包含Wnt誘因受體的抗癌組合物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及包含將Wnt誘因受體作為有效成分的癌癥的預防或治療用組合物。本發(fā)明的癌癥的預防或治療用組合物或其表達產(chǎn)物與Wn?t配體相結(jié)合，來阻斷配體-受體相互作用，從而抑制癌癥的發(fā)生、生長、增殖及轉(zhuǎn)移，并誘導癌細胞的凋亡，來有用地用作有效的抗癌組合物?！緦＠f明】包含Wnt誘因受體的抗癌組合物【
技術(shù)領域：
】[0001]本發(fā)明涉及利用Wnt誘因受體來抑制參與腫瘤進展的Wnt信號傳導的活化的抗癌組合物?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]肺癌為預后不好且在全世界成為癌-相關(guān)死亡的最普遍的原因的癌癥。據(jù)2009年美國癌癥協(xié)會(AmericanCancerSociety)統(tǒng)計,在美國發(fā)病的新肺癌患者的數(shù)量為219440名。雖然外科手術(shù)及放射線治療等標準治療法在大部分情況下無效(1)，但隨著對肺癌的分子水平機制的理解有所提高，正在開發(fā)嶄新而有希望的新治療法(2)。隨著化學治療法的發(fā)達，雖然增加了侵襲性非小細胞肺癌患者的生存率，但對化學療法的耐藥性(chemoresistance)成為治療失敗的主要原因(3)。表皮生長因子受體(EGFR,epithelialgrowthfactorreceptor)中的突變活化成為肺腺癌(lungadenocarcinomas)的原因之一，并且向這些腫瘤賦予對作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑的吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)的強的抵抗性(4、5)。很多侵襲性肺癌通過在包含Wnt、K_ras、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK,extracellularsignal-regulatedkinase)、Akt及環(huán)氧化酶_2的多種癌-相關(guān)基因中發(fā)生變形，來給出了多種不同的分子機制作用于肺腺癌中的癌癥產(chǎn)生的啟示(6~8)。[0003]自從20多年前，隨著發(fā)現(xiàn)Wnt-1作為小鼠哺乳類腫瘤病毒的整合位點(integrationsite),首次報告了癌中的Wnt信號傳導的作用(9)。據(jù)很多研究報告，Wnt配體、受體及胞外拮抗劑的表達變化與癌癥的發(fā)端/進行以及干細胞的自我更新/分化相關(guān)(10)。雖然Wnt配體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5,low-densitylipoproteinreceptorrelatedprotein5)以及LRP6的表達在肺癌中增加,但像抑制Wnt配體來阻斷與受體的相互作用的Wnt拮抗劑[例如，WIF-1(Wnt抑制因子(inhibitoryfactor)-1)]>分泌型卷曲相關(guān)蛋白(sFRP,secretedFrizzled-relatedproteins)以及DKK(dickkopf蛋白(proteins),表達會減少或者處于非活化的狀態(tài)(11、12)。因此,對Wnt的單克隆抗體以及siRNA和Wnt拮抗劑的超表達在多種體外及體內(nèi)腫瘤模型中減少腫瘤的生長。[0004]引起作為核心效應分子的連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化以及向核的轉(zhuǎn)移的常規(guī)的fct信號傳導機制的活化需要屬于LRP超家族(superfamily)的LRP6(13)。為了與Wnt相結(jié)合，需要由4個個別的YWTDi1-螺旋槳/EGF-樣結(jié)構(gòu)域形成，且將第一域及第二域(El及E2)配對的LRP6(14-16)。本發(fā)明人對作為由LRP6的El及E2位點構(gòu)成的新的水溶性Wnt受體的SLRP6E1E2的治療有用性進行了研究。本發(fā)明人對與胞外fct配體相結(jié)合，且切斷配體-受體相互作用的SLRP6E1E2的生物學效果進行了調(diào)查。其結(jié)果，獲得了特定fct配體/受體相互作用可具有作為抗癌治療劑的潛在用途的直接證據(jù)。[0005]在本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。引用的論文及專利文獻的所有公開內(nèi)容作為參照插入于本說明書中，從而更加明確地說明本發(fā)明所屬【
技術(shù)領域：
】的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。【
發(fā)明內(nèi)容】[0006]要解決的問題[0007]本發(fā)明人為了通過有效地抑制腫瘤的發(fā)生及生長來開發(fā)抗腫瘤活性最大化的基因抗癌治療組合物而銳意研究努力。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了作為新的水溶性fct受體的SLRP6E1E2通過與Wnt3a蛋白質(zhì)的結(jié)合來抑制癌中的Wnt信號傳導機制，從而抑制癌細胞的生長、增殖及轉(zhuǎn)移，并誘導癌細胞的凋亡的事實，從而完成了本發(fā)明。[0008]因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種癌癥預防或治療用組合物。[0009]本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種癌癥預防或治療方法。[0010]通過以下發(fā)明的詳細說明、發(fā)明要求保護范圍以及附圖，來使本發(fā)明的其他目的以及優(yōu)點更加明確。[0011]解決問題的手段[0012]根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供一種癌癥預防或治療用組合物，上述組合物包含具有序列表中序列2的氨基酸序列的多肽作為有效成分。[0013]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，本發(fā)明提供一種癌癥預防或治療方法，該方法包括以下步驟:將包含具有序列表中序列2的氨基酸序列的多肽的藥劑學有效量的組合物給藥到對象(subject)。[0014]本發(fā)明人為了通過有效地抑制腫瘤的發(fā)生及生長來開發(fā)抗腫瘤活性最大化的基因抗癌治療組合物而銳意研究努力。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了作為新的水溶性fct受體的SLRP6E1E2通過與Wnt3a蛋白質(zhì)的結(jié)合抑制癌中的Wnt傳遞信號傳導機制，來抑制癌細胞的生長、增殖及轉(zhuǎn)移，并誘導癌細胞的凋亡的事實。[0015]在本說明書中，術(shù)語“多肽”意味著通過肽結(jié)合，由氨基酸殘基相互結(jié)合而成的線性的分子。序列表中序列2的氨基酸序列為作為由LRP6的El及E2位點構(gòu)成的新的水溶性Wnt受體的SLRP6E1E2的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，SLRP6E1E2與Wnt配體相結(jié)合來阻斷配體-受體相互作用，由此抑制對癌的發(fā)生、生長、增殖及轉(zhuǎn)移起到重要的作用的fct信號傳導的活化。[0016]更詳細地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的水溶性Wnt受體減少細胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白水平及T細胞因子(TCF，T-cellFactor)轉(zhuǎn)錄活性，抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞的細胞凋亡，抑制腫瘤的生長，減少在血管生成、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中起到重要的作用的MMP-2及MMP-9的表達量，并減少腫瘤細胞的滲透性。因此，本發(fā)明的組合物可用作有效地抑制癌變的有效的抗癌組合物。[0017]將本發(fā)明的SLRP6E1E2解釋為也包含相對于序列表中序列2的氨基酸序列表示實質(zhì)同一'丨生(substantialidentity)的氨基酸序列。上述實質(zhì)同一'丨生意味著，在以最大限度地使本發(fā)明的上述氨基酸序列與任意其他序列相對應的方式排比，并利用該領域中的常用的算法來分析已排比的序列的情況下，表示最小80%的同源性、更優(yōu)選地表示最小90%的同源性、最優(yōu)選地表示最小95%的同源性的氨基酸序列。[0018]并且，本發(fā)明中所利用的SLRP6E1E2除了具有其天然型氨基酸序列的蛋白質(zhì)之外，其氨基酸序列突變體還包含在本發(fā)明的范圍。SLRP6E1E2蛋白質(zhì)的突變體意味著，SLRP6E1E2蛋白質(zhì)的天然氨基酸序列與一個以上的氨基酸殘基通過缺失、插入、非保守性置換或保守性置換或它們的組合具有不同的序列的蛋白質(zhì)。不使分子的活性整體上變更的蛋白質(zhì)以及肽中的氨基酸交換公知在該領域(H.Neurath,R.L.Hill,TheProteins,AcademicPress,NewYork,1979)。最普遍發(fā)生的交換為氨基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly之間的交換。[0019]根據(jù)情況，SLRP6E1E2蛋白質(zhì)也可以由磷酸化(phosphorylation)、硫化(sulfation)、丙烯酸酯化(aeryIation)、糖基化(glycosyIation)、甲基化(methylation)或法尼基化(farnesylation)等修飾(modification)。[0020]上述SLRP6E1E2蛋白質(zhì)或其突變體可從天然中提取或合成(Merrifleld,J.Amer.chem.Soc..85:2149-2156，1963)，或者可通過基于DNA序列的重組方法來制成(Sambrook,J.etal.,MolecularCloning.ALaboratoryManual,3rded.ColdSpringHarborPress(2001))。[0021]根據(jù)本發(fā)明的其他實施方式，本發(fā)明提供一種癌癥預防或治療用組合物，上述組合物包含對序列表中序列2的氨基酸序列進行編碼的核苷酸序列作為有效成分。