來自蘋果的主要變應原Mal d 1的低變應原性變體的制作方法
【專利摘要】公開了蘋果主要變應原Mal?d?1的低變應原性變體，及其在治療變應性疾病中的用途。
【專利說明】來自蘋果的主要變應原Mal d 1的低變應原性變體
[0001]本發(fā)明涉及Mal dl蛋白質(zhì)的低變應原性序列變體、編碼其的核酸分子、包含其的藥物組合物以及它們在由蘋果(Malus domestica)物種導致的變應性疾病的免疫療法中的用途。
【背景技術】
[0002]變態(tài)反應由免疫系統(tǒng)功能異常導致，所述免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生IgE-類抗體與主要包含在花粉、螨、上皮和食品中的無害蛋白質(zhì)反應。
[0003]最近的評估表明工業(yè)化國家中超過25%的人口患有該疾病，如果疾病持續(xù)不愈，則可以導致癥狀惡化(例如出現(xiàn)哮喘)或?qū)ζ渌儜旅?，由此造成更難以選擇最適當?shù)闹委煛?br> [0004]在世界范圍內(nèi)，約三分之一的變應性對象是對樹木花粉過敏。在溫帶地區(qū)，屬于山毛櫸目(Fagales)的樹(樺樹、榿木、榛樹、橡樹和角樹)的花粉是變應性哮喘和鼻炎的主要原因之一。對樺樹花粉變應的患者約95%產(chǎn)生抗Bet vl的IgE抗體，60%的這類患者僅與Bet vl(以登錄號X15877保存在GenBank的cDNA)反應，這是樺樹花粉的主要變應原(I )。
[0005]在食用某些食物(蘋果、胡蘿卜、榛子和芹菜)后，對樺樹花粉變應的個體高百分比(50%-93%)出現(xiàn)變應反應。樺樹花粉變應患者中的這類超敏性被描述為“花粉-食物綜合征(PFS)”，其特征是對水果、堅果和蔬菜的變應性。癥狀范圍從上消化道粘膜的反應(口服變態(tài)反應綜合征)和胃腸道的反應至蕁麻疹和哮喘，在某些情況下可以導致過敏性休克。對水果的負面反應最常見于蘋果中。在由樺樹花粉導致的花粉熱的情況下，該綜合征主要是由Bet vl最初誘導的交叉反應性IgE抗體介導(2)。
[0006]這類患者的治療主要基于避免從膳食中攝入食物變應原。對于治療對花粉、動物和螨的變態(tài)反應，已經(jīng)證實了脫敏特異性免疫療法(SIT)是有效的病原治療形式，與藥理治療不同，前者積極地影響著作為這類疾病`的基礎的一些免疫學參數(shù)。SIT涉及施用增加劑量的獲自導致疾病的物質(zhì)的標準提取物(疫苗)(3)。以這種方式，在患者中逐步誘導出對該物質(zhì)的一類“免疫耐受”，同時伴隨著變態(tài)反應癥狀的降低(如果不是消失的話)。但是，考慮到引起嚴重副作用(包括過敏性休克)的高風險，特定的免疫療法通常不用于治療食物變態(tài)反應。
[0007]雖然Bet vl和同源食物蛋白質(zhì)之間的交叉反應性是PFS誘導的反應的潛在原因，但已發(fā)現(xiàn)，使用樺樹花粉的SIT不導致食物變態(tài)反應癥狀的任何改善。
[0008]在胡蘿卜變態(tài)反應中已經(jīng)觀察到了該無效作用，胡蘿卜變態(tài)反應主要是由Bet vl的同源物——變應原Dau Cl導致的，其中初發(fā)敏化作用是對樺樹變應原發(fā)生的，而在食用胡蘿卜后，后續(xù)的敏化作用則是針對不與Bet vl交叉反應的Dau cl的新表位的(4)。
[0009]在治療蘋果變態(tài)反應中，使用樺樹花粉提取物的SIT產(chǎn)生了有爭議的，有時是有利的結果，可能是由于Bet vl和Mal dl之間更高的序列同一性導致的(氨基酸序列為60%，與 Dau Cl 僅為 40%)ο
[0010]在1998年的一項研究中，用基于樺樹花粉提取物的SIT治療的對樺樹和蘋果過敏的患者中的84%的患者中，經(jīng)過第一年的治療后，出現(xiàn)食用蘋果后的OAS (口服變態(tài)反應綜合征)癥狀的顯著降低(50%-95%)或完全消失(5)。在2004年公開的一項更新的研究中，使用樺樹花粉提取物的SIT僅在3個月的治療后，就導致了對Bet vl和Mal dl的SPT反應性的顯著降低。由Bet vl強烈誘導的IgG4抗體表現(xiàn)出與Mal dl的交叉反應性，因此支持這樣的假設，即，抗樺樹花粉變態(tài)反應的SIT也可以降低對含有Bet vl同源性變應原的食物變態(tài)反應(6)。同年公開的另一項研究(2004)顯示，在對樺樹和蘋果過敏的患者中，基于樺樹花粉提取物的SIT顯著改善了由花粉導致的變應性癥狀，但不降低蘋果變態(tài)反應的嚴重程度(7)。
[0011]因此，基于現(xiàn)有知識，不能確定的認為使用樺樹花粉變應原的免疫療法為對含有Bet vl同源物的食物的變態(tài)反應的情形提供顯著好處，所述情形因此應該作為獨立的疾病進行治療。
[0012]針對Bet vl的PFS交叉反應性最常涉及的變應原之一是Mal dl,這是屬于薔薇科
(Rosaceae)的水果-蘋果-的主要變應原。Mal dl與Bet VI共享約60%的氨基酸序
列(同一性)，交叉反應性實驗證實了存在共同的IgE和T表位(8，9)。
[0013]Mal dl(登錄號Q9SYW3或AJ417551)是159個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為17.7kDa
(10)。該變應原屬于“發(fā)病機制相關蛋白”的PR-10家族，即，由植物響應環(huán)境脅迫或病理性脅迫時產(chǎn)生的遍在蛋白質(zhì)，其功能被認為與類固醇運輸相關。Mal dl位于蘋果的果皮和果肉中。測量多種蘋果變種的蛋白質(zhì)提取物中的Mal dl含量證實該變應原在不同變種中以相當不同的濃度存在；在生長于不同地區(qū)的同一變種中也發(fā)現(xiàn)了 Mal dl含量的變化。此外，即使是在具有低Mal dl含量的變種中，也觀察到變應原濃度在果實的成熟和儲藏過程中顯著增加。
