抗原呈遞癌癥疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供治療黑色素瘤的試劑、方法和試劑盒。該試劑包括干擾素-γ（IFN-γ）應(yīng)答的黑色素瘤細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，并且其中所述細(xì)胞表達(dá)MHC?II類分子。在另一方面，所述試劑包括負(fù)載了干擾素-γ應(yīng)答的、非凋亡性的、表達(dá)MHC?II類的黑色素瘤細(xì)胞的樹突細(xì)胞。
【專利說明】抗原呈遞癌癥疫苗
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求享有2011年10月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/549681和2012年2月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/594304的全部巴黎公約優(yōu)先權(quán)及其權(quán)益，上述兩篇臨時(shí)申請(qǐng)通過引用并入本文,如同其全部?jī)?nèi)容在本文中闡述一樣。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及治療黑色素瘤、篩選適合治療的受試者、物質(zhì)組合物、方法和試劑盒。
[0004]發(fā)明背景
[0005]癌癥的特征是缺乏對(duì)癌癥有效的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的缺乏可由以下事實(shí)引起:例如許多腫瘤抗原是“自身抗原”;腫瘤細(xì)胞缺乏MHC的表達(dá)以及由此產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞缺乏腫瘤抗原的呈遞；巨噬細(xì)胞與腫瘤的關(guān)聯(lián)，該巨噬細(xì)胞表達(dá)降低免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子；以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的免疫抑制活性。對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的缺乏還可以由以下事實(shí)引起:腫瘤細(xì)胞傾向于不表達(dá)那些刺激先天性免疫應(yīng)答的分子，即刺激Toll樣受體(TLRs)或核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體的分子。癌癥包括實(shí)體腫瘤以及諸如白血病和骨髓發(fā)育不良綜合征的血液癌癥。
[0006]免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫、體液免疫、補(bǔ)體反應(yīng)(complement response)。細(xì)胞免疫包括多種細(xì)胞和多種活動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)，涉及樹突細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞；細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞)和CD4+T細(xì)胞(輔助T細(xì)胞)。樹突細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)獲得多肽抗原，其中這些抗原可以從DC的外部獲得，也可以在DC的內(nèi)部由感染生物體來生物合成。DC處理多肽，得到長(zhǎng)度約10個(gè)氨基酸的肽，并將這些肽傳輸給MHC I類或MHC II類以形成復(fù)合體，并將復(fù)合體運(yùn)(shuttles)到DC的表面。當(dāng)攜帶MHC I類/肽復(fù)合體的DC與⑶8+T細(xì)胞接觸時(shí)，結(jié)果是CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。對(duì)于MHC II類所起的作用，當(dāng)攜帶MHC II類/肽復(fù)合體的DC與CD4+T細(xì)胞接觸時(shí)，其結(jié)果是CD4+T細(xì)胞的活化和增殖(Munz等(2010)Curr.0pin.1mmunol.22:89-93 ；Monaco(1995)J.Leukocyte Biol.57:543-547 ；Robinson等(2002) Immunologyl05:252-262)。盡管呈遞抗原給T細(xì)胞的樹突細(xì)胞能夠“活化”該T細(xì)胞，活化的T細(xì)胞可能不能夠具有有效的免疫應(yīng)答。CD8+T細(xì)胞的有效的免疫應(yīng)答通常需要DC通過一次或多次多個(gè)交互來在先刺激(prior stimulation)。這些交互包括⑶4+T細(xì)胞與DC的直接接觸(通過⑶4+Τ細(xì)胞的⑶40配體與DCs的⑶40受體接觸的方式)，或者TLR激動(dòng)劑與樹突細(xì)胞的toll樣受體(TLRs)中的一個(gè)受體的直接接觸。
[0007]體液免疫涉及B細(xì)胞和抗體。B細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞表達(dá)并分泌抗體。初始B細(xì)胞的區(qū)別在于它們不表達(dá)標(biāo)志物(marker)⑶27，而抗原特異性B細(xì)胞則表達(dá)⑶27(Perez-Andres 等(2010)Cytometry Part B78B(Suppl.1)S47_S60)。分泌的抗體隨后可以與駐留在腫瘤細(xì)胞表面上的腫瘤抗原結(jié)合。結(jié)果是受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞被抗體標(biāo)記。隨著抗體與受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，結(jié)合的抗體介導(dǎo)(mediates)殺滅受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，其中殺滅細(xì)胞是由NK細(xì)胞進(jìn)行的。盡管并沒有以配置T細(xì)胞來識(shí)別靶抗原的方式對(duì)NK細(xì)胞 進(jìn)行配置來識(shí)別特定的靶抗原，但是NK細(xì)胞與抗體的恒定區(qū)域結(jié)合的能力使得NK細(xì)胞能夠特異性地殺滅抗體所標(biāo)記的細(xì)胞。NK細(xì)胞對(duì)抗體的識(shí)別是由與抗體的Fe部分結(jié)合的(NK細(xì)胞的)Fc受體介導(dǎo)的。這種類型的殺滅被稱為抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)15NK細(xì)胞也可以不依賴ADCC機(jī)理來殺滅細(xì)胞，在這種情況下這種殺滅需要在靶細(xì)胞中MHC I類的表達(dá)損失或缺乏(參見例如Caligiuri (2008)Bloodll2:461-469)。
[0008]可以使用“遲發(fā)型超敏反應(yīng)”(delayedtype hypersensitivity response)技術(shù)來區(qū)分主要涉及細(xì)胞免疫的免疫應(yīng)答或主要涉及體液免疫的免疫應(yīng)答。遲發(fā)型超敏反應(yīng)的陽性信號(hào)表明細(xì)胞應(yīng)答(參見，例如Roychowdhury等(2005)PS J.E834-E846)。
