重組多順?lè)醋雍怂岱肿拥闹谱鞣椒?br> 【專利摘要】本公開(kāi)內(nèi)容提供包含至少四種核苷酸序列的重組多順?lè)醋雍怂岱肿?，所述核苷酸序列編碼感興趣的蛋白質(zhì)，尤其是體內(nèi)形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列各操作性連接至單獨(dú)的亞基因組啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，這些蛋白質(zhì)及其形成的復(fù)合物引發(fā)強(qiáng)效的中和抗體。因此，使用所公開(kāi)平臺(tái)來(lái)呈遞皰疹病毒蛋白可產(chǎn)生有助于疫苗開(kāi)發(fā)的廣泛且強(qiáng)效的免疫應(yīng)答。
【專利說(shuō)明】重組多順?lè)醋雍怂岱肿?br> [0001] 序列表
[0002] 本申請(qǐng)包含通過(guò)EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通過(guò)引用全文納入本文。 2012年9月28日創(chuàng)建的所述ASCII副本命名為PAT05457. txt，大小為233, 480字節(jié)。
[0003] 背景
[0004] 病原體可導(dǎo)致個(gè)體的實(shí)質(zhì)性發(fā)病和死亡。例如，皰疹病毒廣泛傳播并造成大范圍 的人類疾病，最嚴(yán)重的情況可導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性發(fā)病和死亡，這主要發(fā)生在免疫力低下的個(gè)體中 (例如，移植物受者和HIV感染的個(gè)體）。人容易被至少8種皰疹病毒感染。單純性皰疹 病毒-1 ((HSV-1、HHV-1)、單純性皰疹病毒-2 (HSV-2、HHV-2)和水痘-帶狀皰疹病毒（VZV、 HHV-3)是α-亞家族病毒，巨細(xì)胞病毒（CMV，HHV-5)和玫瑰疹病毒（HHV-6和HHV-7)是 β-亞家族病毒，EB(Epstein-Barr)病毒（EBV、HHV_4)和卡波西（Kaposi)肉瘤相關(guān)皰疫病 毒（KSHV、HHV-8)是感染人的γ-亞家族病毒。
[0005] CMV感染導(dǎo)致免疫力低下的個(gè)體（移植物受者和HIV感染的個(gè)體）中的實(shí)質(zhì)性發(fā) 病和死亡，并且先天性的感染可導(dǎo)致新生兒神經(jīng)發(fā)育的破壞性缺陷。CMV包膜糖蛋白gB、 gH、gL、gM和gN代表具有吸引力的候選疫苗，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓《颈砻嫔媳磉_(dá)并可引起保護(hù) 性的病毒中和體液免疫應(yīng)答。已有一些CMV疫苗策略靶向主要表面糖蛋白B(gB)，這可誘 導(dǎo)主要抗體應(yīng)答。（6〇和？〇11 &^，110197:1631-1633(2008))。01^糖蛋白88可誘導(dǎo)中 和抗體應(yīng)答,而中和CMV陽(yáng)性患者的血清中的成纖維細(xì)胞感染的抗體的大部分是針對(duì)gB 的（Brittl990)。類似地，據(jù)報(bào)道gH和gM/gN是對(duì)自然感染的免疫應(yīng)答的靶標(biāo)（Urban等 (1996) J. Gen. Virol. 77 (Pt. 7) :1537-47 ;Mach 等（2000) J. Virol. 74(24) :11881-92)。
[0006] CMV蛋白的復(fù)合物也是具有吸引力的候選疫苗，因?yàn)樗鼈兯坪跎婕八霾?毒生命周期的重要過(guò)程。例如，gH/gL/gO復(fù)合物似乎對(duì)進(jìn)入成纖維細(xì)胞和上皮/ 內(nèi)皮細(xì)胞起重要作用。普遍認(rèn)同模型表明，gH/gL/gO復(fù)合物介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的感 染。hCMV g〇-缺失突變體在成纖維細(xì)胞上產(chǎn)生小斑塊并且病毒效價(jià)很低，這指示其 對(duì)進(jìn)入具有作用（Dunn (2003)，Proc. Natl. Acad. Sci.USAlOO :14223-28 ;Hobom(2000) J. Virol. 74:7720-29)。近期研究表明，gO并沒(méi)有納入含gH/gL的病毒粒，而是可能作為 分子伴侶起作用，使gH/gL從ER向高爾基體的輸出增加并納入病毒粒（Ryckman (2009) J. Vir〇182:60-70)。通過(guò)脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)，顯示少量的g0與gH/gL的長(zhǎng)期保持結(jié)合，但大多 數(shù)g〇從gH/gL/gO復(fù)合物解離或降解，因?yàn)椴⑽窗l(fā)現(xiàn)其存在于胞外病毒粒中或由細(xì)胞分泌。 當(dāng)從CMV(TR)臨床毒株剔除g0時(shí)，那些病毒顆粒顯著減少了 gH/gL納入病毒粒中的量。此 夕卜，從TR病毒剔除g0還抑制進(jìn)入上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，表明gH/gL也是進(jìn)入上皮/內(nèi)皮細(xì) 胞所需的（Wille (2010) J. Virol. 84 (5) : 2585-96)。
