含野木瓜提取物的醫(yī)藥組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種作為有效成份含有野木瓜葉提取物的解熱藥。本發(fā)明是通過確認(rèn)所述野木瓜葉提取物不僅沒有細(xì)胞毒性還具有與現(xiàn)有的具有解熱效果的解熱藥相比良好的解熱效果來完成的，作為有效成份含有其的所述解熱用組合物，解熱效果非常良好。
【專利說明】含野木瓜提取物的醫(yī)藥組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及包含野木瓜提取物的組合物以及野木瓜提取物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]炎癥反應(yīng)是指，當(dāng)細(xì)胞或組織暴露在包含細(xì)菌、霉菌、病毒或多種過敏源物質(zhì)等這樣的外部感染源的來自外部的有害物質(zhì)或有機(jī)體中，或者因暴露在上述來自外部的有害物質(zhì)或有機(jī)體中等各種因素導(dǎo)致細(xì)胞或組織受損傷或被破壞時(shí)，為了使該損傷最小化且使損傷部位恢復(fù)原狀，而局部發(fā)生的免疫反應(yīng)。
[0003]而且，引起上述炎癥的各種因素包括由外傷、燙傷、凍傷、放射能等引起的物理因素，強(qiáng)酸等化學(xué)物質(zhì)引起的化學(xué)因素，以及由抗體反應(yīng)引起的免疫學(xué)因素，另外，血管或激素的不均衡也會引起上述炎癥。
[0004]上述炎癥反應(yīng)是保護(hù)生物體、去除組織損傷所產(chǎn)生的生成物的有用的防御機(jī)制，局部血管和體液中存在的各種炎癥媒介因子及免疫細(xì)胞相互關(guān)聯(lián)，從而出現(xiàn)酶活性化、分泌炎癥媒介物質(zhì)、體液浸潤、細(xì)胞移動(dòng)、組織破壞、紅斑、浮腫、發(fā)熱等痛癥癥狀，如上所述的正裝會導(dǎo)致功能性障礙。
[0005]上述炎癥在通常情況下，在生物體內(nèi)通過炎癥反應(yīng)抑制外部感染源或者中和或去除發(fā)病因素，并且再生受損組織，恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和功能。但是，當(dāng)抗原繼續(xù)存在、或者因特定的內(nèi)部物質(zhì)使炎癥超過一定的正常水平或慢性化，則會發(fā)展成過敏性疾病或慢性炎癥這樣的疾病狀態(tài)。已知在臨床疾病中，大部分疾病幾乎都能觀察到炎癥反應(yīng)，而且在癌癥發(fā)病過程中，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的酶起到重要的作用。并且，輸血、藥物服用或臟器移植等治療過程中也成為障礙因素。
[0006]在生物體中，炎癥反應(yīng)涉及多種生化反應(yīng)現(xiàn)象，特別是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的、與炎癥反應(yīng)相關(guān)的多種酶會啟動(dòng)或調(diào)節(jié)上述反應(yīng)。
[0007]據(jù)最近發(fā)現(xiàn),生物體內(nèi)的炎癥反應(yīng)的進(jìn)行與COX(cyclooxygenase,環(huán)氧酶)的酶活性相關(guān)。上述COX酶是參與存在于生物體內(nèi)的前列腺素(prostaglandin)的生物合成的主要酶，存在C0X-1和C0X-2這兩種異形酶。C0X-1通常存在于胃或腎臟等組織中，維持正常的抗生作用，相反，C0X-2是在發(fā)生炎癥或其他免疫反應(yīng)時(shí)，由細(xì)胞分類因子(mitogen)或細(xì)胞因子(cytokines)在細(xì)胞內(nèi)短暫且快速發(fā)現(xiàn)的酶。
[0008]作為另一個(gè)較強(qiáng)的炎癥媒介物質(zhì)的一氧化氮(Nitric oxide, NO),是通過NO合成酶(NOS)自L-精胺酸產(chǎn)生，并且也通過UV等外部的不適反應(yīng)、內(nèi)毒素(endotoxin)或細(xì)胞因子(cytokine)等物質(zhì)在各種細(xì)胞中生成。上述炎癥刺激可增加細(xì)胞內(nèi)的誘導(dǎo)性NOS(iNOS)的發(fā)現(xiàn)，由此在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)NO的生成，使巨噬細(xì)胞具備活性，從而引起炎癥反應(yīng)。
[0009]因此，為了實(shí)現(xiàn)有效的炎 癥緩解，最近正在開展能抑制NO生成的物質(zhì)的研究。但是，這樣研發(fā)出來的抗炎癥物質(zhì)的幾種副作用成為問題。例如，急性炎癥疾病或慢性炎癥疾病的治療中使用的非留體類化合物消炎藥物，不僅能抑制C0X-2酶，同時(shí)還抑制C0X-1酶，會引起胃腸障礙等副作用。
[0010]另一方面，在日常生活中常用的化妝品是為了保護(hù)、美化、清潔皮膚而使用的，但化妝原料成分中不可缺少地包含著與皮膚保護(hù)目的無關(guān)的成分，例如表面活性劑、防腐劑、香料、防紫外線劑、色素及為實(shí)現(xiàn)其它功能或效果而使用的各種成分。已知在化妝品生產(chǎn)中必須使用的上述成分通常會對皮膚產(chǎn)生炎癥、疙瘩、浮腫等副作用。
[0011]再者，從體內(nèi)排出的皮脂成分、汗成分及化妝品成分中的脂肪酸、高級乙醇、蛋白質(zhì)等會被存在于皮膚上的皮膚常附細(xì)菌分解成強(qiáng)毒性物質(zhì)，由此會引起皮膚炎癥，而且，通過來自太陽的紫外線也會引起皮膚炎癥。
[0012]如上所述，在化妝品中始終潛伏著皮膚副作用的誘發(fā)因素，為了解決這個(gè)問題進(jìn)行了各種研究。目前為止，用于紅斑或浮腫的緩解刺激及炎癥的物質(zhì)，已知有氟滅酸(f lufenamic acid)、普羅芬(ibuprofen)、節(jié)達(dá)明(benzydamine)、吲哚美辛(indomethacin)等非留族化合物類(Nonsteroid),氫化潑尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)等甾族化合物類固醇(steroid)類，尿囊素(allantoin)、甘菊藍(lán)(azulene)、-氨基己酸(Aminocaproic Acid)、醋酸氫化可的松(hydrocortisone)、甘草酸及其衍生物(β -甘草酸(β -glycyrrhizinic)、甘草酸衍生物)等具有抗炎效果。
[0013]但是,通常作為抗炎劑使用的上述η引哚美辛(indomethacin)是不能用于化妝原料的物質(zhì)，上述醋酸氫化可的松(hydrocortisone)則限制了其用量，甘草酸及其衍生物其性質(zhì)不穩(wěn)定且溶解度差，故在實(shí)際應(yīng)用中，受到濃度的限制而無法發(fā)揮實(shí)質(zhì)性效果。目前為止知曉的抗炎劑在皮膚安全性、化妝原料配比時(shí)的穩(wěn)定性方面都存在問題點(diǎn)，限制了其使用。
[0014]此外，最近的一種胃炎治療劑的基理是,通過堵住H2受體(H2receptor)來減少胃壁細(xì)胞的胃酸分泌的H2受體阻抗劑(H2-BloCkers)發(fā)揮主要作用。因胃酸減少，可防止已受損的胃壁細(xì)胞(如胃潰瘍等)進(jìn)一步受損傷。這種H2受體阻抗劑防礙肝臟中的其他藥物的代謝(potent inhibitors of P-450),所以在同時(shí)服用其他藥物時(shí)需要注意,另外，其還具有抗男性激素(Ant1-Androgen)效果,對男性產(chǎn)生乳腺發(fā)育(gynecomastia)、陽痿(impotence)、性欲減退等副作用。再者，其可透過胎盤和腦血管壁，對孕婦和老人的副作用更大，會引發(fā)頭痛、混沌、昏迷、頭暈等不適癥狀。
[0015]因此，有必要開發(fā)一種天然物質(zhì)提取物，其能夠有效地抑制NO的產(chǎn)生、iNOS及TNF-α的發(fā)現(xiàn)，還能有效抑制C0X-2酶的活性，不僅抗炎效果突出，而且不具有上述副作用、或者對細(xì)胞毒性的危害不存在或很少，幾乎不必限制其使用量。
[0016]特別是，最近為了滿足廣大消費(fèi)者需求，積極研發(fā)著使用了作為利用天然原料生產(chǎn)的純天然藥物的抗炎癥劑、或者利用天然原材料的化妝原料及其成分。
[0017]另外,解熱劑(antipyretic drug)是能降低發(fā)熱狀態(tài)的體溫的藥物,通常還同時(shí)具備鎮(zhèn)痛作用，故稱為解熱鎮(zhèn)痛藥。`
[0018]與上述解熱劑相關(guān)的作用機(jī)理中，當(dāng)前廣泛受到支持的意見是，上述解熱劑阻礙前列腺素(prostaglandin;PG)的生化合成,起到抑制發(fā)熱，因此能夠退熱。
[0019]具體地說，發(fā)熱時(shí)丘腦下部的體溫調(diào)節(jié)中樞的前列腺素含量會上升，如果降低上述體溫調(diào)節(jié)中樞的前列腺素含量，就能抑制發(fā)熱作用，實(shí)現(xiàn)退熱效果。而且，已知上述前列腺素是誘發(fā)痛癥的媒介物質(zhì)。但是，此外還公開了關(guān)于發(fā)熱癥狀的多種機(jī)制。[0020]目前處方用的退熱藥有阿司匹林等水楊酸衍生物,丙酮苯胺(acetone anilide)、非那西丁(phenacetin)等阿尼林(Aniline)衍生物，安替比林(antipyrine)、氨基比林(aminopyrine)或安乃近(sulphyrine)等吡唑啉酮衍生物。另外，抗炎癥劑中的Π引哚美辛(indomethacin)等非甾族化合物類抗炎劑中也包含能起到解熱鎮(zhèn)痛作用的藥劑。
[0021]如上所述，有時(shí)會發(fā)現(xiàn)解熱鎮(zhèn)效果用和抗炎效果即消炎效果之間的關(guān)聯(lián)性，但是，有的藥劑幾乎不具有抗炎效果但其解熱效果顯著，相反，有的藥劑幾乎沒有解熱效果但其抗炎效果顯著，由此可以判斷抗炎效果和解熱及鎮(zhèn)痛效果不是必然具有直接的相互關(guān)聯(lián)性。
