特異性靶向癌細胞的輸送系統(tǒng)及其使用方法

文檔序號：1250014閱讀：474來源：國知局

特異性靶向癌細胞的輸送系統(tǒng)及其使用方法
【專利摘要】公開用于預防、治療或抑制受試者的癌細胞的生長或轉移的多種方法。其中一種方法包括向受試者施用治療有效量的腫瘤相關抗原結合配體包覆的含有細胞毒性劑的行星球磨（PBM）納米顆粒的步驟。
【專利說明】特異性靶向癌細胞的輸送系統(tǒng)及其使用方法
[〇〇〇1] 本申請要求2011年8月15日提交的第61/523,626號臨時申請的優(yōu)先權。該臨時申請的全部內(nèi)容通過引用并入到本發(fā)明中。【技術領域】
[0002] 本申請總體上涉及輸送系統(tǒng)和癌癥的治療。特別地，本申請涉及使用納米顆粒的細胞毒性劑的運輸。【背景技術】
[0003] 全身性毒性是與破壞細胞的分裂和復制的能力的許多細胞毒性藥物相關聯(lián)的主要問題。例如，盡管有一些益處，基于鉬的藥物(例如卡鉬、順鉬、奧沙利鉬、沙鉬、三鉬替群妥英（triplatin tetranin)等)、天然酚類(例如小豆蘧、姜黃素、高良姜、生姜、內(nèi)亞胡椒、姜黃等)，植物堿和紫杉烷類(例如喜樹堿、多西他賽、紫杉醇、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、長春新堿等)、其它的烷基化劑(例如六甲蜜胺、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、乙撐亞胺、六甲蜜胺、肼、異環(huán)磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法侖、亞硝基脲、胡椒堿、丙卡巴肼、鏈佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類抗生素(例如博萊霉素、色霉素、更生霉素、道諾紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達比星、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、拓撲異構酶抑制劑(例如安吖啶、依托泊苷、伊立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、抗代謝物（5-氟尿嘧啶、6-硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、腺苷脫氨酶抑制劑、卡培他濱、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤、奈拉濱、噴司他丁有絲分裂抑制劑、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑等）以及各種抗腫瘤藥(例如天門冬酰胺酶、貝沙羅汀、雌莫司汀、羥基脲、異維甲酸、米托坦、培加帕酶、類維生素 A、維生素 A酸等）在抑制癌細胞中是非常有效的。然而，它們的效用仍不確定，存在復雜性和問題。例如，基于鉬的藥物不是治療癌癥的首選，因為這些藥物容易被健康組織吸收，且只有少于1 %的施用藥物到達細胞內(nèi)靶標 (例如腫瘤細胞的細胞核/DNA)。結果，基于鉬的和其他癌癥藥物可能對健康組織毒性極高。因此，需要一種輸送系統(tǒng)，專門針對癌細胞的細胞毒性劑的遞送。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本申請的一個方面涉及一種用于特異性地靶向癌細胞的系統(tǒng)，其包含用高親和力和選擇性的腫瘤細胞配體涂覆并含有細胞毒性劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。
[0005] 本申請的另一個方面涉及一種用于在需要的受試者中治療癌癥的方法，包括對所述受試者施用有效量的用于特異性地靶向癌細胞的系統(tǒng)，其包含用高親和力和選擇性的腫瘤細胞配體涂覆并含有細胞毒性劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。
[0006] 本申請的另一個方面涉及在需要的受試者中抑制癌轉移，包括對所述受試者施用有效量的用于特異性地靶向癌細胞的系統(tǒng)，其包含用高親和力和選擇性的腫瘤細胞配體涂覆并含有細胞毒性劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。
[0007] 本申請的另一個方面涉及在需要的受試者中誘導調(diào)節(jié)性T (Treg)細胞的細胞凋亡,包括對所述受試者施用有效量的用高親和力和選擇性的腫瘤細胞配體涂覆并含有對 Treg細胞有細胞毒性的藥劑的行星球磨（PBM)納米顆粒。【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1示出了用于制造可生物降解的行星球磨（PBM)納米顆粒的示例性方法。
[0009] 圖2是由姜黃素調(diào)節(jié)的分子靶標的圖。
[〇〇1〇] 圖3示出了通過乳腺癌組織和細胞系的葉酸受體的表達。
[0011] 圖4示出了乳腺癌（BrCa)細胞的PBM納米顆粒介導的細胞凋亡。
[0012] 圖5示出了在MDA-MB-231-Luc異種移植中PBM納米顆粒介導的腫瘤消退。
[0013] 圖6示出了 CD4+CD25*FoxP3+ (Treg)細胞的PBM納米顆粒介導的細胞凋亡。
[0014] 圖7示出了葉酸受體（FRs)由PC3和PTEN-CaP2腫瘤表達，而不是由細胞系或正常細胞表達。
[0015] 圖8示出了在體外順鉬負載的葉酸包覆的PBM納米顆粒介導的PC3細胞的破壞。
[0016] 圖9示出了接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或包含順鉬的葉酸涂覆的XP包層納米顆粒的移植有PC3-luc瘤的小鼠的腫瘤消退。
[0017] 圖10示出了涂覆和未涂覆的PBM納米顆粒的粒徑分布。
[0018] 圖11示出了涂覆有表面結合葉酸的聚己內(nèi)酯的PBM納米顆粒。
[0019] 圖12示出了前列腺腫瘤特異性PBM顆粒的ζ電勢。
[0020] 圖13示出了葉酸受體由前列腺細胞系和腫瘤的表達。
[0021] 圖14示出了負載ΡΒΜ納米顆粒的姜黃素孵育的PC3細胞的凋亡。
[0022] 圖15示出了制造 ΡΒΜ納米顆粒的示例性的圖。
[0023] 圖16示出了心室內(nèi)和骨內(nèi)（intratibialy)注入PC3腫瘤細胞的老鼠。
[0024] 圖17示出了前列腺腫瘤特異性PBM納米顆粒的粒度分布。
[0025] 圖18示出了前列腺腫瘤特異性PBM納米顆粒的ζ電勢。
[0026] 圖19示出了 ΡΒΜ納米顆粒處理過的前列腺癌細胞的TUNEL和DRAQ5染色。
[0027] 圖20顯示ΡΒΜ納米顆粒介導的癌細胞與正常細胞的凋亡。
[0028] 圖21顯示ΡΒΜ納米顆粒運輸?shù)郊毎撕蚑UNEL染色。【具體實施方式】
[0029] 陳述以下的詳細描述以使所屬領域的任何技術人員能夠制造和使用本發(fā)明。為了解釋的目的，闡述具體的術語以提供對于本發(fā)明的完全理解。然而，對于本領域技術人員來講，顯而易見的是這些具體的描述不是實施本發(fā)明必需的。具體應用的描述僅作為典型的實例。本發(fā)明并不試圖限定于所示實施例，而是使與本發(fā)明所公開的原理和特征與盡可能廣泛的范圍相一致。
[0030] 除非另有限定，否則所使用的與本發(fā)明相關的科學和技術術語應該具有由本領域的普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術語應包括復數(shù)，復數(shù) 術語應包括單數(shù)。
[0031] 釋義
[0032] 當在本發(fā)明中使用時，下列術語具有以下含義：
[0033] 當用于本發(fā)明中時，術語"癌癥（cancer)"指的是惡性新生物或惡性贅生物，是一組細胞顯示出不受控制的生長，侵入和破壞鄰近組織，有時通過淋巴或血液轉移或擴散到身體的其他部位的一類疾病。癌癥的這三種惡性與不侵入或轉移的良性腫瘤區(qū)分開來。術語"癌癥"在此包括"癌"、"肉瘤"、"淋巴瘤"、"白血病"、"黑色素瘤"、"胚細胞瘤"和"母細胞瘤"。
[〇〇34] 當用于本發(fā)明中時，術語"腫瘤"指的是由細胞的異常生長而形成的腫瘤或固體病變。腫瘤可以是良性的、惡性前的或惡性的。
[0035] 當用于本發(fā)明中時，術語"癌（carcinoma)"是指一種侵入性惡性腫瘤，包括轉化的上皮細胞或未知組織來源的轉化細胞，但它們具有與上皮細胞相關的特定的分子的或組織學的特征，例如細胞角蛋白或細胞間橋的產(chǎn)生。本發(fā)明的典型的癌包括黑色素瘤、卵巢癌、陰道癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島細胞瘤、腺癌、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、口腔癌、腦癌、成神經(jīng)管細胞瘤、神經(jīng)外胚層瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體癌和骨癌。
[0036] 當用于本發(fā)明中時，術語"肉瘤"是指由結締組織產(chǎn)生的癌癥，例如骨、軟骨、月旨肪和神經(jīng)組織，每一種從起源于骨髓外的間充質(zhì)細胞中的細胞發(fā)育而來，即一種由在從胚胎的中胚層發(fā)育的許多組織中的一種組織中的轉化細胞產(chǎn)生的癌癥。因此，肉瘤包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管和造血組織的腫瘤。例如，骨肉瘤來自骨，軟骨肉瘤來自軟骨，脂肪肉瘤來自脂肪，平滑肌肉瘤來自平滑肌。典型的肉瘤包括:Askin腫瘤、葡萄狀肉瘤 (botryodies)、軟骨肉瘤、Ewing' s-PNET、惡性血管內(nèi)皮瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤。軟組織肉瘤的次級分類包括：腺泡狀軟組織肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促纖維增生性小圓細胞瘤、上皮樣肉瘤骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、Kaposi肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。
