衰老過程的正常部分，絕經(jīng)期間由卵巢分泌的雌激素和孕酮的水平逐漸下降。大約80%的婦女經(jīng)歷輕微的或很少的癥狀。但是，有些婦女具有嚴(yán)重癥狀，包括:熱潮紅、嚴(yán)重出汗、焦慮、恐慌或抑郁、皮膚干燥和起皺、陰道干燥和不適、壓迫性尿失禁、膀胱炎、失眠、易怒(irritability )和骨質(zhì)疏松癥。世界衛(wèi)生組織在1990年公布的報(bào)告估計(jì)，全世界絕經(jīng)后婦女的總?cè)藬?shù)為4.76億。在2030年前，預(yù)測的人數(shù)將達(dá)到12億。
[0004]當(dāng)前的減輕絕經(jīng)期綜合征的治療是激素替代療法(HRT)，其由施用補(bǔ)充性的外源雌激素或雌激素加上孕酮組成，最經(jīng)常通過使用丸劑、皮下植入物或皮膚貼劑進(jìn)行。盡管HRT通過給絕經(jīng)婦女提供外源雌激素來增加循環(huán)雌激素水平，但是由于絕經(jīng)婦女之間的生理?xiàng)l件的個(gè)體差異，難以確定適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煶掷m(xù)時(shí)間。結(jié)果，HRT有時(shí)是無效的，且易于造成副作用，包括子宮內(nèi)膜瘤、？L腺和卵巢癌、冠心病和中風(fēng)。
[0005]骨質(zhì)疏松癥起因于增加的骨吸收速率和相對(duì)地降低的骨形成速率，導(dǎo)致減少的骨量和骨架的微結(jié)構(gòu)衰退，以及增加的骨折風(fēng)險(xiǎn)。骨改建在絕經(jīng)后歲月大幅增加，并在較老的骨質(zhì)疏松癥患者中保持升高，這表示在絕經(jīng)期中卵巢激素的喪失是骨質(zhì)疏松癥的主要危險(xiǎn)因素之一。這樣的骨狀態(tài)導(dǎo)致婦女中年齡相關(guān)的骨胳脆性增加。已經(jīng)證實(shí)，小梁骨礦物質(zhì)密度、小梁骨體積分?jǐn)?shù)、小梁厚度和小梁數(shù)目都隨著年齡增長而下降。并且，較低的骨量主要特征在于較小的板/桿比(plate-to-rod ratio )。所有這些變化減弱骨強(qiáng)度和增加骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006]承重鍛煉在絕經(jīng)后婦女中具有成骨作用。但是，在老年人中需要?jiǎng)×义憻拋懋a(chǎn)生成骨作用。已經(jīng)證實(shí)，HRT與承重鍛煉的聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)。這表明，施用的雌激素可以增強(qiáng)成骨應(yīng)答。
[0007]選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)是一種補(bǔ)救手段，尤其是用于減輕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。但是，沒有證據(jù)表明SERM會(huì)增加絕經(jīng)婦女的內(nèi)源雌激素水平，并因此可能不會(huì)減輕除了骨質(zhì)疏松癥以外的絕經(jīng)期綜合征。
[0008]多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，從不同種的山藥塊莖分離出的蛋白或其它化合物具有抗氧化活性、殼多糖酶活性和免疫調(diào)節(jié)活性，包括活化雌激素受體。[0009]渴望開發(fā)針對(duì)絕經(jīng)期綜合征癥狀的有成本效益的治療，以便減輕或預(yù)防由低血清雌激素水平和孕酮水平引起的骨質(zhì)疏松癥和/或認(rèn)知減退。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了源自山藥(薯葡，Dioscorea opposita)塊莖的新穎多肽。所述多肽增加循環(huán)雌激素水平、增量調(diào)節(jié)卵巢促卵泡激素受體(FSHR)的表達(dá)、升高卵巢芳香酶(卵巢CYP-19)，并表現(xiàn)出抗骨質(zhì)疏松活性。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了源自薯蕷根莖的分離的或基本上純的多肽，其中所述多肽具有約32.5 kDA的分子量(通過在SUPERDEX 75 10/300 GL柱上的色譜法確定)和 N 端序列 Gly—lie—Gly—Lys—lie—Thr—Thr—Tyr—Trp—Gly—Gin—Tyr—Ser—Asp—Glu—Pro-Ser-Leu-Thr-Glu-Ala (SEQ ID NO:l)0在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)將所述肽施用給雌性主
體時(shí)，血清雌激素和孕酮水平增加。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物用于在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的治療用途、用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受體(FSHR)的表達(dá)水平的治療用途，和用于治療絕經(jīng)期綜合征的治療用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]通過不同實(shí)施方案的附圖和下面給出的詳細(xì)描述解釋本發(fā)明。所述附圖不應(yīng)當(dāng)用于將本發(fā)明限定至具體實(shí)施方案，而是用于解釋和理解。詳細(xì)描述和附圖僅僅是本發(fā)明的示例，而不是限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書及其等同方案限定。附圖不是按比例繪制。通過結(jié)合附圖閱讀詳細(xì)描述會(huì)更容易地理解本發(fā)明的前述方面和其它伴隨的優(yōu) 點(diǎn)。