`[0014]Mal dl由具有至少18個成員的基因家族所表不,其特征是基因中存在或缺少內(nèi)含子。一些成員在不同的蘋果變種中是高度保守的(Mai dl.0UMal dl.02)，而其他成員則存在更大的變化(Mai dL04、Mal dl.05、Mal dl.06A、B、C) (11)。當在花粉-食物綜合征的患者中進行SPT分析時，觀察到了在由Mal dl.04和Mal dl.06A基因編碼的蛋白質(zhì)變體之間的關聯(lián)性，以及蘋果變種的更大的變應原性。該類研究的結果可應用于鑒別和培育具有較低變應原性的蘋果變種，用作食物或常規(guī)免疫療法的原材料。
[0015]出現(xiàn)用于特定免疫療法的低變應原性食物變應原可代表避免食物變應原的良好替代方案，以及允許治療疾病，所述疾病涉及對患者健康的高風險，對生活質(zhì)量具有顯著的負面影響，并可以導致不適的營養(yǎng)失衡。
[0016]近年來，大量的注意力集中在研發(fā)更安全、更有效的疫苗，包括在對IgE結合重要的氨基酸水平誘變重組蛋白質(zhì)，即，在不導致副作用的條件下有利的影響疾病天然進程的低變應原性變體(12)。
[0017]文獻中可獲得關于Mal dl或?qū)儆谒N薇科的其他果實的同源蛋白質(zhì)的低變應原性變體的一些研究。
[0018]基于Bet vl和Mal dl之間的交叉反應性,通過定點誘變同種型Mal d 1.0108上的5個氨基酸殘基(T10P ;I30V、T57N、T112C和I113V)，生產(chǎn)主要的蘋果變應原——Maldl——的突變體，所述突變體是通過與Bet vl變應原的低變應原性突變體類似選定的
(9)。由SPT和DBPCFC (雙盲安慰劑-對照的食物刺激)分析證實，取代所述氨基酸降低了Mal dl的90%的變應原活性。與Bet vl的類似物突變體和相應的野生型分子平行的測試了具有5個氨基酸取代的相同突變體(13)。雖然在免疫印跡測試中，對樺樹和蘋果過敏的患者的血清表現(xiàn)出對Bet vl更大的IgE反應性，但也觀察到與兩種測試的突變體的結合降低。在ELISA測定中，在大部分測試血清(10/14)中，相比野生型變應原，觀察到突變體Maldl的IgE結合降低30%至88%。然而，誘變選定的5個氨基酸似乎對Mal dl的主要表位沒有IgE反應性的偏見，因為在一些分析血清中沒有觀察到特定IgE結合的改變(3/14)。
[0019]在Pru avl——與Mal dl同源的主要櫻桃變應原中，證實了絲氨酸112的點狀取代對IgE識別分子是關鍵性的。在同源物Bet vl中的脯氨酸中的相同氨基酸誘變證實了絲氨酸112在保留交叉反應性IgE的表位結構中的重要性。將Pru avl的P環(huán)序列中的Glu45取代為色氨酸證實了該區(qū)域是與Bet vl交叉反應的IgE表位(14)。通過誘變第28位(Asn28Lys)、第108位(Prol08Ala)或兩個位置上的氨基酸，獲得了 3個其他的Pru avl變體。在單突變體(Asn28Lys)和雙突變體(Asn28Lys、Prol08Ala)中觀察到了對樺樹和櫻桃過敏的患者血清中IgE結合降低多達80%，而在Prol08位的單突變體僅獲得12%的降低，提示Pru avl中的氨基酸Asn28參與IgE表位。該天冬酰胺暴露在溶劑中，并且是假設為同源蛋白質(zhì)Bet vl的主要抗原位點的區(qū)域之一的一部分(15)。
[0020]通過NMR分析和X射線衍射研究Bet vl的三維結構，導致鑒別出可能涉及IgE結
合的具有大于600人I的面積的三個區(qū)域(16)。這3個區(qū)域暴露在同源變應原的由高保守氨
基酸組成的表面上，所述變應原是在屬于山毛 櫸目的物種中表達的，并被認為是對Bet vl與植物花粉的同源蛋白質(zhì)之間的交叉反應性負責的潛在IgE表位。定點誘變這些區(qū)域中的氨基酸驗證了它們參與IgE結合。Bet vl中的突變例如修飾出多達5個分布在分子表面上的不同區(qū)域(包括上述3個區(qū)域)，且導致變應原性降低(17)，所述突變表征出2個多重突變體(T28、Q32、S45、G108)和(V5、S42、S45、K78、V103、1123、E134、H156、N160)。構成3個Gajhede假設的IgE表位的氨基酸序列在與Bet vl同源的食物變應原中也是保守的。為了降低與Bet vl的表面相似性，位于一個上述區(qū)域中的Mal dl的保守性氨基酸Thr28、Gln32和Ser45被Bet vl中相應位置上存在的氨基酸取代。相比wt對應物，這些殘基的取代不改變突變體Mal dl抑制IgE-Bet vl結合的能力，同時在5個測試例的唯一一例中，消除了相同樺樹變態(tài)反應患者的血液中的嗜堿性粒細胞中的組織胺釋放(24)。
[0021]為了鑒別參與花粉-食物綜合征的臨床癥狀的IgE表位，通過向Bet vl序列移植4個Mal dl的短肽片段，生成嵌合蛋白質(zhì)(18)。移植區(qū)域包括之前驗證過對患者與兩種變應原(Bet vl和Mal dl)的IgE結合關鍵性的氨基酸殘基:T10、F30、S57、S112、1113和D125。使用來自兩組患者的血清，測試嵌合蛋白質(zhì)的IgE反應性，兩組患者具有樺樹變態(tài)反應，在攝入蘋果后無PFS或表現(xiàn)出PFS癥狀。兩組的IgE識別嵌合分子，但相比具有蘋果變態(tài)反應的患者，無PFS的組的結合顯著更低,提示Bet vl上移植的序列參與Bet vl/MaldllgE交叉反應性。
[0022]特征是PFS的樺樹花粉變態(tài)反應代表了用于鑒別交叉反應性IgE表位的優(yōu)秀的研究模型，所述模型允許生產(chǎn)具有降低的IgE結合能力的重組變應原。
[0023]長期以來，在特定的脫敏免疫療法中使用改造的多聚體分子的可能性都被認為是有吸引力的，所述多聚體分子由來自相同生物或不同生物的不同變應原組成。該方法允許在單個分子中裝配多個變應原，其優(yōu)點是生產(chǎn)含有精確摩爾比的變應原的單一制品。在單個雜合分子中關聯(lián)Bet vl和Maldl應該展示兩種分子的T表位庫,可誘導針對兩種變應原的強IgG保護性應答(17)。誘導特異性針對敏化變應原的IgG抗體是與由SIT導致的益處的相關因素之一。這類(保護性)抗體可以抑制與抗原的IgE結合，改變分子的三維構象。