[0037] 當用于本發(fā)明中時，術語"淋巴瘤"是指由離開骨髓并在淋巴結中成熟的造血細胞所產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)的淋巴細胞的癌癥。淋巴瘤通常呈現(xiàn)為實體瘤。典型的淋巴瘤包括：小淋巴細胞淋巴瘤、淋巴楽細胞性淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、楽細胞瘤、結外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、結節(jié)性邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤（NMZL)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B 細胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤、結節(jié)性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤、鼻型結外NK/T細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、母細胞性NK細胞淋巴瘤、蕈樣霉菌病、塞澤里綜合征（sezary syndrome)、原發(fā)性皮膚⑶30-陽性T細胞淋巴增生性疾病、原發(fā)性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、非指定外周T 細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。典型霍奇金淋巴瘤的代表形式包括：結節(jié)性硬化、混合細胞性、富淋巴細胞、淋巴細胞耗盡或非耗盡。
[0038] 當用于本發(fā)明中時，術語"白血病"是指由離開骨髓并在血液中成熟的造血細胞所產(chǎn)生的癌癥。白血病是涵蓋廣泛疾病的廣義術語。反過來，它是稱為血液腫瘤的更廣泛的一組疾病的一部分。白血病被細分成各種大類，第一部是介于白血病急性和慢性形式之間。急性白血病的特征在于，未成熟的血細胞的數(shù)量迅速增加。由于這種細胞的聚集，使骨髓無法產(chǎn)生健康的血細胞。慢性白血病的特征是相對成熟的白血細胞的過度積聚，但仍然不正常。通常經(jīng)過幾個月或幾年的發(fā)展，細胞以比正常細胞高得多的速率產(chǎn)生，導致血液中許多異常的白血細胞。白血病也通過影響血細胞細分。這種區(qū)分將白血病劃分為淋巴細胞或淋巴細胞性白血病和髓細胞或骨髓性白血病。在淋巴細胞或淋巴細胞性白血病中，癌性變化發(fā)生在一類通常會形成為淋巴細胞的骨髓細胞中。在骨髓細胞或骨髓性白血病中，癌性變化發(fā)生在一類通常形成為紅細胞的骨髓細胞中、某些其它類型的白細胞和血小板中。結合這兩種分類，共提供四種主要類型。在這四個主要類型的每一種中，通常有幾種小類。也有這種分類方法以外的罕見的類型。典型的白血病包括急性淋巴細胞白血?。╝ll)、慢性淋巴細胞性白血?。–LL)、急性髓性白血?。ˋML)、慢性髓細胞性白血?。–ML)、毛細胞白血病 (HCL)、T-細胞幼淋巴細胞白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病、未成熟骨髓單核細胞性白血病、B細胞幼淋巴細胞白血病、伯基特細胞白血病、成熟T-細胞白血病。
[0039] 當用于本發(fā)明中時，術語"黑色素瘤"是一種黑素細胞的癌癥或惡性腫瘤。黑素細胞是產(chǎn)生暗色素、黑色素(負責皮膚的顏色)的細胞。它們主要在皮膚中發(fā)生，但在身體的其他部位也發(fā)現(xiàn)過，包括腸和眼睛。黑色素瘤分為以下定型和亞型：惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、肢端雀斑樣痣黑素瘤、黏膜黑色素瘤、結節(jié)性黑色素瘤、息肉狀黑色素瘤、黑色素瘤促纖維增生、無色素性黑色素瘤、軟組織惡性黑色素瘤、有小痣樣細胞的黑色素瘤、有斯皮茨痣特征的黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤。
[0040] 當用于本發(fā)明中時，術語"生殖細胞腫瘤"是指由生殖或多能干細胞衍生的癌癥，包括存在于睪丸(精原細胞瘤）或卵巢(無性細胞瘤）的那些細胞。生殖細胞腫瘤可以是癌性或非癌性腫瘤。生殖細胞通常發(fā)生在性腺(卵巢和睪丸）內(nèi)，起源于性腺外的生殖細胞腫瘤可能是在胚胎發(fā)育過程中的錯誤所導致的出生缺陷。生殖細胞腫瘤大致分為兩大類：生殖細胞瘤的或精原細胞瘤的和非生殖細胞瘤的或非精原細胞瘤的生殖細胞腫瘤。典型的生殖細胞瘤的或精原細胞瘤的生殖細胞腫瘤包括：生殖細胞瘤、無性細胞瘤和精原細胞瘤。典型的非生殖細胞瘤的或非精原細胞瘤的生殖細胞腫瘤包括：胚胎癌、內(nèi)胚竇瘤或卵黃囊瘤 (EST，YST)、絨毛膜癌、成熟性畸胎瘤、皮樣囊腫、未成熟畸胎瘤、惡性轉化畸胎瘤、多胚瘤、性腺胚細胞瘤和混合型GCT。
[0041] 當用于本發(fā)明中時，術語"胚細胞瘤"是指由未成熟前體細胞或胚胎組織衍生的癌癥。
[0042] 當用于本發(fā)明中時，術語"BrCa"指的是乳腺癌。在這里使用的術語"PCa"是指前列腺癌。
[〇〇43] 當用于本發(fā)明中時，術語"轉移"是指癌癥或癌從一個器官或部分擴散到另一個非相鄰的器官或部分。
[0044] 當用于本發(fā)明中時，術語"抗體"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白（Ig)分子的免疫活性部分，即含有與抗原特異性結合(發(fā)生免疫反應）的抗原結合位點的分子。術語"抗體"在最廣泛的意義上使用，特別地覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學活性。由 "特異性結合"或"發(fā)生免疫反應"是指該抗體與期望抗原的一個或多個抗原決定簇發(fā)生反應，不與其它多肽發(fā)生反應(即結合)或與其它多肽以更低的親和力結合。術語"抗體"還包括包含全長抗體的一部分(通常是其抗原結合區(qū)或可變區(qū))的抗體片段。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段；雙抗體、線性抗體、單鏈抗體（scFv)分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。在本發(fā)明的某些實施方式中，例如，可能理想的是使用抗體片段而非完整抗體來提高腫瘤穿透。在這種情況下，為了增加其血清半衰期，可能理想的是使用已通過本領域已知的任何方法修飾的抗體片段。
[0045] 當用于本發(fā)明中時，術語"單克隆抗體"指從實質(zhì)上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即除了可能天然發(fā)生的少量存在的突變之外，構成群體的各個抗體是相同的。特別地，在本發(fā) 明中單克隆抗體包括"嵌合"抗體，以及此類抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學活性，其中，重鏈和/或輕鏈的一部分與由特定物種衍生的或?qū)儆谔囟贵w類別和亞類的抗體中的序列相同或同源，而其余的鏈是與由其他物種衍生的或?qū)儆谄渌贵w類別和亞類的抗體中的序列相同或同源。
[0046] 非人抗體的"人源化"形式是含有從非人免疫球蛋白衍生的最小序列的嵌合抗體。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體)，其中，來自受體的高變區(qū)殘基由來自非人物種(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和力和/或能力的非人靈長類動物的高變區(qū)殘基替換。用于制備人源化的和其它嵌合抗體的方法在本領域中是已知的。
[0047] "雙特異性抗體"是具有對于至少兩種不同抗原的結合特異性的抗體。用于制備雙特異性抗體的方法在本領域中是已知的。
[0048] "異源結合抗體（heteroconjugate antibodies)"的使用也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。異源結合抗體由兩種共價連接的抗體組成。例如，有人提出此類抗體使免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利號4, 676, 980)?？梢栽O想，可以用合成蛋白質(zhì)化學中已知的方法 (包括涉及交聯(lián)劑的方法）在體外制備該抗體。
[0049] 本申請還考慮使用"免疫偶聯(lián)物（immunoconjugates)"，包含與諸如毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素，或其片段）或放射性同位素（即放射性偶聯(lián)物）的細胞毒性劑結合的抗體?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅?A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈(來自銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa))、菌麻毒素 A鏈（ricin A chain)、相思豆毒蛋白A鏈（abrin A chain)，蒴蓮根毒素 A鏈 (modeccin A chain)、a -帚曲霉素（alpha-sarcin)、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹蛋白（dianthin protein)、美洲商陸（Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜（momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白（curcin)、巴豆毒素（crotin)、肥阜草（sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素（gelonin)、絲林霉素（mitogellin)、局限曲菌素（restrictocin)、酚霉素（phenomycin)、伊諾霉素（enomycin)和單孢霉烯族毒素 (tricothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射性偶聯(lián)抗體。實例包括 212Bi、131I、131In、 90Υ 和 186Re。
[0050] 為治療目的的"哺乳動物"是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人類、非人類的靈長類動物、家畜和農(nóng)畜，以及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，例如狗、馬、貓、牛等，優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
[0051] 當用于本發(fā)明中時，術語"治療（treat、treating或treatment)"是指減輕或消除疾病和/或其并發(fā)癥的方法。當用于本發(fā)明中時，術語"預防（prevent、preventing或 prevention)"是指限制受試者罹患疾病和/或其并發(fā)癥的方法。在某些實施方式中，"預防 (prevent、preventing或prevention)"是指降低摧患疾病和/或其并發(fā)癥的風險的方法。