[0022]因此，最近要求開發(fā)一種包含天然物質(zhì)提取成分的天然物質(zhì)提取物，其不僅具有顯著的解熱作用，同時(shí)幾乎沒有上述的副作用和對細(xì)胞毒性的危害，用來代替引起急性中毒癥的苯胺(aniline)等這樣的存在各種副作用的化合物提取物。
[0023]特別是，最近為了滿足廣大消費(fèi)者的需求，正在積極進(jìn)行著將利用天然原料的天然藥物作為解熱劑的研發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種抗炎組合物，以發(fā)生副作用的可能性很低的植物提取物作為有效成分。
[0025]此外，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種解熱用組合物，以發(fā)生副作用的可能性很低的植物提取物作為有效成分。
[0026]本發(fā)明提供以野木瓜的提取物為有效成分的抗炎組合物，此抗炎組合物既可以是藥用組合物，也可以是消`炎鎮(zhèn)痛藥，且可被提供以抑制炎癥為目的的化妝品的有效原料成分。
[0027]本發(fā)明提供以野木瓜的提取物為有效成分的抗炎藥。
[0028]本發(fā)明提供以野木瓜的提取物為有效成分的炎癥改善和緩和用化妝原料成分。
[0029]本發(fā)明提供以野木瓜的提取物為有效成分的解熱用組合物，其解熱用組合物可以是藥用組合物，也可以是解熱藥或解熱鎮(zhèn)痛藥。
[0030]本發(fā)明人在天然物抗炎作用的研究當(dāng)中，明確了野木瓜的提取物有優(yōu)秀的抗炎效果。更具體地說，野木瓜的提取物能有效抑制NO分泌，還能抑制與NO的生成相關(guān)的iNOS的發(fā)現(xiàn)，并相連在生物體內(nèi)存在的前列腺素(prostaglandin)的生化合成，阻礙進(jìn)行炎癥反應(yīng)的COX(cyclooxygenase)酶的活性。并且追加發(fā)現(xiàn)，野木瓜的葉子提取物的幾種溶劑萃取中，乙酸乙酯(ethyl acetate)萃取后的毒性在不成問題的范圍內(nèi)，比其他物質(zhì)的萃取，能有效抑制NO的生成和COX酶的活性。
[0031 ] 本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，對天然物的解熱鎮(zhèn)痛原材料的研究當(dāng)中，野木瓜的提取物的解熱效果很優(yōu)秀。更具體地說，野木瓜的提取物不像其他植物提取物那樣無解熱效果或很微小，它具有明顯顯著解熱效果。并且追加發(fā)現(xiàn)，野木瓜的提取物的幾種溶劑萃取中，乙酸乙酯(ethyl acetate)萃取后的毒性在不成問題的范圍內(nèi)，比其他物質(zhì)的萃取，更具有明顯顯著解熱效果。
[0032]下面，詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0033]本發(fā)明涉及以野木瓜的提取物作為有效成分的抗炎組合物。[0034]上述野木瓜(Stauntonia hexapillya)是雙子葉植物毛茛木木藤科的常綠藤本植物，也叫野木瓜樹。
[0035]該野木瓜是雌雄同柱。該野木瓜的葉交叉生長，是由5~7小葉構(gòu)成的掌狀復(fù)葉，花期為5月，黃白色花，總狀花序。該野木瓜的果實(shí)是漿果，呈卵圓形或橢圓型，長5~10厘米，10月份成熟至紅褐色，果肉比木通果香。內(nèi)含黑色種子，呈雞蛋狀的橢圓型。該野木瓜產(chǎn)于韓國、日本、中國大陸及臺灣等地。在韓國主要生長于全羅南道、慶尚南道、忠清南道等南方地區(qū)的溪谷或樹林中。
[0036]上述野木瓜提取物可根據(jù)通常的植物提取物的制造方法制造，例如，在野木瓜的果實(shí)、花、葉、枝、徑、根、樹皮或其粉碎物質(zhì)中，優(yōu)選在野木瓜的葉或果實(shí)中，更優(yōu)選在其葉中加入萃取溶劑而提取制造，或者用萃取溶劑提取后，再加入萃取溶劑而萃取制造。該野木瓜的葉的產(chǎn)量比其他部位大，容易生產(chǎn)，抗炎效果也顯著，因此，優(yōu)選上述野木瓜提取物最好是野木瓜葉提取物。
[0037]上述萃取溶劑可以是選自由水和有機(jī)溶劑所組成的組中的一種。上述有機(jī)溶劑可以是碳原子數(shù)為I至5的醇、或上述醇稀釋水、乙酸乙酯(ethyl acetate)或丙酮(acetone)等極性溶劑，乙醚(ether)、三氯甲燒(chloroform)、苯(benzene)、核酸或二氯甲燒(dichloromethane)等非極性溶劑,或者它們的混合溶劑。上述碳原子數(shù)為I至5的醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇等，但不限定于此。另外，醇稀釋水可以是按50%(v/V)~99.9%(v/v)將醇稀釋于水中而得到。
[0038]本發(fā)明的野木瓜提取物的萃取溶劑，優(yōu)選的是選自由水、碳原子數(shù)為I至5的醇、醇稀釋水和它們的混合物所組成的組中的一種以上，更優(yōu)選的是選自由水、碳原子數(shù)為I至4的醇、醇稀釋水和它們的混合物所組成的組中的一種以上，最優(yōu)選的是水。
[0039]上述提取過程可以在50°C~150°C、或者75°C~130°C、或者90°C~120°C的溫度條件下進(jìn)行，但不只限定于些。此外，上述提取時(shí)間沒有特意限定，可以是10分鐘至12小時(shí)、或者30分鐘至6小時(shí)、或者2小時(shí)至4小時(shí)。
`[0040]本發(fā)明的野木瓜提取物可以根據(jù)通常的植物提取物的制造方法來制造，具體地說，包括熱水提取法的熱提取法、冷浸提取法、溫浸提取法、超聲波提取法等，可利用通常的提取設(shè)備、超聲波粉碎提取機(jī)或萃取器而進(jìn)行提取。
[0041]并且，利用上述溶劑提取的提取物，以后可以用選自由核酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲燒(methylene chloride)、乙醚(ethyl ether)、丙酮、丁醇、水及其混合物所組成的組中的I種個(gè)以上溶劑來進(jìn)一步實(shí)施萃取過程。萃取時(shí)，可利用2種以上的溶劑，根據(jù)溶劑的極性順次使用或混合使用，可以制造各溶劑提取物。
[0042]上述野木瓜提取物的萃取物可以是乙酸乙酯萃取物或者是三氯甲烷萃取物，優(yōu)選乙酸乙酯萃取物。
[0043]上述制造的提取物或經(jīng)過上述萃取過程獲得的萃取物，之后可以通過執(zhí)行過濾、濃縮或干燥過程去除溶劑，也可以執(zhí)行過濾、濃縮和干燥這些所有過程。具體地說，過濾時(shí)，可利用過濾紙，或利用減壓過濾器；濃縮時(shí)，利用減壓濃縮機(jī)，例如旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)機(jī)進(jìn)行減壓濃縮；干燥時(shí)，例如可利用凍結(jié)干燥法。
[0044]對上述野木瓜提取物、例如野木瓜葉熱水提取物和野木瓜果實(shí)熱水提取物進(jìn)行MTT分析的結(jié)果，將其濃度處理至200 μ g/ml，也沒有細(xì)胞毒性。[0045]因此，上述抗炎組合物可利用于抑制炎癥，或者用于治療、改善、緩解或預(yù)防炎癥。
[0046]上述炎癥是包含通常炎癥疾病的概念，例如，炎癥疾病包括先天性過敏體質(zhì)的各種皮膚炎、皮肌炎(dermatomyositis)、多發(fā)性肌炎(polymyositis)、過敏、全身紅斑性狼瘡、天皰瘡、皰疹樣阿弗他口炎、忙膜炎、胃炎、肝炎、氣管炎、食道炎、腸炎、胰腺炎、大腸炎、腎炎、蓐瘡、狼瘡、慢性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化癥等各種慢性炎癥疾病和敗血癥、休克、放射線損傷、臟器移植的排異反應(yīng)等各種急性炎癥疾病、全身浮腫及局部浮腫中的一種以上。
[0047]所以，上述抗炎組合物可達(dá)到上述炎癥疾病的治療、預(yù)防、或改善的目的。
[0048]上述過敏癥包括過敏性反應(yīng)(anaphylaxis)、過敏性鼻炎癥(allergicrhinitis)、氣喘(asthma)、過敏性結(jié)膜炎、過敏性皮膚炎、特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)、接觸性皮膚炎、風(fēng)疫(urticaria)、昆蟲過敏、食品過敏及藥品過敏。
[0049]具體地說，上述全身浮腫可以是選自由淤血性心功能障礙、膠著性心囊炎、局部性心臟肌肉病癥、肝硬化、腎功能障礙、腎綜合癥及其組合所組成的組中的一種，上述局部浮腫是指皮膚和軟組織的一部分浮腫的狀態(tài)，具體地說，它可以包括皮膚和軟組織出現(xiàn)炎癥的蜂窩組織炎(cellulites)、靜脈或淋巴管的回流障礙、皮膚或軟組織的局部燙傷、蟲咬、細(xì)菌感染等。
[0050]因此，本發(fā)明的抗炎組合物可應(yīng)用于炎癥疾病的治療或作為預(yù)防用組合物應(yīng)用，也可應(yīng)用于上述炎癥疾病的預(yù)防或改善用的食品組合物。
[0051]上述的所謂健康食品是指利用物理、生化學(xué)、生物工學(xué)等方法，使相應(yīng)食品的機(jī)能達(dá)到特定目的，給予附加價(jià)值的食品組或食品組成具有生物預(yù)防調(diào)節(jié)機(jī)能、防止疾病和恢復(fù)等體調(diào)節(jié)機(jī)能而設(shè)計(jì)加工的食品。上述健康食品可包括食品加工上允許的食品添加劑，進(jìn)而也可以包括通常使用于健康功能食品制造適宜的載體、成型添加劑和稀釋劑。
[0052]本發(fā)明的炎癥疾病的預(yù)防或改善用`健康食品組合物可包含上述野木瓜提取物占食品全部重量的0.001~99.9重量％、或者0.01~50重量％、或者0.1~30重量％、或者
0.1~15重量％。
[0053]上述抗炎組合物可利用于藥劑、醫(yī)藥或藥學(xué)用途，從這個(gè)角度看，其抗炎組合物可以是醫(yī)藥用組合物，例如是消炎鎮(zhèn)痛藥。