[0024]已進行一些研究探討使用變應原Bet vl的三聚體衍生物的SIT對樺樹花粉變態(tài)反應的臨床效果(19)。治療誘導強的IgGl和IgG4特異性變應原抗體應答，和降低鼻與皮膚的反應性，但沒有產(chǎn)生臨床癥狀的顯著改善。
[0025]在用胡蘿卜變應原Dau cl的二聚體wt或第112位的突變體形式治療的小鼠實驗中，也觀察到了顯著的IgG抗體應答，所述Dau Cl與Bet vl變應原同源(20)。兩種二聚體變體都被證實比相應單體形式的混合物抗原性更高。此外，針對Dau Cl生產(chǎn)的所有鼠血清(單體、二聚體、wt和突變體形式)都含有與人IgE識別的表位交叉反應的特異性抗體，提示結構上改變的抗原(如二聚體)能夠誘導產(chǎn)生對構象表位特異性的抗體。
[0026]使用低變應原性雜交變體(如Bet vl-Mal dl)可消除由對食物變應原的嚴重副反應導致的難題，當進行使用樺樹花粉提取物的SIT時，改善了不僅對Bet vl的致耐原性應答，而且也改善了對蘋果的主要變應原的致耐原性應答。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027]現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過取代特定的氨基酸殘基來修飾序列，可以降低Mal dl變應原對IgE的結合。
[0028]根據(jù)其第一方面，本發(fā)明提供從蘋果的主要變應原Mal dl(wt序列SEQ ID NO:1)或其與SEQ ID N0:1具有至少95%，優(yōu)選至少97%序列同一性的同種型，獲得的Mal dl序列變體，所述變體的特征在于:
[0029]a)與野生型Mal dlSEQ ID NO:1相比，對IgE的反應性降低；
[0030]b)當與SEQ ID NO:1比對時，氨基酸序列在SEQ ID NO:1的第25位和第78位的Asp和/或Asn殘基中，或在Mal dl的所述同種型的相應位置中存在至少一個，優(yōu)選兩個取代。
[0031]Mal dl的同種型與SEQ ID NO:1具有至少95%序列同一性，包括以登錄號Maldl.0201 (Uniprot Q40280)和 Mal dl.0204 (Uniprot Q9SYV4)保藏的天然序列。
[0032]變應原Mal dl的優(yōu)選變體是這樣的變體，所述變體的殘基Asp25被中性、極性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自Ala、Thr> Gly、Pro、Leu、lie、Ser> Phe> Lys和Arg,更優(yōu)選Ala、Thr、Ser、Gly、Lys和Arg,而殘基Asn78被中性、酸性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自 Ala、Gly、Pro、Leu、lie、Phe> Lys、Arg、Asp 和 Glu,更優(yōu)選 Ala、Gly、Lys、Arg、Asp 和 Glu。
[0033]在優(yōu)選的實施方案中，具有2個取代的本發(fā)明的變體具有SEQ ID N0:2中確定的序列。
[0034]本發(fā)明的變應原Mal dl的取代變體對垂枝樺花粉和蘋果過敏的患者血清表現(xiàn)出比野生型分子降低至少10%的IgE反應性，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少80%。
[0035]在來自變應性個體的血清庫中通過ELISA測定分析變體SEQ ID NO: 2的IgE反應性(圖1)。相對于wt變應原Mal dl (SEQ ID NO:1)，當用來自對樺樹花粉和蘋果過敏的患者的血清庫孵育時，所述變體表現(xiàn)出IgE反應性降低89% (至lyng/ml) (SEQ ID N0:2)。在相同條件下，Mal dl變應原的變體的另一個例子(具有取代Asn78Ala) (SEQ ID N0:11)表現(xiàn)出IgE結合降低70.9% (圖1)。
[0036]這些結果由ELISA抑制實驗證實，該實驗可以評測來自不同蛋白質(zhì)的同源表位的反應性。發(fā)現(xiàn)利用0.3125 μ g/ml抑制劑，wt Mal dl蛋白質(zhì)(SEQ ID N0:1)與來自血清庫的IgE的結合被抑制93.3% (當血清用相同蛋白質(zhì)預處理時)，而當用變體SEQ ID NO: 2預溫育時，則被抑制25.4% (圖2)。在相同條件下，在Asn78具有單取代的變體抑制SEQ IDNO: 1-1gE 結合 19.7% (圖 2，SEQ ID NO: 11)。
[0037]這些結果明確提示取代SEQ ID NO:1的第25位和/或第78位的氨基酸干擾IgE對Mal dl變應原的識別。
[0038]還觀察到以濃度0.625 μ g/ml使用的變應原wt Mal dlSEQ ID N0:1和低變應原性變體SEQ ID NO: 2以不同程度的效果抑制wt Bet vl與樺樹-和蘋果陽性血清庫中的IgE結合。當用相同蛋白質(zhì)wt Bet vl預處理血清時,抑制的量高達94%,當用蛋白質(zhì)SEQ IDNO:1預溫育時，抑制的量是46%，當用蛋白質(zhì)SEQ ID NO: 2預溫育時，抑制的量是4.2%，并且當用單取代變體SEQ ID NO: 11預處理血清時，抑制的量是32.1% (圖3)。
[0039]用于免疫Balb/c小鼠的wt Mal dl變應原SEQ ID NO:1和低變應原性變體SEQID N0:2誘導特異性IgG應答(圖4)。特別是，針對SEQ ID NO:2生產(chǎn)的抗體也識別wt對應物SEQ ID NO:1 (圖5)，表明修飾第25和78位的殘基不導致分子IgG表位的重大改變。此外，用變體SEQ ID NO: 2免疫接種誘導比用wt對應物SEQ ID NO:1所獲得的免疫應答更高和更快的免疫應答。相反，用不相關抗原免疫的動物血清中存在的抗體不能識別wt Maldl和 SEQ ID NO:2。