[0052] 術語"抑制"是相對的術語，相對于參照試劑，如果施用藥劑后，反應或狀態(tài)從數(shù) 量上減弱，或者，如果施用藥劑后，其被減弱，則藥劑抑制反應或狀態(tài)。類似地，術語"防止" 并不一定意味著藥劑完全消除了反應或狀態(tài)，只要消除了反應或條件中的至少一種特性即可。因此，可以減少或防止腫瘤生長或反應(例如病理反應)組合物，可以但不必完全消除上述增長或反應，只要生長或反應可測量地減弱，例如，比在沒有藥劑的生長或反應或者與參照藥劑相比，減少至少約50%，例如至少約70%、或約80%，或甚至約90% (即至其10%以下)。
[0053] 術語"提高水平"指的是高于在相關領域中通常限定或使用的正?；?qū)φ账降?更高水平。例如，在組織中免疫染色增加的水平是本領域的普通技術人員認為比在對照組織中的免疫染色水平更高的水平。
[0054] 當用于本發(fā)明中時，術語"生物樣品"是指生物來源的材料，其可以是體液或身體產(chǎn)物，例如血液、血漿、尿液、唾液、脊髓液、糞便、汗液或呼出的空氣。生物樣品還包括組織樣品和細胞樣品。
[0055] 在本發(fā)明中，范圍可以表示為從"約"一個特定值，和/或到"約"另一個特定值。當表達這樣的范圍時，另一種實施方式包括從一個特定值和/或到另一個特定值。類似地，當數(shù)值表示為近似值時，通過使用先行詞"約"，可以理解的是，該特定值形成另一種實施方式。可以進一步理解為，每個范圍的端點相對于另一端點是顯著的，并且獨立于另一端點。也可以理解的是，本發(fā)明中公開了一些值，并且除了該值本身，每個值在本發(fā)明中也以"約" 的特定值公開。例如，如果公開了"10"的值，那么"約10"也被公開。正如本領域技術人員的適當理解，還應當理解的是，當以"小于或等于"某值公開該值時，"大于或等于該值"以及數(shù)值間可能的范圍也被公開。例如，如果公開了"10"的值，則"小于或等于10"以及"大于或等于10"也被公開。
[0056] 在本申請的上下文中，"有效量"是指足以實現(xiàn)有益的或期望的結果的組合物的量，例如，預防或治療疾病的有效量。"疾病"指會受益于抗體治療的任何狀態(tài)，包括癌和化學抗性。這包括慢性和急性疾病，或包括使哺乳動物易于罹患所討論的疾病的那些病理狀態(tài)的疾病。
[0057] 攜帶特異性靶向癌細胞的納米顆粒的藥物
[0058] 本申請的一個方面涉及攜帶特異性靶向特定細胞的納米顆粒的藥物，例如腫瘤細胞和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞)。在一些實施方式中，攜帶納米顆粒的藥物包括一個行星球磨納米顆粒核，一種或多種細胞毒性劑，以及一種或多種細胞靶向劑。在某些實施方式中，所述一種或多種細胞毒性劑包括姜黃素，所述一種或多種細胞靶向劑包括葉酸。在某些其它實施方式中，一種或多種細胞毒性劑包含姜黃素和一種或多種其他細胞毒性劑。本申請的攜帶藥物的納米顆粒允許使用較低劑量的細胞毒性藥物，降低不良反應，提高療效，并減少藥物被迅速從靶標腫瘤或癌細胞清除的可能性。例如，本申請的攜帶藥物的納米顆粒能夠靶向并由乳腺或前列腺癌細胞吸收，從而有效地將化學治療劑運送到癌細胞中的細胞內(nèi) 靶標，并攜帶充足的藥物以完成細胞凋亡過程來限制化學抗性和全身毒性的可能性。
[0059] 行星球磨（PBM)納米顆粒
[0060] 如在本發(fā)明中所用，術語" PBM納米顆粒"和" XPc 1 ad納米顆粒"是相同的，可以互換使用。在一些實施方式中，所述PBM納米顆粒的直徑的范圍為0. 1ηπι-60μπι、0. lnm-?μπι、 0· lnm-500nm、0. lnm_200nm、lnm-200nm、5nm_60 μ m、5nm-30nm、30nm-80nm、30nm-180nm、 80nm_l μ m、180nm_l μ m、200nm_l μ m、1 μ m_6 μ m、4 μ m_12 μ m 和 10 μ m_60 μ m。在其它實施方式中，所述PBM納米顆粒可以是生物可降解的納米顆粒?？梢允褂靡环N新配方的方法來產(chǎn)生大小均勻，100%的疏水性或親水性藥物負載效率，含有用于靶向遞送的后續(xù)涂層并控制用于全身性、口服或皮膚運送的表面的logP (用于親脂性：親水性分布的度量）的顆粒，以制造 PBM納米顆粒。
[0061] 本申請中描述的PBM納米顆粒表示使用行星球磨機以產(chǎn)生均勻尺寸的，100 %的疏水性或親水性藥物負載效率，含有用于靶向遞送的后續(xù)涂層并控制用于全身性、口服或皮膚運送的表面的logP的顆粒的新型納米顆粒制劑方法。這些是通過以RES設計表面特性靶向乳腺腫瘤的FR1和無間隙的FR4表達Treg細胞的均勻大小的顆粒得到的PBM納米顆粒的首次研究。
[0062] 在一些實施方式中，所述PBM納米顆粒包括納米基質(zhì)芯，包括一種或多種可生物降解的聚合物或多糖，例如藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉。其它合適的可生物降解的聚合物包括但不限于聚乙二醇（PEG)、聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸（PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA)、聚羥基脂肪酸酯（PHA)、聚羥基丁酸酯-戊酸酯（PHBV)、聚乙烯醇（PVA)、聚對苯二甲酸乙酯（PET)、聚乙交酯-丙交酯、聚己內(nèi)酯（PCL)、乳酸-ε-己內(nèi)酯共聚物（PLCL)、聚二噁烷酮（PD0)、聚三亞甲基碳酸酯（PTMC)、聚（氨基酸)、聚二噁烷酮、聚草酸酯、聚酐、聚（磷酸酯)、聚原酸酯以及它們的共聚物。在某些實施方式中，所述納米顆粒核心的基質(zhì)包括PEG 和選自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉的聚合物或多糖的混合物。細胞毒性劑的分子截留在納米顆粒核基質(zhì)中。在一些實施方式中，細胞毒性劑在基質(zhì)芯的形成過程中與生物可降解聚合物和多糖混合。在其他實施方式中，首先形成基質(zhì)芯，在隨后的階段中加載細胞毒性劑。
[0063] 在一些實施方式中，所述基質(zhì)的核心是通過將生物聚合物(例如藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉）溶解在水中以形成水溶液，將細胞毒性劑加入到該水溶液中以形成生物聚合物/細胞毒性劑的混合物，并任選地將另一種聚合物(例如PEG)加入到該生物聚合物/ 細胞毒性劑的混合物中以形成最終混合物。將該最終混合物干燥為顆?；蚱瑒┑男问?，然后在受控的溫度（<37°C)下使用行星式球磨機研磨?？梢酝ㄟ^行星球磨的速度和時間控制納米顆粒的尺寸。在一些實施方式中，所述納米顆粒的尺寸范圍為〇· 1至5nm、5至30nm、30 至 80nm、30 至 180nm、180 至 lOOOnm 或 200 至 lOOOnm。研磨速度范圍為 100-600rmp,優(yōu)選 200-400rmp〇
[0064] 在其它實施方式中，所述PBM納米顆粒進一步用釋放控制聚合物涂覆以控制內(nèi)含物釋放的時間、提高顆粒的機械強度和/或穩(wěn)定PBM納米顆粒中的活性成分。適合的用于釋放控制涂層的聚合物包括但不限于聚己內(nèi)酯（PCL)和聚乙二醇。在其它實施方式中，所述PBM納米顆?？梢员贿M一步涂布，與腫瘤特異性或細胞/組織特異性的祀向劑結合或修飾。所述腫瘤特異性或細胞/組織特異性的靶向劑的實例包括但不限于賴氨酸、多肽、抗體和葉酸。
[0065] 如圖1所示，由于PEG-涂層和具有負的LogP值，可生物降解的行星球磨（PBM)納米顆粒具有提高的包封藥物的血清半衰期。
[0066]目前有幾種用于藥物遞送的納米載體：聚合物、膠束、樹枝狀聚合物、脂質(zhì)體、白蛋白、病毒、碳納米管以及氧化硅/金屬。然而這些納米顆粒存在一定的限制（即非均勻的尺寸、難以制造和/或缺乏靶向），降低了它們的實用性。
[〇〇67] 在一些實施方式中，通過涂布口服抗癌劑(包括但不限于沙鉬、卡培他濱、厄洛替尼）配制成用于口服遞送的PBM納米顆粒。用于口服遞送的納米顆粒調(diào)節(jié)：用于腸道吸收的表面logP值，在首過效應中水解的共聚物的添加，通過肝臟膽道系統(tǒng)無肝毒性地轉運，對原發(fā)或轉移性腫瘤(包括乳腺癌和前列腺腫瘤)的靶向-全身性傳遞。也可制成制劑以包括用于檢測微轉移灶和活化處理的基板。
[0068] 細胞毒性藥劑
[〇〇69] 具有不同的胞內(nèi)靶標的各種細胞毒性藥劑可以誘導細胞凋亡的相同表型。這意味著細胞毒性藥劑的細胞毒素活性不是完全依賴于特定的藥物-靶標相互作用，而且還依賴于癌細胞的凋亡(細胞信號傳導)系統(tǒng)的活性。細胞毒性藥劑的實例包括但不限于基于鉬的藥物(例如卡鉬、順鉬、奧沙利鉬、沙鉬、三鉬替群妥英和卡鉬等)、天然的酚類(例如小豆蘧、姜黃、高良姜、生姜、內(nèi)亞胡椒、姜黃等)、植物生物堿和紫杉烷類(例如喜樹堿、多西他賽、紫杉醇、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、長春新堿等)、其它的烷基化劑(例如六甲蜜胺、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、乙撐亞胺、六甲蜜胺、肼、異環(huán)磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法侖、亞硝基脲、胡椒堿、丙卡巴肼、鏈佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類抗生素(例如博萊霉素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、拓撲異構酶抑制劑(例如安吖啶、依托泊苷、伊立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、抗代謝物(例如5-氟尿嘧啶、6-硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、腺苷脫氨酶抑制劑、卡培他濱、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤、奈拉濱、噴司他丁有絲分裂抑制劑、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑等）以及雜抗腫瘤藥(例如天冬酰胺酶、貝沙羅汀、雌莫司汀、羥基脲、異維甲酸、米托坦、培門冬酶、類視黃酸、維A酸，等等)。
[0070] 基于鉬類的治療法廣泛使用，通過破壞DNA和通過細胞色素 C釋放及隨后的半胱天冬酶激活來誘導細胞凋亡而發(fā)揮功能。許多化療耐藥的細胞系對于基于鉬的藥物(例如多西紫杉醇和卡鉬）更敏感。但是，這些藥物有許多副作用，包括但不限于：嗜中性白血球減少癥、肝功能障礙、貧血（70%)、惡心（40%)、感染（20%)、神經(jīng)肌肉功能障礙（15%)、腎功能衰竭，以及可能的心臟毒性-接受此種治療的患者死亡率上升為1. 7%。這些副作用意味著需要創(chuàng)新方法，從而克服或規(guī)避藥物療效的內(nèi)在機理、耐藥性、毒性以及同時阻礙早期原發(fā)性或預發(fā)性(例如，轉移性三重陰性）疾病。