[0009]自噬是一個(gè)穩(wěn)態(tài)過程，細(xì)胞溶質(zhì)(cytosolic)成分和細(xì)胞器通過該過程被輸送到溶酶體降解。自噬也與細(xì)胞內(nèi)病原體的先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答有關(guān)，細(xì)胞溶質(zhì)抗原借助于細(xì)胞內(nèi)病原體而被負(fù)載到主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibilitycomplex, MHC) II類分子上，用于CD4+T細(xì)胞識(shí)別。
[0010]說明[0011]本文中使用時(shí)，包括所附權(quán)利要求書中使用時(shí)，除文本另有明確說明外，諸如“一個(gè)”、“一種”(“a”和“an”)和“所述”的詞語的單數(shù)形式包括其相應(yīng)的復(fù)數(shù)指示物。本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用并入本文，并入的程度如同明確且單獨(dú)地指出各個(gè)出版物、專利、公開的專利申請(qǐng)和序列表以及在所述公開和專利文獻(xiàn)中的圖片和照片通過引用并入本文一樣。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明公開哺乳動(dòng)物樹突細(xì)胞群落，其包含來自給定受試者的黑色素瘤特異性肽，該受試者患有黑色素瘤并且包含黑色素瘤細(xì)胞；其中所述黑色素瘤特異性肽是被樹突細(xì)胞從所述黑色素瘤細(xì)胞體外獲得，該黑色素瘤細(xì)胞未經(jīng)IFN-Y或IFN-Y模擬物(mimetic)體外處理，其中超過60%的未經(jīng)IFN- Y或IFN- Y模擬物體外處理的所述黑色素瘤細(xì)胞是自噬性和非凋亡性的，并且其中樹突細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞來自相同的受試者。
[0014]本發(fā)明還公開上述哺乳動(dòng)物樹突細(xì)胞群落，其中超過80%的所述黑色素瘤細(xì)胞是自噬性的和非凋亡性的。
[0015]本發(fā)明公開上述樹突細(xì)胞，其中基本上所有的未經(jīng)IFN- Y或IFN- Y模擬物處理的黑色素瘤細(xì)胞都不能細(xì)胞分裂；以及上述樹突細(xì)胞，其中基本上所有的未經(jīng)IFN- Y或IFN-y模擬物處理的黑色素瘤細(xì)胞受到輻照且不能細(xì)胞分裂；以及上述樹突細(xì)胞，其中至少80%的未經(jīng)IFN-Y或IFN-Y模擬物處理的黑色素瘤細(xì)胞受到輻照且不能細(xì)胞分裂；以及上述樹突細(xì)胞，其中至少80%的未經(jīng)IFN-Y或IFN-Y模擬物處理的黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)核酸交聯(lián)劑處理且不能細(xì)胞分裂。
[0016]本發(fā)明還公開了包含上述哺乳動(dòng)物樹突細(xì)胞的上述群落的疫苗。
[0017]本發(fā)明還公開了上述樹突細(xì)胞，其中基本上所有的黑色素瘤特異性肽均來自不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
[0018]本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述樹突細(xì)胞，其中基本上所有的黑色素瘤特異性肽來自由于黑色素瘤細(xì)胞受到輻照而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明公開了上述樹突細(xì)胞，其中基本上所有的黑色素瘤特異性肽來自由于黑色素瘤細(xì)胞的染色體被核酸交聯(lián)劑交聯(lián)而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
[0020]本發(fā)明還公開了上述樹突細(xì)胞，包含來自經(jīng)輻照處理過的黑色素瘤細(xì)胞的黑色素瘤特異性肽。
[0021]本發(fā)明公開了上述樹突細(xì)胞，其包含黑色素瘤特異性肽，其中所有所述肽來自經(jīng)輻照處理過的黑色素瘤細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明還公開了上述樹突細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)衍生自黑色素瘤特異性抗原的肽，黑色素瘤特異性抗原是 S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、Mel-5、MAGE-l、ART-l 或酪氨酸酶。
[0023]本發(fā)明公開了上述樹突細(xì)胞，其中基本上所有黑色素瘤特異性肽來自在體外經(jīng)處理而不能細(xì)胞分裂的黑色素瘤細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明還公開了上述樹突細(xì)胞，其中給定受試者是人類受試者。
[0025]本發(fā)明還公開了上述樹突細(xì)胞，其中給定受試者是非人哺乳動(dòng)物。
[0026]本發(fā)明公開了包含至少一種成熟樹突細(xì)胞的黑色素瘤疫苗，該成熟樹突細(xì)胞來自患有黑色素瘤的受試者，其中至少一種成熟樹突細(xì)胞已經(jīng)與來自相同受試者的至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞接觸，其中與至少一種成熟樹突細(xì)胞接觸的至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞是未分裂的、自噬性和非凋亡性的。
[0027]本發(fā)明還公開了刺激對(duì)黑色素瘤特異性抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向受試者施用免疫刺激量的權(quán)利要求1的樹突細(xì)胞。
[0028]本發(fā)明公開了其中受試者患有黑色素瘤并且確實(shí)具有黑色素瘤細(xì)胞。
[0029]本發(fā)明公開了上述方法，其中受刺激的免疫應(yīng)答包括⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答、⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答中的一種或多種。
[0030]本發(fā)明公開了上述方法，其中通過ELISPOT測(cè)定、通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定、通過四聚體測(cè)定、或者通過檢測(cè)抗原特異性抗體的產(chǎn)生來測(cè)定CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CDS+T細(xì)胞應(yīng)答或B細(xì)胞應(yīng)答。
[0031]本發(fā)明還公開了上述方法，其中免疫應(yīng)答包括含有2年總生存率(OS)的生存時(shí)間，并且其中2年總生存率至少為60%。
[0032]本發(fā)明公開了上述方法，其中所述施用包括皮下注射疫苗。
[0033]本發(fā)明公開了上述方法，其中施用包括將每周給予的疫苗注射三個(gè)月，然后每月給予的疫苗注射五個(gè)月。