[0040]從第五周開始，可 檢測到用SEQ ID N0:2免疫小鼠誘導的抗體與蘋果提取物的反應性，峰值在第七周，此時用SEQ ID NO:1免疫產(chǎn)生的抗體僅觀察到非常弱的識別，盡管在7周時，對wt Mal dl的抗體滴度與用SEQ ID NO:2免疫小鼠獲得的抗體滴度是相當?shù)?圖6)。
[0041]對于誘導能夠在變應原和IgE結合中競爭的保護性抗體，觀察到針對SEQ ID NO:2產(chǎn)生的IgG抗體比wt蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:1)更有效的(ρ〈(λ 001)抑制Mal dl (SEQ IDNO:1)與對樺樹和蘋果過敏的患者的IgE的結合(圖7)。ELISA抑制實驗已證實，來自用SEQID NO: 2免疫的小鼠的IgG抑制7位患者血清的IgE反應性平均為66% (數(shù)值范圍從49.6至82.2%)，針對SEQ ID NO:1產(chǎn)生的IgG抑制平均為32.3% (11.5_53%)。作為對照使用的未免疫接種的動物的血清對特異性IgE-Mal dl結合不產(chǎn)生任何抑制作用。
[0042]本發(fā)明的另一方面涉及與Mal dl片段相應的免疫活性肽，所述免疫活性肽包含至少一種上述取代。所述肽優(yōu)選含有15-35個、更優(yōu)選15-20個氨基酸殘基。本文使用的表達方式“免疫活性的”意指肽必須能夠刺激不依賴IgE的免疫應答。
[0043]本發(fā)明的另一方面涉及含有本文所述的蘋果主要變應原的序列變體和垂枝樺花粉的Bet vl主要變應原的低變應原性變體的雜交蛋白質(zhì)，兩者可能由接頭分隔開。
[0044]在本發(fā)明的雜交蛋白質(zhì)中，所述Mal dl和Bet vl的低變應原性變體被按頭-尾方向放置在氨基末端或羧基末端均可；換言之，當雜交蛋白質(zhì)的氨基末端與Bet vl或Maldl的氨基末端一致時，雜交蛋白質(zhì)的羧基末端則分別與蛋白質(zhì)Mal dl或Bet vl的羧基末端一致。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，雜交蛋白質(zhì)的氨基末端被Bet vl占據(jù),而羧基末端則被Maldl占據(jù)(圖8)。
[0045]分隔Bet vl和Mal dl的突變序列的接頭優(yōu)選由8個氨基酸的鏈組成,更優(yōu)選由2個氨基酸的鏈組成，甚至更優(yōu)選由二肽EF (Glu-Phe)組成。
[0046]在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，雜交蛋白質(zhì)含有描述在國際專利申請W02007/073907和歐洲專利申請EP2172215中的Bet vl的低變應原性變體，兩篇專利申請是由相同 申請人:提交的，并通過引用全文整合到本文中。特別是，包含在本發(fā)明的雜交蛋白質(zhì)中的Bet vl的低變應原性變體是從序列SEQ ID NO:5的蛋白質(zhì)或其同種型通過用選自Ala、Thr、Gly、Pro、Leu、lie、Phe和Ser的中性或極性氨基酸取代了第54、115和/或123位(SEQ ID NO: 5的情況下)或所述同種型的相應位置的Lys殘基獲得的，所述同種型與所述序列SEQ ID NO:5至少94%，優(yōu)選至少97%相同。在優(yōu)選的實施方案中，所述Bet vl的低變應原性變體是SEQ ID N0:6。本文所述的Bet vl的低變應原性變體描述在上述兩個專利申請中。
[0047]與SEQ ID NO: 5具有超過94%序列同一性的Bet vl的同種型包括以登錄號Betvl-a (Uniprot P15494)、Bet vl-j (Uniprot P43184)和 Bet vl-f (Uniprot P43179)保藏的天然分子。
[0048]序列SEQ ID N0:4的這樣的雜交蛋白質(zhì)是特別優(yōu)選的，其中Bet vl的低變應原性變體(SEQ ID N0:6)通過二肽EF接頭，按頭-尾方向(Bet vl — Mal dl)結合Mal dl的低變應原性變體(SEQ ID NO:2)。
[0049]與wt雜交體相 比，本發(fā)明的雜交變體表現(xiàn)出IgE結合降低至少10%，優(yōu)選50%，并且更優(yōu)選70%。
[0050]在對樺樹花粉和蘋果過敏的個體的血清庫中，通過ELISA測定分析變體SEQ IDN0:4的IgE反應性(圖9)。當與血清孵育時，與wt雜交體(SEQ ID N0:3)相比，所述變體表現(xiàn)出IgE反應性平均降低55.1%。
[0051]這些結果是由ELISA抑制實驗證實的。觀察到在等濃度(1.25 μ g/ml)的抑制劑條件下，當血清用單wt變應原的混合物預處理時，吸附在孔上的變應原wt Bet vlCSEQ IDNO:5)與包含在7位患者血清中的特異性IgE之間的結合平均被抑制79.9%，當血清用2種誘變組分的混合物預溫育時，平均抑制53.3%，而當血清用SEQ ID NO:3預處理時，平均抑制為63.3%，并且當血清用SEQ ID NO:4預溫育時，平均抑制32.1% (表2和圖10A)。突變的雜交體SEQ ID NO:4在Bet vl_IgE結合中競爭的能力比SEQ ID NO: 3和兩種誘變變應原(mut Bet vl-SEQ ID N0:6 和 mut Mal dl-SEQ ID NO:2)的混合物顯著減小(ρ〈0.05)。
[0052]在等量抑制劑的條件下(1.25μ g/ml),當血清用單wt變應原的混合物預處理時，吸附在孔上的wt Mal dl變應原(SEQ ID NO:1)與包含在7位患者血清中的特異性IgE之間的結合平均被抑制82.8%，當血清用2種誘變組分的混合物預溫育時，平均抑制51.6%，而當血清用SEQ ID NO: 3預處理時，平均抑制為74.6%，并且當血清用SEQ ID NO:4預溫育時，平均抑制63.6%(表3和圖10B)。針對Mal dl獲得的結果與針對Bet vl測量的結果相當，SEQ ID NO:4是例外，它被證實更與Mal dl反應。