[0022]根據(jù)本發(fā)明的其他實施方式，本發(fā)明提供一種癌癥預防或治療方法，上述方法包括以下步驟:將包含對序列表中序列2的氨基酸序列進行編碼的核苷酸序列的藥劑學有效量的組合物給藥到對象(subject)。[0023]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施例，本發(fā)明的核苷酸序列具有序列表中序列I的核苷酸序列。[0024]根據(jù)本發(fā)明，序列表中序列I的核苷酸序列為由LRP6的El及E2胞外域(Wnt結(jié)合位點)形成的SLRP6E1E2的核苷酸序列。[0025]對于該領域普通技術(shù)人員來說明確的是，本發(fā)明中所利用的核苷酸序列不限定于在所附的序列目錄中記載的核苷酸序列。[0026]核苷酸中的變異也有在蛋白質(zhì)不發(fā)生變化的。這種核酸從功能上包含核酸分子，上述核酸分子包含功能上均等的密碼子或者對相同的氨基酸進行編碼的密碼子(例如，由于密碼子的簡并性，對精氨酸或絲氨酸的密碼子為6個)，或者對生物學均等的氨基酸進行編碼的密碼子。[0027]若考慮上述具有生物學均等活性的變異，則將本發(fā)明中所利用的核酸分子解釋為也包含與記載于序列目錄的序列表示實質(zhì)同一'丨生(substantialidentity)的序列。上述實質(zhì)同一性意味著，在以最大限度地使本發(fā)明的上述序列與任意其他序列相對應的方式排t匕，并利用該領域中的常用的算法來分析已排比的序列的情況下，表示最小60%的同源性、更優(yōu)選地表示70%的同源性、尤其優(yōu)選地表示80%的同源性、最優(yōu)選地表示90%的同源性的序列。[0028]用于序列比較的排比方法公知在該領域中。對排比的多種方法及算法公開在SmithandWaterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needlemanandffunsch,J.Mol.Bi0.48:443(1970)；PearsonandLipman,MethodsinMol.Biol.24:307-31(1988);HigginsandSharp,Gene73:237-44(1988)；HigginsandSharp,CAB10S5:151-3(1989)；Corpetetal.,Nuc.AcidsRes.16:10881-90(1988)；Huangetal.,Comp.Appl.BioSc1.8:155-65(1992)andPearsonetal.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。NCBIBasicLocalAlignmentSearchTooI(BLAST)(Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403-10(1990))可從美國國立生物信息中心(NBCI，NationalCenterforBiologicalInformation)等接近，可在互聯(lián)網(wǎng)上與blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx等序列分析程序聯(lián)動地利用?？稍趆ttp://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/中連接到BLSAT。利用上述程序的序列同源性比較方法可在http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/blast—help,html中確認。[0029]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施例，本發(fā)明的核苷酸序列包含在基因遞送體(genedeliverysystem)。[0030]在本說明書中，術(shù)語“基因遞送體”包含為了將外源基因送遞到宿主細胞等，從而利用宿主細胞的基因表達系統(tǒng)來使最終送遞的基因表達而使用的所有介質(zhì)。[0031]根據(jù)本發(fā)明的更加優(yōu)選的實施例，本發(fā)明的基因遞送體為質(zhì)粒、重組腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV，Adeno-associatedviruses)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、單純皰疫病毒、麻疫病毒、痘病毒、塞姆利基森林病毒、痘苗病毒、聚合物、納米物質(zhì)、脂質(zhì)體或類脂質(zhì)體。[0032]本發(fā)明中要傳遞的核苷酸序列可適用于用在普通的基因治療的所有基因遞送體，優(yōu)選地，可適用于質(zhì)粒、腺病毒(LockettLJ,etal.，Clin.CancerRes.3:2075-2080(1997))、腺相關(guān)病毒(LashfordLS.,etal.,GeneTherapyTechnologies,ApplicationsandRegulationsEd.A.Meager(1999))、逆轉(zhuǎn)錄病毒(GunzburgWHetal.,GeneTherapyTechnologies,ApplicationsandRegulationsEd.A.Meager,(1999))、慢病毒(WangG.etal.，J.Clin.1nvest.104(11):R55_62(1999))、單純痕疫病毒(ChamberR.，etal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA92:1411-1415(1995))、痘苗病毒(PuhlmannM.etal.,HumanGeneTherapylO:649-657(1999))、痘病毒(GCE，NJL，KrupaM，EstebanΜ.,ThepoxvirusvectorsMVAandNYVACasgenedeliverysystemsforvaccinationagainstinfectiousdiseasesandcancerCurrGeneTher8(2):97-120(2008))、呼腸孤病毒、麻疫病毒、塞姆利基森林病毒、聚合物(Hwangetal.，InvitroandInvivoTransfectionEfficiencyofHumanOsteoprotegerinGeneusingNon-ViralPolymerCarriers.,KoreanJ.BoneMetab.13(2):119-128(2006))、脂質(zhì)體(MethodsinMolecularBiology,Voll99,S.C.BasuandM.Basu(Eds.),HumanPress2002)、納米物質(zhì)或類脂質(zhì)體。最優(yōu)選地，本發(fā)明的基因遞送體適用于重組腺病毒而制成。[0033]1.腺病毒[0034]腺病毒因借助中間程度的基因組大小、操作的便利性、高的滴度、廣泛的靶細胞以及優(yōu)秀的感染性而多用作基因遞送載體?；蚪M的兩個末端包含100~200bp的反向終端重復序列(ITR，invertedterminalrepeat)，這是DNA復制以及包裝必不可少的順式元件?；蚪M的El區(qū)域(ElA及ElB)對調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄及宿主細胞基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)進行編碼。E2區(qū)域(E2A及E2B)對參與病毒DNA復制的蛋白質(zhì)進行編碼。在當前已開發(fā)的腺病毒載體中，多使用缺少El區(qū)域的不能復制的腺病毒。另一方面，E3區(qū)域提供從普通的腺病毒載體去除而使外源基因插入的位置(Thimmappaya，B.etal.，Cell,31:543-551(1982);以及RiordanjJ.R.etal.，Science，245:1066-1073(1989))。因此，本發(fā)明的核苷酸序列可插入于ElA基因的啟動子序列位置，用于調(diào)節(jié)ElA基因的表達。在本說明書中，與病毒基因組序列相關(guān)而使用的術(shù)語“缺失”意味著不僅包含相應序列完全缺失的，還包含部分缺失的。[0035]優(yōu)選地，本發(fā)明的重組腺病毒載體為ElB及E3區(qū)域缺失的，本發(fā)明的序列表中序列I的核苷酸序列插入于ElB或E3區(qū)域。[0036]并且，由于腺病毒可包裝至野生型基因組的約105%，因而還可以追加地包裝約2kb(Ghosh-Choudhuryetal.,EMBOJ.，6:1733-1739(1987))。因此，也可以使插入于腺病毒的上述外源序列追加地與腺病毒的基因組相結(jié)合。[0037]由腺病毒送遞的外源基因以與附加體相同的方式被復制，由此，對宿主細胞的基因毒性非常低。因此，判斷為利用本發(fā)明的腺病毒基因送遞系統(tǒng)的基因治療會非常安全。[0038]ii.逆轉(zhuǎn)錄病毒[0039]由于逆轉(zhuǎn)錄病毒可使其本身的基因插入于宿主的基因組，可送遞大量的外源基因物質(zhì)，且可感染細胞的光譜寬，因而多用作基因遞送載體。[0040]為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，要送遞的目標核苷酸序列插入于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組來替代逆轉(zhuǎn)錄病毒的序列，從而生產(chǎn)不能復制的病毒。雖然為了生產(chǎn)病毒體，包含gag、pol及env基因，但構(gòu)建沒有長末端重復序列(LTR,longterminalrepeat)和Ψ序列的包裝細胞株(Mannetal.,Cell,33:153-159(1983))。若將包含要送遞的目標核苷酸序列、LTR及Ψ序列的重組質(zhì)粒引入上述細胞株，則Ψ序列可生產(chǎn)重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄體，上述轉(zhuǎn)錄體由病毒包裝，病毒向培養(yǎng)基排出(NicolasandRubinstein“Retroviralvectors,，，In:Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,RodriguezandDenhardt(eds.),Stoneham:Butterworth,494-513(1988))0收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基并進行濃縮，來用作基因送遞系統(tǒng)。