[0007] CMV gH/gL也可與UL128、UL130和UL131A(本文稱為UL131)相關(guān)聯(lián)，并且形成 進(jìn)入若干細(xì)胞類型所需的五聚體復(fù)合物，所述細(xì)胞類型包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和樹(shù)突細(xì) 胞（Hahn 等（2004)J. Virol. 78(18):10023-33;Wang 和 Shenk(2005)Proc. Natl. Acad. Sci USA102(50):18153-8;Gerna 等（2005)·J.Gen.Virol. 84(Pt6):1431-6;Ryckman 等（2008) J. Virol. 82:60-70)。相反，成纖維細(xì)胞的感染不需要該復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)室hCMV分離物在 UL128-UL131基因座上攜帶突變，并且突變僅在培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中傳代數(shù)次后在臨床分離 物中發(fā)生（Akter等（2003)J.Gen.Virol.84(Pt5):1117-22)。自然感染過(guò)程中，所述五聚 體復(fù)合物引發(fā)以極高效力中和上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（以及其中五聚體復(fù)合物介導(dǎo)病毒進(jìn)入 的可能的任何其它細(xì)胞類型）感染的抗體（Macagno等（2010) J. Virol. 84 (2): 1005-13)。 并且，似乎針對(duì)該復(fù)合物的抗體顯著有助于人血清中和上皮細(xì)胞感染的能力（Genini等 (2011) J. Clin. Virol. 52(2) : 113-8)。
[0008] US5, 767, 250公開(kāi)了含有g(shù)H和gL的某些CMV蛋白質(zhì)復(fù)合物的制備方法。通過(guò)將 編碼gH的DNA構(gòu)建體和編碼gL的DNA構(gòu)建體引入細(xì)胞從而使gH和gL共表達(dá)來(lái)產(chǎn)生所述 復(fù)合物。
[0009] W02004/076645描述了編碼CMV蛋白的重組DNA分子。根據(jù)該文獻(xiàn)，可將編碼不同 CMV蛋白的不同DNA分子的組合引入細(xì)胞，以獲得經(jīng)編碼的CMV蛋白的共表達(dá)。當(dāng)gM和gN 通過(guò)該方式共表達(dá)時(shí)，其形成二硫鍵連接的復(fù)合物。用產(chǎn)生gM/gN復(fù)合物的DNA構(gòu)建體或 編碼gB的DNA構(gòu)建體免疫兔子，產(chǎn)生等同的中和抗體應(yīng)答。
[0010] 需要編碼四種或更多種蛋白質(zhì)的多順?lè)醋雍怂?，在相同?xì)胞中表達(dá)四種或更多種 蛋白質(zhì)的方法，和產(chǎn)生更強(qiáng)免疫應(yīng)答的免疫方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明涉及用于共同遞送4種或更多種蛋白質(zhì)（例如，病原體蛋白如皰疹病毒 (例如，CMV)蛋白，尤其是在體內(nèi)形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)）至細(xì)胞的重組多順?lè)醋雍怂岱肿樱?例如多順?lè)醋幼詮?fù)制RNA分子。