[0014]圖1是山藥薯蕷的照片。
[0015]圖2的色譜圖顯示了在HiPrep 16/10 DEAE FF柱上對(duì)薯蕷提取物的純化。
[0016]圖3的色譜圖顯示了在HiPrep 16/10 Phenyl FF (high sub)柱上對(duì)DO蛋白級(jí)分的進(jìn)一步純化。
[0017]圖4的色譜圖顯示了在Superdex 75 10/300 GL柱上對(duì)DO蛋白級(jí)分的純化。
[0018]圖5是DO提取物的15%非變性PAGE (左)和15% SDS PAGE (右)的照片，顯
示了通過銀染色顯影的從DO提取物回收的蛋白。
[0019]圖6A的色譜圖顯不了蛋白標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖藍(lán)和卵白蛋白在Superdex 75 10/300 GL柱上的洗脫。
[0020]圖6B的色譜圖顯示了蛋白標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白和抑肽酶在Superdex 75 10/300GL柱上的洗脫。
[0021]圖6C的色譜圖顯示了根據(jù)本發(fā)明的DO肽在Superdex 75 10/300 GL柱上的洗脫。
[0022]圖6D的圖表顯示了校正曲線，從該曲線確定DO肽的分子量。
[0023]圖7顯示了分離的DO蛋白的N端序列。
[0024]圖8的圖表顯示了根據(jù)本發(fā)明的DO蛋白對(duì)粒層細(xì)胞的雌激素活性；
圖9的圖表顯示了 NaOH處理過的DO肽對(duì)粒層細(xì)胞的雌激素活性。
[0025]圖10的圖表顯示了 HCl處理過的DO肽對(duì)粒層細(xì)胞的雌激素活性。
[0026]圖11的圖表顯示了熱處理過的DO肽對(duì)粒層細(xì)胞的雌激素活性。[0027]圖GA是用DO肽治療2周以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌二醇)水平的圖表。
[0028]圖1ZB是使用DO肽的4周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌
二醇)水平的圖表。
[0029]圖12C是使用DO肽的6周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌
二醇)水平的圖表。
[0030]圖12D是根據(jù)本發(fā)明使用DO肽的2周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的圖表。 [0031 ] 圖12E是使用DO肽的4周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的圖表。
[0032]圖12F是使用DO肽的6周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的圖表。
[0033]圖13的圖表顯示了粒層細(xì)胞中的卵巢CYP-19芳香酶的蛋白表達(dá)。
[0034]圖14的圖表顯示了粒層細(xì)胞中的FSHR的蛋白表達(dá)。
[0035]圖15的圖表顯示了用DO肽治療以后，得自大鼠的卵巢中的卵巢CYP-19芳香酶的mRNA表達(dá)。
[0036]圖16的圖表顯不了用DO治療以后，得自大鼠的卵巢中的FSHR的mRNA表達(dá)。
[0037]圖17的圖表顯示了用DO肽治療以后，得自大鼠的卵巢中的卵巢CYP-19芳香酶的蛋白表達(dá)水平。
[0038]圖18的圖表顯示了用DO肽治療以后，得自大鼠的卵巢中的FSHR的蛋白表達(dá)水平。
[0039]圖19的圖表顯示了 DO對(duì)BT-483乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。
[0040]圖20的圖表顯示了 DO對(duì)OVCA-429卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。
[0041]圖21的圖表顯示了用DO肽治療以后，大鼠的體重。
[0042]圖22的圖表顯示了用DO肽治療6周以后，大鼠的椎骨L2的表觀小梁骨礦物質(zhì)密度。
[0043]圖23的圖表顯示了用DO肽治療6周以后，大鼠的椎骨L2的骨體積分?jǐn)?shù)。
[0044]圖24是根據(jù)本發(fā)明使用DO肽的6周治療期以后，大鼠的椎骨L2的小梁數(shù)目的圖表；
圖25是使用DO肽的6周治療期以后，大鼠的椎骨L2的小梁厚度的圖表。
[0045]圖26是使用DO肽的6周治療期以后，大鼠的椎骨L2的結(jié)構(gòu)模型指數(shù)的圖表。
[0046]圖27是使用DO肽的6周治療期以后，大鼠的椎骨L2的小梁分離的圖表。
[0047]圖28是用DO肽治療以后，大鼠海馬中的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白的蛋白水平的圖表。
[0048]圖29的圖表顯示了用DO肽治療以后，大鼠前額皮質(zhì)中的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白的蛋白水平。
[0049]圖30的圖表顯示了用DO肽治療以后，大鼠前額皮質(zhì)中的TrkBgpl45受體蛋白
的蛋白水平。
[0050]圖31的圖表顯示了 DO肽對(duì)小鼠脾細(xì)胞的促有絲分裂活性的測定結(jié)果。[0051 ] 圖32是15% SDS PAGE的照片，顯示了通過銀染色顯影的通過抗體親和柱分離的DO蛋白。左泳道是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品，右泳道顯示了洗脫的被親和柱保留的DO蛋白。與分子量標(biāo)準(zhǔn)品的大小34kDA和26 kDA相比，洗脫的DO蛋白的大小為大約30 kDA。DO肽的表觀分子量與使用常規(guī)柱純化技術(shù)得到的值一致。