[0041]發(fā)表了利用第二代逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因送遞。Kasaharaal.Science,266:1373-1376(1994))制備了莫洛尼鼠白血病病毒的突變體，在這里，將促紅細胞生成素(ΕΡ0,erythropoietin)序列插入于包膜位點,來生產(chǎn)了具有新的結(jié)合特性的嵌合蛋白。本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)也可以通過這種第二代逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建戰(zhàn)略來制成。[0042]ii1.AAV載體[0043]由于腺相關(guān)病毒(AAV)具有可感染非分裂細胞并被多種細胞感染的能力，因而適合作為本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)。對AAV載體的制備及用途的詳細說明詳細公開在美國專利第5139941號及第4797368號。對作為基因送遞系統(tǒng)的AAV的研究公開在LaFaceetal,Viology,162:483486(1988),Zhouetal.,Exp.Hematol.(NY)，21:928-933(1993),Walshetal,J.Clin.1nvest.,94:1440-1448(1994)以及Flotteetal.,GeneTherapy,2:29-37(1995)。最近，AAV載體作為囊性纖維化的治療劑實施了臨床I。[0044]典型地，AAV病毒使包含旁邊有兩個AAV末端重復序列的目標基因序列(包含松弛素基因及要送遞的目標核苷酸序列的質(zhì)粒(McLaughlinetal.，J.Virol.，62:1963-1973(1988);以及Samulskietal.，J.Virol.，63:3822-3828(1989))以及包含沒有末端重復序列的野生型AAV編碼序列的表達質(zhì)粒(McCartyetal.,J.Virol.,65:2936-2945(1991))同時轉(zhuǎn)化而制成。[0045]iv.其他病毒載體[0046]其他病毒載體也可用作本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)。來源于痘苗病毒(PuhlmannM.etal.,HumanGeneTherapylO:649-657(1999);Ridgeway,“Mammalianexpressionvectors,，，In:Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses.RodriguezandDenhardtjeds.Stoneham:Butterworthj467-492(1988)；BaichwalandSugdenj“VectorsforgenetransferderivedfromanimalDNAviruses:Transientandstableexpressionoftransferredgenes,”In:KucherlapatiR，ed.Genetransfer.NewYork:PlenumPress,117-148(1986)以及Couparetal.，Gene，68:1-10(1988))、慢病毒(WangG.etal.,J.Clin.1nvest.104(11):R55_62(1999))或單純皰疫病毒(ChamberR.，etal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA92:1411-1415(1995))、痘病毒(GCE,NJLjKrupaM，EstebanM.,ThepoxvirusvectorsMVAandNYVACasgenedeliverysystemsforvaccinationagainstinfectiousdiseasesandcancerCurrGeneTher8(2):97-120(2008)、呼腸孤病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒的載體也能夠用作可將目標核苷酸序列送遞至細胞內(nèi)的送遞系統(tǒng)。[0047]V.聚合物[0048]作為廣泛地用作非病毒性基因遞送體的聚合物類送遞體，利用聚乙二醇(PEG，polyethyleneglycol)、聚醚酰亞胺(PEI，Polyetherimide)、多聚-L-賴氨酸(PLL，poly-LLysine)、明膠、殼聚糖(CarrenoGBjDuncanR.Evaluationofthebiologicalpropertiesofsolublechitosanandchitosanmicrospheres.1ntJPharml48:231-240(1997))多聚-L-賴氨酸(PLL，poly-LLysine)(MaruyamaA,IshiharaT，KimJS，KimSWjAkaikeT.NanoparticleDNAcarrierwithpoly(L-lysine)graftedpolysaccharidecopolymerandpoly(D，Llactide).BioconjugateChem8:735-742(1997))以及PEI(polyethyleneamine)(AbdallahB，HassanA,BenoistC，GoulaD，BehrJPjDemeneixBA.Apowerfulnonviralvectorforinvivogenetransferintotheadultmammalianbrain:Polyethyleneimine.HumanGeneTher7:1947-1954(1996))等。聚合物類基因遞送體的優(yōu)點在于，免疫反應和急性毒性的表達率低、制備方法簡單、且可進行大量生產(chǎn)。[0049]Vi.脂質(zhì)體及類脂質(zhì)體[0050]脂質(zhì)體由分散于水相的磷脂自動形成。用脂質(zhì)體將外源DNA分子成功地送遞至細胞內(nèi)的例子公開在Nicolau及Sene、Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)以及Nicolauetal.,MethodsEnzymol.，149:157-176(1987)。另一方面，最多用于利用脂質(zhì)體的動物細胞的轉(zhuǎn)化的試劑有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine)(玉博BRL公司，GibcoBRD0內(nèi)含要送遞的目標核苷酸序列的脂質(zhì)體通過內(nèi)吞作用、向細胞表面的吸附或與漿細胞膜的融合等機制，與細胞相互作用，從而向細胞內(nèi)送遞要送遞的目標核苷酸序列。[0051]脂質(zhì)體利用磷脂來制成，相反，類脂質(zhì)體(niosome)可用由非離子性表面活性劑(non-1onicsurfactant)及膽固醇(cholesterol)混合而成的雙膜轉(zhuǎn)運體來封入極性物質(zhì)及非極性物質(zhì)，并在滲透壓方面有活性，具有相比于作為基于磷脂等的脂質(zhì)微粒的送遞體的脂質(zhì)體穩(wěn)定，且具有制備時所使用的表面活性劑在保管和處理時不需要特別的條件的優(yōu)點。[0052]另一方面，將上述本發(fā)明的基因送遞系統(tǒng)導入細胞內(nèi)的方法可通過向該領域公知的多種方法來實施。[0053]在本發(fā)明中，基因送遞系統(tǒng)基于病毒載體制成的情況下，根據(jù)該領域公知的病毒感染方法來實施。利用病毒載體的宿主細胞的感染記載在上述對比文件。[0054]在本發(fā)明中，基因送遞系統(tǒng)為裸(naked)重組DNA分子或質(zhì)粒的情況下，可通過微注射法(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980)；以及Harland和ffeintraub,J.CellBiol.101:1094-1099(1985))、磷酸鈣沉淀法(Graham,F.L.etal.,Virology,52:456(1973)；以及Chen和Okayama,Mol.Cell.Biol.7:2745-2752(1987))、電穿孔法(Neumann,E.etal.,EMBOJ.，1:841(1982);以及Tur-Kaspaetal.,Mol.CellBiol.,6:716-718(1986))、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染法(Wong,T.K.etal.,Gene,10:87(1980)；Nicolau以及Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)；以及Nicolauetal.,MethodsEnzymol.,149:157-176(1987))、DEAE-葡聚糖處理法(Gopal,Mol.CellBiol.,5:1188-1190(1985))以及基因轟擊(Yangetal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.，87:9568-9572(1990))方法來將基因移入細胞內(nèi)。[0055]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施例，本發(fā)明的組合物抑制癌細胞中的Wnt信號傳導機制的活化。[0056]更優(yōu)選地，就本發(fā)明的組合物而言，具有序列表中序列2的氨基酸序列的多肽與fct3a蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而抑制癌細胞中的Wnt信號傳導機制的活化。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在SLRP6E1E2-轉(zhuǎn)導細胞中，相比于對照組，Wnt3a及LPR6蛋白質(zhì)的水平低，這意味著SLRP6E1E2的LPR6E1-E2域有效地與Wnt3a相結(jié)合，其結(jié)果，抑制了參與腫瘤進展的Wnt信號傳導。[0057]如上所述，本發(fā)明的組合物表現(xiàn)癌細胞的生長以及增殖抑制或者癌細胞的殺傷功效，因而本發(fā)明的藥劑學組合物可用于治療與腫瘤相關(guān)的多種疾病或者疾患，例如可用于胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、腦癌、前列腺癌、肉瘤(sarcoma)、支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌及宮頸癌等。