對(duì)t細(xì)胞活化性抗原和腫瘤抗原特異性的雙特異性抗體及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及特異性結(jié)合T細(xì)胞活化性抗原和腫瘤抗原(TA)的雙特異性抗體，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中第二Fab重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；且其中該雙特異性抗體不包含F(xiàn)c域；用于生成它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物，和它們的用途。
【專利說(shuō)明】對(duì)T細(xì)胞活化性抗原和腫瘤抗原特異性的雙特異性抗體及
使用方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及特異性結(jié)合T細(xì)胞活化性抗原和腫瘤抗原(TA)的雙特異性抗體，其包含第一 Fab片段和第二 Fab片段，其中第二 Fab重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；且其中該雙特異性抗體不包含F(xiàn)e域；用于生成它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物，和它們的用途。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在多種臨床背景中常常想要選擇性破壞個(gè)別細(xì)胞或特定細(xì)胞類型。例如，特異性破壞腫瘤細(xì)胞而使健康細(xì)胞和組織不受損害是癌癥療法的首要目標(biāo)。一種辦法是選擇性誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，其觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞(諸如天然殺傷(NK)細(xì)胞或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL))攻擊及隨后破壞腫瘤細(xì)胞。CTL構(gòu)成免疫系統(tǒng)最有力的效應(yīng)細(xì)胞，然而它們不能通過(guò)由常規(guī)治療性抗體的Fe域介導(dǎo)的效應(yīng)器機(jī)制來(lái)激活。在此方面，能夠結(jié)合癌細(xì)胞上的表面抗原及活化T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合物中的不變組分的雙特異性抗體在最近幾年已變得感興趣。雙特異性抗體對(duì)其靶物二者的同時(shí)結(jié)合迫使癌細(xì)胞和T細(xì)胞之間的暫時(shí)相互作用，引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化和隨后腫瘤細(xì)胞裂解。
[0004]已開發(fā)出數(shù)種雙特異性抗體型式并調(diào)查了它們對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫療法的適宜性。其中，所謂的BiTE (雙特異性T細(xì)胞銜接物(engager))分子已進(jìn)行非常好地表征，而且早就在臨床中顯示出一些有希望的結(jié)果(綜述見(jiàn)Nagorsen and BauerIe,Exp Cell Res317, 125 5-1260(2011) )。BiTE 是串聯(lián) scFv 分子，其中兩個(gè) scFv 分子通過(guò)柔性接頭融合。針對(duì)T細(xì)胞銜接評(píng)估的其它雙特異性型式包括雙抗體(Holligeret al., Prot Eng9, 299-305 (1996))及其衍生物，諸如串聯(lián)雙抗體(Kipriyanov etal., J Mol Biol293，41-66 (1999))。一項(xiàng)最近的進(jìn)展是所謂的DART (雙重親和力重新革El向)分子，其基于雙抗體型式但特征在于實(shí)現(xiàn)額外穩(wěn)定化的C端二硫橋(Moore etal.，Bloodll7, 4542-51 (2011))。所謂的triomab (其為完整雜合小鼠/大鼠IgG分子且目前亦在臨床試驗(yàn)中評(píng)估)代表尺寸更大的型式(綜述見(jiàn)Seimetz et al., Cancer TreatRev36, 458-467(2010))。
[0005]然而，至今已知的為T細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫療法開發(fā)的雙特異性抗體具有涉及它們功效、毒性和適用性的重大缺點(diǎn)。小構(gòu)建物(諸如例如BiTE分子)，雖然能夠有效交聯(lián)效應(yīng)器和靶細(xì)胞，但是具有非常短的血清半衰期，從而要求通過(guò)連續(xù)輸注對(duì)患者施用它們。另一方面，IgG樣形式，雖然具有長(zhǎng)半衰期的極大好處，但是受制于與IgG分子固有的天然效應(yīng)器功能有關(guān)的毒性。這種免疫原性潛力構(gòu)成IgG樣雙特異性抗體對(duì)于成功治療劑開發(fā)的另一個(gè)不利特征。最后，雙特異性抗體的一般開發(fā)中的一項(xiàng)主要挑戰(zhàn)仍然是以臨床充足的數(shù)量和純度生產(chǎn)雙特異性抗體構(gòu)建物。具有不同特異性的抗體重和輕鏈在共表達(dá)時(shí)的錯(cuò)配降低正確裝配的構(gòu)建物的產(chǎn)率且導(dǎo)致許多無(wú)功能的副產(chǎn)物。
[0006]鑒于與目前可獲得的用于T細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫療法的雙特異性抗體有關(guān)的難點(diǎn)和缺點(diǎn)，仍然存在對(duì)此類分子的新穎的改進(jìn)型式的需要?，F(xiàn)在已經(jīng)用本發(fā)明的新雙特異性抗體克服了這些缺點(diǎn)。由于錯(cuò)配副產(chǎn)物的量減少(這顯示聚集比本領(lǐng)域已知的雙特異性抗體片段少)，能容易地以升高的產(chǎn)率生成新雙特異性抗體。使用交換辦法，能在不需要生成常規(guī)(common)輕鏈的情況下迫使正確的LC聯(lián)合。另外，新雙特異性抗體具有與許多常規(guī)雙特異性抗體片段相比更高的分子量，如此防止過(guò)度腎清除且導(dǎo)致改進(jìn)體內(nèi)半衰期。新雙特異性抗體是完全功能性的且具有與相應(yīng)常規(guī)雙特異性抗體相當(dāng)或改進(jìn)的結(jié)合和活性。