[0052]圖33顯示了DO蛋白對(duì)卵巢粒層細(xì)胞的雌激素活性。使用抗體親和柱，從薯蕷分離出DO蛋白。將結(jié)果表示為平均值± SEM,n=30 **通過不成對(duì)t-檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，
P < ().()1 ο
[0053]圖34顯示了 DO蛋白對(duì)乳腺中的芳香酶表達(dá)的影響。
[0054]序列簡述
S EQ ID ΝΟ:1是從山藥塊莖薯蕷純化的新穎蛋白(DO)的N端序列。
[0055]S EQ ID ΝΟ:2是根據(jù)本發(fā)明有用的引物序列。
[0056]S EQ ID ΝΟ:3是根據(jù)本發(fā)明有用的引物序列。
[0057]S EQ ID ΝΟ:4是根據(jù)本發(fā)明有用的引物序列。
[0058]S EQ ID ΝΟ:5是根據(jù)本發(fā)明有用的引物序列 詳細(xì)描述
在本說明書由始至終，相同的附圖標(biāo)記表示相同的要素。
[0059]本發(fā)明涉及分離自山藥塊莖薯蕷的新穎蛋白(DO蛋白或肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述純化的DO肽通過增量調(diào)節(jié)卵巢促卵泡激素受體(FSHR)和卵巢芳香酶(卵巢CYP-19)的表達(dá)而升高循環(huán)雌激素水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述DO肽減少或預(yù)防骨脫鈣和骨質(zhì)疏松癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述DO肽增加海馬中的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的水平，并增加前額皮質(zhì)中的BDNF和TrkB gpl45受體蛋白的水平。
[0060]蛋白
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的或基本上純的、具有約32.5 kDa的表觀分子量的多肽，其中在所述多肽N端處的前21個(gè)連續(xù)氨基酸由SEQ ID NO:1組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽源自薯葡屬種(Htwcorea sp.)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述多肽源自薯蕷。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有如表1所示的DO肽的特征。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮水平。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽增加卵巢組織和/或血液(例如血清、血漿、全血)中的雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽增加芳香酶和/或促卵泡激素受體(FSHR)的表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽增加芳香酶:GAPDH和/或FSHR:GAPDH的表達(dá)水平比率。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，與在pH O或在pH 2溫育以后相比，本發(fā)明的多肽在pH約I溫育以后具有更高的活性(諸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與在60°C或在100°C溫育以后相比，本發(fā)明的多肽在80°C溫育以后具有更高的活性(諸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。 [0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽在pHO溫育以后具有活性(諸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽在100°C溫育以后具有活性(諸如增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平)。[0065]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽不會(huì)增加乳腺癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽不會(huì)增加主體的體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽增加主體(包括具有低雌激素和/或孕酮水平的主體)中的骨礦物質(zhì)密度、骨體積分?jǐn)?shù)、小梁數(shù)目和/或小梁厚度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽降低主體(包括具有低雌激素和/或孕酮水平的主體)中的結(jié)構(gòu)模型指數(shù)和/或小梁分離。
[0066]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽增加主體(包括具有低雌激素和/或孕酮水平的主體)的腦中的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和/或TrkB gpl45受體的水平。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的或基本上純的、具有約32.5kDa的表觀分子量的多肽，其中所述多肽的N端序列與SEQ ID ΝΟ:1具有至少85%同一性，其中所述多肽在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有27kDa至34kDa的表觀分子量或二者之間的分子量，諸如28 kDa.29 kDa、30 kDa、31 kDa、31.5 kDa、32 kDa、32.5 kDa、33 kDa、33.5 kDa或 34 kDao