優(yōu)選地，用本發(fā)明的組合物治療的癌癥為肺癌。[0058]在本說明書中，術(shù)語“治療”意味著(i)腫瘤細胞形成的預防；[0059](ii)與去除腫瘤細胞而引起的腫瘤相關(guān)的疾病或疾患的抑制；以及[0060](iii)與去除腫瘤細胞而引起的腫瘤相關(guān)的疾病或疾患的減輕。[0061]包含在本發(fā)明的組合物的藥劑學上接受的載體是在制劑時通常所利用的，其包含乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露糖醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯膠(acaciagum)、磷酸|丐(calciumphosphate)、藻酸鹽(alginate)、明膠(gelatin)、娃酸鈣(calciumsilicate)、微晶纖維素(microcrystalIinecellulose)、二甲基亞諷(DMS0,Dimethylsulfoxide)、聚乙烯批咯燒酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖衆(zhòng)(syrup)、甲基纖維素(methylcellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、羥基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸續(xù)(magnesiumstearate)及礦物油(mineraloil)等，但并不局限于此。本發(fā)明的藥劑學組合物除了上述成分之外，還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。[0062]本發(fā)明的藥劑學組合物優(yōu)選為非口服給藥，例如，可利用靜脈內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥或局部給藥來進行給藥。像卵巢癌，向腹腔內(nèi)給藥的情況以及像肝癌，向門靜脈給藥的情況下，可利用注入方法來進行給藥，像乳腺癌，可直接向腫塊注射來進行給藥，像結(jié)腸癌，可直接向灌腸注射來進行給藥，像膀胱癌，可直接向?qū)Ч軆?nèi)注射來進行給藥。[0063]本發(fā)明的藥劑學組合物的適合的給藥量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、疾病癥狀的程度、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速度以及反應靈敏性等因素而多樣，一般來講，熟練的醫(yī)生可以根據(jù)治療的目標而容易地決定和處方有效的給藥量。一般情況下，本發(fā)明的藥劑學組合物包含IXio5-lX1015pfu/ml的重組腺病毒，通常，以每兩天注射一次的方式，將IXIO10Pfu注射2周。[0064]本發(fā)明的藥劑學組合物可根據(jù)本發(fā)明所屬【
技術(shù)領域：
】的普通技術(shù)人員容易實施的方法，利用藥劑學上接受的載體和/或賦形劑來進行制劑化，由此制備成單位容量形態(tài)，或者裝入至大容量容器內(nèi)而制成。此時，劑型可以為油性或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或者也可以為浸膏劑、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，并且還可以追加地包含分散劑或穩(wěn)定劑。[0065]本發(fā)明的藥劑學組合物能夠以單獨的療法被利用，但也可以與其他常規(guī)的化學療法、細胞治療劑或放射療法一起被利用，實施這種并行療法的情況下，可以更加有效地治療癌癥。與本發(fā)明的組合物一起被利用的化療藥物包含順鉬(cisplatin)、卡鉬(carboplatin)、甲基節(jié)餅(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、二硫燒(bisulfan)、亞硝基脲(nitrosourea)、更生霉素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博來霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、三苯氧胺(tamoxifen)、紫杉酹(taxol)、反鉬(transplatinum)、5_氟尿嘧唳(5_fIuorouracil)、長春新喊(vincristin)、長春喊(vinblastin)以及氨甲蝶呤(methotrexate)等?？膳c本發(fā)明的組合物一起被利用的放射療法為X射線照射及Y射線照射等?？膳c本發(fā)明的組合物一起被利用的細胞治療法為樹突狀細胞(dendriticcells)、自然殺傷(NK，NaturalKiller)細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL,TumorInfiltratingLymphocytes)以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL,CytotoxicTLymphocytes)等。[0066]發(fā)明的效果`[0067]歸納本發(fā)明的特征以及優(yōu)點如下:[0068](a)本發(fā)明提供一種癌癥的預防或治療用組合物，上述組合物包含Wnt誘因受體作為有效成分。[0069](b)本發(fā)明的組合物或其表達產(chǎn)物與Wnt配體相結(jié)合，來阻斷配體-受體相互作用，從而可抑制癌癥的發(fā)生、生長、增殖及轉(zhuǎn)移，并誘導癌細胞的凋亡，從而有用地用作有效的抗癌組合物?！緦＠綀D】【附圖說明】[0070]圖1為表示誘因Wnt受體SLRP6E1E2的特性的圖。圖1a為表示本發(fā)明中所使用的腺病毒載體的基因結(jié)構(gòu)的模式圖的圖。圖1b為在一些人類肺癌細胞株中表示W(wǎng)nt3a的內(nèi)在的表達形態(tài)的圖。圖1c為表示SLRP6E1E2的表達及分泌的圖。利用FLAG-或LRP6-特異性抗體來調(diào)查了細胞培養(yǎng)液的上清液。圖1d為表示用dEl-k35/LacZ或dEl-k35/sLRP6ElE2(50M0I)將H322及H460細胞轉(zhuǎn)化48小時，并用細胞破碎物對Wnt3a(IP:Wnt3a)或LRP6(IP:LRP6)的抗血清免疫沉淀之后，用相同的抗體執(zhí)行免疫印跡法的結(jié)果的圖。[0071]圖2為表示誘因Wnt受體SLRP6E1E2使細胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白及T-細胞因子轉(zhuǎn)錄活性減少的圖。圖2a為表示A549細胞中的TCF/LEF螢光素酶報告基因分析結(jié)果的圖(與dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)化或PBS-處理細胞比較時，P<0.05)。圖2b為表示H460及H322細胞中的TCF/LEF螢光素酶報告基因分析結(jié)果的圖(與處理或未處理Wnt3a的PBS-處理或者dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)化細胞比較時，P<0.05)。圖2c為表示用dEl_k35/LacZ或dEl_k35/SLRP6E1E2(50M0I)將處理或未處理Wnt3a的H322細胞轉(zhuǎn)化，并用抗-β-連環(huán)蛋白標記之后觀察的結(jié)果的圖(倍率X630)。[0072]圖3為表示誘因Wnt受體SLRP6E1E2抑制人類肺癌細胞的增殖的圖。用dEl_k35/LacZ或dEl-k35/sLRP6ElE2(20M0I)將A549及H322細胞轉(zhuǎn)化，次日在這些Wnt3a(IOOng/ml)的存在或不存在的條件下進行了培養(yǎng)。3天后，利用MTT分析測定了細胞增殖(平均土標準誤差)(圖3a)*P<0.05，#P<0.01各組的無處理對照組，**P<0.001dEl_k35/LacZ-轉(zhuǎn)化或PBS-處理細胞，n.s.=無顯著性(notsignificant)。如圖3a所示地處理了A549細胞，并利用對DV12、Axin、CyclinDl或GSK-3特異性的抗體來進行了免疫印跡法(圖3b)。如圖3a所示地處理了H460細胞(50M0I)，并進行了對MEK、ERK、Survivin、mTOR、PI3K及Akt的免疫印跡法。[0073]圖4為表示誘因Wnt受體SLRP6E1E2誘導人類肺癌細胞的細胞凋亡(apoptosis)的圖。用dEl-k35/LacZ或dEl-k35/sLRP6ElE2將細胞轉(zhuǎn)化(20M0I)，并在72小時之后，拍照(倍率X200)(圖4a)。并且，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL,terminaldexynucIeotidyltransferase(TdT)-mediateddUTPnickendlabeling)染色來檢測了SLRP6E1E2-誘導細胞凋亡(倍率X400)(圖4b)。圖4c為分別表示每個域的TUNEL-陽性細胞的整個數(shù)字的圖(平均土標準誤差)。*在P<0.05Wnt3a條件下，處理PBS或dEl-k35/LacZ，#P<0.001PBS-處理或dEl_k35/LacZ-轉(zhuǎn)化對照組，n.s.=無顯著性。圖4d為表示利用免疫印跡法來分析SLRP6E1E2-介導的細胞凋亡的結(jié)果的圖。用dEl_k35/LacZ或dEl-k35/sLRP6ElE2(20M0I)將H460細胞轉(zhuǎn)化，并利用非切割(uncleaved)多聚腺苷二憐酸核糖聚合酶(PARP,polyADP-ribosepolymerase)、切割(cleaved)PARP、胱天蛋白酶原-3(procaspase-3)、切割胱天蛋白酶_3及細胞色素c來進行了免疫印跡法。圖4e為表示如上圖4d地處理H460細胞，并對細胞質(zhì)及微粒體分餾物執(zhí)行免疫印跡法，來分析細胞色素c的細胞內(nèi)位置的結(jié)果的圖。圖4f為表示如圖4d地處理A549細胞,并用抗-細胞色素c抗體(綠色)及線粒體突光探針(MitoTracker)(紅色)染色之后,用激光共聚焦突光顯微鏡觀察的結(jié)果的圖(倍率X1260)。[0074]圖5為表示誘因Wnt受體SLRP6E1E2抑制腫瘤的生長和特性化的圖。圖5a為表示第一天、第三天及第五天將磷酸鹽緩沖溶液(PBS,Phosphatebuffersolution)()、dEl-k35/LacZ(?)