[0007]本發(fā)明提供設(shè)計(jì)用于T細(xì)胞活化和重新定向的雙特異性抗原結(jié)合分子，其組合了良好的功效和生產(chǎn)能力與較低毒性和有利的藥動(dòng)學(xué)特性。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明涉及特異性結(jié)合T細(xì)胞活化性抗原和腫瘤抗原(TA)的雙特異性抗體，其包含第一 Fab片段和第二 Fab片段，其中第二 Fab重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；且其中該雙特異性抗體不包含F(xiàn)e域。
[0010]本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的表面上的腫瘤抗原且同時(shí)結(jié)合T細(xì)胞活化性抗原。由此，所述雙特異性抗體能夠在腫瘤部位特異性引發(fā)免疫應(yīng)答，隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。
[0011]一方面，提供特異性結(jié)合T細(xì)胞活化性抗原和腫瘤抗原(TA)的雙特異性抗體，其包含至少兩個(gè)Fab片段，其中第一 Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)腫瘤抗原(TA)特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)；且第二Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)T細(xì)胞活化性抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中第
二Fab重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；且其中該雙特異性抗體不含F(xiàn)e域。
[0012]特別地，本發(fā)明涉及如下的雙特異性抗體，其中T細(xì)胞活化性抗原為CD3T細(xì)胞共同受體(CD3)靶抗原。
[0013]一方面，提供特異性結(jié)合⑶3T細(xì)胞共同受體(⑶3)抗原和腫瘤抗原(TA)的雙特異性抗體，其包含至少兩個(gè)Fab片段，其中第一 Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)腫瘤抗原(TA)特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)；且第二 Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)⑶3T細(xì)胞共同受體(⑶3)特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中第二 Fab重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；且其中該雙特異性抗體不含F(xiàn)e域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二 Fab片段經(jīng)由肽接頭連接。優(yōu)選地，所述肽接頭為(G4S)2接頭。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體另外包含第三Fab片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)腫瘤抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三Fab片段連接所述第一 Fab片段的輕鏈或重鏈的N或C端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三Fab片段連接所述第二 Fab片段的輕鏈或重鏈的N或C端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三Fab片段經(jīng)由肽接頭連接所述第一或第二 Fab片段。優(yōu)選地，所述肽接頭為(G4S) 2接頭。
[0015]依照本發(fā)明的雙特異性抗體至少是二價(jià)的，而且可以是三價(jià)的或多價(jià)的，例如四價(jià)的或六價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是二價(jià)的(1+1型式)，分別有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)各自靶向腫瘤抗原(TA)和T細(xì)胞活化性抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是三價(jià)的(2+1型式)，有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)各自靶向腫瘤抗原(TA)且有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)靶向T細(xì)胞活化性抗原，如下節(jié)詳述的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞活化性抗原為CD3。
[0016]在第二個(gè)目標(biāo)中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的雙特異性抗體。[0017]在第三個(gè)目標(biāo)中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供所述雙特異性抗體作為藥物的用途。優(yōu)選地，所述用途為用于治療癌癥。
[0018]在別的目標(biāo)中，本發(fā)明涉及包含的序列編碼本發(fā)明的雙特異性抗體的重鏈的核酸序列，包含的序列編碼本發(fā)明的雙特異性抗體的輕鏈的核酸序列，包含本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)載體和包含本發(fā)明的載體的原核或真核宿主細(xì)胞。另外，提供生成抗體的方法，其包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，使得所述抗體生成。
[0019]附圖簡(jiǎn)述