[0034]本發(fā)明還公開了制備樹突細(xì)胞疫苗的上述方法，該樹突細(xì)胞疫苗包含來自相同受試者的黑色素瘤細(xì)胞和樹突細(xì)胞，該方法包括:用防止細(xì)胞分裂的試劑處理一種或多種黑色素瘤細(xì)胞；不對(duì)所述一種或多種黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行干擾素-Y (IFN-Y)或IFN-Y模擬物體外處理；選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，丟棄非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞；并且其中向一種或多種自體樹突細(xì)胞提供自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，或者其中向一種或多種自體樹突細(xì)胞提供衍生自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的肽。
[0035] 本發(fā)明公開一種組合物，其包含:來自第一受試者的未經(jīng)干擾素- Y (IFN-y)處理的至少一種黑色素瘤細(xì)胞，和來自相同第一受試者的至少一種抗原呈遞細(xì)胞(APC)，其中黑色素瘤細(xì)胞是:自噬性和非凋亡性的。
[0036]本發(fā)明還公開上述組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞能表達(dá)MHC II類。
[0037]本發(fā)明還公開上述組合物，其中APC是樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞。
[0038]本發(fā)明公開上述組合物，其中至少一種黑色素瘤細(xì)胞包含黑色素瘤特異性肽，并且其中黑色素瘤特異性肽基本不包含于所述APCs中，而且黑色素瘤特異性肽基本不被所述APCs加工。
[0039]本 發(fā)明還公開上述組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞包含黑色素瘤特異性肽，并且其中黑色素瘤特異性肽基本包含于所述APCs中，而且黑色素瘤特異性肽部分地或基本上在APCs中被加工。本發(fā)明還公開上述組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞被負(fù)載于APC中。本發(fā)明公開上述組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞未被負(fù)載于APC中。
[0040]本發(fā)明公開上述組合物，其中自噬是通過如下測(cè)試證明的，該測(cè)試測(cè)定微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3)。
[0041]本發(fā)明公開上述組合物，其中使用7-氨基放線菌素D (7-AAD)試劑或Annexin (膜聯(lián)蛋白)試劑中至少一種來證明細(xì)胞是非凋亡性的。
[0042]本發(fā)明公開在受試者中刺激免疫應(yīng)答的方法，該受試者患有黑色素瘤且包含黑色素瘤細(xì)胞，其中受試者是與第一受試者相同的受試者，包括施用免疫有效量的上述組合物。
[0043]本發(fā)明公開上述組合物，其中至少90%的黑色素細(xì)胞未經(jīng)IFN- Y體外處理，并且小于10%的黑色素細(xì)胞經(jīng)IFN-Y體外處理。
[0044]本發(fā)明公開制造上述疫苗或上述組合物的方法，其包括將至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞與至少一種抗原呈遞細(xì)胞(APC)接觸，其中至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞來自第一人受試者，并且其中至少一種APC來自相同的第一人受試者。
[0045]本發(fā)明公開制備樹突細(xì)胞疫苗的方法，其包括:用防止細(xì)胞分裂的試劑處理從第一受試者獲得的黑色素瘤細(xì)胞，其中不對(duì)所述黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行IFN-Y或IFN-Y模擬物體外處理；選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞；并且將所選擇的黑色素瘤細(xì)胞與來自相同第一受試者的自體樹突細(xì)胞接觸。
[0046]本發(fā)明公開一種組合物，其包含通過上述方法所制得的樹突細(xì)胞疫苗。
[0047]本發(fā)明公開刺激對(duì)黑色素瘤特異性抗原免疫應(yīng)答的方法，其包括給患有黑色素瘤的受試者施用上述組合物。
[0048]本發(fā)明公開包含至少一種來自第一受試者的黑色素瘤細(xì)胞和至少一種來自相同第一受試者的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞是:自噬性的、非凋亡性的、并且表達(dá)MHC II類的。在本發(fā)明中，經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞未負(fù)載于APC中；并且其中經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞未負(fù)載于APC中。在另一方面，本發(fā)明包含上述組合物，其中黑色素瘤細(xì)胞來自患有I期(Stage I)、II期(Stage II)、III期(Stage III)或IV期(Stage IV)黑色素瘤的受試者。此外，本發(fā)明涉及上述組合物、相關(guān)的試劑盒和相關(guān)的方法，其中APC包含至少一種樹突細(xì)胞。
[0049]在一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物組合物、試劑和相關(guān)的方法采用癌癥細(xì)胞的制劑，該制劑為7-AAD陰性并且Annexin V陰性。這種群落(population)的非限制性例子可以是,例如約99%7-AAD陰性和約99%Annexin V陰性、或者至少約95%7_AAD陰性和約95%annexin V陰性、或者至少約90%7-AAD陰性和約90%Annexin V陰性。
[0050]此外，本發(fā)明包含上述組合物，其中自噬是通過如下測(cè)試證明的，該測(cè)試測(cè)定微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3);以及上述組合物，其中使用7-氨基放線菌素D (7-AAD)試劑或Annexin (膜聯(lián)蛋白)試劑中至少一種來證明細(xì)胞是非凋亡性的。
[0051]在方法方面，本發(fā)明提供制造如上所述組合物的方法，其包括從第一受試者中去除至少一種黑色 素瘤細(xì)胞，從第一受試者中去除至少一種APC，并且允許黑色素瘤細(xì)胞與APC接觸；以及刺激對(duì)受試者或患者中黑色素瘤的免疫應(yīng)答的方法，其包含向受試者施用上述組合物。
[0052]在試劑盒方面，本發(fā)明提供用于測(cè)試對(duì)受試者中腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的試劑盒，其中通過一種或多種上述方法來治療受試者，并且其中試劑盒包含檢測(cè)體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和先天性免疫應(yīng)答的試劑。
[0053]定義