[0053]還觀察到用于免疫接種Balb/c小鼠的低變應原性變體SEQ ID N0:4誘導產(chǎn)生能夠識別存在于垂枝樺提取物中的Bet vl變應原的特異性IgG (圖11)。雜交分子SEQ IDNO: 4誘導的特異性IgG應答與用樺樹提取物、SEQ ID NO: 3或各wt或誘變變應原的混合物在小鼠中誘導的應答相似。相反，在用不相關抗原免疫接種的動物的血清中存在的抗體不能識別SEQ ID NO: 3和4，以及wt和突變變應原的混合物。
[0054]低變應原性雜交變體SEQ ID NO:4也能夠誘導對蘋果果肉提取物組分的特異性IgG應答(圖12)。在初次免疫接種后5周，用SEQ ID NO:4免疫接種誘導的IgG應答比用等摩爾量的兩種單誘變變體的混合物(mut混合)免疫接種獲得的應答大30倍，比wt雜交變應原SEQ ID NO:3的應答大3.2倍。從第5周起，用樺樹提取物免疫接種誘導產(chǎn)生能夠識別包含在蘋果提取物中的Mal dl的IgG。
[0055]此外，當其是雜交低變應原性分子SEQ ID NO:4的一部分時，低變應原性變體SEQID N0:2的免疫原性增加。在用雜交變體SEQ ID NO:4免疫接種的小鼠中，特異性針對wtMal dl (SEQ ID N0:1)和突變體Mal dl (SEQ ID NO: 2)的IgG抗體的誘導作用比用單變應原SEQ ID N0:2免疫接種的小鼠高得多且早得多。在治療的第四周中，已經(jīng)觀察到SEQID N0:4誘導作用的實質(zhì)性增加，而用蛋白質(zhì)SEQ ID N0:2免疫接種的動物花費了至少七周時間來獲得相同的應答(圖13-A，B)。
[0056]關于誘導能夠抑制變應原和IgE之間結合的保護性抗體，已觀察到針對SEQ IDN0:4生產(chǎn)的IgG抗體比用兩種單突變變體的混合物(mut混合)誘導的抗體更有效的(ρ〈0.05)抑制Bet vl (SEQ ID NO:5)與對樺樹和蘋果過敏的患者的IgE的結合(圖14)。ELISA抑制實驗已證實了在用SEQ ID NO:4免疫接種的小鼠中生產(chǎn)的IgG抑制7名患者的血清的IgE反應性，平均抑制87.7% (數(shù)值范圍從77.4至94.7%)，而針對兩種誘變的變體的混合物(mut混合)產(chǎn)生的抗體則平均抑制82% (63.5-92.3%);針對wt蛋白質(zhì)的混合物(wt混合)產(chǎn)生的IgG抗體平均抑制結合54.7% (32.4-68.6%)，而用wt雜交SEQ ID NO: 3免疫接種獲得的抗體則平均抑制82.2% (51.9-93.5%)。
[0057]用SEQ ID N0:4免疫接種的小鼠中誘導的IgG抗體還抑制在Mal dl(SEQ ID NO:1)和對樺樹和蘋果過敏的患者的血清中的IgE之間的結合，平均抑制47.5%，如果它們是用wt蛋白質(zhì)的混合物、突變變體的混合物或免疫原SEQ ID N0:3免疫接種的，則分別平均抑制
9.9%, 53.5% 和 59.4% (圖 15)。
[0058]用作對照的未免疫接種的動物的血清不導致對特異性IgE與Bet vl和Mal dl的結合的任何抑制作用。
[0059]使用本領域技術人員已知的技術，通過誘變Mal dl (SEQ ID NO: 7)>Bet vI (SEQID N0:8)、其同種型或天然變體的cDNA序列，或wt雜交物的cDNA序列(SEQ ID NO:9),可容易地制備本發(fā)明的取代變體(21)。
[0060]編碼SEQ ID NO: 2和4所示的(單體)雙取代變體或雜交變體的cDNA序列分別報告于 SEQ ID NO: 10 和 19 中。
[0061]因此，本發(fā)明的其他方面涉及編碼本文所述的變應原Mal dl變體的核酸分子、編碼來自其的肽的核酸分子或編碼雜交蛋白質(zhì)Mal dl-Bet vl的核酸分子,和包含所述分子與用于在真核或原核細胞中表達控制的元件的表達載體，所述元件如轉(zhuǎn)錄啟動子或增強子、信號序列、或其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。載體可以是質(zhì)粒、病毒、噬菌體或遺傳工程中通常使用的任何其他載體。
[0062]本發(fā)明還包括用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞。原核細胞例如大腸桿菌(Escherichia coli)或枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis),或真核細胞例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)通常用作克隆和cDNA表達的載體。
[0063]本發(fā)明的低變應原性變體還可作為融合蛋白制備。
[0064]由于它們降低的IgE反應性，本發(fā)明的Mal dl變體可方便地用于制備藥物組合物(例如片劑)，所述藥物組合物用于對蘋果和/或垂枝樺花粉的過敏的個體的免疫療法。
[0065]因此本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，其包含有效量的Mal dl的低變應原性變體，任選和其他垂枝樺的變應原，和可藥用載體、賦形劑或佐劑組合。在優(yōu)選實施方案中，所述藥物組合物以適當?shù)囊呙缧问接糜谧儜约膊〉念A防性或治療性治療，所述疾病如支氣管哮喘和鼻炎、結膜炎和口服變態(tài)反應綜合征。舌下、皮下和透皮的施用形式是最優(yōu)選的。
[0066]接種的原理和方法是本領域技術人員已知的，描述在例如(22)中。
[0067]下列實施例進一步闡明本發(fā)明。
實施例
[0068]除非另行指出，下列實施例中所用方法描述于Sambrook, Fritsch ETManiatis “Molecular cloning:A laboratory manual，，第二版,第 1-2-3 卷，CSH Lab 出版，1989。
[0069]實施例1 -編碼Mal dl奪應原的cDNA的位點特異件誘奪