[0020]圖1:本發(fā)明的例示性雙特異性抗體型式的示意圖。a)Fab-Crossfab分子C端,b)Fab-Crossfab 分子 N 端,c) (Fab) 2-Crossfab 分子 C 端,d) (Fab) 2-Crossfab 分子 N 端,e)Fab-Crossfab-Fab 分子。
[0021]圖2:hu Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)生成和純化的分析:SDS-Page:4_12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考馬斯染色):a) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -非還原的 hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) ；b) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -還原的 huFab(MCSP)-Crossfab (CD3)。
[0022]圖3:Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)生成和純化的分析。分析型大小排阻層析，層析圖 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v) NaCl ;注入 50 μ g 樣品)。
[0023]圖4:hu Fab (MCSP) -Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)生成和純化的分析:SDS_Page:4-12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考馬斯染色):a) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -非還原的 hu Fab (MCSP) -Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) ;b) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -還原的 hu Fab (MCSP) -Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)。
[0024]圖5:hu Fab (MCSP)-Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)生成和純化的分析。分析型大小排阻層析，層析圖 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mMNaCl，0.02%(w/v) NaCl ;注入 50μ g 樣品)。
[0025]圖6:hu Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)生成和純化的分析。SDS-Page:4-12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考馬斯染色):a) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -非還原的 hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) ;b) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -還原的 hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) -Fab (MCSP)。
[0026]圖7:hu Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)生成和純化的分析。分析型大小排阻層析，層析圖 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mMNaCl，0.02%(w/v) NaCl ;注入 50μ g 樣品)。
[0027]圖8:鼠 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)-Fab (MCSP)生成和純化的分析。SDS-Page:4-12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考馬斯染色):a) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -非還原的鼠 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)-Fab (MCSP) ；b) 1-標(biāo)志物 12 (invitrogen)，2 -還原的鼠 Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) -Fab (MCSP)。
[0028]圖9:鼠Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) -Fab (MCSP)生成和純化的分析。分析型大小排阻層析，層析圖 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mMNaCl，0.02%(w/v) NaCl ;注入 50μ g 樣品)。
[0029]圖10:在與人泛T細(xì)胞共培養(yǎng)(E:T比例=5:1)并通過(guò)不同濃度的huFab(MCSP)-Crossfab (CD3) (= “Fab-Crossfab”)、hu Fab(MCSP)-Crossfab (CD3)-Fab (MCSP) (= “Fab-Crossfab-Fab”)、hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab (CD3)(=“ (Fab) 2-Crossfab”)以及(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e) (= “ (scFv) 2”)雙特異性分子活化20小時(shí)時(shí)MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞的殺死(如通過(guò)LDH釋放所測(cè)量的)。具有二價(jià)MCSP靶向的構(gòu)建體顯示了與“(scFv)2”構(gòu)建體相比相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒活性，而具有單價(jià)MCSP結(jié)合的“Fab-Crossfab ”構(gòu)建體則明顯的效力較低。