[0054]免疫刺激量可以是，但不限于，以可測(cè)量的量增加ELISPOT測(cè)定結(jié)果的量、以可測(cè)量的量增加ICS測(cè)定結(jié)果的量、以可測(cè)量的量增加四聚體測(cè)定結(jié)果的量、以可測(cè)量的量增加抗原特異性⑶4+T細(xì)胞的血液總數(shù)(blood population)的量、以可測(cè)量的量增加抗原特異性⑶8+T細(xì)胞的血液總數(shù)的量、或者其中當(dāng)與合適的對(duì)照相比時(shí)增加了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、1.5倍、2.0倍、3.0倍等。合適的對(duì)照可以是對(duì)照疫苗，其中沒有用黑色素瘤細(xì)胞負(fù)載樹突細(xì)胞，或者沒有用衍生自黑色素瘤細(xì)胞的肽負(fù)載樹突細(xì)胞。
[0055]術(shù)語〃黑色素瘤特異性抗原〃包括通常與黑色素瘤相關(guān)的抗原，并且其中該抗原對(duì)于黑色素瘤來說被認(rèn)為是唯一的，而不是與其他癌癥有關(guān)，并且此外，術(shù)語〃黑色素瘤特異性抗原類〃包括通常與黑色素瘤相關(guān)的抗原，并且其中該抗原也與諸如乳腺癌、大腸癌等其他類型癌癥有關(guān)。
[0056]在輻照本發(fā)明的黑色素瘤細(xì)胞的上下文中，“輻照”優(yōu)選地通過Y-輻照，但也包括通過X-射線、電子、中子、質(zhì)子、電磁輻照、可見光、紫外光等的輻照。在一個(gè)方面，輻照起到防止黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂的作用。在另一方面，輻照不僅防止細(xì)胞分裂，而且使細(xì)胞蛋白質(zhì)變性。作為輻照的替換，本發(fā)明可通過物理破壞的方式諸如超聲、空洞形成(cavitation)、脫水、離子耗竭(ion depletion)或者通過暴露于一種或多種鹽產(chǎn)生的毒性來防止黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂。
[0057]在“超過60%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語〃%〃(百分?jǐn)?shù))涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。在“超過80%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語〃%"涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。在“小于40%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語"%"涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。在“小于20%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語"%"涉及肽分子的數(shù)目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的數(shù)目。
[0058]在“超過60%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語〃肽〃涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的數(shù)目的總和。在“超過80%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語〃肽〃涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的數(shù)目的總和。在“小于40%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語"肽"涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的數(shù)目的總和。在“小于20%的黑色素瘤特異性肽”中，術(shù)語"肽"涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子等的數(shù)目的總和。
[0059]在從一種或多種癌細(xì)胞獲得的肽的上下文中，“衍生自”或“從……獲得”(derivedfrom)包含以下內(nèi)容。癌細(xì)胞可以被分解，例如通過均化器或通過滲透破裂，從而得到粗提取物?？梢允勾痔崛∥锏碾?、寡肽和多肽接觸到樹突細(xì)胞，然后通過樹突細(xì)胞處理肽。“衍生自”也包括提供具有完整癌細(xì)胞的樹突細(xì)胞，其中癌細(xì)胞是活的，或者其中已經(jīng)采用輻照處理癌細(xì)胞但癌細(xì)胞仍然具有代謝活性，或者其中已經(jīng)采用核酸交聯(lián)劑處理癌細(xì)胞但癌細(xì)胞仍然具有代謝活性。“衍生自”包括癌細(xì)胞碎片、游離癌細(xì)胞蛋白質(zhì)和經(jīng)輻照的癌細(xì)胞的混合物，它們被樹突細(xì)胞攝取(taken up),因此衍生自癌細(xì)胞。
[0060]應(yīng)用于人、哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物受試者、動(dòng)物、獸醫(yī)受試者、安慰劑受試者、研究受試者、實(shí)驗(yàn)受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時(shí)，“施用”指的是，但不限于給受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體等接觸外源性配體、試劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物?！笆┯谩笨缮婕袄缣幚矸椒?、藥代動(dòng)力學(xué)方法、診斷方法、研究方法、安慰劑方法和實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞的處理包括給細(xì)胞接觸試劑、以及給流體接觸試劑，其中流體與細(xì)胞接觸?！笆┯谩币舶ㄖT如細(xì)胞的體外(in vitro)和活體外(ex vivo)處理,其通過試劑、診斷、結(jié)合組合物或者通過另一細(xì)胞進(jìn)行。
[0061]涉及配體和受體時(shí)，“激動(dòng)劑”包括刺激受體的分子、分子的組合、復(fù)合物、試劑的組合。例如，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的激動(dòng)劑可以包括GM-CSF、GM-CSF的變異體變白或衍生物、GM-CSF的肽模擬物、模擬GM-CSF的生物功能的小分子、或者刺激GM-CSF受體的抗體。涉及配體和受體時(shí)，拮抗劑包括抑制、抵消、下調(diào)和/或脫敏受體的分子、分子的組合物或復(fù)合物?！稗卓箘卑ㄒ种剖荏w的組成性活性(constitutiveactivity)的任何試劑。組成性活性是當(dāng)不存在配體/受體相互作用時(shí)顯露的活性?！稗卓箘边€包括抑制或防止受刺激(或受調(diào)節(jié))的受體活性的任何試劑。舉例如下，GM-CSF受體的拮抗劑包括但不限于:與配體(GM-CSF)結(jié)合并防止其結(jié)合受體的抗體，或者與受體結(jié)合并防止配體與受體結(jié)合的抗體，或者其中抗體將受體封鎖在非活性構(gòu)象。
[0062]除本文另有指明或上下文指定外，術(shù)語“表達(dá)”包括如下內(nèi)容。表達(dá)包括mRNA的生物合成、多肽生物合成、多肽活化，例如通過翻譯后修飾，或者通過改變亞細(xì)胞位置或通過募集到染色質(zhì)使表達(dá)活化。換言之，“提高的表達(dá)”包括由磷酸酯引起的生物合成提高或活性提高，或者由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的遷移所引起的活性提高。