[0071] 盡管以多西他賽進行了廣泛的臨床試驗，對于其功效和毒性仍有較高水平的不可預測性，這限制了其應用。多西他賽由CYP3-介導的氧化進行代謝，，這導致具有降低了的細胞毒性的代謝產(chǎn)物。這種排除途徑部分是由藥物外排轉運體ABCB1支配，但在ABCB1基因中的C1236T多態(tài)性顯著地降低多西他賽清除率。也有證據(jù)表明，在編碼的DNA修復基因中的多態(tài)性(例如NER和BER)和代謝滅活酶可能有助于在抗腫瘤功效以及卡鉬毒性方面的個體差異。幾種機制說明，賦予毒性，降低敏感性和對于卡鉬(包括外排泵(例如ABCB1))的耐受性，提高解毒酶，分別與NER和BER相關。在以基于鉬類的療法的背景下，這些多態(tài)性可以減少NER/BERd的功能和鉬-DNA損傷的修復。
[0072] 在一種具體的實施方式中，所述細胞毒性劑是姜黃素。在另一種實施方式中，所述細胞毒性劑包含姜黃素和一種或多種其他細胞毒性劑。
[0073] 在另一種【具體實施方式】中，所述細胞毒性劑選自化療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、 siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對癌細胞有細胞毒性的任何其他藥劑。
[0074] 在另一種實施方式中，所述化療劑選自基于鉬的藥物、天然酚、植物生物堿和紫杉烷類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物以及各種抗腫瘤藥物。
[0075] 在又一種實施方式中，所述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[0076] 在又一種實施方式中，所述抗體能夠與選自以下的腫瘤相關抗原結合：腺苷受體、 α νβ 3整合素、氨肽酶Ρ、α -胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、Ras、Ρ53、Her2/Neu、 ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射誘導的細胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細胞癌抗原、血小板反應蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關糖蛋白72、酪氨酸酶和酪氨酸激酶。
[〇〇77] 在又一種實施方式中，所述對于癌細胞有細胞毒性的藥劑選自白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白 A鏈、蒴蓮根毒素 A、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和 PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、單端孢子菌霉菌毒素以及它們的片段。
[0078] 姜黃素
[0079] 姜黃素(姜黃素 diferuloylmethane)是一種來源于植物姜黃的多酚，通常稱為姜黃。其在印度草藥學中保持高度地位，眾所周知的作為"具有抗氧化劑、抗炎、抗致癌、抗增殖和抗血管生成特性的身體清潔劑"的疏水性天然化合物。然而姜黃素的疏水性導致其生物利用性差，這阻礙了姜黃素的功效和作為抗癌劑的有效作用。因此，關鍵的挑戰(zhàn)是將姜黃素直接遞送到腫瘤細胞以提高其效用，并誘導癌細胞的死亡，同時防止損害正常細胞。
[0080] 能夠克服姜黃素較差的生物利用性并避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)間隙的長循環(huán)納米顆粒會導致具有增加的通透性和有缺陷的淋巴引流(即增強通透性和保留EPR效應)的腫瘤的聚集。這些納米尺寸的媒介的吸收有許多優(yōu)點，包括由于靶向給藥而顯著地減少全身毒性。這些納米顆粒防止化學抗性的出現(xiàn)也是合理的。納米顆粒能夠靶向并由前列腺腫瘤吸收，會有效地遞送姜黃素以擾亂細胞內(nèi)的靶標，并在生物利用上充分地誘導腫瘤細胞的凋亡過程。
[0081] 釋放控制聚合物涂層
[0082] 所述釋放控制聚合物涂層控制釋放內(nèi)含物的時間，增加涂層PBM納米顆粒的機械強度，和/或穩(wěn)定PBM納米顆粒的活性成分。適合的釋放控制涂層的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚己內(nèi)酯（PCL)、化學改性PCL和它們的混合物。在一些實施方式中，所述控制釋放聚合物涂層PBM納米顆粒進一步以針對特異性祀標(例如，腫瘤細胞或Treg細胞)的細胞靶向藥劑涂布、結合或修飾。
[0083] 細胞靶向藥劑
[0084] 細胞靶向藥劑允許含藥物的納米顆粒靶向附加物中的細胞的特定類型。細胞靶向藥劑的實例包括但不限于結合到或靶向腫瘤相關抗原的小分子(例如葉酸、腺苷、嘌呤）和大分子(例如肽或抗體)。腫瘤相關抗原的實例包括但不限于腺苷受體、αΥβ 3、氨肽酶P、 α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、 CD20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、Ras、Ρ53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射誘導的細胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細胞癌抗原、血小板反應蛋白、腫瘤抗原 4、腫瘤相關糖蛋白72、酪氨酸酶以及和酪氨酸激酶。在一些實施方式中，細胞靶向藥劑是與葉酸受體（FRs)特異性結合的葉酸或葉酸衍生物。
[0085] 所述還原性葉酸載體（RFC)是低親和力、高容量系統(tǒng)，其介導還原性葉酸在藥理 (μ M)濃度下吸收到癌細胞中。生理葉酸的濃度在5至50nM的范圍內(nèi)。因此，存在高親和力的人FRs并由一個家族基因編碼，其同源產(chǎn)物稱為FRa、β、 Υ、δ型，其也分別描述為 FR1、FR2、FR3、FR4。膜同種型FR1、FR2和FR4可以結合并運輸葉酸或葉酸衍生物進入細胞內(nèi)，而FR3缺少膜錨定點并從細胞中分泌。FR1和FR2分別以類似但不同的親和力結合葉酸和6S5-甲酰四氫葉酸（即亞葉酸鈣)，親和力L5nM對0·35ηΜ (葉酸）以及和800nM對7nM (亞葉酸鈣)。6S5-甲基四氫葉酸是在血液中占主導地位的葉酸，并對于FR1和FR2具有相似的親和力，分別為55nM和InM。而PC3人前列腺癌細胞在培養(yǎng)基中不顯著表達FR (例如 FR1 )，F(xiàn)Rs是由PC3腫瘤表達。FRs還通過BrCa細胞表達，與不良后果或通過這些受體運輸葉酸(不管對于甲氨蝶呤的抗性）有關。
[0086] 大多數(shù)非增殖性組織缺乏功能性FR表達。在增殖性正常組織中的FR表達僅限于某些上皮細胞的腔表面，從而無法進入循環(huán)。然而，在惡性腫瘤和白血病中存在的高水平的 FR2 (高親和力受體）暴露于循環(huán)中，使得它們成為用于腫瘤特異性療法的有吸引力的候選者。腎臟(其中FR1 (中度親和力受體）的表達在近端小管）由排除腎小球濾過的FR-靶向性治療來保護。進一步保護是腎葉酸保護機制的結果，其中，通過腎小管細胞的FR-介導的內(nèi)吞后，還有葉酸的迅速分解和運輸穿過基底膜進入血液。
[〇〇87] 癌細胞的氨甲喋呤抗性主要依賴于在二氫葉酸還原酶基因中的變化，降低的細胞內(nèi)聚谷氨酸、增加的經(jīng)由RFC流出和運輸；由于這種治療是通過FR結合和運輸，僅僅適度地影響甲氨蝶呤耐藥腫瘤的作用，因此，不太可能存在對本申請的生物降解的行星球磨（PBM) 納米顆粒的抗性。
[0088] 在PBM納米顆粒中葉酸作為靶向劑的應用還允許腫瘤細胞和調(diào)節(jié)性T (Treg)細胞。廣泛認可的是，大量的Treg細胞抑制腫瘤的免疫力。具體而言，Treg細胞抑制(外部和自身）反應性T細胞，而不是通過接觸-依賴或細胞因子(例如IL-KKTGF-β等）分泌殺死它們。FR4在Treg細胞中選擇性地上調(diào)。已經(jīng)表明FR4的抗體阻斷耗盡Treg細胞并引起荷瘤小鼠的腫瘤免疫。因此，攜帶細胞毒性劑的葉酸-涂層PBM納米顆粒將吸收用于其破裂的FR-表達細胞，其包括直接（即BrCa細胞）和間接（S卩乳腺腫瘤相關及周邊Treg細胞）抑制腫瘤發(fā)展。
[0089] 在另一種實施方式中，所述靶向劑是能夠結合腫瘤相關抗原的選自但不限于以下各項的抗體或肽：腺苷受體、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、 RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射誘導的細胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑 B4、鱗狀細胞癌抗原、血小板反應蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0090] 治療方法
[0091] 本申請的另一個方面涉及用于在所需要受試者中治療癌癥的方法，其包括給所述受試者施用有效量的包括含有細胞毒性劑和細胞祀向劑的行星球磨（PBM)納米顆粒的藥物組合物。在一些實施方式中，所述細胞靶向劑是葉酸或葉酸衍生物。
[0092] 含有藥物的PBM納米顆粒是能夠抗巨噬細胞的吞噬作用并避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) (RES)間隙的長循環(huán)納米顆粒，這反過來，將導致具有增加的透氣性和有缺陷的淋巴引流 (即增強通透性和保留-EPR效應)的腫瘤積聚。這些納米尺寸的載體的吸收有許多益處。由于靶向遞送，本申請的含藥物的PBM納米顆粒顯著地減少全身毒性。
[0093] 在其它實施方式中，本申請的含藥物的PBM納米顆粒防止耐藥性的出現(xiàn)。耐藥性通過兩個主要機制介導：（i)足夠量的細胞毒性藥物未到達所述祀向細胞(和胞內(nèi)作用位點)和（ii)細胞凋亡機制的誘導后未能完成細胞死亡。能夠靶向并由乳腺腫瘤吸收的納米顆粒有效地遞送化學治療劑和細胞內(nèi)的靶標，并攜帶足夠的藥物以完成細胞凋亡過程。
[0094] 在一些實施方式中，所述癌癥選自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞腫瘤和生殖細胞瘤。
[0095] 在另一種實施方式中，所述癌是前列腺癌。在一些其它實施方式中，所述癌癥是前列腺癌并且本申請的藥物組合物有效量的維生素 D結合施用。在一些男性的極低的維生素 D狀態(tài)也在PCa過程中顯示。此外，抗癌藥物相關的低鈣血癥通常是溫和的，但如果患者有預先存在維生素 D缺乏，則可能是嚴重的。由于基于鉬類的癌癥治療和調(diào)節(jié)NER基因的靶標以調(diào)節(jié)DNA修復(這有助于前列腺癌的發(fā)展和對藥物的反應)，維生素 D能有效防止腎毒性。
[0096] 在又一種實施方式中，所述癌是乳腺癌。