[0070]編碼Mal dl變應原的cDNA(SEQ ID NO: 7，5’前是編碼6個組氨酸的序列)的位點特異性誘變通過原核載體(pBluescript，GenBank登錄號X52327)中的cDNA克隆，然后是PCR擴增進行。PCR反應中用作引物的寡核苷酸(表1)具有合適的堿基取代。對于每個誘變，使用結合到DNA鏈相應區(qū)域的互補寡核苷酸(21)。擴增后，限制酶DpnI催化的酶促消化選擇性降解未改變的原模板。`然后用誘變的分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞。根據(jù)Sanger(法)對獲自單細菌菌落的克隆進行測序，以確定cDNA中正確的堿基修飾以及不存在非特定的突變。
[0071]在PCR擴增后，在原核載體(pBluescript，GenBank登錄號X52327)中通過cDNA克隆進行Mal dl變應原(SEQ ID NO: 7，5’前端為編碼六組氨酸的序列)編碼cDNA的位點特異性誘變。在PCR反應中用作引物的寡核苷酸(表1)具有恰當?shù)膲A基取代。對于每種誘變，使用與DNA鏈的相應區(qū)域結合的互補寡核苷酸(21)。在擴增后，通過限制性酶Dpn I催化的酶促消化選擇性降解不變的原始模板。然后，用誘變分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞。根據(jù)Sanger測序從單細菌集落獲得克隆，確定正確的堿基修飾和cDNA中缺少的非特定的突變。
[0072]表1.位點特異性誘變中用作引物的寡核苷酸序列。突變的堿基為黑體字符。
[0073]
亥苷酸I序列
MaldlD25 Gcc ttt gtc ctt get get gac aac ctc (SEQ ID NO:12)
MaldlN78 Gtt gac gag gca gcc tac tea tac gcc (SEQ ID NO:13)
[0074]實施例2 _構建編碼里予生型Bet vl-Mal dl雜交分子的質(zhì)粒(wtHybrid)
[0075]通過融合編碼單變應原的cDNA，獲得含有野生型Bet vl-Mal dl雜交物的遺傳信息的雜交分子。
[0076]對Betvl 使用 Bet vlDIM FWCggt gtt ttc aat tac gaa act g-SEQ ID NO: 14)和 Bet vlDIM Eco RV(Gc Raa ttc gtt gta ggc ate ggag-SEQ ID NO: 15)寡核苷酸引物，對 Mal dl 使用 Mal dlDIM Eco FW (cgc gaa ttc ggt gtc tac aca ttt gag aac g-SEQID NO:16)和 Mal dlDIM Bam RV (Gcg gga tcc tta gtt gta tgc gtc ggg gtg-SEQ IDNO: 17)寡核苷酸引物，通過PCR分別獲得編碼成熟Bet vl和Mal dl蛋白質(zhì)的cDNA。使用Bet vlSEQ ID N0:8 和 Mal dlSEQ ID N0:7 克隆作為模板。
[0077]通過用Bet vlDIM Kpn FW (gcg ggt acc cat atg cat cac cat cac cat cacggt gtt ttc aat tac gaa act g-SEQ ID NO: 18)替換Bet vlDIM FW引物，重新擴增從Betvl獲得的擴增產(chǎn)物，從而在Bet vl序列的上游插入編碼六組氨酸的序列。在Bet vl擴增產(chǎn)物的5’插入Kpn I位點和Nde I位點(含有ATG)，在其3’插入Eco R I位點替換終止密碼子。在Mal dl的5’插入Eco R I位點替換ATG，在其3’的終止密碼子之后插入BamH I位點。純化擴增產(chǎn)物，用Kpn I和Eco R I限制性酶(Bet vl)或Eco R I和Bam H I(Mai dl)(限制性位點是引物中下劃線的)消化,之后插入到pEt3c載體(Stratagene, LaJolla，CA)的Kpn I/Bam H I位點中，獲得能夠表達位于六組氨酸序列之前的Bet vl-Maldl融合蛋白的構建體。導入Eco R I限制性位點是克隆片段必需的，這允許在兩個蛋白質(zhì)的連接處插入2個氨基酸(谷氨酸和苯丙氨酸)而不改變閱讀框(圖8)。
[0078]通過Sanger方法，測序從單個細菌菌落獲得的克隆，驗證堿基改變是正確的，以及在cDNA中沒有非特定的突變。
[0079]實施例3-構律編碼突奪體Bet vl~Mal dl雜奪分子的質(zhì)粒(MutHvbrid)
[0080]按照實施例2中描述的用于野生型雜交變體的方法，獲得編碼突變體Bet vl-Maldl雜交物的雜交分子。
[0081]用于PCR反應中的寡核苷酸對是相同的，而用作模板的cDNA編碼兩種低變應原性變體，其序列在本文中如SEQ ID NO:20 (對于Bet vl突變體)和SEQ ID NO: 10 (Mai dl突變體)所示。
[0082]通過Sanger方法，測`序從單個細菌菌落獲得的克隆，驗證堿基改變是正確的，以及在cDNA中沒有非特定的突變。
[0083]實施侈!I 4 -牛.產(chǎn)Mal dl矛口 Bet vl蛋白質(zhì)、相應的突變體、wtHybrid矛口 MutHybrid
[0084]根據(jù)標準方案(23)，將前面是六組氨酸的編碼序列的野生型Bet vl (SEQ IDN0:8)和 Mal dl (SEQ ID NO:7) cDNA、誘變的 cDNA (SEQ ID N0:20 和 SEQ ID NO: 10)、和改造的wt和Mut雜交cDNA (SEQ ID NO:9el9)克隆到表達載體中，并在大腸桿菌細胞中表達。離心收集細胞,重懸于IOOmM NaH2POj^沖液，pH8中并超聲裂解。離心分離重組蛋白。將含有不溶蛋白質(zhì)聚集體的沉淀重懸于變性緩沖液尿素6M、NaH2PO4IOOmM, TrislOmM pH8中，并在20°C下攪拌60分鐘。將溶解的重組蛋白從不溶性殘渣中離心分離，并通過使用這樣的瓊脂糖柱的親和層析從上清液中純化，所述瓊脂糖柱結合了與變應原融合的六組氨酸部分相互作用的氨三乙酸螯合型鎳離子。在(NH4) HC035mM溶液中4°C透析18小時來重折疊純化的蛋白質(zhì)。