[0054]包含上述野木瓜提取物作為有效成分的抗炎組合物，可直接應(yīng)用于包括人類的動(dòng)物。上述動(dòng)物是對應(yīng)于植物的生物群，主要是指攝取有機(jī)物作為營養(yǎng)成分，分化有消化器官、排泄器官以及呼吸器官，優(yōu)選哺乳類，更優(yōu)選人類。
[0055]上述野木瓜提取物可單獨(dú)使用于上述抗炎組合物內(nèi)，另外，還可以追加包含藥理學(xué)上允許范圍內(nèi)的載體、成型添加劑、稀釋劑或副成分。更詳細(xì)地說，當(dāng)包含上述野木瓜提取物的組合物用作藥劑、或者用于醫(yī)藥或藥學(xué)用途時(shí)，上述野木瓜提取物可以按照通常方法與藥學(xué)上允許的載體、或者成型添加劑混合使用，也可以用稀釋劑稀釋后使用。
[0056]此時(shí)，上述組合物內(nèi)野木瓜提取物的含量可以是0.001~99.9重量％、或者0.1~99重量％、或者I~50重量％，但不限定于些，可根據(jù)組合物的使用狀態(tài)及使用方法，上述化合物的含量可適當(dāng)調(diào)節(jié)為期望的含量。
[0057]上述藥學(xué)上允許的載體、成型添加劑或稀釋劑，可以列舉選自由乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、海藻酸、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、細(xì)胞膜質(zhì)、甲基纖維素、微晶細(xì)胞膜質(zhì)、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基安息香酸鹽、滑石、硬脂酸鎂及礦物油、糊精、碳酸鈣、丙二醇、液體石蠟及生理食鹽水組成的組中選擇的一種以上，但并非限定于此，通常的載體、成型添加劑或稀釋劑都可以使用。而且，上述藥學(xué)組合物還可以含有通常的充填劑、增量劑、結(jié)合劑、崩解劑、抗凝固劑、潤滑齊?、濕潤劑、PH調(diào)節(jié)劑、營養(yǎng)劑、維生素、電解質(zhì)、褐藻酸及其鹽、果膠酸及其鹽、保護(hù)性膠體、甘油、香料、乳化劑或防腐劑等。上述成分可以獨(dú)立或組合追加到作為上述有效成分的野木瓜葉提取物中。
[0058]而且，本發(fā)明的組合物中，除了上述有效成分以外，還會包含公認(rèn)為具有抗炎效果的物質(zhì)，例如作為C0X-2抑制劑，NO抑制劑或抗炎癥劑等使用的物質(zhì)。
[0059]當(dāng)上述組合物用做藥劑時(shí)，投藥方法為口服或非口服均可，例如口服、經(jīng)皮、皮下、靜脈或者包括肌肉在內(nèi)的各種途徑用藥。
[0060]此外，上述組合物的劑型根據(jù)使用方法的不同而不同，給哺乳動(dòng)物用藥后，為了提供其活性成分的迅速、持續(xù)或延遲放出，采用本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法進(jìn)行劑型化。一般來講，口服用固體制劑有片劑、藥片、軟或硬膠囊、藥丸、藥粉及顆粒等。這樣的制劑可混合成成型添加劑制作，例如，淀粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖、明膠等?？诜靡簞┯袘腋?、內(nèi)用液劑、乳劑及糖漿等。常用單純稀釋劑，水和液體石蠟以外，還包括成型添加劑，如，濕潤劑、甜味劑、芳香劑、保鮮劑等。
[0061]用于非口服的形態(tài)有乳霜、洗劑、藥膏、膏藥、液體藥劑、噴霧劑、液體提取物、酏劑、浸劑、香囊、護(hù)傷用膏藥、針劑等。
[0062]本發(fā)明的組合物使用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知的適當(dāng)方法或雷明頓的文獻(xiàn)中記載的方法即可實(shí)現(xiàn)劑型化。
[0063]上述組合物的`用藥量根據(jù)用藥方法、服用人的年齡、性別、患者的重癥程度、狀態(tài)、體內(nèi)可吸收活性成分的吸收度、惰性率和同時(shí)使用的藥物來決定，例如以I日有效成分為基準(zhǔn)時(shí)，分別按照0.lmg/kg (體重)~500mg/kg (體重)，或者0.lmg/kg(體重)~400mg/kg(體重)、或者lmg/kg(體重)~300mg/kg(體重)服用一次或分?jǐn)?shù)次服用。上述服用量不論從哪方面都不限定在本發(fā)明的范圍。
[0064]本發(fā)明還提供包含野木瓜提取物作為有效成分的抗炎組合物。
[0065]另外，本發(fā)明提供包含野木瓜提取物作為有效成分的抗炎癥劑。
[0066]上述野木瓜提取物優(yōu)選是野木瓜葉熱水提取物，更優(yōu)選是野木瓜葉熱水提取物的乙酸乙酯萃取物。
[0067]上述抗炎癥劑可以單獨(dú)含有上述有效成分，此外，根據(jù)劑型、使用方法及使用目的，還可以包含藥劑學(xué)上允許的載體或成型添加劑。以混合物提供時(shí)，上述有效成分相對于抗炎癥劑整體可包含0.1重量％~99.9重量％，但是，通常含量為0.001重量％~50重量％。
[0068]上述抗炎癥劑可用于紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等這類的各種慢性炎癥疾病、敗血癥、休克、臟器移植的排異反應(yīng)，各種急性炎癥疾病、眼病、氣管炎或炎癥腸疾病的預(yù)防及治療。
[0069]上述載體或成型添加劑里雖然含有水、糊精、碳酸鈣、乳糖、丙二醇、液體石蠟、生理食鹽水、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、細(xì)胞膜質(zhì)、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥基苯甲酸甲酯、羥基安息香酸鹽、滑石、硬脂酸鎂及礦物油，但并不限定在這些，可以使用載體或成型添加劑的兩種以上。
[0070]將抗炎癥劑藥劑化時(shí)，一般還包含充填劑、增量劑、結(jié)合劑、崩解劑、界面活性劑、抗凝聚劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑或防腐劑等。
[0071]本發(fā)明的抗炎癥劑除了上述有效成分以外，還包含具有公知的抗炎活性的化合物或植物提取物。相對于上述有效成分100重量份，可以包含0.1~99.9重量份，或者0.5~20重量份。
[0072]抗炎癥劑的劑型根據(jù)使用方法來決定其形態(tài)，尤其是給哺乳動(dòng)物用藥后，為了實(shí)現(xiàn)活性成分的迅速、持續(xù)抑或延遲放出，采用本領(lǐng)域公知的方法即可實(shí)現(xiàn)劑型化。具體劑型有硬膏劑、顆粒劑、乳霜?jiǎng)?、涂抹劑、檸檬水劑、散劑、糖漿、眼軟膏、液體藥劑、噴霧劑、提取物、酏劑、軟膏、液體提取物、乳劑、懸浮劑、煎劑、浸劑、點(diǎn)眼劑、藥片、佐劑、注射劑、醑劑、膠囊、乳霜?jiǎng)⑼鑴?、軟質(zhì)或硬質(zhì)明膠膠囊等。
[0073]本發(fā)明的抗炎癥劑可以口服或以非口服形式用藥，例如通過真皮、肌肉、腹膜、靜脈、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外及口腔等使用，用藥量根據(jù)用藥方法、服用者的年齡、性別及體重、疾病的輕重等決定。例如，以有效成分為基準(zhǔn)時(shí)，本發(fā)明的抗炎癥劑可以按I日0.lmg/kg(體重)~100 mg / kg (體重)服用I次以上。但是，上述用藥量只是舉例而已，并不限定在該范圍里。 [0074]本發(fā)明提供包含野木瓜提取物作為有效成分的化妝原料組合物。
[0075]上述野木瓜提取物是天然物質(zhì)，沒有副作用，不僅沒有細(xì)胞毒性，而且抑制炎癥效果突出。因此，抗炎及抗刺激活性非常好，有效地消除化妝品里所含成分引起的炎癥及外部環(huán)境引起的炎癥。上述野木瓜提取物可用于具有改善、預(yù)防及緩解炎癥效果的化妝原料組合物的有效成分。從這一層面上來講，上述化妝原料組合物改善炎癥，緩解用化妝原料組合物。
[0076]上述野木瓜提取物優(yōu)選是野木瓜葉熱水提取物，更優(yōu)選野木瓜熱水提取物的乙酸乙酯萃取物。
[0077]上述化妝原料組合物用于基礎(chǔ)化妝原料、彩妝原料、潤膚露、頭發(fā)用、頭皮用、刮臉剃須用以及口腔用化妝原料。
[0078]使用上述基礎(chǔ)化妝原料的有乳霜、化妝水、面膜、按摩霜、乳液等。上述彩妝化妝原料有粉底霜、保濕隔離霜、口紅、眼影、眼線筆、睫毛膏、眼線筆等。潤膚露化妝原料有肥皂、液體清潔劑、入浴劑、防曬霜、防曬油等。頭發(fā)用化妝原料有洗發(fā)精、護(hù)發(fā)液、護(hù)法修護(hù)素、摩絲、發(fā)露、潤發(fā)脂、染發(fā)劑、漂白劑或染色護(hù)發(fā)素等。頭皮用化妝原料有生發(fā)油或頭皮護(hù)理植物油等。刮臉用化妝原料有美容水、剃胡膏等?？谇挥没瘖y原料有牙膏、鼠標(biāo)洗滌劑等。
[0079]上述化妝原料組合物除了有效成分外，根據(jù)使用用途及化妝原料組合物的性質(zhì)，一般配合化妝原料組合物的成分有保濕劑、紫外線吸收劑、維生素類、動(dòng)植物提取成分、消化劑、美白劑、血管擴(kuò)張劑、收斂劑、清涼劑、荷爾蒙劑等。而且，上述化妝原料組合物為使藥物或有效成分滲透進(jìn)皮膚組織里，需要某種機(jī)制。
[0080]上述化妝原料組合物的劑型根據(jù)使用用途及化妝原料組合物的性質(zhì)，采用適當(dāng)?shù)男螒B(tài)，例如水溶液系、可融化系、乳化系、乳液系、凝I父系、衆(zhòng)料系、軟骨系、氣霧劑系、水_油2層系或水-油-粉末3層系。上述劑型的例子只是舉例而已。本發(fā)明的化妝原料組合物的劑型及形態(tài)不受上述例子的限制。[0081]以上述化妝原料組合物總重量為準(zhǔn)，上述有效成分可以包含0.001~50重量％，可以優(yōu)選0.01~20重量％。上述含量根據(jù)化妝原料組合物所含有效成分的成分含量，可適當(dāng)調(diào)整。本發(fā)明所含有效成分的含量不受上述含量的限制。
[0082]本發(fā)明涉及包含野木瓜提取物作為有效成分的解熱用組合物。