[0063]抗原呈遞細(xì)胞(APCs)是用于呈遞抗原給T細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。APCs包括樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、邊緣區(qū)KupfTer細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、郎格漢斯細(xì)胞、T細(xì)胞和 B 細(xì)胞(參見，例如 Rodriguez-Pinto 和 Moreno (2005)Eur.J.1mmunol.35:1097-1105)。樹突細(xì)胞產(chǎn)生在至少兩個(gè)譜系中。第一譜系包括前體-DC1、骨髓DCl和成熟DC1。第二譜系包括 CD34++CD45RA-早期祖多能細(xì)胞(early progenitor multipotent cells)、CD34++CD45RA+ 細(xì)胞、CD34++CD45RA++CD4+IL-3Ralpha++ 促-DC2 細(xì)胞、CD4+CD11(T 漿細(xì)胞樣DC2前體細(xì)胞、淋巴樣人DC2漿細(xì)胞樣-衍生的DC2、和成熟DC2 (參見，例如Gilliet和Liu (2002)J.Exp.Med.195:695-704 ;Bauer 等(2001)J.1mmunol.166:5000-5007 ；Arpinati等(2000)Blood95:2484-2490 ;Kadowaki 等(2001)J.Exp.Med.194:863-869 ;Liu(2002)Human Immunology63:1067-1071 ;McKenna等(2005) J.Virol.79:17-27 ;0，Neill 等(2004)Blood104:2235-2246 ；Rossi 和 Young(2005)J.Tmmunol.175:1373-1381 ；Banchereau 和Palucka(2005)Nat.Rev.Tmmunol.5:296-306)。
[0064] “有效量”包括但不限于可改善、反轉(zhuǎn)、減輕、預(yù)防或診斷醫(yī)學(xué)病情(condition)或病癥(disorder)的癥狀或跡象的量。除非另有明確指明或通過上下文指明外，“有效量”不限于足以改善病情的最小量。疾病或病癥的嚴(yán)重程度以及處理以預(yù)防、治療或減輕疾病或病癥的能力，可以通過生物標(biāo)志物或通過臨床參數(shù)測(cè)定，但不限于此。生物標(biāo)志物包括核酸,血清、尿、腦脊液中的血球計(jì)數(shù)、代謝水平,腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù),癌癥干細(xì)胞計(jì)數(shù),腫瘤水平。腫瘤水平可以通過 RECIST 標(biāo)準(zhǔn)(Eisenhauer 等(2009)Eur.J.Cancer.45:228-247)來測(cè)定。表達(dá)標(biāo)志物包括mRNA的基因表達(dá)或者基因擴(kuò)增、抗原表達(dá)和多肽的表達(dá)。臨床參數(shù)包括但不限于無進(jìn)展生存期(PFS, progression-free survival )、6月PFS、無病生存期(DFS,dsease-free srvival)、疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP, time to progression)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間(TDM,time to distant metastasis)和總生存期(overall survival)。
[0065]“標(biāo)記的”組 合物可通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、同位素或化學(xué)方法直接或間接地檢測(cè)。例如有用的標(biāo)記包括32P、33P、35S、14C、3H、1251、穩(wěn)定同位素、表位標(biāo)簽、熒光染料、電子-致密試劑、底物或酶例如在酶聯(lián)免疫測(cè)定中使用的酶或fIuorettes(例如參見 Rozinov 和 Nolan (1998) Chem.Biol.5:713-728)。
[0066]評(píng)估免疫應(yīng)答的方法
[0067]本發(fā)明還提供用于表征免疫應(yīng)答的ELISPOT測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)和四聚體測(cè)定(參見例如，Pardoll 的 US2007/0190029 ；Chattopadhyay (2008) CytometryA.200873:1001-1009 ；Vollers(2008)Immunology.123:305-313 ；Lalvan1.等(1997)J.Exp.Med.186:859-865 ；ffaldrop(1997)J.Clin.1nvest.99:1739-1750 ；Hudgens(2004)J.1mmunol.Methods288:19-34 ；Goulder (2001) J.Virol.75:1339-1347 ；Goulder (2000)J.Exp.Med.192:1819-1831 ;Anthony (2003)Methods29:260-269 ；Badovinac 和Harry (2000) J.1mmunol.Methods238:107-117)。通過腫瘤學(xué)臨床試驗(yàn)中所使用的終點(diǎn)來評(píng)估患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答，包括客觀反應(yīng)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))、總生存期、無進(jìn)展生存期(PFS)、無病生存時(shí)間、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間、6月PFS、12月PFS等等。
[0068]疫苗
[0069]本發(fā)明的樹突細(xì)胞疫苗可以通過皮內(nèi)、結(jié)內(nèi)、粘膜或皮下途徑或上述的任意組合來施用。每劑可以包括約IOX IO3個(gè)樹突細(xì)胞、20X IO3個(gè)細(xì)胞、50X IO3個(gè)細(xì)胞、IOOX IO3個(gè)細(xì)胞、200 X IO3個(gè)細(xì)胞、500 X IO3個(gè)細(xì)胞、I X IO6個(gè)細(xì)胞、2 X IO6個(gè)細(xì)胞、20 X IO6個(gè)細(xì)胞、50X IO6 個(gè)細(xì)胞、100X IO6 個(gè)細(xì)胞、200X 1066、500X 106、1X IO9 個(gè)細(xì)胞、2X IO9 個(gè)細(xì)胞、5X IO9個(gè)細(xì)胞、10X IO9個(gè)細(xì)胞等等。施用頻率可以是例如一周一次、一周二次、兩周一次、三周一次、四周一次、一個(gè)月一次、兩個(gè)月一次、三個(gè)月一次、四個(gè)月一次、五個(gè)月一次、六個(gè)月一次等等。進(jìn)行施用的天的總數(shù)目可以是一天、2天或3天、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、或20等等。應(yīng)當(dāng)理解的是，任何給定的施用可以包含同一天中兩次或更多次注射。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用整個(gè)腫瘤細(xì)胞負(fù)載樹突細(xì)胞，其中至少10%、其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的負(fù)載到樹突細(xì)胞中的衍生自黑色素瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)存在于整個(gè)腫瘤細(xì)胞中。在非限制性實(shí)施方式中，樹突細(xì)胞疫苗在燒瓶中、小瓶中、瓶子中、注射器、導(dǎo)管中、套管中等等。為了施用，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%的被施用的樹突細(xì)胞是樹突細(xì)胞。