[0012] 一方面，所述重組多順?lè)醋雍怂岱肿?，例如多順?lè)醋幼詮?fù)制RNA分子，包含：a) 編碼第一蛋白質(zhì)或其片段的第一核苷酸序列，該序列操作性連接至第一亞基因組啟動(dòng)子 (SGP) ;b)編碼第二蛋白質(zhì)或其片段的第二核苷酸序列，該序列操作性連接至第二SGP;c) 編碼第三蛋白質(zhì)或其片段的第三核苷酸序列，該序列操作性連接至第三SGP ;和d)編碼第 四蛋白質(zhì)或其片段的第四核苷酸序列，該序列操作性連接至第四SGP ;其中，當(dāng)將所述自復(fù) 制RNA分子引入合適的細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生所述第一和第二蛋白質(zhì)或其片段。任選地，所述重組多 順?lè)醋雍怂岱肿?，例如多順?lè)醋幼詮?fù)制RNA分子，還包含編碼第五蛋白質(zhì)或其片段的第五 核苷酸序列，該序列操作性連接至第五SGP。優(yōu)選地，所述第一蛋白質(zhì)或其片段、第二蛋白質(zhì) 或其片段、第三蛋白質(zhì)或其片段和第四蛋白質(zhì)或其片段，以及（若存在）第五蛋白質(zhì)或其片 段形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一蛋白質(zhì)或其片段和第二蛋白質(zhì)或其片段，所述第三 蛋白質(zhì)或其片段、所述第四蛋白質(zhì)或其片段，以及（若存在）所述第五蛋白質(zhì)或其片段各來(lái) 自皰疹病毒，例如，HHV-1、HHV-2、HHV-3、HHV-4、HHV-5、HHV-6、HHV-7、HHV-8 或 HHV-9。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，所述第一蛋白質(zhì)或其片段和第二蛋白質(zhì)或其片段、所述第三 蛋白質(zhì)或其片段、所述第四蛋白質(zhì)或其片段，以及（若存在）所述第五蛋白質(zhì)或其片段各來(lái) 自HHV-5(CMV)。在此類實(shí)施方式中，所述第一蛋白質(zhì)或片段、所述第二蛋白質(zhì)或片段、所述 第三蛋白質(zhì)或片段、所述第四蛋白質(zhì)或片段和所述第五蛋白質(zhì)或片段獨(dú)立地選自下組：gB、 gH、gL、g0、gM、gN、UL128、UL130、UL131及前述任何一種的片段。例如，所述第一蛋白質(zhì)或 片段可以是gH或其片段，且所述第二蛋白質(zhì)或片段可以是gL或其片段，所述第三蛋白質(zhì)或 片段可以是UL128或其片段，所述第四蛋白質(zhì)或片段可以是UL130或其片段，且所述第五蛋 白質(zhì)或片段可以是UL131或其片段。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，所述第一蛋白質(zhì)或其片段和第二蛋白質(zhì)或其片段、所述第三 蛋白質(zhì)或其片段、所述第四蛋白質(zhì)或其片段，以及（若存在）所述第五蛋白質(zhì)或其片段各來(lái) 自HHV-3(VZV)。在此類實(shí)施方式中，所述第一蛋白質(zhì)或片段、所述第二蛋白質(zhì)或片段、所述 第三蛋白質(zhì)或片段、所述第四蛋白質(zhì)或片段和所述第五蛋白質(zhì)或片段獨(dú)立地選自下組：gB、 gE、gH、gl、gL及前述任何一種的片段。
[0016] 所述重組多順?lè)醋雍怂岱肿涌梢允嵌囗樂(lè)醋幼詮?fù)制RNA分子。自復(fù)制RNA分子可 以是α病毒復(fù)制子。在該情況下，可以α病毒復(fù)制子顆粒（VRP)的形式遞送所述α病毒 復(fù)制子。自復(fù)制RNA分子也可以是"裸" RNA分子的形式。
[0017] 本發(fā)明還涉及編碼如本文所述的自復(fù)制RNA分子的重組DNA分子。在一些實(shí)施方 式中，所述重組DNA分子是質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，所述重組DNA分子包括驅(qū)動(dòng)編碼的自 復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。
[0018] 本發(fā)明還涉及包含如本文所述自復(fù)制RNA分子和藥學(xué)上可接受的載劑的組合 物。在一些實(shí)施方式中，所述組合物包含編碼CMV蛋白（例如五聚體復(fù)合物gH/gL/UL128/ UL130/UL131)的自復(fù)制RNA分子。所述組合物還可包含RNA遞送系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體、聚合納 米顆粒、水包油陽(yáng)離子納米乳液或其組合。例如，自復(fù)制RNA分子可包封在脂質(zhì)體中。
[0019] 在某些實(shí)施方式中，所述組合物包含VRP，所述VRP含有編碼CMV蛋白的α病毒復(fù) 制子。在一些實(shí)施方式中，所述VRP包含編碼五聚體復(fù)合物gH/gL/UL128/UL130/UL131的 復(fù)制子。所述組合物還可包含佐劑。