[0083]上述野木瓜提取物可以根據(jù)通常的植物提取物制造方法制造。例如野木瓜的葉、枝條、根系或皮等，將這些粉碎后，加入野木瓜葉萃取溶劑后提取制作。向制作的提取物加入萃取溶劑，進(jìn)行萃取而制作。
[0084]同其它部位相比，野木瓜葉收獲量大，容易生產(chǎn)，而且，解熱效果突出。上述野木瓜提取物可優(yōu)選野木瓜葉提取物。
[0085]上述萃取溶劑可以是選自由水及有機(jī)溶劑組成的組中的一種以上。上述有機(jī)溶劑可以是碳原子數(shù)I~5的醇、該醇的稀釋水、乙酸乙酯或丙酮等的極性溶劑和乙醚、三氯甲烷、苯、乙烷或二氯甲烷的非極性溶劑或這些物質(zhì)的混合溶劑。
[0086]本發(fā)明的野木瓜提取物的萃取溶劑可以是選自由水、碳原子數(shù)I~5的醇、該醇的稀釋水及其混合物組成的組中的I種以上，更優(yōu)選是選自由水、碳原子數(shù)I~5的醇及其混合物所組成的組中的一個(gè)，最優(yōu)選是水。上述提取過程例如在50°C~150°C、或者75°C~120°C、或者90°C~115°C條件下進(jìn)行，但并不受其限制。而且，上述提取時(shí)間也不是特別限定，可以是10分鐘~12小時(shí)、或者30分鐘~8小時(shí)、或者2小時(shí)~6小時(shí)。
[0087]本發(fā)明的野木瓜葉提取物可以根據(jù)通常的植物提取物制作方法制作。具體地說，可以是包含熱水提取法的熱提取法、冷浸提取法、溫浸提取法、超聲波提取法等，可以采用通常的提取設(shè)備、超聲波粉碎提取機(jī)或粉碎機(jī)。
[0088]采用上述溶劑提取的提取物，之后還可以用選自由乙烷、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇醚、丙酮、丁醇、水及其`混合物所組成的組中的一種以上溶劑進(jìn)行萃取過程。進(jìn)行該萃取時(shí)，可使用兩種以上溶劑，可根據(jù)溶劑的極性依次使用或混合使用，以便制造各溶劑提取物。
[0089]上述所制野木瓜溶劑提取物的萃取物、具體說野木瓜葉熱水提取物的萃取物，可以是乙酸乙酯萃取物、三氯甲烷萃取物或丁醇萃取物，更優(yōu)選的是乙酸乙酯萃取物或三氯甲烷萃取物，最優(yōu)選的是乙酸乙酯萃取物。
[0090]將上述所制提取物或通過上述萃取過程獲得的萃取物進(jìn)行過濾或濃縮或者干燥過程，消除溶劑，也可以進(jìn)行過濾、濃縮及干燥這些全部過程。具體來講，該過濾可以利用過濾紙或減壓過濾機(jī)；該濃縮可以使用減壓濃縮機(jī)，例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機(jī)或減壓濃縮；該干燥可以采用凍結(jié)干燥法。
[0091]上述解熱用組合物可以用于藥劑，或者用于醫(yī)藥或其它藥學(xué)用途，從這些方面來講，上述解熱用組合物可以是醫(yī)藥用組合物，例如可以是解熱劑或解熱鎮(zhèn)痛劑。
[0092]上述解熱用組合物例如用于醫(yī)藥或其它藥學(xué)用途時(shí)，上述解熱用組合物抑制異常發(fā)熱，或者可用于治療或預(yù)防與某種疾病相伴的異常發(fā)熱。
[0093]從這一層面上來講，本發(fā)明可以涉及包含野木瓜提取物作為有效成分的解熱用組合物。包含上述野木瓜提取物、優(yōu)選的是野木瓜葉提取物作為有效成分的解熱用組合物，可以用于抑制或治療異常發(fā)熱或與疾病相伴的異常發(fā)熱，也可用于改善或預(yù)防，具體而言可以是解熱劑或解熱鎮(zhèn)痛劑。[0094]關(guān)于包含上述野木瓜提取物作為有效成分的解熱用組合物，上述野木瓜提取物可以是野木瓜葉熱水提取物，優(yōu)選的是野木瓜葉熱水提取物的三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物，更優(yōu)選的是野木瓜葉熱水提取物的三氯甲烷萃取物或乙酸乙酯萃取物，最優(yōu)選的是野木瓜葉熱水提取物的三氯甲烷萃取物。
[0095]上述異常發(fā)熱是指體溫異常地高。
[0096]上述解熱劑是為消除發(fā)熱或異常發(fā)熱而使用的藥。指的是體溫異常高時(shí)，為降熱而使用的醫(yī)藥品?，F(xiàn)有的解熱劑有安替比林、乙醢胺苯、阿司匹林、沙利比林等。上述解熱劑大都具有緩解陣痛效果，也叫解熱鎮(zhèn)痛劑。
[0097]包含上述野木瓜提取物作為有效成分的解熱用組合物直接適用于人和動(dòng)物。該動(dòng)物是對應(yīng)于植物的生物群，主要攝取有機(jī)物作為營養(yǎng)成分，其分化有消化器官、排泄器官及呼吸器官，優(yōu)選的是哺乳類，更優(yōu)選的是人類。
[0098]上述野木瓜提取物可單獨(dú)用于解熱用組合物內(nèi)。此外，還可以包含藥理學(xué)上允許的載體、成型添加劑、稀釋劑或次要成分。
[0099]更為詳細(xì)的是，將上述野木瓜提取物的組合物用于藥材、醫(yī)藥或醫(yī)學(xué)用途時(shí)，上述野木瓜提取物可利用通常方法，與醫(yī)學(xué)上允許的載體或成型添加劑混合或稀釋劑稀釋后使用。
[0100]這時(shí)，上述組合物內(nèi)野木瓜提取物的含量可以是0.001~99.9重量％、或者0.1~
99重量％、或者1~50重量％，但并不限定在這一范圍里。根據(jù)組合物的使用形態(tài)及使用方法，上述提取物的含量可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行調(diào)整后使用。
[0101]上述藥學(xué)上允許的載體、成型添加劑或稀釋劑的例子，可以是選自由乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、海藻酸、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、細(xì)胞膜質(zhì)、甲基纖維素、微晶細(xì)胞膜質(zhì)、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基安息香酸鹽、滑石、硬脂酸鎂及礦物油、糊精、碳酸鈣、丙二醇、液體石蠟及生理食鹽水所組成的組中的一種以上，但并不限定于此，通常的載體、成型添加劑或稀釋劑都可以使用。載體或成型添加劑可以使用兩種以上。
[0102]另外，上述解熱用組合物還可以包含通常的充填劑、增量劑、結(jié)合劑、崩解劑、抗凝固劑、潤滑劑、濕潤劑、PH調(diào)節(jié)劑、營養(yǎng)劑、維生素、電解質(zhì)、褐藻酸及其鹽、果膠酸及其鹽、保護(hù)性膠體、甘油、香料、乳化劑或防腐劑等。上述成分通過獨(dú)立或組合地向作為上述有效成分的野木瓜葉提取物中追加。
[0103]而且，本發(fā)明的解熱用組合物除了上述有效成分外，還可以包含具有解熱效果的物質(zhì)。
[0104]除了上述有效成分之外，本發(fā)明的解熱劑還可以包含具有解熱作用的化合物或植物提取物，對于上述有效成分100重量份，可以分別包含0.1~99.9重量份或0.5~20重量份。
[0105]上述組合物用作藥劑時(shí)，投藥方法有口服或非口服均可，例如口服、經(jīng)皮、皮下、靜脈或者包括肌肉在內(nèi)的各種途徑用藥。
[0106]上述組合物的劑型根據(jù)使用方法的不同而不同，為了實(shí)現(xiàn)向哺乳動(dòng)物用藥后其活性成分的迅速、持續(xù)或者延遲放出，采用本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法即可實(shí)現(xiàn)劑型化。
[0107]一般來講，口服用固體制劑有片劑、藥片、軟或硬膠囊、藥丸、藥粉及顆粒等，這樣的制劑可混合成成型添加劑制作，例如，淀粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖、明膠等?？诜靡簞┯袘腋?nèi)用液劑、乳劑及糖漿等。常用單純稀釋劑水、液體石蠟以外，還包括成型添加劑，如，濕潤劑、甜味劑、芳香劑、保鮮劑等。
[0108]非口服投藥的形態(tài)可以是乳霜、洗劑、藥膏、膏藥、液體藥劑、噴霧劑、液體提取物、酏劑、浸劑、香囊、護(hù)傷用膏藥、針劑等。
[0109]再者，本發(fā)明的組合物可以使用所屬【技術(shù)領(lǐng)域】公知的適當(dāng)方法或者雷明頓文獻(xiàn)中記載的方法即可實(shí)現(xiàn)劑型化。
[0110]上述組合物的用藥量根據(jù)用藥方法、服用人的年齡、性別、患者疾病的輕重程度、狀態(tài)、體內(nèi)活性成分的吸收度、惰性率藥物來決定，例如以I日有效成分為基準(zhǔn)時(shí)，分別按照0.lmg/kg (體重)~500mg/kg (體重)、或者0.lmg/kg (體重)~400mg/kg (體重)、或者lmg/kg (體重)~300mg/kg (體重)服用，可以一次服用或分?jǐn)?shù)次服用。上述用藥量并不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0111]發(fā)明效果
[0112]本發(fā)明的野木瓜提取物是從食用植物提取的，沒有副作用或安全方面的問題，經(jīng)MTT分析結(jié)果顯示，不僅細(xì)胞毒性非常低，而且，抗炎效果及解熱效果非常突出，可用于抗炎及醫(yī)藥或化妝品和需要解熱效果的藥品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0113]圖1是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的野木瓜葉熱水提取物和上述熱水提取物的溶劑萃取物的制造過程的示意圖。
[0114]圖2是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的野木瓜葉熱水提取物和上述熱水提取物的溶劑萃取物的制造過程的`示意圖。