[0070]疫苗均勻性
[0071]在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含樹突細(xì)胞的疫苗，該樹突細(xì)胞包含衍生自體外負(fù)載的黑色素瘤肽，其中疫苗以至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1等的樹突細(xì)胞/黑色素瘤細(xì)胞的比例包含樹突細(xì)胞(包含黑色素瘤肽的DC和不包含黑色素瘤肽的DC的總和)。本發(fā)明還提供包含樹突細(xì)胞的疫苗，該樹突細(xì)胞包含衍生自體外負(fù)載的黑色素瘤肽，其中疫苗以至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1 等的[樹突細(xì)胞]/[既非DC又非黑色素瘤的細(xì)胞]的比例包含樹突細(xì)胞(包含黑色素瘤肽的DC和不包含黑色素瘤肽的DC的總和)。本發(fā)明提供一種帶間隔的容器，其中第一間隔包含黑色素瘤細(xì)胞，并且第二間隔包含樹突細(xì)胞。兩個(gè)間隔可以通過以下物質(zhì)來分離:膜、過濾器、閥門、導(dǎo)管、耦合器來分離，其防止黑色素瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞接觸，但其中手動(dòng)傳輸或其中去除膜或打開閥門時(shí)允許黑色素瘤細(xì)胞與樹突細(xì)胞接觸，使得黑色素瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞片段和/或黑色素瘤肽可以負(fù)載到樹突細(xì)胞上。
[0072]干擾素-Y模擬物
[0073]本發(fā)明包含模擬物，例如干擾素-Y模擬物，例如模擬肽95-132 (Ahmed (2007)J.1mmunol.178:4576-4583 ；Fulcher (2008) FEBS Lett.582:1569-1574)。IFN-模擬物包括例如具有與干擾素-Y相同激動(dòng)劑活性的抗體。[0074]使黑色素瘤細(xì)胞失活
[0075]本發(fā)明提供其中癌癥細(xì)胞失活的組合物和方法，例如通過輻射失活或通過核酸交聯(lián)劑的方式失活。示例性交聯(lián)劑具有交聯(lián)DNA但不修飾蛋白質(zhì)的能力。核酸烷基化劑可以是β _丙氨酸、N-(卩丫唳-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙基酯。在一些實(shí)施方式中，核酸靶向化合物是經(jīng)由UVA輻照活化的補(bǔ)骨脂素化合物。例如，核酸靶向化合物可以是4’ - (4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(本文中也稱為〃S-59〃)?？梢杂?50微摩爾補(bǔ)骨脂素 S-59 和 3J/cm2UVA 光(FX1019 福照裝置，Baxter Fenwal, Round Lake, IL)來失活細(xì)胞。用S-59進(jìn)行的失活被稱為光化學(xué)處理，并且導(dǎo)致細(xì)胞的完全失活?？梢詼y(cè)試各種濃度的核酸交聯(lián)劑在失活細(xì)胞方面的效力，例如在防止細(xì)胞分裂方面的效力。S-59的特征在于其交聯(lián)核酸但保持蛋白質(zhì)完整未被修飾的能力。細(xì)胞可以懸浮于含0、1、10、100和1000nM補(bǔ)骨脂素S-59的5mL生理鹽水中?？梢匀缦碌剌椪彰總€(gè)樣品?？梢砸訧OOnM的濃度加入 S-59。以大約 2J/cm2 (FX1019 福照裝置，Baxter Fenwal, Round Lake, II1.)的劑量UVA輻照樣品。并然后將每個(gè)樣品轉(zhuǎn)移到15mL管、離心并去除上清液，然后用5mL生理鹽水洗滌、離心并去除上清液，并且最終的沉淀懸浮于0.5mL的生理鹽水中(Dubensky的美國(guó)專利 Nos.7833775 和 7691393)。
[0076]富集非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞
[0077]可以使黑色素瘤細(xì)胞群落富含非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，例如通過使用如下技術(shù):將非凋亡性且自噬性細(xì)胞與非自噬性且凋亡性的細(xì)胞分離，其中分離是通過將自噬性且非凋亡性的細(xì)胞粘附到表面來進(jìn)行的，其中其他細(xì)胞處于浮動(dòng)狀態(tài)。還可以通過去除凋亡的細(xì)胞來獲得富含非凋亡性黑色素瘤細(xì)胞的群落，例如通過對(duì)磷脂酰絲氨酸特異的抗體的方式去除。通過經(jīng)固定化的抗體的方式去除細(xì)胞的技術(shù)是已知的(Onodera(1998)Ther.Apher.2:37-42)。對(duì)磷脂酰絲氨酸特異的抗體是已知的(例如EMDMillipore, Billerca, MA)0也可以用熒光抗磷脂酰絲氨酸抗體標(biāo)記黑色素瘤細(xì)胞的主體群落(bulk population),其中通過流式細(xì)胞法、親和層析法、免疫磁性分離(參見例如Hoeppener (2012)Recent Results Cancer Res.195:43-58 ；Dainiak (2007)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.106:1-18)除去標(biāo)記的凋亡黑色素瘤細(xì)胞。[0078]細(xì)胞凋亡的抑制劑
[0079]Z-VAD(Z-VAD-fmk)是一種細(xì)胞凋亡的抑制劑，其可以從例如 Enzo Life Sciences (Exeter, UK) > R&D Systems(Minneapolis,MN) >Tocris Biosciences(Bristol, UK) > BioMol(Plymouth Meeting, PA)和 EMDChemicals (Gibbstown, NJ)獲得。Z-VAD-fmk 是一種合成妝 Z-Val-Ala-Asp (OMe) _CH2F。半胱天冬酶(caspases,胱天蛋白酶)是半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶家族。半胱天冬酶被死亡受體連接(li gat ion)而活化，例如TRAIL、FAS、通過DNA損傷、應(yīng)激、血清饑餓以及在某些細(xì)胞類型中干擾素。半胱天冬酶在包括核斷裂、染色質(zhì)濃縮和細(xì)胞質(zhì)完整性損失的細(xì)胞凋亡的高度調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵的作用。泛蛋白酶抑制劑(pan-capase) z-VAD-fmk (節(jié)氧羰基-纈氨酰-丙氨酰-天冬氨酰- [O-甲基]-氟甲基酮)不可逆地結(jié)合半胱天冬蛋白酶的催化位點(diǎn)，并抑制它們?cè)谡T導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的功能。在對(duì)IFN-Y應(yīng)答時(shí)抑制細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的能力可以是如下方式:通過此方式產(chǎn)生非凋亡性但自噬性細(xì)胞，而無洗滌選擇步驟來去除浮動(dòng)的凋亡細(xì)胞。