、RdB-k35(▲)、dEl_k35/sLRP6ElE2(X)或RdB_k35/sLRP6ElE2(.)給藥到腫瘤的結(jié)果的圖。該結(jié)果用平均土標準誤差(η=7)來表示。*P<0.05PBS-處理或dEl-k35-處理對照組及dEl-k35/sLRP6ElE2。#P<0.01PBS-處理或dEl_k35-處理對照組。圖5b為表示將各組的腫瘤切割面相對于ElA或FLAG進行免疫染色的結(jié)果的圖(倍率X40及X100)。圖5c為表示用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(0八?1，4’，6-diamidino_2-phenylindole)(藍色)、抗_Ki67(紅色)及TdT介導的TUNEL(綠色)將各組的腫瘤組織染色的結(jié)果的圖(倍率X100)。圖5d為表示通過對CD31的染色觀察血管的結(jié)果的圖(倍率X100)。圖5e為表示各處理組的平均毛細血管濃度(⑶31陽性細胞/域)的圖。該結(jié)果用平均土標準誤差來表示。*P<0.05PBS、dEl-k35或dEl_k35/sLRP6ElE2。n.s.=無顯著性。圖5f為表示用DAPI(藍色)、抗_Wnt3a(紅色)或抗-β-連環(huán)蛋白(綠色)將細胞染色的結(jié)果的圖(倍率X100)。[0075]圖6為示出Wnt3a處理使腫瘤細胞中的細胞之間的連接位點以及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化衰變的圖。圖6a為表示對H322細胞指定時間內(nèi)的Wnt3a(100ng/ml)處理，并用光學顯微鏡觀察形態(tài)變化的結(jié)果的圖(倍率X200)。圖6b為表示對H322細胞處理Wnt3a之后，測定上皮鈣粘著蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及β-連環(huán)蛋白mRNA水平的結(jié)果的圖。圖6c為表示在Wnt3a(100ng/ml)存在或不存在的條件下，將H322細胞培養(yǎng)24小時之后，用DAPI(藍色)、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽(TRITC,tetramethylrhodamineisothiocyanate)-標記鬼筆環(huán)肽(紅色)或抗-上皮鈣粘著蛋白(綠色)染色的結(jié)果的圖(倍率X630)。[0076]圖7為示出誘因Wnt受體SLRP6E1E2抑制癌細胞的遷移及滲透，并調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT,epithelial-mesenchymaltransition)標記及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP，matrixmetalloproteinases)的表達的圖。圖7a為表示A549肺癌細胞遷移的定量分析結(jié)果的圖。反復實驗了三次，并用平均土標準誤差來表示了結(jié)果。*P<0.05PBS或dEl-k35/LacZ處理對照組；#與1社3&—起處理了P<0.001PBS或dEl-k35/LacZ。圖7b為表示分別用五個域內(nèi)的每個過濾器中存在的細胞的數(shù)字來對腫瘤細胞的滲透進行量化的結(jié)果的圖。反復實驗了三次，并用平均土標準誤差來表示了結(jié)果。*P<0.05PBS或dEl-k35/LacZ處理對照組；#與fct3a—起處理P<0.001PBS或dEl_k35/LacZ。圖7c為表示在Wnt3a(IOOng/ml)存在或不存在的條件下，用PBS、dEl-k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2處理，在24小時之后，再測定H322細胞內(nèi)的EMT標記的表達的結(jié)果的圖。用DAPI(藍色)、TRITC_標記鬼筆環(huán)肽(紅色)或抗上皮鈣粘著蛋白(綠色)將細胞進行了染色(倍率X630)。圖7d為表示如圖3a所示地處理A549細胞，并利用半定量(semiquantitative)RT-PCR來測定MMP-2及MMP-9mRNA水平的結(jié)果的圖。【具體實施方式】[0077]以下，通過實施例對本發(fā)明進行更為詳細的說明。這些實施例僅用于更加具體地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍不受這些實施例的限制，這對于該領域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。[0078]實施例[0079]實驗材料及實驗方法[0080]實驗材料[0081]從賽信通公司(CellSignalingTechnology)(比弗利(Beverly),馬薩諸塞州(MA))購入了對絲裂原活化蛋白激酶(MEK1/2)、p44/42絲裂原活化蛋白激酶(MAPKErkl/2)、哺乳動物雷帕霉素祀蛋白(mTOR,mammaliantargetofrapamycin)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K,phosphatidylinositol3_kinase)以及蛋白激酶(Akt,alsoknownasproteinkinase)的多克隆抗體以及對nt3a、Dvl2、Axin、糖原合成酶激酶(GSK3-0)、多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP,poly(ADP-ribose)polymerase)以及切割胱天蛋白酶-3的單克隆抗體。從賽信通公司(CellSignalingTechnology)購入了對作為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子的β_連環(huán)蛋白以及上皮鈣粘著蛋白的抗體。從加利福尼亞州圣克魯斯生物技術(shù)公司(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)購入了對細胞周期蛋白Dl(H-295)、細胞色素c(用于免疫印跡法的C-20)及脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP6，lipoproteinreceptor-relatedprotein6)(C_10)的抗體以及蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖珠。從不列顛哥倫比亞省維多利亞強生物技術(shù)公司(StressGenBiotechnologies,Victoria,BC)購入了對胱天蛋白酶的單克隆抗體。從加利福尼亞州圣迭戈BDPharmingen公司(SanDiego,CA)購入了對細胞色素c(用于免疫組織化學分析的6H2.B4)的多克隆抗體。從加利福尼亞州卡爾斯巴德英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA)購入了AlexaFluor488_接合以及AlexaFluor568-接合抗-兔IgG抗體。從密蘇里州圣路易斯西格馬公司(Sigma,St.Louis,MO)購入了DAPI(lg/ml)、赫克斯特(Hoechst)33342及四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC，tetramethylrhodamineisothiocyanate)-接合鬼筆環(huán)妝(phalloidin)。從明尼蘇達州明尼阿波利斯R&D系統(tǒng)公司(Systems,Minneapolis,MN)購入了純化的Wnt3a蛋白質(zhì)。[0082]表達水溶性LRP6受體的腺病毒載體的制備[0083]為了研究水溶性LRP6受體(SLRP6E1E2)的生物學功能，本發(fā)明人構(gòu)建了LRP6的El及E2胞外域(Wnt-結(jié)合位點)的結(jié)構(gòu)(17)，并將FLAG-標記(tagged)SLRP6E1E2亞克隆在穿梭載體(18)。將上述pCA14-sLRP6ElE2載體與不能復制的腺病毒5/35嵌合載體(dEl-k35)或能復制的嵌合溶瘤(oncolytic)腺病毒載體(RdB_k35)共轉(zhuǎn)化(co-transformation)(19),來分別制備了pdEl_k35/sLRP6ElE2以及pRdB_k35/SLRP6E1E2。[0084]這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導到HEK293細胞株，從而生成了dEl_k35/sLRP6ElE2以及RdB-k35/sLRP6ElE2。將不能復制的dEl_k35/LacZ以及能復制的溶瘤RdB_k35載體用作了陰性對照組(20)(圖la)。所有病毒是通過公知的方法來獲取的(21)。[0085]用于測定β-連環(huán)蛋白活性的螢光素酶報告基因分析[0086]為了測定連環(huán)蛋白/TCF(T-cellfactor)信號傳導活性，使用了TOPflash及FOPflash螢光素酶報告基因載體(紐約州普萊西德湖北部生物技術(shù)公司=UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY)。培養(yǎng)A549、H322及H460細胞，并與作為陰性對照組的0.3gTOPflash(具有野生型TCF結(jié)合位點的)或FOPflash(具有變異的TCF結(jié)合位點的)一起用dEl-k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2(20,50M0I)進行了轉(zhuǎn)化。經(jīng)過12小時后，用添加或未添加100ng/ml的Wnt3a的I%的達氏改性伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，Dulbeco'sModifiedEagle’sMedium)替代了培養(yǎng)基，再將細胞培養(yǎng)了24小時。利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem)(威斯康星州麥迪遜普洛麥格公司:Promega,Madison,WI)來分析了細胞提取物。[0087]細胞增殖分析[0088]利用3-(4，5_二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四氮唑溴鹽(MTT，(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)_2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide)分析來測定細胞增殖(西格馬(Sigma))(19)。