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的或基本上純的多肽，其中所述多肽與特定肽具有至少85%序列同一性，所述特定肽具有約32.5 kDa的表觀分子量，且所述特定肽的N端的前21個(gè)連續(xù)氨基酸由SEQ ID ΝΟ:1組成，其中所述多肽在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的或基本上純的多肽片段，其中所述多肽具有約32.5 kDa的表觀分子量，且所述多肽的N端的前21個(gè)連續(xù)氨基酸由SEQ ID ΝΟ:1組成，其中所述片段在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述片段與本 發(fā)明的多肽具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%序列同一性，且所述片段在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平。
[0071]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的蛋白和融合構(gòu)建體。
[0072]本發(fā)明的多肽可以是天然存在的，或者可以重組地生產(chǎn)。
[0073]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了得自薯蕷屬種(例如薯蕷)的分離的水性提取物，其中所述提取物包含本發(fā)明的多肽。
[0074]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的或基本上純的蛋白和多肽。本文中使用的術(shù)語“基本上純的”表示超過99%純。
[0075]本文中使用的“分離的”表示這樣的提取物和化合物(例如，蛋白和多肽):其已經(jīng)從它們?cè)谧匀唤缰锌赡艽嬖谟谄渲械娜魏苇h(huán)境中取出。例如，分離的提取物或化合物不表示這樣的化合物或提取物:存在于可以從其中分離出所述化合物的植物中的化合物或提取物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物和提取物是至少75%純，優(yōu)選至少90%純，更優(yōu)選地是超過95%純，且最優(yōu)選地超過99%純(基本上純的)。
[0076]絕經(jīng)期綜合征和其它疾病的治療
主題發(fā)明的另一個(gè)方面提供了所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物的下述治療用途:用于在體內(nèi)和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平，用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受體(FSHR)的表達(dá)水平，和用于治療絕經(jīng)期綜合征。
[0077]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加細(xì)胞中的雌性生殖激素(諸如雌二醇、雌激素和/或孕酮)的水平的方法，所述方法包括:給細(xì)胞施用有效量的包含本發(fā)明的多肽化合物或其鹽的組合物。
[0078]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是在需要增加雌性生殖激素(例如，雌二醇、雌激素和/或孕酮)的水平的主體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是卵巢細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，與具有正常生殖功能的正常雌性群體的水平相比，所述主體具有低血清雌性生殖激素(例如，雌二醇、雌激素和/或孕酮)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主體是女性人主體，且所述正常雌性群體由具有正常生殖功能的14-40歲的女性組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主體是處于絕經(jīng)期、圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后時(shí)期的女性。
[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明不會(huì)增加乳腺癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明不會(huì)增加主體的體重。
[0080]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于治療主體的骨質(zhì)疏松癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主體是這樣的雌性:其雌二醇、雌激素和/或孕酮水平低于具有生殖功能的正常雌性群體的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于改善主體的認(rèn)知功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主體是這樣的雌性:其雌二醇、雌激素和/或孕酮水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群體的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于增加主體腦中的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和/或TrkB gpl45受體的水平。