[0020] 本發(fā)明還涉及一種形成CMV蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法。在一些實(shí)施方式中，向細(xì)胞遞 送編碼四種或更多種CMV蛋白的自復(fù)制RNA，使所述細(xì)胞維持在適于表達(dá)CMV蛋白的條件 下，其中形成CMV蛋白質(zhì)復(fù)合物。在其它實(shí)施方式中，向細(xì)胞遞送包含編碼四種或更多種 CMV蛋白的自復(fù)制RNA的VRP，使所述細(xì)胞維持在適于表達(dá)CMV蛋白的條件下，其中形成CMV 蛋白質(zhì)復(fù)合物。所述方法可用于在體內(nèi)細(xì)胞中形成CMV蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0021] 本發(fā)明還涉及通過(guò)向個(gè)體給予重組多順?lè)醋雍怂岱肿樱ɡ缱詮?fù)制RNA分子）來(lái) 誘導(dǎo)個(gè)體內(nèi)的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施方式中，向個(gè)體給予編碼四種或更多種CMV蛋 白的自復(fù)制RNA。所述自復(fù)制RNA分子可以包含RNA遞送系統(tǒng)（如脂質(zhì)體）的組合物形式遞 送。在其它實(shí)施方式中，向個(gè)體給予包含編碼四種或更多種CMV蛋白的自復(fù)制RNA的VRP。 優(yōu)選地，誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生中和抗CMV抗體。更優(yōu)選地，所述中和抗體是補(bǔ)體非依賴 性的。
[0022] 本發(fā)明還涉及抑制CMV進(jìn)入細(xì)胞的方法，所述方法包括：使細(xì)胞接觸編碼四種或 更多種CMV蛋白的自復(fù)制RNA分子。所述細(xì)胞可選自下組：上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì) 胞及其組合。在一些實(shí)施方式中，使所述細(xì)胞接觸包含編碼四種或更多種CMV蛋白的自復(fù) 制 RNA 的 VRP。
[0023] 本發(fā)明還涉及編碼來(lái)自細(xì)胞中CMV蛋白質(zhì)復(fù)合物的四種或更多種CMV蛋白的自復(fù) 制RNA分子（例如，VRP、包含自復(fù)制RNA分子的組合物和脂質(zhì)體）在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或抑制 CMV進(jìn)入細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0024] 附圖簡(jiǎn)述
[0025] 圖1是編碼5種CMV蛋白的五順?lè)醋覴NA復(fù)制子A526、A527、A554、A555和A556 的示意圖。亞基因組啟動(dòng)子用箭頭表示，標(biāo)記了其它控制元件。"呢？1"、"呢?2"、"呢?3"和 "NSP4"分別是α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1?4,其是病毒復(fù)制所需的。示意圖中顯示NSP4，NSP1、 NSP2 和 NSP3 在 NSP4 上游。
[0026] 圖2是顯示用A527RNA復(fù)制子轉(zhuǎn)染的BHKV細(xì)胞表達(dá)gH/gL/UL128/UL130/UL131 五聚體復(fù)合物的熒光直方圖。用抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，所述抗體結(jié)合五聚體復(fù)合物上所呈遞 的構(gòu)象表位。
[0027] 詳細(xì)描述
[0028] 本發(fā)明提供用于向細(xì)胞共同遞送蛋白質(zhì)（例如，蛋白質(zhì)抗原）的平臺(tái)，所述蛋白質(zhì) 例如皰疹病毒蛋白質(zhì)（例如CMV蛋白），尤其是在體內(nèi)形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)。本文所述的重 組多順?lè)醋雍怂岱肿泳哂邢蚣?xì)胞遞送編碼四種或更多種蛋白質(zhì)的序列以及驅(qū)動(dòng)所述蛋白 質(zhì)表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。采用該方法，所述四種或更多種經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)可以充足的胞內(nèi)水平表達(dá)， 以供體內(nèi)形成包含所述四種或更多種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。例如，通過(guò)選擇合適的表達(dá) 控制序列，所述經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)或其片段可以基本相同的水平，或必要時(shí)以不同水平表達(dá)。 相較于通過(guò)向細(xì)胞共同遞送編碼不同蛋白質(zhì)的兩種或更多種個(gè)體DNA分子的方法（其可能 具有低效率和高可變性）而言，在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)復(fù)合物是一種顯著更有效的方法。參見(jiàn) 例如，W02004/076645。