[0097] 在另一種【具體實施方式】中，所述細胞毒性劑是姜黃素。
[〇〇98] 在另一種【具體實施方式】中，所述細胞毒性劑選自化療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、 siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對癌細胞有細胞毒性的任何其他藥劑。
[0099] 在另一種實施方式中，所述化療劑選自基于鉬的藥物、天然酚、植物生物堿和紫杉烷類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物以及各種抗腫瘤藥物。
[0100] 在又一種實施方式中，所述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[〇1〇1] 在又一種實施方式中，所述能夠結合腫瘤相關抗原的抗體或肽包括但不限于以下各項：腺苷受體、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、RAS、Ρ53、 HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射誘導的細胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細胞癌抗原、血小板反應蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0102] 在又一種實施方式中，對癌細胞有細胞毒性的試劑選自白喉毒素 A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈，蒴蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素，以及它們的片段。
[0103] 在另一種【具體實施方式】中，所述細胞毒性劑包括天然苯酚和選自化學治療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、肽、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對癌細胞有細胞毒性的任何其他藥劑中的一種或多種其他細胞毒性劑。
[0104] 本申請的另一個方面涉及在需要的受試者中抑制癌轉移，包括對所述受試者施用有效量的包括含有細胞毒性劑和細胞靶向劑的行星球磨（PBM)納米顆粒的藥物組合物。在一些實施方式中，所述細胞靶向劑是葉酸或葉酸衍生物。
[0105] 在一種【具體實施方式】中，所述癌癥選自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞腫瘤和胚細胞瘤。
[0106] 在另一種實施方式中，所述癌是前列腺癌。
[0107] 在又一種實施方式中，所述癌是乳腺癌。
[0108] 在另一種【具體實施方式】中，所述細胞毒性劑是姜黃素。
[0109] 在另一種【具體實施方式】中，所述所述細胞毒性劑選自化學治療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、肽、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對癌細胞有細胞毒性的任何其他藥劑。
[〇11〇] 在另一實施方式中，所述化療劑選自基于鉬的藥物、天然酚、植物生物堿和紫杉烷類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物以及各種抗腫瘤藥物。
[0111] 在又一種實施方式中，所述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和 186Re的放射性同位素。
[0112] 在又一種實施方式中，所述能夠結合腫瘤相關抗原的抗體或肽包括但不限于以下各項：腺苷受體、ανβ 3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、⑶20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、RAS、Ρ53、 HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射誘導的細胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑M、鱗狀細胞癌抗原、血小板反應蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0113] 在又一種實施方式中，對癌細胞有細胞毒性的試劑選自白喉毒素 A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈，蒴蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素，以及它們的片段。
[0114] 在另一種【具體實施方式】中，所述細胞毒性劑包括姜黃素和選自化學治療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、肽、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及對癌細胞有細胞毒性的任何其他藥劑中的一種或多種其他細胞毒性劑。
[0115] 在另一種【具體實施方式】中，靶向配體包括能夠與以下腫瘤相關抗原結合的抗體或肽，但不限于此：腺苷受體、ανβ3、氨肽酶Ρ、α-胎兒蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窩蛋白-1、趨化因子受體、叢生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性腫瘤抗原、黑色素瘤相關抗原、 RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、葉酸受體、前列腺特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、嘌呤受體、輻射誘導的細胞表面受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、絲氨酸蛋白酶抑制劑 B4、鱗狀細胞癌抗原、血小板反應蛋白、腫瘤抗原4、腫瘤相關糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
[0116] 本申請的另一個方面涉及在需要的受試者中誘導調(diào)節(jié)性T (Treg)細胞的細胞凋亡，其包括：對所述受試者施用有效量的包括含有細胞毒性劑和細胞靶向劑的行星球磨 (PBM)納米顆粒的藥物組合物。在一些實施方式中，所述細胞靶向劑是葉酸或葉酸衍生物。
[0117] 本發(fā)明的另一個方面涉及含有一種以上的化學治療劑的葉酸涂層的可生物降解的PBM納米顆粒在治療癌癥的發(fā)展中的應用。負載多西紫杉醇或卡鉬的葉酸涂覆PBM納米顆粒增強了對腫瘤的治療效果，降低毒性，并通過靶向和誘導BrCa細胞和Treg細胞的細胞凋亡以增加腫瘤免疫力。
[0118] 本申請的另一個具體方面涉及涂布有葉酸的負載姜黃素的PBM納米顆粒的靶向遞送以增強體內(nèi)效力并改進現(xiàn)有的化學預防癌癥的策略。
[0119] 本發(fā)明的另一個方面是與受試者預先的治療結合，給受試者用含有細胞毒性劑的 PBM納米顆粒治療，同時或之后，用至少一種治療有效量的其它治療劑(包括但不限于不包含在PBM納米顆粒的姜黃素或化療劑)。在一些實施方式中，所述不包含在PBM納米顆粒中的化學治療劑選自卡鉬、順鉬、多西他賽和奧沙利鉬。
[0120] 本申請的藥物組合物可以用已知的方法對受試者給藥，例如作為推注的或通過連續(xù)輸注一段時間的靜脈內(nèi)給藥、通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑。在某些實施方式中，本申請的藥物組合物直接給藥至腫瘤或癌組織，包括在侵入性手術中直接給藥至腫瘤床。本申請的藥物組合物也可以放置在固體支持物(例如海綿或紗布)上施加到受感染的組織中。本申請的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒可以以通常接受的藥學上可接受的載體來施用?？山邮艿妮d體包括但不限于生理鹽水、緩沖鹽水和生理鹽水中的葡萄糖。
[0121] 例如，適當劑量("治療有效量"）的本申請的藥物組合物取決于待治療的疾病、病情的嚴重程度和狀態(tài)進程、本申請的藥物組合物給藥是用于預防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史、對包含在所述藥物組合物中的細胞毒性劑的反應、所使用的細胞毒性劑的種類以及主治醫(yī)師的診斷。本申請的藥物組合物可以適當?shù)匾淮位蛟谝幌盗兄委熤惺┯?給患者，并且可以在自診斷起的任何時間施用給患者。本申請的藥物組合物可以作為單獨治療或者與對于所討論的治療狀態(tài)中有用的其他藥物或療法相結合來給藥。
[0122] 在一些實施方式中，本申請的藥物組合物含有姜黃素，以0. lmg/kg至100mg/kg、 0· 5mg/kg 至 100mg/kg、0. lmg/kg 至 50mg/kg、0. 5mg/kg 至 50mg/kg、l. Omg/kg 至 20mg/kg、 2. 5mg/kg至50mg/kg、2. 5mg/kg至20mg/kg以及5mg/kg至lOmg/kg的日姜黃素劑量范圍給藥。含姜黃素的PBM納米顆粒可以連續(xù)給藥，每小時，每天4次，每天3次，每天2次，每天一次，或者每2、3、4、5、6和7天一次，或者每1、2、3或4周一次。