[0081 ]本文中使用的術(shù)語“主體”或“患者”描述了可以給其提供使用根據(jù)本發(fā)明的組合物的治療的生物體，包括哺乳動(dòng)物諸如靈長類動(dòng)物?？梢詮墓_的治療方法受益的生物體包括但不限于:猿、黑猩猩、猩猩、人類、猴；馴化的動(dòng)物諸如狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞；和其它動(dòng)物諸如小鼠、大鼠、豚鼠和倉鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主體或患者是雌性。
[0082]本文中使用的術(shù)語“治療(treatment )”或其任意語法變體(例如，treat、treating和treatment等)包括但不限于:改善或減輕疾病或病癥的癥狀，減輕、遏制、抑制、減少，或影響病癥的進(jìn)展、嚴(yán)重程度和/或范圍。
[0083]本文中使用的術(shù)語“有效量”表示這樣的量:其能夠治療或改善疾病或病癥，或者以其它方式能夠產(chǎn)生預(yù)期的治療效果。
[0084]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療骨質(zhì)疏松癥的方法，所述方法包括:將薯蕷植物根莖的水性提取物施用給患者，和由此刺激雌激素和孕酮分泌。
[0085]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療絕經(jīng)期綜合征的方法，所述方法包括:將薯蕷植物根莖的水性提取物施用給患者，和刺激雌激素和孕酮分泌。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患者的骨質(zhì)疏松癥的方法，所述方法包括:將薯蕷植物根莖的水性提取物施用給患者，和增量調(diào)節(jié)促卵泡激素受體和卵巢芳香酶CYP-19 O
[0087]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療絕經(jīng)期綜合征的方法，所述方法包括:將薯蕷植物根莖的水性提取物施用給患者，和響應(yīng)于所述治療而刺激雌激素和孕酮分泌。
[0088]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療具有低血清雌激素和孕酮水平的患者的認(rèn)知功能減退的方法，所述方法包括:將薯蕷植物根莖的水性提取物施用給患者，和由此升高血清雌激素和孕酮水平，并響應(yīng)于所述升高的血清雌激素和孕酮水平而提高認(rèn)知功能。[0089]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改進(jìn)患者的認(rèn)知功能的方法，所述方法包括:給所述患者施用薯蕷植物根莖的水性提取物，和響應(yīng)于所述提取物而升高患者腦部的海馬和皮質(zhì)中的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)。
[0090]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改進(jìn)患者的認(rèn)知功能的方法，所述方法包括:給所述患者施用薯蕷植物根莖的水性提取物，和響應(yīng)于所述提取物而升高患者腦部的前額皮質(zhì)中的TRKB受體。
[0091]從薯#揋取蛋白
將薯蕷的根莖102 (圖1)剝皮，并以1:2 (w/v)的比例在水性提取緩沖液(5%乙酸+0.1% β -琉基乙醇)中在4°C均質(zhì)化3小時(shí)。將勻漿物在17,700g在4°C離心30分鐘。收集上清液，并加入硫酸銨至80%飽和。將混合物在4°C攪拌過夜，并在17,700g在4°C離心I小時(shí)。收集上清液，并加入硫酸銨至80%飽和。將混合物在4°C攪拌過夜，并在17,700g在4°C離心I小時(shí)。保留沉淀物(蛋白提取物)，并再懸浮于凈化水中。將蛋白提取物混合物在重蒸溜H2O中透析過夜，然后在40,OOOg在4°C超速聞心2小時(shí)。收集上清液，并進(jìn)行快速蛋白液相色譜法(FPLC)。
[0092]梓絀化
將上述提取物的樣品調(diào)節(jié)至IOOmM Tris (pH 8.0)的終濃度，并應(yīng)用于HiPrep 16/10DEAE FF柱(GE Healthcare, Inc., Princeton, NJ)，并通過FPLC進(jìn)行色譜分離。洗脫緩沖液由緩沖液A和緩沖液B組成，所述緩沖液A為IOOmM Tris (pH 8.0)，緩沖液B為含有IMNaCl的100 niM Tris (pH 8.0)。使用O - 45%緩沖液B的梯度。洗脫曲線顯示為圖2中的色譜圖200。收集級(jí)分D3 (20 2)，并在重蒸餾H2O中透析過夜。
[0093]然后將級(jí)分D3 (202)調(diào)節(jié)至50%緩沖液B，并應(yīng)用于HiPrep 16/10 Phenyl FF (highsub)柱(GE Healthcare, Inc., Princeton, NJ)，并通過FPLC進(jìn)行色譜分聞。使用由 mill1-Q H2O和含有IM (NH4)2SO4的IOmM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)組成的洗脫緩沖液(緩沖液B( bufferB ))。用30 - 0%緩沖液B ( buffer B )的梯度，洗脫柱。洗脫曲線300顯示在圖3中。收集級(jí)分Pl (302)，并在重蒸餾H2O中透析過夜，然后凍干以得到粉末狀殘余物。