[0029] 優(yōu)選地，所述重組多順?lè)醋雍怂岱肿邮潜疚乃龅淖詮?fù)制RNA分子，其中編碼蛋 白質(zhì)的各核苷酸序列操作性連接至其自身的α病毒亞基因組啟動(dòng)子（SGP)。這些自復(fù)制 RNA分子小于其它表達(dá)控制序列（例如，其它啟動(dòng)子）中所用的對(duì)應(yīng)分子。不希望受任何 具體理論的限制，據(jù)信可更有效地將這種類型的自復(fù)制RNA分子包裝進(jìn)入VRP，并且獲得比 包含其它表達(dá)控制序列（例如IRES)的對(duì)應(yīng)分子更高的產(chǎn)量。還相信，本文所述的自復(fù)制 RNA分子和包含它們的VRP能比包含其它表達(dá)控制序列（例如IRES)的對(duì)應(yīng)分子產(chǎn)生更好 的免疫應(yīng)答。
[0030] 在一些實(shí)施方式中，所述經(jīng)遞送的蛋白質(zhì)或其形成的復(fù)合物引發(fā)強(qiáng)效的中和抗 體。通過(guò)共同遞送蛋白質(zhì)（尤其是在體內(nèi)形成復(fù)合物的那些蛋白質(zhì)）產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可強(qiáng) 于采用其它方式產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。例如，可使編碼CMV 8!141^見(jiàn)128、見(jiàn)130和見(jiàn)131的1?隱 分子表達(dá)以產(chǎn)生gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚體復(fù)合物，從而相較于編碼單一 CMV蛋白 (例如，gB、gH、gL等）的RNA分子或甚至獨(dú)立編碼gH、gL、UL128、UL130和UL131的RNA分 子的混合物而言，能夠誘導(dǎo)更高的中和效價(jià)和/或保護(hù)性免疫。
[0031] 在一個(gè)廣義方面，本發(fā)明涉及重組多順?lè)醋雍怂岱肿?，例如，自?fù)制RNA分子，用 于向細(xì)胞遞送四種或更多種蛋白質(zhì)。所述重組多順?lè)醋雍怂岱肿樱ɡ?，自?fù)制RNA分子） 包含：操作性連接至第一 SGP的編碼第一蛋白質(zhì)或其片段的第一序列，操作性連接至第二 SGP的編碼第二蛋白質(zhì)或其片段的第二序列，操作性連接至第三SGP的編碼第三蛋白質(zhì)或 其片段的第三序列，和操作性連接至第四SGP的編碼第四蛋白質(zhì)或其片段的第四序列。必 要時(shí)，所述自復(fù)制RNA分子中可具有操作性連接至第五SGP的編碼第五蛋白質(zhì)或其片段的 第五序列，和可任選的編碼其它蛋白質(zhì)或其片段的其它序列。在一些實(shí)施方式中，編碼所述 第一、第二、第三、第四和第五蛋白質(zhì)的序列編碼α病毒（例如，CMV)蛋白或其片段。
[0032] 在本文所述的多順?lè)醋雍怂嶂校?jīng)編碼的第一、第二、第三和第四蛋白質(zhì)或片段以 及（若存在）經(jīng)編碼的第五蛋白質(zhì)或片段，一般且優(yōu)選來(lái)自相同生物，例如病原體（例如病 毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、古細(xì)菌）。在某些示例中，由多順?lè)醋幼詮?fù)制RNA分子編碼的蛋白質(zhì) 或片段全部是皰疹病毒蛋白，例如CMV蛋白或VZV蛋白。
[0033] 所述重組多順?lè)醋雍怂岱肿涌苫谌魏嗡璧暮怂?，例如DNA(例如質(zhì)?；虿《?DNA)或RNA?？刹捎萌魏魏线m的DNA或RNA作為攜帶編碼皰疹病毒（例如CMV)蛋白或其片 段的開(kāi)放閱讀框的核酸載體。合適的核酸載體具有攜帶并驅(qū)動(dòng)表達(dá)多于一種蛋白質(zhì)基因的 能力。此類核酸載體為本領(lǐng)域已知，并且包括，例如，質(zhì)粒、獲自DNA病毒（例如牛痘病毒載 體（如，NYVAC，參見(jiàn)US5,494,807)和痘病毒載體（如，ALVAC金絲雀痘載體，賽諾菲巴斯德 公司（Sanofi Pasteur)))的DNA，以及獲自合適RNA病毒（例如α病毒）的RNA。若需要， 可以修飾所述重組多順?lè)醋雍怂岱肿?，例如包含?jīng)修飾的核堿基和或如本文進(jìn)一步所述的 連接。優(yōu)選地，所述多順?lè)醋雍怂岱肿邮荝NA分子。