[0123] 作為一般的建議，無論是通過一次或多次給藥，包含在PBM納米顆粒中的治療有效量的每種細胞毒劑(例如姜黃素或順鉬)，以約lng/kg體重/天至約100mg/kg體重/天的范圍給藥。在一種【具體實施方式】中，包含在PBM納米顆粒中的每種細胞毒劑以以下范圍給藥：從約lng/kg體重/天至約lOmg/kg體重/天、約lng/kg體重/天至約lmg/kg體重 /天、約lng/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、約lng/kg體重/天至約10 μ g/kg體重 /天、約lng/kg體重/天至約1 μ g/kg體重/天、約lng/kg體重/天至約100ng/kg體重/ 天、約lng/kg體重/天至大約10ng/kg體重/天、約10ng/kg體重/天至約100mg/kg體重 /天、約l〇ng/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、約10ng/kg體重/天至約lmg/kg體重/ 天、約10ng/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、約10ng/kg體重/天至大約10 μ g/kg 體重/天、約l〇ng/kg體重/天至約1 μ g/kg體重/天、10ng/kg體重/天至約100ng/kg體重/天、約l〇〇ng/kg體重/天至約100mg/kg體重/天、約100ng/kg體重/天至約10mg/kg 體重/天、約l〇〇ng/kg體重/天至約lmg/kg體重/天、約100ng/kg體重/天至約100 μ g/ kg體重/天、約l〇〇ng/kg體重/天至約10μ g/kg體重/天、約100ng/kg體重/天至約 1 U g/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約100mg/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約 10mg/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約lmg/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約 100 μ g/kg體重/天、約1 μ g/kg體重/天至約10 μ g/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/天至約100mg/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/ 天至約lmg/kg體重/天、約10 μ g/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天、約100 μ g/kg體重/天至約l〇〇mg/kg體重/天、約100 μ g/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、約100 μ g/ kg體重/天至約lmg/kg體重/天、約lmg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天，約lmg/kg 體重/天至約l〇mg/kg體重/天、約10mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天。
[0124] 在另一種實施方式中，包含在PBM納米顆粒中的每種細胞毒性劑以以下范圍給藥：每個體給藥約10ng至約100ng、每個體給藥約10ng到約1 μ g、每個體給藥約10ng到約 10以8、每個體給藥約1〇1^到約100以8、每個體給藥約1〇1^到約111^、每個體給藥約1〇1^ 到約10mg、每個體給藥約10ng至約100mg、每次注射約10ng至約lOOOrng、每個體給藥約 l〇ng到約10, OOOrng、每個體給藥約100ng至約1 μ g、每個體給藥約100ng至約10μ g、每個體給藥約l〇〇ng至約100yg、每個體給藥約100ng至約lmg、每個體給藥約100ng至約 10mg、每個體給藥約100ng至約100mg、每次注射約100ng至約lOOOrng、每個體給藥約100ng 至約10,000mg、每個體給藥約lyg到約10yg、每個體給藥約lyg到約lOOyg、每個體給藥約1 μ g到約lmg、每個體給藥約1 μ g到約10mg、每個體給藥約1 μ g到約100mg、每次注射約1 μ g到約l〇〇〇mg、每個體給藥約1 μ g到約10, OOOmg、每個體給藥約10 μ g到約 100 μ g、每個體給藥約10 μ g到約lmg，每個體給藥約10 μ g到約10mg、每個體給藥約10 μ g 到約100mg、每次注射約10 μ g到約lOOOrng、每個體給藥約10 μ g到10, OOOrng、每個體給藥約100 μ g到約lmg、每個體給藥約100 μ g至約10mg、每個體給藥約100 μ g至約100mg、每次注射約100 μ g至約l〇〇〇mg、每個體給藥約100 μ g至約10, OOOrng、每個體給藥約lmg至約10mg、每個體給藥約lmg到約100mg、每次注射約lmg至約lOOOrng、每個體給藥約lmg到約10,000mg、每個體給藥約10mg至約100mg、每次注射約10mg至約lOOOrng、每個體給藥約 10mg至約10, OOOmg、每次注射約lOOmg至約lOOOmg、每個體給藥約lOOmg至約10, OOOmg以及每個體給藥約lOOOmg到約10,000mg。包含在PBM納米顆粒中的化學治療劑可以每天、或每2、3、4、5、6和7天、或每1、2、3或4周給藥。
[0125] 在其他的【具體實施方式】中，包含在PBM納米顆粒中的每種細胞毒性劑的給藥量為或是約為：〇· 〇〇〇6mg/ 天、0· OOlmg/ 天、0· 003mg/ 天、0· 006mg/ 天、0· Olmg/ 天、0· 03mg/ 天、 0· 06mg/天、0· lmg/天、0· 3mg/天、0· 6mg/天、lmg/天、3mg/天、6mg/天、10mg/天、30mg/天、 60mg/天、lOOmg/天、300mg/天、600mg/天、lOOOmg/天、2000mg/天、5000mg/天或 10, OOOmg/ 天。正如預期的那樣，所述劑量取決于患者的病情、體重、年齡和狀況。正如預期的那樣，所述劑量取決于患者的病情、體重、年齡和狀況。
[0126] 所述含有細胞毒性劑的PBM納米顆?？梢园凑者m當?shù)鼗虮砻鞯耐ㄟ^丸劑或通過連續(xù)輸注的單劑量，或通過丸劑或通過連續(xù)輸注作為多劑量來給藥。例如，多劑量可以每天多次，每日一次，每2、3、4、5、6或7天，每周，每2、3、4、5或6周或每月一次給藥。然而，其它劑量方案也可利用。此療法的進程易于通過常規(guī)技術來監(jiān)測。
[0127] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆?？梢?作為唯一的治療劑給需要的受試者給藥。在【具體實施方式】中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒殺死腫瘤或癌癥細胞或促進其凋亡。在另一種【具體實施方式】中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌的形成。在進一步的具體實施方式中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌細胞從現(xiàn)有的腫瘤或癌細胞中的遷移或轉移。在又一【具體實施方式】中，治療有效量的含有細胞毒性劑的 PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌癥細胞侵入非癌組織。
[0128] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒可以與一種或多種附加的治療有效的細胞毒性劑結合以施用給需要的受試者。一種或多種附加的治療有效的細胞毒性劑也可以在具有細胞毒性劑的PBM納米顆粒施用之前、與其同時、和/或之后來施用。
[0129] 在具體的實施方式中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒增強所述的一種或多種附加的治療學上有效的細胞毒性劑殺死腫瘤或癌癥細胞的有效性。在一種更具體的實施方式中，治療有效量的包含細胞毒性劑的PBM納米顆粒減少了所述的一種或多種附加的治療學上有效的細胞毒性劑用于殺死腫瘤或癌癥細胞所需要的量。在一種更具體的實施方式中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌癥細胞從已形成的腫瘤或癌遷移或轉移，增強所述的一種或多種附加的治療學上有的細胞毒性劑殺死腫瘤或癌癥細胞的局部有效性。在又一種【具體實施方式】中，治療有效量的含有細胞毒性劑的PBM納米顆粒抑制或防止腫瘤或癌癥細胞向非癌組織侵入，增強所述的一種或多種附加的治療學上有效的細胞毒性劑殺死腫瘤或癌癥細胞的局部有效性。
[0130] 在另一種實施方式中，所述的PBM納米顆粒包含對癌細胞具有細胞毒性的藥劑。在一些實施方式中，所述對癌細胞具有細胞毒性的藥劑選自白喉毒素 A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素，以及它們的片段。
[0131] 本發(fā)明通過下面的實施例進一步說明，而不應該解釋為限制。本申請引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請，以及圖和表的內(nèi)容，通過引用并入本發(fā)明。
[0132] 實施例1 :制各行星球磨納米顆粒
[0133] 首先，將10%至15% (w/v)的藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白、淀粉、乳糖、其它生物聚合物或它們的混合物(賦形劑/生物聚合物)溶解在水中，并使用均化器混合。接著，將10% 至20% (w/v)的蛋白質(zhì)(例如BSA或IgG)或大分子(例如禮、紫杉醇和順鉬等）（w/v)在 4°C下加入到賦形劑/生物聚合物溶液中。接著，將10% PEG (w/v)加入到生物聚合物-細胞毒性劑溶液中，并攪拌30分鐘。離心后，將溶液倒入約3mm3壓片機并干燥。然后在控制的溫度條件下（<37°C)用行星式球磨機研磨上述藥片。所得到的顆?？梢詥为毷褂茫次?涂覆的)，或者通過在l〇〇〇rpm的連續(xù)攪拌下涂布5%、10%或20%的？(^溶液(在二氯甲烷中）。最后用水漂洗PCL包衣生物聚合物-PEG顆粒，干燥并以粉末貯存。
[0134] PCL活化和肽偶聯(lián)：活化PCL以將肽或底物(例如葉酸）連接到其表面上用于顆粒的靶向遞送。首先，將2g的PCL溶解于6ml無水二噁烷中，并在50°C的水浴中加熱2小時以溶解聚合物，然后冷至室溫（RT)。2ml的Ν，Ν'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯 (Ν, Ν' disuccinimidylcarbonate) (153. 7mg/ml，在無水丙酮中）和 2ml 批陡溶液（4. 745mg/ ml，在無水丙酮中）與PCL懸浮液在室溫下連續(xù)攪拌下6小時進行混合。然后用具有1 μ m 孔隙尺寸的G2玻璃纖維過濾該混合物以除去沉淀物。用4體積的乙醚將得到的上清液沉淀。沉淀物在丙酮中再懸浮，用乙醚再次沉淀。然后干燥已活化的或活性的PCL，并于4°C 下貯存。
[0135] 然后將活化的PCL偶聯(lián)到賴氨酸或來自肽的任何游離胺基。將所需的肽或氨基酸 (例如賴氨酸)溶解在〇. 1M Na.取代.2HP04、0. 1M硼酸，2mg/ml的濃度，pH值為8. 5。接著，在4°C下將所述溶解在乙腈中的活化的PCL與肽或氨基酸以8:1的比例（活化的PCL :肽或氨基酸）攪拌混合過夜，用玻璃濾器過濾除去過量的活化未偶聯(lián)的PCL。
[0136] 顆粒的涂覆：用溶解在二氯甲烷中的各種濃度(例如5%、10%和10%)的PCL或結合胺的PCL連續(xù)攪拌（lOOOrmp)涂布已知量和尺寸的顆粒。通過離心分離后除去上清液，將所得到的PCL涂覆顆粒從PCL涂布液中分離。所得PCL涂覆的納米球經(jīng)過過濾、風干，在 4°C下貯存。
[0137] 熱分析：使用珀金埃爾默鉆石DSC (PerkinElmer Diamond DSC)進行差示掃描量熱法（DSC)和熱重/差熱分析。首先，在氮氣氛中，以恒定的速率(每分鐘10°C )將約lmg顆粒從30°C加熱到250°C。然后完成顆粒的熱重曲線。