[0030]圖11:hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= “(Fab)2-Crossfab”)和(scFv) 2 (抗MCSP/抗huCD3e) (= “(scFv) 2”)構(gòu)建體的比較。所描繪的是在與人泛T細(xì)胞共培養(yǎng)(E:T比例=5:1)并通過(guò)不同濃度的雙特異性構(gòu)建體及相應(yīng)IgG活化21小時(shí)時(shí)來(lái)自MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞的LDH釋放?！?Fab) 2-Crossfab”在靶細(xì)胞中至少像(scFv)2分子同等好的誘導(dǎo)凋亡。
[0031]圖12:hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= “(Fab)2-Crossfab”)和(scFv) 2 (抗MCSP/抗huCD3e) (= “(scFv) 2”)構(gòu)建體的比較。所描繪的是在與人PBMC共培養(yǎng)(E:T比例=10:1)并通過(guò)不同濃度的雙特異性構(gòu)建體及相應(yīng)IgG活化26小時(shí)時(shí)來(lái)自MV-3人黑素瘤腫瘤細(xì)胞的LDH釋放?！?Fab) 2-Crossfab”在靶細(xì)胞中至少像(scFv) 2分子同等好的誘導(dǎo)凋亡。
[0032]圖13:由用靶向人MCSP 以及鼠 CD3 的鼠 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)-Fab (MCSP)構(gòu)建體( = (Fab)2-CrossFab)活化的原代鼠T細(xì)胞所誘導(dǎo)的，來(lái)自B16/F10_huMCSP Fluc2克隆48腫瘤細(xì)胞的LDH釋放。效應(yīng)器對(duì)靶細(xì)胞的比例為5:1。在37°C，5%C02溫育23.5小時(shí)后對(duì)該測(cè)定法進(jìn)行分析。所述構(gòu)建體誘導(dǎo)表達(dá)人MCSP之靶細(xì)胞的濃度依賴性的、T細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡。
[0033]圖14:由用 50nM 靶向人 MCSP 以及鼠 CD3 的鼠 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)構(gòu)建體( = (Fab)2-CrossFab)活化的原代鼠T細(xì)胞所誘導(dǎo)的，來(lái)自B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48腫瘤細(xì)胞的LDH釋放。效應(yīng)器與靶細(xì)胞的比例是5:1。在37°C，5%C02溫育23.5小時(shí)后對(duì)該測(cè)定法進(jìn)行分析。所述構(gòu)建體誘導(dǎo)表達(dá)人MCSP之靶細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)之凋亡。在此構(gòu)建體濃度下只有微弱的T細(xì)胞超活化。
[0034]圖15:在存在(A，B)或缺失(C，D)Colo-38腫瘤細(xì)胞的情況下用InM不同CD3-MCSP雙特異性構(gòu)建體(hu Fab (MCSP)-Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) (= “(Fab) 2-Crossfab”)和(scFv) 2 (抗MCSP/抗huCD3e) (= “(scFv) 2”))處理24小時(shí)后全血上清液中測(cè)量的不同細(xì)胞因子水平。將280 μ 1全血加到96孔板的每個(gè)孔中并加入30，000個(gè)Colo-38細(xì)胞，如所指示的。在存在Colo-38腫瘤細(xì)胞的情況下在T細(xì)胞活化時(shí)分泌的主要細(xì)胞因子是IL-6，隨后是IFN Y。此外，在存在靶細(xì)胞的情況下在T細(xì)胞活化時(shí)粒酶B水平也有很大的升高?？偟膩?lái)說(shuō)，在存在靶細(xì)胞的情況下(A和B)，“(scFv) 2”構(gòu)建體與其它雙特異性構(gòu)建體相比稍微更多的提高了 TNF和IFN Y以及粒酶B的水平。
[0035]在存在(或缺失)靶細(xì)胞的情況下在雙特異性構(gòu)建體活化T細(xì)胞時(shí)沒(méi)有顯著的Th2細(xì)胞因子(IL-10和IL-4)分泌。在此測(cè)定法中在缺失靶細(xì)胞的情況下還有微弱的由“ (Fab) 2-Crossfab構(gòu)建體誘導(dǎo)的IFN Y分泌。
[0036]圖16:在自脾細(xì)胞分離的鼠泛T細(xì)胞上晚期活化標(biāo)志物CD25的表面表達(dá)水平。如所指出的(E:T比例為10:1)，在存在或缺失B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48腫瘤靶細(xì)胞的情況下將鼠泛T細(xì)胞與50nM鼠Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) -Fab (MCSP)構(gòu)建體( = (Fab) 2-CrossFab)雙特異性構(gòu)建體(靶向鼠CD3，以及人MCSP) —起溫育。所描繪的是70小時(shí)后⑶8+T細(xì)胞上晚期活化標(biāo)志物⑶25的表達(dá)水平。⑶8+T細(xì)胞上經(jīng)由(Fab) 2-CrossFab構(gòu)建體的⑶25上調(diào)僅發(fā)生在存在靶細(xì)胞的情況下。調(diào)整至相同摩爾濃度使用的參照IgG不能上調(diào)⑶25。
[0037]圖17:Fab (CD33) -CrossFab (CD3)生成和純化的分析。SDS-Page:a) 3_8%Tris/乙酸鹽(NuPage [invitrogen];考馬斯染色):a) 1- HiMark (invitrogen), 2 -非還原的 Fab(CD33)-CrossFab(CD3) ；b)4-12%Bis/Tris (NuPage[invitrogen]):1 -標(biāo)志物 12(invitrogen), 2 -還原的 Fab (CD33) -CrossFab (CD3)。