將A549及H322細胞接種在24-孔板(2XIO4細胞/孔)。經(jīng)過24小時之后，對細胞處理了PBS、dEl-k35/LacZ或dEl-k35/sLRP6ElE2。次日，用重組Wnt3a(IOOng/ml)刺激細胞,或者不處理Wnt3a而再培養(yǎng)了48小時。之后,用酶標儀(microplatereader)測定了540nm中的吸光度。[0089]免疫印跡法及免疫沉淀[0090]在IOOmm板中，用dEl_k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2將在添加有I%的胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)的細胞進行轉(zhuǎn)化。次日，用Wnt3a(100ng/ml)對細胞處理16小時或未處理。用公知的方法來執(zhí)行了免疫印跡(19)。[0091]免疫熒光分析[0092]為了免疫熒光顯微鏡觀察，使培養(yǎng)的細胞固定并透化(permeabilization)。封閉了試樣，并使其與上皮鈣粘著蛋白、β-兒茶素或抗-細胞色素c第一抗體一起進行培養(yǎng)。用AlexaFlour488_接合山羊抗-兔IgG第二抗體使染色可視化。當最終處理抗體時，為了核染色，也包含TRITC-接合鬼筆環(huán)肽及Hoechst33342或DAPI染料(均為Ig/ml,西格馬(Sigma))。用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510,卡爾蔡司顯微成像(CarlZeissMicroImaging),索伍德(Thornwood),紐約(NY))觀察了細胞。[0093]線粒體分餾物及免疫印跡法[0094]利用Qproteome線粒體分離用試劑盒(凱杰公司(QIAGEN)、希爾頓(Hilden)、德國(Germany))根據(jù)制造者的指示準備了線粒體分餾物。清洗細胞，并使其漂浮在用冰塊冷卻的裂解緩沖液。在培養(yǎng)10分鐘之后，將破碎物離心分離，并去除了包含細胞質(zhì)蛋白質(zhì)的上清液。使包含核的沉淀物、細胞碎片及未破碎的細胞再漂浮，使其再漂浮在用冰塊冷卻的破碎緩沖液(disruptionbuffer),并進行離心分離。之后，將上清液(微粒體分懼物)移到干凈的微管。用線粒體儲存緩沖液清洗了獲取的包含線粒體的沉淀物，并進行離心分離。利用兔抗-細胞色素c抗體，通過上述過程執(zhí)行了免疫印跡法。[0095]細胞色素c免疫染色[0096]將處理或未處理Wnt3a的A549細胞平皿培養(yǎng)(plating)在雙室(two-chamber)載玻片(3X104細胞/小室，Nunc公司，內(nèi)珀維爾市(Naperville)，伊利諾斯州(IL))，并與PBS、dEl-k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2—起轉(zhuǎn)導。次日，使細胞固定，并在包含250nM的MitoTrackerRed線粒體染色劑(分子探針(MolecularProbes),尤金(Eugene),俄勒岡州(OR))的培養(yǎng)基中，在常溫條件下培養(yǎng)了30分鐘。之后，將細胞與0.5mg/ml的抗-細胞色素c抗體一起培養(yǎng)。次日，用AlexaFlour488_接合山羊抗-小鼠IgG抗體使染色結(jié)果可視化。在清洗之后，為了核染色，用Hoechst33258(lmg/ml)對載玻片進行染色。[0097]人類異種移植模型中的抗-腫瘤效果[0098]對于6~8周齡的雄性無胸腺(athymic)nu/nu小鼠(查爾斯日本子公司(CharlesRiverJapan),橫濱(Yokohama),日本(Japan)),將IXIO7的H460細胞皮下注射到腹部來確立了異種移植人類非小細胞肺癌。當腫瘤的體積達到約80~IOOmm3時，將小鼠分為平均腫瘤體積類似的五個組。在處理的第一天、第三天及第五天將腺病毒載體注射腫瘤內(nèi)(2X10'病毒粒子/小鼠)。利用以下方法來計算了腫瘤體積(V):V=0.52Xa2Xb(a,最小表面直徑山，最大表面直徑)[0099]腫瘤組織及免疫組織化學[0100]為了組織檢查及免疫組織化學染色，使腫瘤組織固定，并鑲嵌在固體石臘。用蘇木精及伊紅對代表性的對面進行染色，并用光學顯微鏡進行觀察。為了對毛細血管的濃度及Wnt表達進行量化,用抗-小鼠⑶31IgG(BDPharmingen)、抗-兔β-連環(huán)蛋白IgG(CellSignalingTechnology)或抗-小鼠Wnt3aIgG(圣克魯斯生物技術(shù)公司)對腫瘤對面進行染色。利用ABC-過氧化物酶試劑盒(ABC-peroxidasekits)(ChemMate?DAKOEnvisCD3?Detec⑶31kit；DAK0)使陽性免疫反應可視化。[0101]遷移及滲透分析[0102]利用公知的方法來實施了體外遷移分析(23)。在處理或未處理Wnt3a之后，從用PBS、dEl-k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2A549轉(zhuǎn)化的A549細胞獲取已調(diào)節(jié)條件的培養(yǎng)基，并將上述培養(yǎng)基位于下側(cè)的侵襲實驗(Transwell)小室。將A549細胞平皿培養(yǎng)在上側(cè)小室(7XIO4細胞/孔)。在37°C條件下，培養(yǎng)4小時并固定后，用蘇木精及伊紅進行染色。利用Biocoat?細胞遷移小室(cellmigrationchamber)來執(zhí)行了體外基質(zhì)膠侵襲實驗(Matrigelinvasionassays)。基質(zhì)膠基膜基質(zhì)(37mg/過濾器(filter);加利福尼亞州圣何塞碧迪生物科學公司(BDBiosciences,SanJose,CA))由過濾器(8μm孔)涂敷,與細胞遷移分析相同地執(zhí)行了實驗。[0103]逆轉(zhuǎn)錄(RT,Reversetranscription)-聚合酶鏈反應(PCR,polymerasechainreaction)[0104]歸納如下:利用RNeasyMiniKit(凱杰公司(QIAGEN),瓦倫西亞(Valencia),加州(CA))來分離總RNA(Ig),并利用寡脫氧胸苷酸引物及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogeη))來合成了cDNA。將cDNA(25ng)作為模板，并利用以下引物來執(zhí)行了PCR:基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2,matrixmetalloproteinase2)>正向5’-CTCAGATCCGTGGTGAGATCT-3’、反向5’-CTTTGGTTCTCCAGCTTCAGG-3’、MMP9、正向5’-ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC-3’、反向5’-GAAGGGGAAGACGCACAGCT-3’、上皮鈣粘著蛋白、正向5’-ACGATGATGTGAACACCTACA-3’、反向5’-ATGCCATCGTTGTTCACTGCA-3’、波形蛋白(Vimentin)、正向5’-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3’、反向5，-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3’、β-連環(huán)蛋白、正向5’-GCTGATTTGATGGAGTTGGA-3’、反向5’-TCAGCTACTTGTTCTTGAGTGAA-3'、β-肌動蛋白、正向5’-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3’、反向5’-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3’。[0105]統(tǒng)計學分析[0106]用平均值的標準誤差值(SEM,standarderrorofthemean)來表示了實驗結(jié)果。通過單因素方差分析(one-wayanalysisofvariance)比較了各組的結(jié)果,之后,根據(jù)需要執(zhí)行了用于單一觀察(unpairedobservation)的事后學生t檢驗(posthocStudentst-test)或者用于多重比較的邦費羅尼校正(Bonferroniscorrection)。P<0.05的情況下，認為具有統(tǒng)計學顯著性。[0107]實驗結(jié)果[0108]水溶性Wnt誘因受體在肺癌細胞中表達，并與Wnt3a相結(jié)合。[0109]在六個非小細胞肺癌細胞株(A549、H322、H596、H460、H358及H2009)中，通過免疫印跡法測定了內(nèi)源性的fct3a水平。在H322、H460及H2009細胞株中，Wnt3a與其他細胞株相比更強地表達了(圖lb)。因此，為了測定水溶性Wnt誘因受體(SLRP6E1E2)抑制Wnt信號傳導的能力，選擇了H322及H460細胞。通過利用抗-FLAG及抗-LRP6抗體的免疫印跡法確認了dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導A549細胞中的SLRP6E1E2的表達(圖lc)。dE_k35/SLRP6E1E2-轉(zhuǎn)導細胞中的sLRP6E1E2分泌為容量依賴性。[0110]接著，測定了轉(zhuǎn)導有dEl-k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2的細胞中的SLRP6E1E2與Wnt3a的結(jié)合。利用抗-Wnt3a或抗-LRP6抗體來對細胞破碎物進行免疫沉淀，并用免疫印跡法進行分析。如圖1d所示，與用dEl-k35/LacZ轉(zhuǎn)導的細胞相比，在用dEl_k35/SLRP6E1E2轉(zhuǎn)導的細胞中，Wnt3a及LRP6蛋白質(zhì)水平更低。這給出了LRP6E1E2域有效地與Wnt3a相結(jié)合的啟示。[0111]誘因fct受體減少細胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白水平及TCF轉(zhuǎn)錄活性。[0112]由于SLRP6E1E2與Wnt3a相結(jié)合，因而本發(fā)明人為了確認其對β-連環(huán)蛋白產(chǎn)生的效果，利用了由β_連環(huán)蛋白/TCF活化的螢光素酶報告基因系統(tǒng)(24)。