[0115]圖3是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的利用RAW264.7細(xì)胞株以MTT assay法測定野木瓜葉提取物的細(xì)胞毒性的結(jié)果的圖表，在該圖表中，“ + ”表示處理LPS(1 μ g/mL)或提取物，表示沒有處理，橫軸的SHL數(shù)值表示野木瓜葉熱水提取物的投入量(μ g/mL)，縱軸表示沒有投入任何試料的對照組的對比細(xì)胞毒性的數(shù)值(％)。
[0116]圖4是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的利用RAW264.7細(xì)胞株以MTT assay法測定野木瓜果實(shí)提取物的細(xì)胞毒性的結(jié)果的圖表，在該圖表中，“ + ”表示處理LPS(1 μ g/mL)或提取物，表示沒有處理；橫軸的SH數(shù)值表示野木瓜果實(shí)熱水提取物的投入量(μ g/mL)的數(shù)值。
[0117]圖5是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的利用RAW264.7細(xì)胞株為確認(rèn)野木瓜葉熱水提取物的抗炎效果而測定NO分泌量的圖表，“ + ”表示同時(shí)處理了 LPS (I μ g/mL)，表示沒有處理，橫軸的SHL數(shù)值表示野木瓜葉熱水提取物的投入量(μ g/mL)，縱軸表示只處理了 LPS的對照組的對比NO分泌量的相對值(％)。
[0118]圖6是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的為確認(rèn)野木瓜葉熱水提取物的抗炎效果而測定了作為炎癥相關(guān)細(xì)胞活素的iNOS mRNA水平的圖表，“ + ”表示處理了 LPS(IygAiL)或溶劑萃取物，表示沒有處理試料，橫軸數(shù)值表示野木瓜葉熱水提取物的投入量(μ g/mL) ο
[0119]圖7是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的為確認(rèn)野木瓜葉熱水提取物的抗炎效果而測定了 iNOS及C0X-2的表達(dá)程度的圖表，“ + ”表示處理了 LPS(1 μ g/mL)或溶劑萃取物，表示沒有處理，橫軸數(shù)值表示野木瓜葉熱水提取物的投入量(μ g/mL)。
[0120]圖8是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的使用巨卩遼細(xì)胞(Macrophage primary cell)為確認(rèn)野木瓜果實(shí)提取物的抗炎效果而通過RT-PCR法確認(rèn)與驗(yàn)證有關(guān)的細(xì)胞活素的mRNA含量的結(jié)果的照片，該照片中，“ + ”表示同時(shí)處理了 LPS (I μ g/mL)，表示沒有處理LPS，橫軸表示野木瓜葉熱水提取物的投入量(μ g/mL)，縱軸表示細(xì)胞活素的種類。
[0121]圖9是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的使用巨曬細(xì)胞(Macrophage primary cell)為確認(rèn)野木瓜果實(shí)提取物的抗炎效果而確認(rèn)與驗(yàn)證有關(guān)的細(xì)胞活素中的TNF-a的生產(chǎn)量的圖表，在該圖表中，“ + ”表不同時(shí)處理了 LPS (I μ g/mL), 表不沒有處理LPS,橫軸表不野木瓜葉熱水提取物的投入量(μ g/mL)，縱軸表示TNF-a的生產(chǎn)量。
[0122]圖10是表示使用RAW264.7細(xì)胞株通過MTT檢測方法測定了本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的野木瓜葉提取物的萃取組分的細(xì)胞毒性的結(jié)果的圖表，在所述圖表中，“ + ”表示處理了LPSd μ g/mL)或溶劑萃取組分，表示未處理試料，橫軸的各數(shù)值表示野木瓜葉熱水提取物的各萃取溶劑的萃取物投入量(yg/mL)的數(shù)值，縱軸表示未投入任何試料的對照組的對比細(xì)胞毒性的數(shù)值(%)。
[0123]圖11是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的為確認(rèn)野木瓜葉熱水提取物的萃取組分的抗炎效果而使用RAW264.7細(xì)胞株測定NO分泌量的結(jié)果的圖表，“ + ”表示處理了 LPS (I μ g/mL)或溶劑萃取組分，表示未處理試料，橫軸的文字和數(shù)值表示野木瓜葉熱水提取物的各萃取溶劑的種類和投入量(50 μ g/mL)，縱軸表示只處理了 LPS的對照組的對比NO分泌量的相對值(%)。
[0124]圖12是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的為確認(rèn)野木瓜葉熱水提取物的各溶劑萃取組分的抗炎效果而通過C0X-2的活性測定C0X-2抑制活性的結(jié)果的圖表，劃分各曲線的溶劑表示萃取溶劑，橫軸表示處理后經(jīng)過的時(shí)間，縱軸表示C0X-2的活性。
[0125]圖13是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的為確認(rèn)野木瓜葉熱水提取物的解熱效果而利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對LPS所引發(fā)的發(fā)熱進(jìn)行解熱的結(jié)果的圖表，橫軸數(shù)值表示投入試料后經(jīng)過的時(shí)間h，縱軸數(shù)值表示所測定的體溫。
[0126]圖14是表示本發(fā)明的一實(shí)施例涉及的為確認(rèn)野木瓜葉熱水提取物的萃取組分的解熱效果而利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對LPS所引發(fā)的發(fā)熱進(jìn)行解熱的結(jié)果的圖表，橫軸數(shù)值表示投入試料后經(jīng)過的時(shí)間h，縱軸數(shù)值表示從投入試料前測量的體溫發(fā)生波動(dòng)的體溫變化、即從該時(shí)間測量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體溫減去投入試料前測量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體溫的值。
【具體實(shí)施方式】
[0127]下面，為了有助于理解本發(fā)明，通過具體實(shí)施例和比較例詳細(xì)說明本發(fā)明的構(gòu)成和效果。然而，下述實(shí)施例僅僅是用于更清楚地理解本發(fā)明，本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)解釋為，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書的記載為準(zhǔn)，與其同等范圍內(nèi)的全部技術(shù)思想都屬于本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍。
[0128]<實(shí)施例1>制備野木瓜提取物和萃取組分
[0129]1-1.制備野木瓜提取物
[0130]野木瓜(Stauntonia hexaphylla)葉熱水提取物是通過將IOkg的野木瓜葉用熱水在110°c下執(zhí)行圖1所示的熱水提取法的方法來制備的。此外，野木瓜果實(shí)熱水提取物是通過將2100g野木瓜果實(shí)用40L的熱水在100°C下執(zhí)行圖2所示的熱水提取法的方法來制備的。
[0131]更具體地說，對用蒸餾水洗滌過的IOkg野木瓜葉加入200L的蒸餾水之后，利用電煎藥器在100°C下加熱3小時(shí)的同時(shí)進(jìn)行熱水提取。此外，對用蒸餾水洗滌過的2100g野木瓜果實(shí)加入40L的蒸餾水之后，利用電煎藥器在100°C下加熱3小時(shí)的同時(shí)進(jìn)行熱水提取。
[0132]進(jìn)行所述提取之后，用400目濾布過濾各提取物，之后利用減壓旋轉(zhuǎn)濃縮機(jī)分別濃縮所獲得的濾液。過濾后剩余的殘留物中再加入相同量的蒸餾水，執(zhí)行2次相同過程，即提取、過濾及減壓過程。
[0133]利用冷凍干燥機(jī)(Freeze dryer)冷凍干燥通過所述過程制備的野木瓜葉熱水提取液和野木瓜果實(shí)熱水提取液。通過所述冷凍干燥獲得了 Ikg的野木瓜葉熱水提取物，由此可知，所述野木瓜葉熱水提取法的收獲率為10%。此外，通過所述冷凍干燥獲得了 148g的野木瓜果實(shí)熱水提取物，由此可知，所述野木瓜果實(shí)熱水提取法的收獲率為7%。
[0134]1-2.制備野木瓜提取物的萃取組分
[0135]通過圖1或圖2所示的制備方法進(jìn)行野木瓜葉熱水提取物和野木瓜果實(shí)熱水提取物的萃取組分的制備。
[0136]具體地說，使250g所述野木瓜葉熱水提取物完全溶解在5L的蒸餾水中之后，放入分液漏斗中，添加5L的己烷(Hexane)，混合之后進(jìn)行萃取，分離出作為己烷可溶層的己烷層和作為己烷不溶層的水層，只獲取己烷層，從而制得了己烷萃取液。
[0137]在剩余的溶液(水層)中添加5L的氯仿(chloroform)，混合之后進(jìn)行萃取，分離出作為氯仿可溶層的氯仿層和作為氯仿不溶層的水層，只獲取氯仿層，從而制得了氯仿萃取液。
`[0138]在剩余的溶液(水層)中添加5L的乙酸乙酯，混合之后進(jìn)行萃取，分離出作為乙酸乙酯可溶層的乙酸乙酯層和作為乙酸乙酯不溶層的水層，只獲取乙酸乙酯層，從而制得了乙酸乙酯萃取液。
[0139]在剩余的溶液(水層)中添加5L的丁醇，混合之后進(jìn)行萃取，分離出作為丁醇可溶層的丁醇層和作為丁醇不溶層的水層，只獲取丁醇層，從而制得了丁醇萃取液。
[0140]將萃取分離出所述丁醇可溶層后剩下來的丁醇不溶層濃縮，除去剩余的有機(jī)溶劑，從而制得了水萃取液。
[0141]將獲得的所述各萃取液利用減壓過濾裝置過濾且濃縮之后，在_20°C下冷凍干燥而將溶劑完全去除，之后用于本實(shí)驗(yàn)中。通過所述過程獲得了 0.02g的己烷萃取組分(0.015%)、0.67g的氯仿萃取組分(0.27%)、2g的乙酸乙酯萃取組分(1.05%) ,68.75g的丁醇萃取組分(27.5%)，作為試料使用。