[0038]圖18:Fab (CD33) -CrossFab (CD3)生成和純化的分析。分析型大小排阻層析，層析圖 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v) NaCl ;注入 50 μ g 樣品)。
[0039]圖19:在與人PBMC(E:T比例=10:1)共培養(yǎng)并通過(guò)不同濃度⑶3-MCSP雙特異性構(gòu)建體(hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)，命名為“ 1+1 無(wú) Fe”;和(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)
(scFv)2”)參照分子)活化24小時(shí)時(shí)MV-3腫瘤細(xì)胞的殺死(如通過(guò)LDH釋放所測(cè)量的)。該“ 1+1無(wú)Fe”構(gòu)建體在MV-3靶細(xì)胞中以25.4pM的計(jì)算EC50誘導(dǎo)凋亡，而“(scFv) 2”參照分子的計(jì)算EC50則為57pM，顯示了 “1+1無(wú)Fe”分子在EC50方面稍好的效力。
[0040]圖20:在存在huMCSP陽(yáng)性MV-3腫瘤細(xì)胞的情況下，在與人PBMC(E:T比例=10:1)共培養(yǎng)，用CD3-MCSP雙特異性構(gòu)建體(分別是hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)，命名為“ 1+1無(wú) Fe”;和(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e) (= “(scFv) 2”)參照分子)處理約 24 小時(shí)時(shí)，CD4+或⑶8+T細(xì)胞的活化，如通過(guò)⑶69上調(diào)(A)、⑶69陽(yáng)性細(xì)胞各自增加(B)所測(cè)定的。總的來(lái)說(shuō)，與⑶4+T細(xì)胞相比，在⑶8+T細(xì)胞上⑶69中值更高。對(duì)兩種構(gòu)建體而言，⑶69中值以及CD69陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均有明顯的濃度依賴性增加。
[0041]圖21: (scFv)2參照分子的圖解。
[0042]圖22: (scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)生成和純化的分析。SDS-Page:4_12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考馬斯染色):1 -標(biāo)志物 12 (invitrogen), 2 -還原的(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)，3 -非還原的(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)。
[0043]圖23: (scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)生成和純化的分析。分析型大小排阻層析，層析圖A280(Superdex7510/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl ;注入 50μ g 樣品((scFv)2(抗 MCSP/抗 huCD3e)))。
[0044]發(fā)明詳述
[0045]1.定義
[0046]“框架”或“FR”指除高變區(qū)(HVR)殘基外的可變域殘基。一般地，可變域的FR由4個(gè)？1?域組成疋1?1、？1?2、？1?3、和？1?4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL)中一般以如下的順序出現(xiàn):FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0047]出于本文中的目的，“受體人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列變化。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化的數(shù)目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實(shí)施方案中，VL受體人框架與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
[0048]“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來(lái)自可變域序列亞組。通常，序列亞組是如 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIHPublication91-3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VL，亞組是如Kabat等，見(jiàn)上文中的亞組κ I。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VH，亞組是如Kabat等，見(jiàn)上文中的亞組III。
[0049]在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“HVR”指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)(“高變環(huán)”)的每個(gè)區(qū)。一般地，天然的4鏈抗體包含6個(gè)HVR;三個(gè)在VH中(Hl、Η2、Η3)，且三個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含來(lái)自高變環(huán)和/或來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的氨基酸殘基，后一種是最高序列變異性的和/或牽涉抗原識(shí)別。例示性高變環(huán)存在于氨基酸殘基 26-32 (LI) ,50-52 (L2) ,91-96 (L3) ,26-32 (Hl) ,53-55 (Η2)、和96-101 (Η3) (Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917 (1987))。