如圖2a所示，當沒有Wnt3a時，在用dEl-k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2轉(zhuǎn)導的A549細胞中，螢光素酶活性低。當處理fct3a時，螢光素酶表達在對照組細胞中增加了大致7~8倍，而在dEl-k35/SLRP6E1E2-轉(zhuǎn)化的細胞沒有產(chǎn)生上述現(xiàn)象。當沒有處理Wnt3a時，與dEl_k35/LacZ對照組相比，在用dEl-k35/sLRP6ElE2轉(zhuǎn)導的H460細胞中減少了48%，在H322細胞中減少了12%(圖2b；p<0.05)。Wnt3a的刺激在用dEl_k35/LacZ轉(zhuǎn)導的H460細胞和H322細胞中分別將螢光素酶活性增加了53%及102%。但是，與用dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)導的細胞進行比較時，用dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導的H460(48%)及H322(52%)細胞的螢光素酶活性顯著低(P<0.05)。為了調(diào)查SLRP6E1E2對β-連環(huán)蛋白的局部性(localization)產(chǎn)生的影響，在處理PBS或者用dEl-k35/LacZ或dEl_k35/sLRP6ElE2轉(zhuǎn)導的H322細胞中實施了免疫熒光染色。未處理fct3a的情況下，在所有組中，β-連環(huán)蛋白染色一次性地僅在細胞之間的接觸位點實現(xiàn)。用Wnt3a給予刺激的情況下，就對照組細胞(PBS及dEl_k35/LacZ)而言，原生質(zhì)膜尤其細胞間連接部(cellcelljunction)中的β-連環(huán)蛋白局部性減少了，細胞質(zhì)與核中的連環(huán)蛋白水平增加了。[0113]相反，dEl-k35/sLRP6ElE2_轉(zhuǎn)導細胞在細胞質(zhì)中呈現(xiàn)了更低的β-連環(huán)蛋白水平，膜中的連環(huán)蛋白水平更高(圖2c)。這種功能研究的結(jié)果給出了SLRP6E1E2與Wnt之間的相互作用足以阻斷fct信號傳導的啟示。`[0114]誘因Wnt受體SLRP6E1E2抑制肺癌細胞增殖。[0115]Wnt機制調(diào)節(jié)包括增殖在內(nèi)的龐大的范圍的細胞功能(25)。在體外，為了調(diào)查SLRP6E1E2對A549及H322細胞的增殖產(chǎn)生的影響，用PBS處理或者用dEl_k35/LacZ或dEl-k35/sLRP6ElE2轉(zhuǎn)導了細胞。72小時后，用dEl_k35/sLRP6ElE2(20M0I)轉(zhuǎn)導，細胞增殖與用dEl-k35/LacZ轉(zhuǎn)導的對照組相比，在A549細胞中減少了39%，在H322細胞中減少了51%。基于Wnt3a的刺激使對照組細胞的增殖增加了大致10~20%，但沒有對dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導的細胞產(chǎn)生影響。就增殖而言，dEl_k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導的情況與dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)導的情況相比，在A549細胞中減少了54%，在H322細胞中減少了61%(P<0.001，圖3a)。[0116]為了調(diào)查與SLRP6E1E2的抗-增殖作用相關(guān)的信號傳導途徑，本發(fā)明人檢查了其對Wnt信號傳導產(chǎn)生的影響。如圖3b所示，對照組細胞(PBS和dEl-k35/LacZ)中的Dvl2及Axin的蛋白質(zhì)水平借助Wnt3a得到增加，而在dEl_k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞中，沒有基于Wnt3a的變化。類似地，細胞周期蛋白Dl表達雖然在Wnt3a處理后，在對照組細胞中稍微增加了，而在dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞中卻稍微減少了。在Wnt3a處理后，GSK3水平也同樣稍微增加了。[0117]Wnt通過使ERK及PI3K_Akt途徑活化，來對細胞增殖起到重要的作用(26)。因此，本發(fā)明人調(diào)查了在H460細胞中SLRP6E1E2能否抑制這些途徑。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)了，dEl_k35/SLRP6E1E2-轉(zhuǎn)化細胞與對照組細胞相比，MEK、ERKI/2及生存素(survivin)的基礎水平更低(圖3c)。這些蛋白質(zhì)雖然借助Wnt3a處理而增加，但dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞與對照組細胞相比仍然處于非常低的水平。mTOR、PI3K及Akt的表達不受Wnt3a的影響，相比于對照組，在dEl-k35/sLRP6E1E2-轉(zhuǎn)導細胞中更低。綜上所述，可知，SLRP6E1E2通過MEK-ERK及PI3K-Akt途徑抑制Wnt信號傳導，來起到抗-增殖作用。[0118]誘因WntSLRP6E1E2受體誘導細胞凋亡。[0119]Wnt信號傳導用于抑制細胞凋亡，并促進細胞增殖及生存(27)。為了調(diào)查SLRP6E1E2抑制非小細胞肺癌的增殖的分子機制，本發(fā)明人調(diào)查了SLRP6E1E2對細胞凋亡(apoptosis)產(chǎn)生的影響。在dEl-k35/sLRP6ElE2轉(zhuǎn)導3天后，觀察到A549、H1299及H358細胞在培養(yǎng)皿中逐漸分離，并與附著的細胞相比變得更圓更小(圖4a)。這意味著SLRP6E1E2誘導細胞凋亡。對于細胞凋亡的證據(jù),通過探索核的凋亡小體(apoptoticbody)來收集(無數(shù)據(jù))，通過檢測核小體間DNA斷裂化(internucleosomalDNAfragmentation)的TUNEL分析來進行測定(28)。如圖4b所示，在Wnt3a存在或不存在的條件下，dEl_k35/SLRP6E1E2-轉(zhuǎn)導細胞與對照組細胞相比，觀察到更多的TUNEL-陽性細胞。由TUNEL染色的量化結(jié)果確認，dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞與dEl_k35/LacZ-轉(zhuǎn)導對照組細胞相比，細胞凋亡比率更高，且大致為1.9倍(未處理Wnt3a)及2.8倍(處理Wnt3a)的事實(P<0.001)(圖4c)。本發(fā)明人測定了胱天蛋白酶家族及細胞色素c最熟知的細胞凋亡的調(diào)控因子。在Wnt3a存在或不存在的條件下，在dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞中的全長116-kDaPARP蛋白質(zhì)減少，85-kDa切割片段得到增加(圖4d)。胱天蛋白酶-3的切割(活化)的形態(tài)也借助SLRP6E1E2大幅增加了。如圖4e所示，dEl_k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)化細胞也呈現(xiàn)了增加的細胞質(zhì)細胞色素c以及減少的微粒體細胞色素c水平。基于Wnt3a的刺激也呈現(xiàn)了類似的效果。為了更深入地調(diào)查細胞色素c的局部性，實施了免疫熒光分析。PBS-處理及dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)導細胞呈現(xiàn)了細胞質(zhì)細胞色素c染色，與線粒體位置相一致。相反，分泌SLRP6E1E2的細胞呈現(xiàn)擴散的細胞質(zhì)細胞色素c染色結(jié)果，從而呈現(xiàn)了與從線粒體向細胞質(zhì)的遷移相一致的結(jié)果(圖4f)。[0120]誘因Wnt受體SLRP6E1E2抑制異種移植腫瘤的生長。[0121]本發(fā)明人測定了SLRP6E1E2在小鼠異種移植模型中抑制腫瘤的生長的能力。將H460細胞皮下注射到裸鼠的腹部來形成腫瘤。腫瘤的平均大小達到80~IOOmm3之后，在第一天、第三天及第五天注射了PBS、dEl-k35、RdB_k35、dEl_k35/sLRP6ElE2或RdB_k35/SLRP6E1E2。圖5a示出了注入有sLRP6E1E2_表達載體的腫瘤的體積與對照組相比顯著地減少。25天之后，處理PBS的腫瘤達到3883.1±418.08mm3的平均體積，處理dEl_k35及RdB-k35的腫瘤分別達到了3388.1±226.9mm3及1991±311.8mm3。相反，腫瘤的生長在將dEl-k35/sLRP6ElE2(與1645.3±353.6mm3PBS或dEl_k35組比較時，P<0.05)或RdB_k35/SLRP6E1E2(與923.3±180.4mm3PBS或RdB_k35組比較時，P<0.01)給藥的小鼠中大幅減少了。[0122]為了在腫瘤組織中調(diào)查SLRP6E1E2的生物學效果，最后注入腺病毒3天后，采集了腫瘤。通過腺病毒ElA蛋白質(zhì)表達的分析，確認了RdB-k35及RdB-k35/sLRP6ElE2被復制而擴展到整個腫瘤的情況(圖5b，E1A)。根據(jù)SLRP6E1E2的免疫組織化學分析結(jié)果(圖5b，F(xiàn)LAG)確認，在RdB-k35/sLRP6ElE2-處理腫瘤中，SLRP6E1E2擴展更廣，由此可知腫瘤腺病毒與不能復制的腺病毒相比，更加有效地表達了sLRP6E1E2，從而發(fā)揮更加優(yōu)秀的抗-腫瘤效果。[0123]異種移植H460中的SLRP6E1E2-表達載體的抗-增殖及細胞凋亡效果[0124]為了調(diào)查對SLRP6E1E2的小鼠異種移植腫瘤生長的效果，在腫瘤樣品中，用Ki_67免疫染色分析了增殖細胞，并用TUNEL染色分析了凋亡細胞。其結(jié)果確認，dEl-k35/SLRP6E1E2或RdB_k35/sLRP6ElE2處理腫瘤與對照組相比，K1-67表達減少，TUNEL-陽性細胞增加(圖5c)。相比于dEl-k35/sLRP6ElE2-處理腫瘤，本發(fā)明人在RdB_k35/sLRP6E1E2-處理腫瘤中，檢測了更多的TUNEL-陽性細胞，這與之前的結(jié)果相一致。為了確認在SLRP6E1E2-處理腫瘤中的血管生成是否減少，用⑶31染色測定了毛細血管密度。在注入有腫瘤腺病毒(RdB-k35及RdB-k35/sLRP6ElE2)的組織中，觀察到了更少于PBS-處理腫瘤的內(nèi)皮細胞及血管組織(P<0.05)，但在注入有dEl-k35或dEl-k35/sLRP6ElE2的腫瘤中，血管密度沒有發(fā)生變化(圖5d及圖5e)。