[0094]將得自302的凍干粉末溶解在含有I5O niM NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.2)中，應(yīng)用于 Superdex 75 10/300 GL 柱(GE Healthcare, Inc., Princeton, NJ)，并通過 FPLC 進(jìn)行色譜分離。以0.6 ml/min的流速，用50 mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.2)洗脫柱。色譜圖400顯示在圖4中。收集級(jí)分S2 (402)，并在重蒸餾H2O中透析過夜并凍干至干燥?；厥諆龈傻臍堄辔铮⒃?20°C儲(chǔ)存。該粉末狀殘余物被稱作DO肽，并將其進(jìn)一步表征以評(píng)價(jià)它的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。
[0095]對(duì)粉末狀殘余物DO的一部分進(jìn)行在15%非變性PAGE系統(tǒng)上和在15%十二烷基硫酸鈉(SDS) PAGE系統(tǒng)上的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，分別如圖5A和圖5B所示。發(fā)現(xiàn)DO肽在2個(gè)系統(tǒng)中作為單個(gè)帶502泳動(dòng)，從而指示DO殘余物是相對(duì)純的肽。將DO肽級(jí)分的泳動(dòng)與分子量標(biāo)準(zhǔn)品504 (其具有26 kDA的分子量)和506 (其具有34 kDA的分子量)的泳動(dòng)進(jìn)行對(duì)比。從其在SDS PAGE上的泳動(dòng)確定，發(fā)現(xiàn)DO肽的分子量為大約30kDA。
[0096]使用抑肽酶(6500 Da)、卵白蛋白(44287 Da)和牛血清白蛋白(66000 Da)作為校準(zhǔn)大小標(biāo)準(zhǔn)品，通過DO肽在Superdex 75 10/300柱上的保留時(shí)間，確定DO肽(級(jí)分S2)的
天然大小。在圖6A中顯示了色譜圖，其顯示了卵白蛋白602的洗脫時(shí)間以及由葡聚糖藍(lán)604指示的柱前(column front )洗脫體積。在圖6B中顯示了色譜圖，其顯示了牛血清白蛋白606和抑肽酶608的洗脫時(shí)間。通過將洗脫體積相對(duì)于3種標(biāo)準(zhǔn)品的分子量繪圖，構(gòu)建圖6D中顯示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，對(duì)純化的級(jí)分S2 (DO肽)610進(jìn)行色譜分離，并將色譜圖顯示在圖6C中。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的DO肽的大小為32.5 kDa。
[0097]表1顯示了 DO肽的分子量確定的總結(jié)，所述分子量從DO肽的色譜洗脫體積來確定。
[0098]表1 計(jì)算DO的分子量:
【權(quán)利要求】
1.在體外或在體內(nèi)增加雌激素水平的肽，其中該肽選自: `a)分離的或基本上純的可得自薯葡屬種{Dioscoreasp.)的多肽，其中通過色譜法確定，該多肽具有約32.5 kDA的表觀分子量，其中在該多肽N端處的首21個(gè)連續(xù)氨基酸由SEQ`ID NO:1 組成； ` b)所述多肽的片段，其中所述片段表現(xiàn)出增加雌激素的活性;和 `c)與所述多肽具有至少85%序列同一性的變體，其中所述變體表現(xiàn)出增加雌激素的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中該肽在體外或在體內(nèi)增加孕酮的水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其是分離的或基本上純的可得自薯蕷屬種的多肽，其中通過色譜法確定，該多肽具有約32.5 kDA的表觀分子量，且其中在該多肽N端處的首21個(gè)連續(xù)氨基酸由SEQ ID ΝΟ:1組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中該多肽源自薯葡{DiscoreaOpposita) Q
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其是重組地生產(chǎn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中與在pHO或在pH 2溫育以后相比，該肽在pH I溫育以后具有更高的活性，其中該活性是增加卵巢細(xì)胞中或雌性主體中的雌激素和/或孕酮的水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肽，其中該肽在pH O溫育以后具有活性，其中該活性是增加卵巢細(xì)胞中或雌性主體中的雌激素和/或孕酮的水平。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中與在60°C或在100°C溫育以后相比，該肽在80°C溫育以后具有更高的活性，其中該活性是增加卵巢細(xì)胞中或雌性主體中的雌激素和/或孕酮的水平。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肽，其中該肽在100°C溫育以后具有活性，其中該活性是增加卵巢細(xì)胞中或雌性主體中的雌激素和/或孕酮的水平。
10.一種抗體，其特異性地結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽。