[0080]本發(fā)明提供藥物、試劑、試劑盒(包括診斷試劑盒)，其中藥物、試劑、試劑盒包含樹突細(xì)胞、抗體或抗原。本發(fā)明還提供施用含至少一種樹突細(xì)胞和至少一種抗原的組合物的方法、刺激抗體形成的方法、刺激ADCC的方法、刺激補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的方法、以及確定患者適用性的方法和試劑盒、在臨床試驗(yàn)中確定患者入選/排除標(biāo)準(zhǔn)的方法和試劑盒、預(yù)測(cè)對(duì)藥物或試劑的應(yīng)答的方法?，F(xiàn)有技術(shù)中已描述補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(參見例如Goodman等(1990) J.Clin.0ncol.8:1083-1092 ；Cheson(2010) J.Clin.0ncol.28:3525-3530)。本發(fā)明的藥物組合物、試劑和相關(guān)方法包含CD83陽性樹突細(xì)胞，其中CD83是通過用IFN-Y處理的癌細(xì)胞負(fù)載而誘導(dǎo)的。在本發(fā)明的⑶83方面，⑶83被誘導(dǎo)了至少2%、至少3%、至少4%、6%、7%、8%、9%、10% 等。
[0081]圖
[0082]圖1展現(xiàn)了在用IFN- Y處理之前(左)和IFN- Y處理72小時(shí)之后(右)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的圖形。處理后，培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞要么是浮動(dòng)的、非自噬性且凋亡的，要么是粘附的、自噬性且非凋亡的。浮動(dòng)的細(xì)胞示出表達(dá)凋亡標(biāo)志物磷脂酰絲氨酸。浮動(dòng)的細(xì)胞示出具有相對(duì)較少的表達(dá)的MHC II類，而粘附細(xì)胞示出具有過度表達(dá)的MHC II類。
[0083]圖2A-D示出了用于負(fù)載樹突細(xì)胞的經(jīng)IFN-Y處理的自體腫瘤細(xì)胞的特征。在15%FBS/ECS中在RPMI中使用或者不使用1000IU/mL IFN-y處理自體黑色素瘤腫瘤細(xì)胞72小時(shí)，收獲并用IOOGy輻照并凍存。然后在AIMV中將細(xì)胞解凍，并采樣用于流式細(xì)胞，以及用于在抗原負(fù)載DC之前制備用于免疫印跡的細(xì)胞裂解物。四個(gè)獨(dú)立的自體黑色素瘤細(xì)胞系的例子示于圖2A、圖2B和圖2C中。通過IFN- Y處理自體腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體(圖2D)。在使用或者不使用1000IU/mL IFN-y處理72小時(shí)后收獲腫瘤細(xì)胞，然后測(cè)定MHC I類和II類。使用對(duì)照同類型抗體來認(rèn)定陽性群落。深色數(shù)據(jù)點(diǎn)表示中值平均+/-95%置信區(qū)間。N=65。輻照后，通過測(cè)定檢查黑色素瘤細(xì)胞，來確定無任何有絲分裂。
[0084]在一個(gè)方面，本發(fā)明排除用于負(fù)載樹突細(xì)胞的非自體腫瘤細(xì)胞，并且排除使用用于負(fù)載樹突細(xì)胞的非自體腫瘤細(xì)胞的方法。
[0085]圖3A和3B描述用自體黑色素瘤細(xì)胞系負(fù)載的樹突細(xì)胞的表型，其中使用干擾素-Y處理自體黑色素瘤細(xì)胞系或未使用干擾素-Y處理自體黑色素瘤細(xì)胞系。使用或者不使用1000IU/mL IFN-y處理一組四個(gè)自體黑色素瘤細(xì)胞系72小時(shí)，輻照并凍存。然后在AIMV中將細(xì)胞解凍，并在收獲和通過流式細(xì)胞法測(cè)定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II類的表達(dá)之前，與自體樹突細(xì)胞組合大約24小時(shí)(圖3A)。數(shù)據(jù)總結(jié)于圖3B中。示出了平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD ), n=4。
[0086]圖4A和4B示出了劑型(dose)制備所使用的樹突細(xì)胞的表型。在用經(jīng)IFN-y處理的、輻射的自體腫瘤細(xì)胞負(fù)載之前(Pre-ATC Load DC, N=53)和負(fù)載之后(Post-ATC LoadDC, N=65)，通過流式細(xì)胞法評(píng)估DC的樣品對(duì)于⑶80、⑶83、⑶86和MHC II類的表達(dá)。使用FACS Caliber?球來設(shè)置的初始流式細(xì)胞儀儀器設(shè)定，然后在整個(gè)數(shù)據(jù)的采集中保持該設(shè)定不變(圖4A)。在圖4B中，比較ATC負(fù)載之前和ATC負(fù)載之后的百分?jǐn)?shù)表示的值和平均熒光強(qiáng)度(MFI) +SD0 *ρ=0.019 且 **ρ=0.0009。
[0087]圖5Α至5C示出了經(jīng)干擾素-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行自噬。選擇商業(yè)可購(gòu)得的黑色素瘤細(xì)胞系，并在5%FBS/RMPI中用10001U/mL IFN-y培育72小時(shí)。在培育期結(jié)束時(shí)拍攝SK-5-Mel細(xì)胞培養(yǎng)基的相位差顯微鏡照片(圖5A)，示出了具有自噬體的囊泡的放大的細(xì)胞。在用IFN-Y處理之前，通過使用GFP-LC3B構(gòu)建轉(zhuǎn)染來證明自噬體的確定和形成(圖5B)。通過使用用于LC3B的抗體蛋白質(zhì)印跡(圖5C)，來確定IFN-Y處理后的自噬誘導(dǎo)，確認(rèn)LC3的更快的遷移形式，已經(jīng)表明LC3與自噬性血管形成相關(guān)。
[0088]圖6A和6B展現(xiàn)了對(duì)干擾素-Y應(yīng)答時(shí)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬。用10001U/mL的IFN-y培育SK-5-Mel細(xì)胞72小時(shí)，之后收集非粘附群落和粘附的群落并通過使用7-AAD和Annexin-V流式細(xì)胞法測(cè)定細(xì)胞凋亡和自噬(圖6A)。使用Enzo Cyto-1D自噬檢測(cè)染料，通過測(cè)定制造商所提供的染料的平均強(qiáng)度峰位移，通過流式細(xì)胞法來測(cè)定自噬(圖6B)。圖6C中示出了，與5%FBS/RPMI相比，峰位移的倍數(shù)變化(fold change)，其中無血清作為自噬誘導(dǎo)的陽性對(duì)照。