[0085]實施例5 -變應性受試者血 清的表征
[0086]血清收集自具有對垂枝樺花粉有季節(jié)性變態(tài)反應臨床史，并具有對Bet vl和Maldl變應原特異的RAST3+反應性的個體，然后以單獨或混合的形式使用這些血清。使用來自非變應性患者的血清庫作為陰性對照。
[0087]實施侈I丨6-MaI dl變體對血?青庫中IgE的反應件的ELISA分析
[0088]通過在4°C下溫育16小時，將wt變應原(SEQ ID NO:1)和誘變的變體(SEQ IDNO: 2，SEQ ID NO: 11)的在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中連續(xù)三倍稀釋的等分試樣吸附到ELISA分析用聚苯乙烯(polystirene)板的孔上。用洗漆溶液(60mM含有
0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含25% 山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20、0.01% 鄰乙汞硫基苯酸鈉(Thiomersal)，ρΗ7.4)封閉。向每個樣品中加入60 μ I來自RAST3+或非變應性對象的人血清庫的稀釋緩沖液中的等分試樣，在25°C溫育2小時。洗滌三次后，加入綴合過氧化物酶的抗人-1gE血清(稀釋緩沖液中1:4000)，再在25°C溫育1.5小時。洗滌三次后，加入100 μ I TMB試劑(BioFXLaboratories, Owings Mills, MD),并在 25°C 溫育 15 分鐘，進行比色反應。加入 100μΙΙΝHCl 終止反應，并使用酶標儀(microplate reader spectrophotometer)在 450nm 處讀數(shù)。通過三次獨立實驗驗證結果。應用有一些修飾的相同操作規(guī)程，測試改造的wt和Mut雜交物的IgE反應性。
[0089]在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中，按1:2的比例制備連續(xù)稀釋的雜交變應原(SEQ ID NO: 3和4)，起始濃度為150nM，并吸附到聚苯乙烯(polystirene)板的孔上。在稀釋溶液中1:2.5稀釋對Bet vl和Mal dl陽性或來自作為陰性對照的非變應性對象的血清庫，加入每個孔(70 μ I )，并在25°C溫育3小時。[0090]實施例7-ELISA抑制測定-Mal dl的單體奪體抑制Mal dl與血清中的IgE結合
[0091]通過在4°C下預溫育16小時，將在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的等量(0.1yg)野生型Mal dl吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗滌溶液(60mM含有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含15%山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20, pH7.4)封閉游離的位點。在25°C下，用4倍連續(xù)稀釋的wt或誘變的變應原(起始濃度為5 μ g/ml)預溫育1:3稀釋的Bet vl和Mal dl陽性的混合人血清等分試樣(100 μ 1)2小時。然后將混合物加入到每個孔中，并在4°C溫育16小時。在用0.06M磷酸，pH6.5,0.05% Tween-20緩沖液洗滌三次后，加入在稀釋緩沖液中1:4000稀釋的綴合了過氧化物酶的抗人IgE血清，并在25°C溫育1.5小時。洗滌三次后，通過加入 100 μ I TMB 試劑(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)獲得比色反應顯色，在25°C溫育15分鐘。通過加入100 μ IlN HCl終止反應，用分光光度儀在450nm處讀數(shù)來評價反應。使用下列公式計算抑制百分數(shù):100χ[(Α-Β)/Α]，其中A是無抑制劑時450nm處的吸光度，而B是存在抑制劑時的吸光度。數(shù)據(jù)是3次獨立實驗所代表的。
[0092]實施例8-ELISA抑制測定-Mal dl的單體奪體抑制Bet vl與血清中的IgE結合
[0093]通過在4°C下預溫育16小時，將在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的等量(0.1 μ g)野生型Bet vl吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗滌溶液(60mM含有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含15%山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20, pH7.4)封閉游離的位點。在25V下，用連續(xù)4倍稀釋的wt Bet vl、wt Mal Dl或誘變的變體(起始濃度為10μ g/ml)預溫育I: 3稀釋的Bet vl和Mal dl陽性的混合人血清等分試樣(100 μ I) 2小時。然后將混合物加入到每個孔中，并在4°C溫育16小時。在用0.06M磷酸，pH6.5,0.05% Tween-20緩沖液洗滌三次后，加入在稀釋緩沖液中1:4000稀釋的綴合了過氧化物酶的抗人IgE血清，并在25°C溫育1.5小時。洗滌三次后，通過加入100 μ I TMB試劑(BioFX Laboratories, OwingsMills, MD)獲得比色反應顯色，在25°C溫育15分鐘。通過加入100 μ IlN HCl終止反應，用分光光度儀在450nm處讀數(shù)來評價反應。使用下列公式計算抑制百分數(shù):IOOx [ (A-B)/A]，其中A是無抑制劑時450nm處的吸光度，而B是存在抑制劑時的吸光度。數(shù)值是通過3次獨立實驗所確定的。