11.一種用于增加雌性主體中的雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的方法，該方法包括:給雌性主體施用有效量的包含權(quán)利要求1的肽的組合物，該雌性主體的雌激素水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群體的雌激素水平。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該主體是處于絕經(jīng)期、圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后時(shí)期的人。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該主體的孕酮水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群體的孕酮水平。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該主體具有絕經(jīng)期綜合征。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該主體具有骨質(zhì)疏松癥，且該組合物的施用治療骨質(zhì)疏松癥。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該組合物是薯蕷的分離的水性提取物。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該組合物包含分離的或基本上純的可得自薯蕷屬種的多肽，其中通過色譜法確定，該多肽具有約32.5 kDA的表觀分子量，其中在該多肽N端處的首21個(gè)連續(xù)氨基酸由SEQ ID NO:1組成。
18.一種用于治療雌性主體的方法，該雌性主體具有與低雌激素水平有關(guān)的病癥，該方法包括:給雌性主體施用有效量的包含權(quán)利要求1的肽的組合物，該雌性主體的雌激素水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群體的雌激素水平，其中該施用會(huì)實(shí)現(xiàn)至少一種選自以下的治療效果: a)增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的血清水平； b)增加芳香酶CYP-19和/或促卵泡激素受體(FSHR)的表達(dá)水平； c)增加海馬和前額皮質(zhì)中的腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和/或TrkB受體的水平； d)治療骨質(zhì)疏松癥； e)提高認(rèn)知功能；和 f)刺激脾有絲分裂應(yīng)答。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中該主體是處于絕經(jīng)期、圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后時(shí)期的人。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中該主體具有絕經(jīng)期綜合征。
21.有效量的包含權(quán)利要求1的肽的組合物在制備藥物中的用途，該藥物用于增加雌性主體中的雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平，該雌性主體的雌激素水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群體的雌激素水平。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中該主體是處于絕經(jīng)期、圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后時(shí)期的人。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中該主體的孕酮水平低于具有正常生殖功能的正常雌性群體的孕酮水平。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中該主體具有絕經(jīng)期綜合征。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中該主體具有骨質(zhì)疏松癥，且該藥物治療骨質(zhì)疏松癥。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中該組合物是薯蕷的分離的水性提取物。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中該組合物包含分離的或基本上純的可得自薯蕷屬種的多肽，其中通過色譜法確定，該多肽具有約32.5 kDA的表觀分子量，其中在該多肽N端處的首21個(gè)連續(xù)氨基酸由SEQ ID NO:1組成。
28.有效量的包含權(quán)利要求1的肽的組合物在藥物制備中的用途，該藥物用于治療具有與低雌激素水平有關(guān)的病癥的雌性主體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中該主體是處于絕經(jīng)期、圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后時(shí)期的人。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中該主體具有絕經(jīng)期綜合征。
【文檔編號(hào)】A61P5/30GK103945854SQ201280039980
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月17日
【發(fā)明者】施祖榮, 黃金樂, 童瑤, 張艷波, 張浩斌 申請(qǐng)人:香港大學(xué)