[0138] 蛋白質(zhì)負載的量化和表征：在其內(nèi)含物結合之后，在37°C下，進行了 pH為7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水中PCL包覆的生物聚合物PEG顆粒的體外釋放研究。在37°C下，將約100mg 顆粒在100ml PBS或檸檬酸t(yī)ris緩沖液中懸浮并消化以確定其釋放速率。還使用0. 1、0. 22 或0. 45 μ m的微孔過濾器過濾顆粒。含蛋白質(zhì)的內(nèi)含物溶解于PBS或檸檬酸t(yī)ris緩沖鹽水中，并使用洛瑞蛋白質(zhì)測定法（Lowry's protein assay)測定釋放速率。在聚合物包衣的微粒的情況下，每48小時收集樣品，同時更換PBS以模仿宿主的無限滲透狀態(tài)。
[0139] 圓二色性光譜分析也用于評價分子組裝相比于標準或包封蛋白（例如BSA或IgG) 的規(guī)律性。通過測量它們的以△ ε方式表示的圓二色性并將它們與作為標準的未封裝的蛋白質(zhì)比較以確定釋放的蛋白質(zhì)的分子內(nèi)結構(例如α-螺旋、β片層等）的構象。
[0140] 顆粒大小、電荷和形態(tài)分析：通過使用馬爾文顆粒大小和電荷分析儀(激光粒度儀）對顆粒進行激光衍射分析其粒徑。顆粒分散在dH 20中，分析電荷和大小。用掃描電子顯微鏡（SEM)表征PCL涂覆的生物聚合物PEG顆粒的表面形態(tài)。對于SEM分析，顆粒是通過將干燥的顆粒分配到粘在鋁樁的雙面粘合帶的一側來制備。然后使用極化SC S00-噴射涂布機用金涂覆該樁，至其厚度為20至30nm。然后將樣品引入到掃描電子顯微鏡的樣品室，并檢測表面形態(tài)。通過首先將lmg樣品和lOOmg干燥溴化鉀粉末混合以得到的PCL包覆生物聚合物-PEG顆粒制劑的不同階段的紅外光譜。接著，使用傅里葉變換紅外光譜儀測定樣品的紅外光譜。
[0141] 對于將納米顆粒上漿，以下的方向提供指導。在一般情況下，通過使用填充有一到三個20mm和10至60個10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在200至400rmp的研磨速度，以控制粒度范圍為5至30nm、30至180nm、0. 2至1 μ m、1 至6 μ m、4至12 μ m或10至60 μ m。該研磨間隔時間應設置為10分鐘，隨后進行15分鐘的靜止周期。10至25個循環(huán)(研磨和靜止）允許>99. 5 %的顆粒尺寸范圍為5至30nm、30 至180nm、0. 2至Ιμπκ?至6μ m、4至12 μ m或10至60 μ m。當研磨罐的尺寸增大到>50ml (例如125ml、500ml等)，球的數(shù)量隨罐體積的增加而成比例的增加。
[0142] 通過研磨球和活動-靜止周期的顆粒尺寸調(diào)節(jié)的實例：使用填充有三個20mm和 10個10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在400rmp的研磨速度，可以獲得范圍為5至30nm的顆粒尺寸。該研磨間隔時間應設置為10分鐘，隨后進行 15分鐘的靜止周期。15至25個周期(研磨和靜止)導致>99. 5%的顆粒尺寸范圍從5nm到 30nm〇
[0143] 使用填充有三個20mm和10個10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在400rmp的研磨速度，可以獲得范圍為30至180nm的顆粒尺寸。該研磨間隔時間應設置為10分鐘，隨后進行15分鐘的靜止周期。15至20個周期(研磨和靜止）導致 >99. 5%的顆粒尺寸范圍從30至180nm。
[0144] 使用填充有三個20mm和10個10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在300rmp的研磨速度，可以獲得范圍為0. 2至1 μ m的顆粒尺寸。該研磨間隔時間應設置為10分鐘，隨后進行15分鐘的靜止周期。15至20個周期(研磨和靜止）導致 >99.5%的顆粒尺寸范圍從0.2至1以111。
[0145] 使用填充有2個20mm和13個10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在300rmp的研磨速度，可以獲得范圍為1至6 μ m的顆粒尺寸。該研磨間隔時間應設置為10分鐘，隨后進行15分鐘的靜止周期。20至25個周期(研磨和靜止）導致 >99. 5%的顆粒尺寸范圍從1至6μπι。
[0146] 使用填充有2個20mm和13個10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在250rmp的研磨速度，可以獲得范圍為4至12 μ m的顆粒尺寸。該研磨間隔時間應設置為10分鐘，隨后進行15分鐘的靜止周期。15至20個周期(研磨和靜止）導致>99. 5%的顆粒尺寸范圍從4至12 μ m。
[0147] 使用填充有1個20mm和16個10mm的球和待包裹樣品和賦形劑的50ml的研磨罐，并使用保持在200rmp的研磨速度，可以獲得范圍為10至60 μ m的顆粒尺寸。該研磨間隔時間應設置為10分鐘，隨后進行15分鐘的靜止周期。10至15個周期(研磨和靜止）導致 >99. 5%的顆粒尺寸范圍從10至60 μ m。
[0148] 賦形劑/生物聚合物濃度對顆粒特性的影響：用在dH20賦形劑/生物聚合物溶液）中約10% (w/v)的藻酸鈉、約8% (w/v)纖維素或約10% (w/v)淀粉生產(chǎn)具有不同尺寸的顆粒（5nm至60μπι土平均尺寸的10%)。低于2% (w/v)的藻酸鈉、纖維素或淀粉，發(fā)現(xiàn) 平均尺寸變化不大于10%的顆粒的產(chǎn)率較低。在大于15%的海藻酸鈉或10%的纖維素時，賦形劑/生物聚合物溶液保持高粘性，不能用于片劑形成和隨后的顆粒制備。類似地，淀粉 (賦形劑/生物聚合物）溶液需要加熱到50°C維持20分鐘，以獲得最佳的溶解性和粘度，淀粉的濃度不能超過12% (w/v)。
[0149] 賦形劑/生物聚合物溶液的粘度也對顆粒的形態(tài)具有顯著的影響。隨著賦形劑/ 生物聚合物溶液濃度（>1 % (w/v))的增加，顆粒變得更光滑和球形的。然而，〈10%的賦形劑/生物聚合物溶液產(chǎn)生出理想的顆粒尺寸。在藻酸鈉、纖維素或淀粉的濃度（w/v)分別為10%、8%或10%時，對于納米或微顆粒的產(chǎn)生實現(xiàn)了最佳的產(chǎn)率。因此，在隨后的研究中，準備上述最佳濃度用于研磨成顆粒的3mm 3片劑的產(chǎn)生。
[0150] 研磨速度和行星球的尺寸對于顆粒尺寸的影響：如上面的實例所示，行星球磨裝置的研磨速度（RetschPMlOO)和研磨球的尺寸在控制顆粒大小方面發(fā)揮了顯著作用。改變轉速從0到lOOrpm進行20分鐘，并用10個10mm加3個20mm的球，導致顆粒尺寸范圍從 20至50 μ m ;而以速度為100至200rpm的轉速進行20分鐘，得到10至20 μ m的微粒。調(diào) 節(jié)速度為200至300rpm的轉速進行20分鐘，并使用50個5mm加15個10mm球，導致顆粒尺寸范圍從1至5 μ m。增加轉速從300到400rpm，并使用100個5mm球，導致顆粒尺寸范圍為〇. 5至1 μ m。
[0151] 先研磨片劑產(chǎn)生-20至50 μ m尺寸的微粒以產(chǎn)生<500nm的顆粒。使用100個3mm 球加500個2mm球在400至600rpm下將所得到的微粒進一步研磨20分，以產(chǎn)生尺寸范圍為5至500nm的納米顆粒。再進一步增加速度并未對尺寸的減小有任何顯著的效果。
[0152] 顆粒蛋白截留和負載效率：BSA負載可以從4至25% (w/v)變化。在>20% (w/ v)負載蛋白時，研磨后形成的產(chǎn)物顆粒積聚且形態(tài)異常。在納米或微顆粒中具有100%的效率的BSA負載的可以實現(xiàn)的最1?限為約20%。
[0153] 無涂層的和PCL-涂層的生物聚合物-PEG顆粒的形態(tài)：由SEM來看，顯而易見的是，與無涂層顆粒相比，通過PCL-涂層修飾的顆粒表面表現(xiàn)平整、均勻。以多種PCL涂布的顆粒表面特征出現(xiàn)額外的平滑。然而，在體外釋放內(nèi)含物之后，顆粒的表面由光滑球形變?yōu)?粗糙的、非球形的，并形成空泡。
[0154] 實施例2 :腫瘤相關抗原配體涂層和負載對乳腺癌細朐的化學治療劑的PBM納米顆粒
[0155] 用于偶聯(lián)至葉酸的聚己內(nèi)酯-聚乙二醇共聚物涂布?20nm直徑的負載細胞毒性藥物的可生物降解的行星球磨（PBM)納米顆粒。葉酸涂布的PBM納米顆粒進一步負載多西紫杉醇、卡鉬或順鉬。使用20 μ Μ的順鉬溶液的初級細胞和細胞系的孵化，導致在24小時的培養(yǎng)后，81^&細胞（1〇^-7、10^-1^-231和41'1)和正常(初級）乳房上皮細胞的>90%的細胞死亡。然而，含有10倍以下的化學治療劑的ΡΒΜ納米顆粒被吸收，并分別誘導與順鉬、多西紫杉醇或卡鉬溶液相同水平的BrCa細胞凋亡，但不是原發(fā)性乳腺上皮細胞。此外，通過靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或順鉬包裹葉酸涂布的PBM納米顆粒(相當于順鉬劑量=0. 08mg/kg/周）的攜帶乳腺腫瘤的小鼠產(chǎn)生顯著的（以及類似的）腫瘤消退。接受順鉬溶液的小鼠比天然的或PBM納米顆粒處理過的小鼠具有顯著更高的腎臟和肝臟的毒性。據(jù)了解，類似表達高水平的葉酸受體a (FRa/FRl)的腫瘤細胞，T調(diào)節(jié)性（Treg)細胞表達 FRY (FR4)，并且FR4阻斷增強的腫瘤免疫。因此，本申請的新型PBM納米顆粒增強BrCa 治療效果，降低毒性，提高乳腺腫瘤免疫。
[0156] PBM納米顆粒(含卡鉬或紫杉醇）介導的腫瘤消退是具有特征的。納米顆?？捎?于治療MDA-MB-231-螢光素酶陽性（LUC)，以及MCF-7-luc的異種移植腫瘤(發(fā)展之前和之后)。在一些實施方式中，Caliper/Xenogen IVIS?生物光子成像系統(tǒng)用于測量乳腺腫瘤的負載量。使用Aperio Scanscope和Spectrum軟件，通過免疫組織化學（IHC)的離體腫瘤的體外分析和形態(tài)分析，確定在乳腺腫瘤中細胞凋亡的變化(半胱天冬酶-3和陽性_9)和增生（Ki67陽性）的表型。
[0157] 圖3示出了高親和力的葉酸受體（FR)由BrCa腫瘤和細胞系表達。
[0158] 圖4示出了負載順鉬、多西紫杉醇或卡鉬的葉酸涂布的PBM納米顆粒選擇性地靶向BrCa細胞和誘導其中的細胞凋亡。
[0159] 圖5示出了通過靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或含順鉬(相當于順鉬劑量 =0. 08mg/kg/周）的葉酸涂布的PBM納米顆粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠產(chǎn)生顯著的腫瘤消退。通過靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周)或含順鉬(相當于順鉬劑量=0. 08mg/kg/ 周）的葉酸涂布的PBM納米顆粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠產(chǎn)生顯著的腫瘤消退。