進而，在注入有SLRP6E1E2-表達腺病毒的腫瘤中的血管密度與對照組之間沒有差異，從而表示SLRP6E1E2的抗腫瘤功效并不是借助抗-血管生成效果而介導的。[0125]為了更加仔細地調(diào)查SLRP6E1E2-表達腺病毒的抗腫瘤作用下的Wnt信號傳導的作用，測定了腫瘤組織中的Wnt及β-連環(huán)蛋白位置。在處理PBS或?qū)φ战M載體(dEl-k35和RdB-k35)的腫瘤中，觀察到連環(huán)蛋白及fct的高的內(nèi)在性分泌(圖5f)，但在SLRP6E1E2-表達載體中，顯著地減少了。由此可知，腫瘤細胞中的fct信號傳導的阻斷為延遲腫瘤生長的重要的因子。[0126]Wnt處理改變細胞的外形，并誘導腫瘤細胞的EMT。[0127]EMT為腫瘤生長中的重要的過程，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號途徑在這過程中起到重要的作用。對此，本發(fā)明人調(diào)查了fct3a是否在腫瘤細胞中誘導ΕΜΤ。其結(jié)果確認，在Wnt3a處理I天之后，細胞延伸，從而成為與間充質(zhì)細胞的形狀類似的紡錘(spindle)形狀的事實(圖6a)。本發(fā)明人還觀察到作為間充質(zhì)標記的波形蛋白(Vimentin)以及β-連環(huán)蛋白的表達增加，作為上皮標記的上皮鈣粘著蛋白隨之增加的事實(圖6b)。根據(jù)免疫熒光染色結(jié)果確認，在fct3a處理后,在細胞間接觸部中，細胞角蛋白及上皮鈣粘著蛋白水平大幅減少(圖6c)。[0128]SLRP6E1E2調(diào)節(jié)EMT-相關(guān)標記表達及MMP_2/MMP_9活性。[0129]基于癌細胞的遷移特性的獲得是對轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的傳播重要的因素(29)。由于將Wnt3a的增加視為強化運動性及滲透性，因而本發(fā)明人在通過SLRP6E1E2的表達阻礙Wnt信號傳導途徑的情況下，調(diào)查了是否抑制體外上的運動性及滲透性。本發(fā)明人利用侵襲實驗(transwell)運動性及基質(zhì)膠侵襲實驗(Matrigelinvasionassays)來調(diào)查了對A549細胞產(chǎn)生的SLRP6E1E2的影響。在處理或者未處理Wnt3a之后，從PBS-處理、dEl_k35/LacZ-轉(zhuǎn)導以及dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞收集了已調(diào)節(jié)條件的培養(yǎng)基。從dEl_k35/SLRP6E1E2-轉(zhuǎn)導細胞獲取的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基與從dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)導細胞獲取的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基相比，將轉(zhuǎn)移性減少了12.4%(未處理1社3&)及23.8%(處理Wnt3a)(P<0.001)(圖7a)。類似地，從dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞中獲取的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基相比于從dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)導細胞獲取的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，將滲透性減少了34.2%(未處理Wnt3a)及56.2%(處理Wnt3a)(圖7b)。上皮鈣粘著蛋白表達以及肌動蛋白絲也被Wnt3a減少，但在dEl_k35/sLRP6E1E2-轉(zhuǎn)導細胞中，與處理或未處理Wnt3a的對照組相比更增加了(圖7c)。[0130]基于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP，matrixmetalloproteinase)的胞外基質(zhì)的分解參與成為惡性的細胞的滲透及轉(zhuǎn)移過程。對此，本發(fā)明人調(diào)查了SLRP6E1E2對在血管生成、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中起到重要的作用的MMP-2及MMP-9的表達產(chǎn)生的影響。如圖7d所示，Wnt3a的處理在PBS-處理及dEl-k35/LacZ-轉(zhuǎn)導A549細胞中增加了MMP-2及MMP-9，而在處理或未處理Wnt3a的dEl-k35/sLRP6ElE2-轉(zhuǎn)導細胞中，MMP-2及MMP-9的表達量低。綜上所述，可知，SLRP6E1E2在人類非小細胞肺癌細胞株中，通過對多重的Wnt-相關(guān)途徑產(chǎn)生影響，來減少細胞滲透性。[0131]以上，詳細說明了本發(fā)明的特定的部分，對于該領域的普通技術(shù)人員來說，明確的是，這種詳細說明僅為優(yōu)選的實施例，本發(fā)明的范圍并不受此限制。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍由所附的發(fā)明要求保護范圍和與其等同的技術(shù)方案定義。[0132]參考文獻[0133]1.BursteinHJjGelberS，GuadagnoliEjWeeksJC.Useofalternativemedicinebywomenwithearly-stagebreastcancer.NEnglJMed340:1733-9(1999).[0134]2.BroxtermanHJjGeorgopapadakouNH.Anticancertherapeutics:asurgeofnewdevelopmentsincreasinglytargettumorandstroma.DrugResistUpdat10:182-93(2007).[0135]3.LiuJRjOpipariAWjTanL，etal.Dysfunctionalapoptosomeactivationinovariancancer:1mplicationsforchemoresistance.CancerRes62:924-31(2002).[0136]4.FukuiT，OtaniS，HataishiR，etal.SuccessfulrechallengewitherlotinibinapatientwithEGFR—mutantlungadenocarcinomawhodevelopedgefitinib—re`latedinterstitiallungdisease.CancerChemotherPharmacol65:803-6(2010).[0137]5.LynchTJjBellDWjSordellaR，etal.Activatingmutationsintheepidermalgrowthfactorreceptorunderlyingresponsivenessofnon-small-celllungcancertogefitinib.NEnglJMed350:2129-39(2004).[0138]6.NishioMjKoshikawaT，KuroishiT，etal.Prognosticsignificanceofabnormalp53accumulationinprimary,resectednon-small-celllungcancers.JClin0ncoll4:497-502(1996).[0139]7.NishioMjKoshikawaT，YatabeY，etal.PrognosticsignificanceofcyclinDlandretinoblastomaexpressionincombinationwithp53abnormalitiesinprimary,resectednon-smallcelllungcancers.ClinCancerRes3:1051-8(1997).[0140]8.MitsudomiT，KosakaT，EndohH，etal.MutationsoftheepidermaIgrowthfactorreceptorgenepredictprolongedsurvivalaftergefitinibtreatmentinpatientswithnon-small-celllungcancerwithpostoperativerecurrence.JClin0ncol23:2513-20(2005).[0141]9.NusseR，TheunissenHjWagenaarE，etal.TheWnt-1(int-1)oncogenepromoteranditsmechanismofactivationbyinsertionofproviralDNAofthemousemammarytumorvirus.MolCellBioll0:4170_9(1990).[0142]10.BeachyPA,KarhadkarSSjBermanDM.Tissuerepairandstemcellrenewalincarcinogenesis.Nature432:324-31(2004).[0143]11.HolcombeRF，MarshJLjWatermanML,LinFjMilovanovicT，TruongT.ExpressionofWntligandsandFrizzledreceptorsincolonicmucosaandincoloncarcinoma.MolPathol55:220-6(2002).[0144]12.DeAlmeidaVI，MiaoLjErnstJA，KoeppenH，PolakisP，RubinfeldB.ThesolublewntreceptorFrizzled8CRD-hFcinhibitsthegrowthofteratocarcinomasinviv0.CancerRes67:5371-9(2007).[0145]13.LiY，LuWjHeXjSchwartzAL，BuG.LRP6expressionpromotescancercellproliferationandtumorigenesisbyalteringbeta—cateninsubcellulardistribution.0ncogene23:9129-35(2004).[0146]14.LiuCCjPearsonC，BuG.Co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