[0034] 在一些方面，本發(fā)明是含有編碼皰疹病毒gH或其片段和皰疹病毒gL或其片段的 序列的多順?lè)醋雍怂岱肿?。所述gH和gL蛋白或其片段可來(lái)自任何所需的皰疹病毒，例如 HSV-1、HSV-2、VZV、1 型 EBV、2 型 EBV、CMV、A 型 HHV-6、B 型 HHV-6、HHV-7、KSHV 等。優(yōu)選 地，所述皰疹病毒是VZV、HSV-2、HSV-1、EBV(1型或2型）或CMV。更優(yōu)選地，所述皰疹病毒 是VZV、HSV-2或CMV。甚至更優(yōu)選地，所述皰疹病毒是CMV。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知gH和gL 蛋白的序列以及編碼這些病毒蛋白的核酸序列。示例性序列見(jiàn)表1。所述多順?lè)醋雍怂岱?子可包含編碼表1公開(kāi)的gH蛋白或其片段的第一序列，或與其具有至少約90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的序列。所述多順?lè)醋雍怂岱肿舆€可包含編碼表 1公開(kāi)的gL蛋白或其片段的第二序列，或與其具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%相同性的序列。
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種包含多核苷酸的自復(fù)制RNA分子，所述多核苷酸包含： a) 編碼第一蛋白質(zhì)或其片段的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列操作性連接至第 一亞基因組啟動(dòng)子（SGP);和 b) 編碼第二蛋白質(zhì)或其片段的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列操作性連接至第 二 SGP ; c) 編碼第三蛋白質(zhì)或其片段的第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列操作性連接至第 三SGP ;和 d) 編碼第四蛋白質(zhì)或其片段的第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列操作性連接至第 四 SGP ; 其中，將所述自復(fù)制RNA分子引入合適的細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生所述第一、第二、第三和第四蛋 白質(zhì)或其片段。
2. 如權(quán)利要求1所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，限制條件是：所述第一蛋白質(zhì)、 所述第二蛋白質(zhì)、所述第三蛋白質(zhì)和所述第四蛋白質(zhì)不是相同蛋白質(zhì)或相同蛋白質(zhì)的片 段，所述第一蛋白質(zhì)不是所述第二、第三或第四蛋白質(zhì)的片段，所述第二蛋白質(zhì)不是所述第 一、第三或第四蛋白質(zhì)的片段，所述第三蛋白質(zhì)不是所述第一、第二或第四蛋白質(zhì)的片段， 且所述第四蛋白質(zhì)不是所述第一、第二或第三蛋白質(zhì)的片段。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述自復(fù)制RNA分子還包含 編碼第五蛋白質(zhì)或其片段的第五核苷酸序列，所述第五核苷酸序列操作性連接至第五SGP。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述第一蛋白質(zhì)或 其片段、所述第二蛋白質(zhì)或其片段、所述第三蛋白質(zhì)或其片段和所述第四蛋白質(zhì)或其片段 和存在時(shí)的所述第五蛋白質(zhì)或其片段形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述第一蛋白質(zhì)或 其片段、所述第二蛋白質(zhì)或其片段、所述第三蛋白質(zhì)或其片段、所述第四蛋白質(zhì)或其片段和 存在時(shí)的所述第五蛋白質(zhì)或其片段各來(lái)自皰疹病毒。
6. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述皰疫病毒選自 下組：HHV-1、HHV-2、HHV-3、HHV-4、HHV-5、HHV-6、HHV-7、HHV-8 和 HHV-9。
7. 如權(quán)利要求6所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述皰疹病毒是HHV-5 (CMV)。
8. 如權(quán)利要求7所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述第一蛋白質(zhì)或片段、所述第 二蛋白質(zhì)或片段、所述第三蛋白質(zhì)或片段、所述第四蛋白質(zhì)或片段，和所述第五蛋白質(zhì)或片 段獨(dú)立地選自下組：gB、gH、gL、gO、gM、gN、UL128、UL130、UL131和上述任何一種的片段。