[0160] 接受順鉬溶液的的荷瘤小鼠具有比天然的或PBM納米顆粒治療的小鼠顯著更高的腎臟和肝臟的毒性。熒光素酶表達人類BrCa細胞（MDA-MB-231-luc ;ERNeg PRNeg Her2Neg和 MCF-7-luc ;ERP°S PRp°s Her2p°s)的原位乳腺脂肪墊注射后，描述PBM納米顆粒(含有卡鉬或紫杉醇）介導的腫瘤消退的特征。腫瘤發(fā)展或腫瘤消退之后，含有多紫杉醇、卡鉬或不加藥物的texas紅染料的葉酸涂布的PBM納米顆粒遞送后，是使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系統(tǒng)是對荷瘤Nu/Xid小鼠的非侵入性成像。通過免疫組織化學的體外分析確定在乳腺腫瘤中細胞凋亡(半胱天冬酶-3和陽性_9)的變化和用新型PBM納米顆粒處理過的腫瘤的表型。NIH-III小鼠用于移植MDA-MB-231-luc和MCF-7-luc的細胞系。
[0161] PBM納米顆粒影響腫瘤發(fā)展、免疫，分別使用4Tl-LUC_synograft和新型PyMT-luc 小鼠模型來確定自發(fā)性腫瘤發(fā)展。使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系統(tǒng)對臨床相關的移植（4T1)和自發(fā)性（PyMT)乳腺腫瘤的發(fā)展進行非侵入性監(jiān)測。使用Aperio組織學掃描儀和分析系統(tǒng)進行的免疫組織化學和顯微形態(tài)分析測量在乳腺腫瘤中細胞凋亡的變化(半胱天冬酶-3和陽性-9)和增生（Ki67陽性）的表型。此外，描述對于⑶25、FR4、FoxP3的、 IL-10和/或TGF-β 1的表達，和抑制Thl/Th2細胞增殖能力的外周的、淋巴結和腫瘤相關的T細胞的數(shù)量和活性的特征。
[0162] 本申請的PyMT-LUC轉基因小鼠是通過首先將小鼠跨越3代交配以創(chuàng)造 F3MMTV-LUC小鼠。隨后F3MMTV-LUC小鼠與PyMT小鼠繁殖創(chuàng)造 PyMT-luc小鼠。
[0163] 圖6示出PBM納米顆粒選擇性地殺死調(diào)節(jié)性T細胞（F0XP3+CD25Hi)，但不是T輔助（FoxP3TD25,細胞。類似于表達高水平FR的癌細胞，T調(diào)節(jié)性（Treg)細胞表達FRY (FR4)，并且FR4封鎖增強的腫瘤免疫；以及（vi)顯示我們可以選擇性地破壞Treg細胞 (F0XP3+CD25Hi)，但不是T輔助細胞。圖3-5提供了生物學和臨床基本原理以顯示新型負載多西紫杉醇或卡鉬的葉酸涂層PBM納米顆粒增強對腫瘤的治療效果，降低毒性，并通過靶向和誘導BrCa和Treg細胞死亡來增加腫瘤免疫以減少與化療相關的健康差距。
[0164] 實施例3 :腫瘤細朐靶向和化療-負載PBM納米顆粒對前列腺癌細朐的影響
[0165] 用聚己內(nèi)酯-聚乙二醇共聚物和葉酸涂布?20nm直徑的負載細胞毒性藥物的可生物降解的PBM納米顆粒。使用20 μ Μ順鉬對PCa細胞（PC3和PTEN-CaP2)和正常前列腺上皮細胞（PrEC和RWPE-1)的處理導致>90%的細胞死亡。含有100倍以下順鉬的PBM納米顆粒被吸收，并誘導與順鉬溶液相同的水平的前列腺癌細胞凋亡，但并沒有顯著影響正常細胞。接受順鉬溶液（8mg/kg/周)或葉酸包覆的PBM納米顆粒(含0.08mg/kg/周的等效劑量順鉬）的荷瘤小鼠產(chǎn)生了顯著（以及類似）的腫瘤消退。然而，接受順鉬溶液的小鼠比天然的或PBM納米顆粒處理過的小鼠具有顯著更高的腎臟和肝臟的毒性。PCa細胞表達高水平的葉酸受體a (FRa/FRl);類似地，T調(diào)節(jié)性（Treg)細胞表達FRY (FR4)，并且FR4 阻斷增強的腫瘤免疫。盡管有維生素 D缺乏、小窩蛋白1的表達和NER的基因型相關的健康差距，PBM納米顆粒增強了腫瘤治療效果，降低毒性，并提高乳腺腫瘤免疫。
[0166] 圖7示出FR是由PC3和PTEN_CaP2腫瘤表達，而不是由細胞系或正常細胞表達。
[0167] 如圖8所示，負載順鉬的葉酸涂覆的PBM納米顆粒選擇性地靶向體外PC3細胞的破壞。
[0168] 如圖9所示，通過靜脈注射接受順鉬溶液（8mg/kg/周）或葉酸包覆的
【權利要求】
1. 一種用于特異性靶向癌細胞的藥物組合物，包括：包含姜黃素的行星球磨（PBM)納米顆粒，其中，所述的PBM納米顆粒涂有葉酸或葉酸衍生物。
2. 如權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括選自化學治療齊U、放射性偶聯(lián)物、抗體、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及細胞毒性劑中的一種或多種附加的細胞毒性劑。
3. 如權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進一步包含選自基于鉬的藥物、天然酚，植物生物堿和紫杉烷類、其他烷化劑、腫瘤抗生素和蒽環(huán)類、拓撲異構酶抑制齊[J、抗代謝物、熱休克蛋白拮抗劑和各種抗腫瘤藥物中的一種或多種化學治療劑。
4. 如權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括來自結合一種或多種腫瘤相關抗原的肽或抗體的靶向配體。
5. 如權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括包含選自 212Bi、131I、 131In、9°Y、188Tu和186Re的放射性同位素的放射性偶聯(lián)物。
6. 如權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括選自白喉毒素 A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈，蒴蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、 ΡΑΡΙΙ和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素以及它們的片段中的一種或多種細胞毒性劑。
7. 如權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述ΡΒΜ納米顆粒包括基質(zhì)芯，其含有選自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白、淀粉和PEG中的一種或多種可生物降解的聚合物和多糖。
8. 如權利要求7所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒包含基質(zhì)芯，其含有PEG 和選自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉的其它可生物降解的多糖。
9. 如權利要求7所述的藥物組合物，其中，所述PBM納米顆粒還包括包含選自PEG、PCL 或它們的混合物的可生物降解聚合物的釋放控制涂層。
10. 如權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述葉酸或葉酸衍生物與所述釋放控制涂層結合。
11. 一種用于在有需要的受試者中治療癌癥的方法，其包括給受試者施用一種有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含：包含姜黃素的行星式球磨（PBM)納米顆粒，其中，所述PBM納米顆粒涂覆有葉酸、腺苷、嘌呤、激素、高親和力腫瘤受體的肽配體或抗腫瘤抗原的抗體或它們的混合物。
12. 如權利要求11所述的方法，其中，所述癌癥選自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞腫瘤，以及胚細胞瘤。
13. 如權利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括選自化學治療劑、放射性偶聯(lián)物、抗體、siRNA、反義寡核苷酸、三鏈形成寡核苷酸以及細胞毒性劑中的一種或多種附加的細胞毒性劑。
14. 如權利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括選自卡鉬、順鉬、多西他賽和奧沙利鉬中一種或多種化學治療劑。
15. 如權利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括放射性偶聯(lián)物，所述放射性偶聯(lián)物包含選自212Bi、 131I、mIn、9°Y、188Tu和186Re的放射性同位素。
16. 如權利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括選自白喉毒素 A 鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素 A鏈、相思豆毒蛋白A鏈，蒴蓮根毒素 A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII 和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單孢霉烯族毒素以及它們的片段中的一種或多種細胞毒性劑。
17. 如權利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒包含基質(zhì)芯，其含有選自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白、淀粉和PEG中的一種或多種可生物降解的聚合物。
18. 如權利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒包含基質(zhì)芯，其含有PEG和選自藻酸鹽、纖維素、膠原蛋白和淀粉的其它可生物降解的聚合物。
19. 如權利要求11所述的方法，其中，所述PBM納米顆粒進一步包括包含PEG、PCL或它們的混合物的釋放控制涂層。
20. 如權利要求11所述的方法，其中，所述葉酸或葉酸衍生物與所述釋放控制涂層結合。
21. -種用于在有需要的受試者中抑制癌轉移的方法，其包括給受試者施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括：包含姜黃素的行星球磨（PBM)納米顆粒，其中，所述PBM 納米顆粒涂覆有葉酸。
22. -種用于在有需要的受試者中誘導調(diào)節(jié)性T (Treg)細胞的細胞凋亡的方法，其包括向受試者施用有效量的涂覆有葉酸的并含有對Treg細胞有細胞毒性的藥劑的行星球磨 (PBM)納米顆粒。
【文檔編號】A61K9/14GK104066425SQ201280050727
【公開日】2014年9月24日申請日期:2012年8月8日優(yōu)先權日:2011年8月15日
【發(fā)明者】詹姆斯·W·利拉德申請人:詹姆斯·W·利拉德

完整全部詳細技術資料下載