[0094]實施例9-ELISA 抑制測定-SEQID N0:3 和 SEQ ID NO:4 抑制 Betvl 或 Mal dl 與血.清中的IgE結合
[0095]通過在4°C下預溫育16小時，將在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的等量(0.1 μ g)野生型Bet vl或Mal dl吸附到用于ELISA分析的聚苯乙烯板的孔上。然后用洗滌溶液(60mM含有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH6.5)洗滌孔，并用稀釋溶液(150mM磷酸鹽緩沖液中含15%山羊血清、ImM EDTA、0.05%Tween20, pH7.4)封閉游離的位點。在25°C下，用等量(1.25 μ g/ml)的野生型變應原、誘變或改造的變體(雜交物)預溫育1:3稀釋的Bet vl和Mal dl陽性的混合人血清庫的等分試樣(70 μ 1)2小時。然后將混合物加入到每個孔中，并在4°C溫育16小時。在用0.06M磷酸，pH6.5,0.05% Tween-20緩沖液洗滌三次后，加入在稀釋緩沖液中1:4000稀釋的綴合了過氧化物酶的抗人IgE血清，并在25°C溫育1.5小時。洗滌三次后，通過加入100 μ I TMB試劑(BioFX Laboratories, OwingsMills, MD)獲得比色反應顯色，在25°C溫育15分鐘。通過加入100 μ IlN HCl終止反應，用分光光度儀在450nm處讀數(shù)來評價反應。使用下列公式計算抑制百分數(shù):IOOx [ (A-B) /A]，其中A是無抑制劑時450nm處的吸光度，而B是存在抑制劑時的吸光度。
[0096]表2.雜交野生型-和誘變的-分子抑制Bet vl-1gE結合
[0097]
【權利要求】
1.蘋果(Malusdomestic)主要變應原 Mal dlwt (SEQ ID NO:1)或其與 SEQ ID NO:1至少95%，優(yōu)選至少97%相同的同種型的序列變體，所述變體的特征是: a)其表現(xiàn)出比所述Maldl變應原(SEQ ID NO:1)降低的IgE反應性； b)其具有這樣的氨基酸序列，當與SEQID NO:1比對時，所述氨基酸序列在與SEQ IDNO:1的第25位和第78位對應的Asp和/或Asn殘基上存在至少一個，優(yōu)選兩個取代。
2.權利要求1的序列變體，其中相比Maldl變應原SEQ ID NO: 1，來自對蘋果和/或垂枝樺(Betula verrucosa)花粉過敏的患者的血清的IgE反應性降低至少10%。
3.權利要求1-2的序列變體，其中所述Asp和Asn殘基都被取代。
4.權利要求1-3的序列變體，其中: -Asp25殘基被中性、極性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自Ala、Thr, Gly,Pro、Leu、lie、Ser> Phe> Lys 和 Arg,更優(yōu)選 Ala、Thr> Ser> Gly、Lys 和 Arg ； -Asn78殘基被中性、酸性或堿性的氨基酸取代，所述氨基酸優(yōu)選選自Ala、Gly、Pro、Leu、lie、Phe> Lys、Arg、Asp 和 Glu,更優(yōu)選 Ala、Gly、Lys> Arg、Asp 和 Glu。
5.權利要求1-4的序列變體，由SEQID NO:2組成。
6.含有權利要求1-5定義的蘋果主要變應原的序列變體和垂枝樺花粉的主要變應原Bet vl的低變應原性變體的雜交蛋白質(zhì),任選由接頭分隔開。
7.權利要求6的雜交蛋白質(zhì)，其中所述Betvl低變應原性變體是通過取代SEQ IDNO:5的第54、11 5和/或123位或其同種型的相應位置上的一個或多個Lys殘基從蛋白質(zhì)SEQ ID N0:5或其同種型獲得的，所述同種型與SEQ ID NO:5具有至少94%，優(yōu)選至少97%序列同一性。
8.權利要求?的雜交蛋白質(zhì),其中所述Lys殘基被選自Ala、Thr>Gly、Pro、Leu、lie、Phe和Ser的中性或極性氨基酸取代。
9.權利要求6-8的雜交蛋白質(zhì)，其中所述Betvl低變應原性變體由SEQ ID N0:6組成。
10.權利要求6-9的雜交蛋白質(zhì)，其中所述Maldl和Bet vl低變應原性變體以頭-尾的方向位于氨基末端或羧基末端。
11.權利要求10的雜交蛋白質(zhì),其中Betvl和Mal dl分別位于氨基末端和羧基末端。
12.權利要求6-11的雜交蛋白質(zhì)，其中所述接頭由含有1-8個氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選EF 二肽，組成。
13.權利要求12的雜交蛋白質(zhì)，由SEQID N0:4組成。
14.編碼權利要求1-5的Maldl低變應原性變體，或編碼權利要求6_13的雜交蛋白質(zhì)的核酸分子。
15.權利要求14的核酸分子，其序列選自SEQID NO: 10和19。
16.含有權利要求14-15的核酸分子的表達載體。
17.藥物組合物，其包含有效量的權利要求1-5的Maldl的低變應原性變體或權利要求6-13的雜交蛋白質(zhì),和可藥用載體、賦形劑或佐劑。
18.權利要求17的組合物，其處于適合舌下、皮下或透皮施用的形式。
19.權利要求1-5的Maldl低變應原性變體，或權利要求6_13的雜交蛋白質(zhì)，或權利要求17-18的藥物組合物，用于對蘋果和/或垂枝樺花粉過敏的對象的免疫療法。
20.權利要求19的用于對蘋果和/或垂枝樺花粉過敏的對象的免疫療法的低變應原性變體或雜交蛋白質(zhì)或藥物組合物，其中所述對象患支氣管哮喘、鼻炎、結膜炎或口服變態(tài)反應綜合征。`
【文檔編號】A61K39/36GK103874509SQ201280048686
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年7月31日 優(yōu)先權日:2011年8月3日
【發(fā)明者】G·米斯特雷洛, S·扎諾塔, D·隆卡羅洛 申請人:洛法瑪有限公司