[0142]在所述制備過程中，關(guān)于己烷萃取組分，由于收獲率太低，因此進(jìn)行工業(yè)化可能出現(xiàn)工藝上的問題，所以評價(jià)為不適合。所獲得的所述提取物和萃取組分冷凍保存，直到在實(shí)驗(yàn)中使用。此外，當(dāng)用丁醇萃取和水萃取時(shí)，被確認(rèn)具有良好的收獲率，因此由于萃取組分制備效率方面具有高收獲率，其經(jīng)濟(jì)性被認(rèn)可，被評價(jià)為工業(yè)應(yīng)用效果良好。
[0143]此外，所述野木瓜果實(shí)熱水提取物的萃取組分通過如下方法制備:使40g的所述野木瓜果實(shí)熱水提取物完全溶解在IL的蒸餾水中，放入分液漏斗中，并通過如上所述方法分別添加萃取溶劑，即分別添加IL的己烷、氯仿、乙酸乙酯和丁醇，混合之后進(jìn)行萃取，分離出溶劑可溶層。
[0144]將所獲得的所述野木瓜果實(shí)熱水提取物的萃取液利用減壓過濾裝置進(jìn)行過濾濃縮之后，在_20°C下進(jìn)行冷凍干燥而將溶劑完全去除，之后用于本實(shí)驗(yàn)。通過所述過程獲得了 0.1g的己烷萃取組分、0.6g的氯仿萃取組分、2g的乙酸乙酯萃取組分、15g的丁醇萃取組分，作為試料使用。
[0145]<實(shí)施例2>提取物和萃取組分的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0146]為了檢測在所述實(shí)施例1中制備的野木瓜葉熱水提取物、野木瓜果實(shí)熱水提取物和野木瓜葉熱水提取物的萃取組分的細(xì)胞毒性，從ATCC購買了作為鼠巨噬細(xì)胞的RAW264.7細(xì)胞使用。
[0147]用于所述細(xì)胞培養(yǎng)(Cellculture)的 DMEM/F12 (Dulbecco，s modified Eagle’smedium/Nutrient Mixture Ham’s F12)、FBS(fetal bovine serum)、L-谷氨酉先胺(L-glutamine)和青霉素-鏈霉素,從Gibco/BRL(USA)購買的。
[0148]所述RAW264.7細(xì)胞是在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的FBS、1%的青霉素鏈霉素和1%的L-谷氨酰胺進(jìn)行培養(yǎng)的，在37°C濕潤的CO2培養(yǎng)箱(5%的C02/95%的空氣)中培養(yǎng)。
[0149]培養(yǎng)的所述細(xì)胞占培養(yǎng)皿約80%之后，用PBS(pH7.4)沖洗細(xì)胞單層之后進(jìn)行洗滌，并用0.25%的胰蛋白酶和2.56mmol/L的EDTA處理，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基為每2天交
換一次。
`[0150]培養(yǎng)的所述細(xì)胞以50000個(gè)細(xì)胞/孔的密度分株于48孔板上，進(jìn)一步培養(yǎng)了 24小時(shí)。經(jīng)過所述24小時(shí)之后，分成對照組和實(shí)驗(yàn)組，該對照組是未經(jīng)任何處理而只進(jìn)行LPS處理的，該實(shí)驗(yàn)組是對所述實(shí)施例1的野木瓜葉提取物及萃取組分使用LPS和經(jīng)確認(rèn)對細(xì)胞的存活沒有影響的二甲基亞砜(DMSO)而處理制備成不同濃度的野木瓜葉提取物及萃取組分的，而且進(jìn)一步培養(yǎng)了 24小時(shí)之后，除去培養(yǎng)液，之后采用MTT分析(MTT assay)法測量了活細(xì)胞的數(shù)量。所述MTT分析是通過如下方法來進(jìn)行的。
[0151]首先，除去細(xì)胞培養(yǎng)基之后，將含有MTT (I mg /ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔處理lml，并在37°C濕潤的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)一步培養(yǎng)了 4小時(shí)。之后，除去培養(yǎng)基之后，除去溴化四唑(tetrazoliumbromide)鹽,分株出200 μ I的二甲基亞砜(DMSO)來溶解在各孔中生成的甲臜結(jié)晶，并利用酶標(biāo)儀(BIO-RAD)檢測540nm波長下的吸光度來確認(rèn)細(xì)胞的存活率。
[0152]用所述野木瓜葉提取物處理的結(jié)果是同樣地進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)3次而測得的值的平均值，表示在圖3中，用所述野木瓜果實(shí)熱水提取物處理的結(jié)果是同樣地進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)3次而測得的值的平均值，表示在圖4中，用所述野木瓜葉熱水提取物的萃取組分處理的結(jié)果是同樣地進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)3次而測得的值的平均值，表示在圖10中。
[0153]如圖3所示，對所述實(shí)施例1-1中制備的野木瓜葉熱水提取物按不同濃度進(jìn)行處理，具體地說，分別按50 μ g/ml至200 μ g/ml為止的各濃度處理野木瓜葉熱水提取物，即使經(jīng)過了 24小時(shí)的情況下，也不處理任何試料，而與只用LPS處理的對照例進(jìn)行比較，被確認(rèn)為對所有細(xì)胞的增殖沒有其它影響。因此，從所述結(jié)果確認(rèn)，野木瓜葉提取物直至200μ g/ml為止沒有細(xì)胞毒性。
[0154]此外，如圖4所示，對所述實(shí)施例1-1中制備的野木瓜果實(shí)提取物按不同濃度進(jìn)行處理，具體地說，分別按10 μ g/ml至200 μ g/ml為止的各濃度進(jìn)行處理，即使經(jīng)過了 24小時(shí)的情況，也不處理任何試料，而與只用LPS處理的對照例進(jìn)行比較，其結(jié)果確認(rèn)，對所述實(shí)施例1中制備的野木瓜果實(shí)提取物以不同濃度處理時(shí)，對所有細(xì)胞的增殖沒有顯著影響。因此，從所述結(jié)果確認(rèn)，野木瓜葉提取物直至200μ g/ml為止沒有細(xì)胞毒性。
[0155]此外，如圖10所示，關(guān)于在所述實(shí)施例1-2中制備的野木瓜葉熱水提取物的萃取組分，對己烷萃取組分而言，在投入25 μ g/ml的實(shí)驗(yàn)組中確認(rèn)到細(xì)胞存活率顯著下降，從而確認(rèn)具有細(xì)胞毒性。此外，對乙酸乙酯萃取組分而言，投入100yg/ml的實(shí)驗(yàn)組，雖然并不顯著，但細(xì)胞存活率略微下降，而追加投入200 μ g/ml的實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞存活率顯著下降，因此，確認(rèn)直到100 μ g/ml為止是安全的。此外，其它溶劑的情況下，50 μ g/ml或100 μ g/ml時(shí)，細(xì)胞存活率得以維持，除了己烷之外以其它溶劑作為萃取溶劑使用的萃取組分的情況下，投入50 μ g/ml時(shí)，確認(rèn)沒有細(xì)胞毒性，是安全的。
[0156]<實(shí)施例3>野木瓜葉提取物和萃取組分的抗炎效果的檢測
[0157]為了確認(rèn)在所述實(shí)施例1中制備的野木瓜葉提取物和萃取組分的抗炎效果，利用了在所述實(shí)施例2中培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞。
[0158]將在所述實(shí)施例1中制備的野木瓜葉熱水提取物或野木瓜葉熱水提取物的溶劑萃取組分和LPS —同添加之后，按照所述實(shí)施例2的方法培養(yǎng)24小時(shí)，之后又培養(yǎng)了所述24小時(shí)。培養(yǎng)的所述培養(yǎng)基以3000rpm離心分離5分鐘，分離出上層液，在分離出的所述上層液中加入相同量的格里斯(Griess)試劑(1%的磺胺(sulfanilamide)、0.1%的萘基乙二胺二鹽酸鹽(naphthyl-ethylene diamine dihydrochloride)、2% 的憐酸(phosphoricacid)，美國Promega 公司制)進(jìn)行反應(yīng)之后，測量了 540nm下的NO分泌量，其結(jié)果表示在圖5和圖11中。
[0159]如圖5所示，未用LPS處理的對照組的情況下，確認(rèn)NO分泌量低。而與此相反，添加了 LPS的實(shí)驗(yàn)組的情況下，由于LPS導(dǎo)致炎癥，確認(rèn)NO的含量顯著增加。此外，盡管用LPS進(jìn)行了處理，但是用在所述實(shí)施例1中制備的野木瓜葉熱水提取物處理了的情況下，按照濃度NO分泌量減少，特別是野木瓜葉熱水提取物的情況下，以100μ g/ml處理了時(shí)，NO分泌量減少到LPS導(dǎo)致炎癥的對照組的約80%，以200 μ g/ml處理了時(shí)，NO分泌量減少到小于LPS導(dǎo)致炎癥的對照組的70%，由此可確認(rèn)野木瓜葉提取物的抗炎效果。
[0160]在所述實(shí)施例2中，所述野木瓜葉熱水提取物以200 μ g/ml處理了時(shí)，對細(xì)胞存活也沒有影響，因此確認(rèn)沒有細(xì)胞毒性，所以本發(fā)明的野木瓜葉提取物被確認(rèn)不僅沒有細(xì)胞毒性且安全，還具有良好的抗炎效果。
[0161]此外，如圖11所示，在實(shí)施例2中確認(rèn)，以50μ g/ml處理了時(shí)，所有種類的萃取組分都安全，但用水萃取時(shí)，確認(rèn)NO分泌量幾乎沒有減少。此外，用丁醇萃取時(shí)，確認(rèn)NO分泌量相對于對照組為60%，被確認(rèn)具有抗炎效果。另一方面，野木瓜葉熱水提取物的氯仿萃取組分及乙酸乙酯萃取組分的情況下，確認(rèn)NO分泌量相對于對照組小于20%，在細(xì)胞毒性方面不成為問題的濃度下，乙酸乙酯萃取組分及氯仿萃取組分確認(rèn)具有良好的顯著抑制NO生成的效果。