例示性 CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3)存在于氨基酸殘基 24-34 (LI)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31_35B(HI)、50_65(H2)、和95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda，MD(1991))。術(shù)語(yǔ)高變區(qū)(HVR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)在述及形成抗原結(jié)合區(qū)的可變區(qū)部分時(shí)在本文中可交換使用。此特定區(qū)域已由Kabat等，U.S.Dept, of Healthand Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)及由Chothia等，J Mol Bioll96:901-917(1987)描述，其中定義包括在彼此比較時(shí)氨基酸殘基的重疊或子集。然而，應(yīng)用任一種定義來(lái)指抗體或其變體的CDR意圖在如本文中定義和使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。涵蓋如由上文引用的每篇參考文獻(xiàn)定義的CDR的適宜的氨基酸殘基在下表1中列出作為比較。 涵蓋特定CDR的確切殘基編號(hào)將隨著CDR的序列和大小而變化。鑒于抗體的可變區(qū)氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定哪些殘基構(gòu)成特定CDR。
[0050]表1:CDR 定義1
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種特異性結(jié)合T細(xì)胞活化性抗原和腫瘤抗原(TA)的雙特異性抗體，其包含第一Fab片段和第二 Fab片段，其中第二 Fab重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；且其中該雙特異性抗體不包含F(xiàn)e域。
2.權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其中所述第一Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)腫瘤抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)；且所述第二 Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)T細(xì)胞活化性抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求1或2的雙特異性抗體，其中所述T細(xì)胞活化性抗原為CD3T細(xì)胞共同受體(CD3)抗原。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其中所述第二Fab片段的N端連接所述第一Fab片段的C端。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其另外包含第三Fab片段。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其中所述第三Fab片段包含至少一個(gè)對(duì)腫瘤抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
7.權(quán)利要求5或6的雙特異性抗體，其中所述第三Fab片段連接所述第一Fab片段。
8.權(quán)利要求7的雙特異性抗體，其中所述第三Fab片段的C端連接所述第一Fab片段的N端。
9.權(quán)利要求5或6的雙特異性抗體，其中所述第三Fab片段連接所述第二Fab片段。
10.權(quán)利要求9的雙特異性抗體，其中所述第三Fab片段的N端連接所述第一Fab片段的C端。
11.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其中所述Fab片段是經(jīng)由肽接頭連接的。
12.權(quán)利要求11的雙特異性抗體，其中所述肽接頭為(G4S)2接頭。
13.權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其中所述腫瘤抗原選自下組:黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，癌胚抗原(CEA)，成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)和CD33。
14.權(quán)利要求13的雙特異性抗體，其中所述腫瘤抗原為MCSP。
15.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的雙特異性抗體。
16.權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。
17.權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其用作藥物。
18.權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的雙特異性抗體在制備藥物中的用途。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述藥物用于治療癌癥。
20.一種原核或真核宿主細(xì)胞，其包含載體，該載體包含編碼權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的雙特異性抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子。
21.一種生成抗體的方法,其包括培養(yǎng)權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，使得該抗體生成。
22.本文中描述的發(fā)明，尤其參見(jiàn)實(shí)施例。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103889452SQ201280050795
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月23日
【發(fā)明者】P.布魯恩克, T.福蒂, C.杰格, C.克萊恩, P.尤馬納 申請(qǐng)人:羅切格利卡特公司