9. 如權(quán)利要求8所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述第一蛋白質(zhì)或片段是gH或 其片段，且所述第二蛋白質(zhì)或片段是gL或其片段，所述第三蛋白質(zhì)或片段是UL128或其片 段，所述第四蛋白質(zhì)或片段是UL130或其片段，且所述第五蛋白質(zhì)或片段是UL131或其片 段。
10. 如權(quán)利要求6所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述皰疹病毒是HHV-3 (VZV)。
11. 如權(quán)利要求10所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述第一蛋白質(zhì)或片段、所述 第二蛋白質(zhì)或片段、所述第三蛋白質(zhì)或片段、所述第四蛋白質(zhì)或片段和所述第五蛋白質(zhì)或 片段獨(dú)立地選自下組：gB、gE、gH、gl、gL和上述任何一種的片段。
12. 如權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA分子，其特征在于，所述自復(fù)制RNA 分子是α病毒復(fù)制子。
13. -種包含如權(quán)利要求12所述的α病毒復(fù)制子的α病毒復(fù)制子顆粒（VRP)。
14. 一種組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求13所述的VRP和藥學(xué)上可接受的載劑。
15. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含佐劑。
16. -種組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA和藥 學(xué)上可接受的載劑。
17. 如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含RNA遞送系統(tǒng)。
18. 如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述RNA遞送系統(tǒng)是脂質(zhì)體、聚合納米 顆粒、水包油陽(yáng)離子納米乳液或其組合。
19. 一種形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法，所述方法包括：向細(xì)胞遞送如權(quán)利要求13所述的 VRP或如權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA，和在適于所述α病毒復(fù)制子表達(dá)的 條件下維持所述細(xì)胞，其中形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是體內(nèi)細(xì)胞。
21. -種誘導(dǎo)個(gè)體中免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括：向所述個(gè)體給予如權(quán)利要求1? 12中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA、如權(quán)利要求13所述的VRP或如權(quán)利要求14?18中任一項(xiàng) 所述的組合物。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生中和抗體。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述中和抗體是非補(bǔ)體依賴性的。
24. -種編碼如權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA分子的重組DNA分子。
25. 如權(quán)利要求24所述的重組DNA分子，其特征在于，所述重組DNA分子是質(zhì)粒。
26. 如權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的自復(fù)制RNA、如權(quán)利要求13所述的VRP、如權(quán)利 要求14?18中任一項(xiàng)所述的組合物，或如權(quán)利要求24或25所述的DNA用于誘導(dǎo)個(gè)體中 免疫應(yīng)答的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/25GK104105504SQ201280050099
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月11日
【發(fā)明者】安德斯·利亞, 彼得·梅森 申請(qǐng)人:諾華股份有限公司, 安德斯·利亞, 彼得·梅森