[0162]<實(shí)施例4>通過檢測炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平確認(rèn)抗炎效果
[0163]為了再次確認(rèn)在所述實(shí)施例3中通過NO分泌量被確認(rèn)為具有良好抗炎效果的野木瓜葉熱水提取物的抗炎效果，利用巨噬細(xì)胞(原代細(xì)胞)確認(rèn)了與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子(cytokine),具體地說iNOS的mRNA含量變化。
[0164]為了獲得所述巨噬細(xì)胞(原代細(xì)胞)，從山姆塔克公司(韓國)購買了體重為15g至20g的4周齡雄性小鼠(ICR小鼠、雄性)和SD (Sprague-Dawley)大鼠各32只，分別分為16組，每組放置4只飼養(yǎng)。所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)，在20°C至24°C的溫度條件、60%至70%的濕度條件以及以12小時(shí)為周期晝夜照明的條件下進(jìn)行的，水和飼料自由攝取。所述飼料利用了固體飼料(韓國三洋飼料公司)。所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以所述條件飼養(yǎng)7天后，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境之后，用于實(shí)驗(yàn)中。
[0165]將從所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得的巨噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞的原代細(xì)胞，2X IO6個(gè)細(xì)胞/ml)，采用血清饑餓法(serum starvation medium)培養(yǎng)24小時(shí)。所述培養(yǎng)之后,用LPS (0.5mg/ml)或LPS(0.5mg/ml)和不同濃度的野木瓜葉熱水提取物進(jìn)行處理之后，培養(yǎng)24小時(shí)。所述24小時(shí)之后，分別從培養(yǎng)的所述細(xì)胞中分離出RNA。所述RNA的分離以如下方法進(jìn)行。
[0166]具體地說，將培養(yǎng)的所述細(xì)胞用GIT溶液(easy BLUE Total RNA提取試劑盒，韓國Intron Biotechnology (株))溶解(Iysis),在室溫下以1000Orpm離心分離5分鐘之后，除去上清液，獲得顆粒(pellet)。在所述顆粒中，添加0.1%的DEPC溶液(美國Sigma公司)1ml，以12000rpm再次離心分離2分鐘，除去上清液之后，獲得顆粒。在所獲得的所述顆粒中添加0.5ml的胍鹽(guanidinium),接著進(jìn)行潤旋(vortexing)。此外，添加0.5ml的苯酹 / 氯仿 / 異戍醇(phenol/chloroform/iso-amylalchol)混合溶液(25:24:1),接著渦旋之后，以12000rpm離心分離3分鐘，獲得上清液。添加與所述上清液相同量的異丙醇(iso-propylalcol)之后充分混合,在_20°C下放置30分鐘。之后，以12000rpm離心分離10分鐘，除去上清液之后，用70%的乙醇水溶液洗滌(washing)顆粒，并在真空下干燥，分離出 RNA。
[0167]用Iml的0.P/oDEPC溶液溶解所分離出的所述RNA，用于檢測炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA含量。檢測作為所述炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的iNOS的mRNA含量，以如下方法進(jìn)行。
[0168]在分離出的3 μ g的所述RNA中，添加上標(biāo)II逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript II reversetranscriptase,美國 Invitrogen 公`司)，在 42°C下培育(incubation) I 小時(shí) 45 分鐘之后，在70°C下培育15分鐘，獲得了 cDNA。獲得的所述cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)法進(jìn)行定量。用于進(jìn)行所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列及實(shí)驗(yàn)條件記載在下述表1中。
[0169]【表1】
檢查對象mRNA引物序列退火TmfC)
「 ?I
[0170]iNOSM義(sense.) CAGAGGACCCAG,\GACAAGM) S

反義(ant1-sense) ACCTGATGTTGCCATTGTTG
_^_I_^_
[0171]將所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果和肌動(dòng)蛋白(β-actin)含量進(jìn)行比較，并將其拍攝成照片的結(jié)果表示在圖6中。
[0172]如圖6所示，未用LPS處理的對照組，完全沒有確認(rèn)到作為與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子(cytokine)的iNOS的mRNA,與此相反,只用LPS處理了的情況下,確認(rèn)iNOS的mRNA顯著高。此外，盡管用LPS進(jìn)行了處理，但是用在所述實(shí)施例1中制備的野木瓜葉熱水提取物處理了的情況下，確認(rèn)按照濃度iNOS的mRNA含量減少。用所述野木瓜葉熱水提取物處理時(shí)，根據(jù)按照濃度iNOS的mRNA含量減少的結(jié)果，確認(rèn)所述野木瓜葉熱水提取物具有良好的抗炎效果。
[0173]<實(shí)施例5>確認(rèn)炎癥相關(guān)iNOS和C0X-2表達(dá)抑制活性
[0174]為了再次確認(rèn)在所述實(shí)施例3和實(shí)施例4中通過NO分泌量和iNOS的mRNA含量減少效果被確認(rèn)為具有良好抗炎效果的野木瓜葉熱水提取物的抗炎效果，確認(rèn)了 iNOS和C0X2表達(dá)(expression)抑制活性。
[0175]具體地說，利用DMEM培養(yǎng)基將在所述實(shí)施例4中獲得的巨噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞的原代細(xì)胞)調(diào)整到I X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，之后接種到24孔板，在5%的CO2恒溫器中培養(yǎng)接近18小時(shí)。所述培養(yǎng)之后，分別用不同濃度的野木瓜葉熱水提取物(0.1 μ g/mlU μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml和200 μ g/ml)進(jìn)行處理,培養(yǎng)I小時(shí)之后用LPS (I μ g/ml)進(jìn)行處理，并在與之前的培養(yǎng)條件相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)之后收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline、PBS)洗漆3次,然后添加細(xì)胞裂解緩沖液(50mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH7.5)、150mM的氯化鈉(NaCl)、1%諾乃洗滌劑P-40、2mM的EDTA、ImM的EGTA、ImM的偏釩酸鈉(NaV03)、IOmM的氟化鈉(NaF)、ImM的二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、ImM 的苯甲基橫酸氟(phenylmethyIsulfonyI fluoride)、25 μ g/ml 的抑肽酶(aprotinin) >25 μ g/ml的亮肽素(Ieupeptin)),在4°C下溶解30分鐘之后,在4°C下以15000rpm離心分離15分鐘，除去細(xì)胞膜成分等。
[0176]蛋白質(zhì)濃度是以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，使用了 Bio-Rad公司蛋白檢測試劑盒(Protein Assay Kit)進(jìn)行定量。將被分離出的蛋白質(zhì)20 μ g加載在10%的微型凝膠SDS-PAGE,進(jìn)行變性分離，使其在350mA條件下移動(dòng)(transfer) I小時(shí)至硝酸纖維素膜(membrane, BIO-RAD, Richmond, CA, USA)。封閉(blocking)用于移動(dòng)所述蛋白質(zhì)的膜(membrane)的工作，在含`有5%的脫脂牛奶的TTBS (0.l%Tween20+TBS)溶液中室溫下進(jìn)行2小時(shí)。
[0177]在TTBS溶液中，將作為檢查iNOS表達(dá)水平的抗體的抗小鼠iNOS (Calbiochem，LaJolla, USA)，作為檢查C0X-2表達(dá)水平的抗體的抗小鼠C0X-2 (BD BiosciencesPharmingen, SanJose, USA),以1:1000稀釋，在室溫下使其反應(yīng)2小時(shí)之后，用TTBS洗漆3次。作為二次抗體，將結(jié)合有辣根過氧化物酶HRP(horse radish peroxidase)的抗小鼠 IgG(Amersham Pharmacia Biotech, LittleChalfont, UK)以 1:5000 稀釋，在室溫下使其反應(yīng)30分鐘之后，用TTBS洗滌3次，并與ECL基質(zhì)(AmershamBiosciences, Piscataway, NJ, USA)反應(yīng)30秒之后，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemiluminescence imaging system, ATTO AE_9150EZ_Capture II，Japan)檢測表達(dá)水平。所檢測的上述表達(dá)水平示于圖7。
[0178]如圖7所示，未用LPS處理的對照組中，完全沒有確認(rèn)到與炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)、SPiNOS和C0X-2，而與此相反，只用LPS處理的情況下，被確認(rèn)到iNOS和C0X-2明顯較高。此外，盡管用LPS進(jìn)行了處理，但是用在所述實(shí)施例1中制備的野木瓜葉熱水提取物處理的情況下，被確認(rèn)為根據(jù)濃度iNOS和C0X-2含量減少。用所述野木瓜葉熱水提取物處理時(shí)，從根據(jù)濃度iNOS和C0X-2含量減少的結(jié)果，確認(rèn)為所述野木瓜葉熱水提取物具有良好的抗炎效果。[0179]<實(shí)施例6>通過測定炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平來確認(rèn)抗炎效果
[0180]為了確認(rèn)在所述實(shí)施例1中制備的野木瓜果實(shí)熱水提取物的抗炎效果，利用原代細(xì)胞(primary cell)確認(rèn)了與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子(cytokine)的mRNA含量變化。
[0181]為了獲得所述原代細(xì)胞，從山姆塔克公司購買了體重為15g至20g的4周齡雄性小鼠(ICR小鼠、雄性)和SD大鼠各32只，分別分為16組，每組放置4只飼養(yǎng)。所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)，在20°C至24°C的溫度條件、60%至70%的濕度條件以及以12小時(shí)為周期晝夜照明的條件下進(jìn)行的，水和飼料自由攝取。所述飼料利用了固體飼料(韓國三洋飼料公司)。所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以所述條件飼養(yǎng)7天，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境之后，用于實(shí)驗(yàn)。
[0182]將從所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得的巨噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞的原代細(xì)胞，2X IO6個(gè)細(xì)胞/ml)，采用血清饑餓法(serum starvation medium)培養(yǎng)24小時(shí)。所述培養(yǎng)之后,用LPS (0.5mg/ml)或LPS(0.5mg/ml)和不同 濃度的野木瓜果實(shí)熱水提取物進(jìn)行處理之后，培養(yǎng)24小時(shí)。所述24小時(shí)之后，分別從培養(yǎng)的所述細(xì)胞中分離出RNA。所述RNA的分離以如下方法進(jìn)行。
[0183]具體地說，將培養(yǎng)的所述細(xì)胞用GIT溶液(easy BLUE總RNA提取試劑盒，韓國Intron Biotechnology (株))溶解(Iysis),在室溫下以1000Orpm條件離心分離5分鐘之后，除去上清液，獲得顆粒(pellet)。在所述顆粒中，添加0.1%的DEPC溶液(美國Sigma公司)1ml，以12000rpm條件再次離心分離2分鐘，除去上清液之后，獲得顆粒。在所獲得的所述顆粒中添加0.5ml的胍鹽(guanidinium),接著進(jìn)行潤旋(vortexing)。此外,添加0.5ml的苯酹 / 氯仿 / 異戍醇(phenol/chloroform/iso-amylalchol)混合溶液(25:24:1),接著進(jìn)行渦旋之后，以12000rpm條件離心分離3分鐘，獲得上清液。添加與所述上清液相同量的異丙醇(iso-propylalcol)之后充分混合,在_20°C下放置30分鐘。之后，以12000rpm離心分離10分鐘，除去上清液之后，用70%的乙醇水溶液洗滌(washing)顆粒，并在真空下干燥分離出RNA。
[0184]用Iml的0.P/oDEPC溶液溶解所分離出的所述RNA，用于檢測炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA含量。
[0185]檢測作為所述炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的IL-1 β、IFN- Y和TNF- α的mRNA含量，以如下方法進(jìn)行。
[0186]在分離出的3 μ g所述RNA中，添加上標(biāo)II逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript II reversetranscriptase)(美國 Invitrogen 公司)，在 42°C 下培育(incubation) I 小時(shí) 45 分鐘之后，在70°C下培育(incubation) 15分鐘，獲得了 cDNA。獲得的所述cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)法進(jìn)行定量。用于進(jìn)行所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列及實(shí)驗(yàn)條件記載在下述表2中。
[0187]【表2】
[0188]
【權(quán)利要求】
1.一種抗炎組合物，其中， 作為有效成份含有野木瓜提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗炎組合物，其中， 所述野木瓜提取物為野木瓜葉提取物或野木瓜果實(shí)提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗炎組合物，其中， 所述野木瓜提取物是用選自由水、碳原子數(shù)為I至5的醇及其混合物所組成的組中的一種以上的萃取溶劑萃取所述野木瓜葉或者野木瓜果實(shí)而得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗炎組合物，其中， 所述野木瓜提取物是野木瓜葉熱水提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗炎組合物，其中， 所述野木瓜葉熱水提取物是將乙酸乙酯或氯仿作為萃取溶劑萃取野木瓜葉熱水提取物的萃取組分。
6.一種用于治療和預(yù)防炎癥性疾病的藥物組合物，其中， 作為有效成份含有野木瓜提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于治療和預(yù)防炎癥性疾病的藥物組合物，其中， 所述野木瓜提取物是將乙 酸乙酯或氯仿作為萃取溶劑萃取野木瓜葉熱水提取物的萃取組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于治療和預(yù)防炎癥性疾病的藥物組合物，其中， 所述炎癥性疾病為選自由皮炎、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、過敏癥、全身性紅斑狼瘡、天皰瘡、阿弗他口炎、視網(wǎng)膜炎、胃炎、肝炎、支氣管炎、食管炎、結(jié)腸炎、胰炎、結(jié)腸炎、腎炎、褥瘡、紅斑狼瘡、慢性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、敗血癥、輻射損傷、器官移植排斥反應(yīng)、全身性水腫和局部水腫所組成的組中的任一種。
9.一種緩解炎癥或緩解用化妝原料組合物，其中， 作為有效成份含有野木瓜提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的緩解炎癥或緩解用化妝原料組合物，其中， 所述野木瓜提取物是將乙酸乙酯或氯仿作為萃取溶劑萃取野木瓜葉熱水提取物的萃取組分。
11.一種解熱用組合物，其中， 作為有效成份含有野木瓜提取物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的解熱用組合物，其中， 所述野木瓜提取物是用選自由水、碳原子數(shù)為I至5的醇及其混合物所組成的組中的一種以上萃取溶劑萃取野木瓜葉而得到的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的解熱用組合物，其中， 所述野木瓜提取物是將氯仿、丁醇或乙酸乙酯作為萃取溶劑萃取野木瓜葉熱水提取物的萃取組分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的解熱用組合物，其中， 所述萃取溶劑是乙酸乙酯或氯仿。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的解熱用組合物，其中， 所述萃取溶劑是乙酸乙酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的解熱用組合物，其中，所述解熱用組合物是解熱藥或解 熱鎮(zhèn)痛藥。
【文檔編號】A61K36/71GK103826651SQ201280045043
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月18日
【發(fā)明者】崔徹雄, 潘相吾, 薛熙珍, 李圭玉, 樸嘉賢, 金熙淑, 張旭鎮(zhèn), 金炫, 李東旭, 金善晤, 金載甲 申請人:財(cái)團(tuán)法人全南生物產(chǎn)業(yè)振興院, 永進(jìn)藥品工業(yè)株式會社