[0089]圖7公開了阻斷半胱天冬酶活性后的自噬誘導(dǎo)并不影響在黑色素瘤細(xì)胞中對(duì)IFN- Y應(yīng)答時(shí)的自噬誘導(dǎo)。在20uM的泛半胱天冬酶抑制劑z-VAD或其對(duì)照化合物z_FA存在下，用1000IU/mL的IFN- Y處理SK_5_Mel細(xì)胞72小時(shí)。收獲細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞法測(cè)定自噬，如圖6C中所示。
[0090]圖8示出了 SK-5-Mel細(xì)胞，其用1000IU/mL的IFN- Y在IOuM的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)存在下培育72小時(shí)。然后收獲細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞法測(cè)定細(xì)胞凋亡和MHC II 類(HLA-DR)表達(dá)。
[0091]圖9示出了來自由患者腫瘤樣本(N=36)所產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞系的IFN-Y處理過的細(xì)胞，測(cè)定其在MHC II類或細(xì)胞凋亡方面的變化。所示數(shù)據(jù)為平均熒光強(qiáng)度土SE的平均值。
[0092]圖10示出了經(jīng)IFN- Y處理的細(xì)胞，通過流式細(xì)胞法從用于負(fù)載患者特異性疫苗免疫治療的樹突細(xì)胞的樣品測(cè)定其MHC II類或細(xì)胞凋亡。示出了 MHC II類的倍數(shù)變化、平均熒光強(qiáng)度和凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(Annexin-V陽性)。
[0093]圖11和圖12示出了 MHC II類的誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的缺乏之間的相關(guān)性，在接受用自噬性、非凋亡性、經(jīng)干擾素-Y處理的腫瘤細(xì)胞負(fù)載的樹突細(xì)胞的患者中表現(xiàn)出更好的無進(jìn)展生存期(圖11)和總生存期(圖12)。
[0094] 圖13示出了來自三次試驗(yàn)的生存曲線。點(diǎn)圖(Kaplan-Meier)是步進(jìn)式曲線,表明在臨床試驗(yàn)的過程中研究受試者生存的百分?jǐn)?shù)。設(shè)計(jì)各個(gè)組DC-54 (實(shí)心圓)、TC-74 (實(shí)心方塊)、TC-24 (實(shí)心三角形)以及DC-18 (線)。最差的生存發(fā)生在TC-24組。第二差的生存組是TC-74。TC-24指的是在涉及24個(gè)受試者的研究中腫瘤細(xì)胞的疫苗。
[0095]圖14示出了來自三次試驗(yàn)的生存曲線。這些試驗(yàn)是與圖13中所描述的試驗(yàn)相同的臨床試驗(yàn)，但具有較晚的時(shí)間點(diǎn)所獲得的額外數(shù)據(jù)。
[0096]進(jìn)一步說明
[0097]自體樹突細(xì)胞生成[0098]SSficoled apheresis products 的塑料粘附法(plastic adherence method)(Choi 等(1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ;Luft 等(1998)Exp.Hematol.26:489-500 ；Cornforth 等(2011) Cancer Tmmunol.Immunother.60:123-131),在補(bǔ)充有各 lOOOIU/mL 的IL-4(CellGenix, Freisberg, Germany)和 GM-CSF(Bertex, Seattle, WA) (DC 培養(yǎng)基)的不含抗生素的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen, Grand Island, NY)中，生成樹突細(xì)胞。然后在用經(jīng)IFN- Y處理的、輻照的自體腫瘤細(xì)胞負(fù)載之前，將燒瓶培養(yǎng)6天。
[0099]IFN-Y自體腫瘤細(xì)胞系生成和藥物的制備
[0100]根據(jù)Cornforth 等(Cornforth 等(2011)Cancer Immunol.1mmunother.60: 123-131 ;DiI Iman 等(1993)J.1mmunother.Emphasis TumorTmmunol.14:65-69 ;Dillman 等(2000) Cancer Biother.Radiopharm.15:161-168),生成純的腫瘤細(xì)胞。然后用1000U/mL的干擾素-Y (InterMune, Brisbane, CA)培育腫瘤細(xì)胞72小時(shí)，用來自銫源的 IOOGy 輻照并凍存(Selvan 等(2007) Int.J.Cancerl22:1374-1383 ；Selvan等(2010)Melanoma Res.20:280-292)。從凍存中恢復(fù)經(jīng)IFN-Y處理且輻照的腫瘤細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，然后加入培養(yǎng)的樹突細(xì)胞(DCs)，然后培育約24小時(shí)。通過用橡皮淀帚輕輕刮取來收獲負(fù)載了抗原的DCs，并凍存。獲得經(jīng)IFN-Y處理或未處理的腫瘤細(xì)胞和負(fù)載的DCs的多個(gè)等分部分,用于流式細(xì)胞評(píng)價(jià)和臺(tái)盼藍(lán)拒染(trypan-blueexclusion)測(cè)定。
[0101]皮膚黑色素瘤的分期(Staging)
[0102]本發(fā)明的藥物或試劑可以施用于黑色素瘤患者，其中黑色素瘤診斷為I期、II期、III 期或 IV 期(Mohr 等(2009) Ann.0ncology (Suppl.6) vil4-vi21)0 例如 I 期指的是具有原發(fā)(初始)黑色素瘤而無區(qū)域或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)的患者。II期包括無淋巴結(jié)疾病或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)的患者，其中患者的進(jìn)一步特征在于:例如損傷大于Imm且小于或等于2mm厚的覆上皮(overlying epithelium)潰瘍,或者損傷大于2mm且小于或等于4mm厚的上皮潰瘍。III期黑色素瘤包括病理記錄波及區(qū)域淋巴結(jié)或在途(in-transit)轉(zhuǎn)移或衛(wèi)星(satellite)轉(zhuǎn)移的損傷，其中患者可具有例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)或更多個(gè)受感染的淋巴結(jié)。IV期黑色素瘤定義為存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中轉(zhuǎn)移僅位于遠(yuǎn)處皮膚、皮下組織或淋巴結(jié)，其中轉(zhuǎn)移涉及肺轉(zhuǎn)移，或者其中轉(zhuǎn)移涉及所有其他內(nèi)臟部位。
[0103]本發(fā)明包含預(yù)防性施用的方法，也就是用于尚未或從未診斷為患有黑色素瘤的受試者。本發(fā)明包含施用的方法，其中受試者此前已被診斷為黑色素瘤并且此前已得到成功治療以消除黑色素瘤(或者經(jīng)歷過自動(dòng)完全痊愈)，并且其中在根除后預(yù)防性施用。
[0104]腫瘤抗原
[0105]本發(fā)明的黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)Mage、Mart-1, Mel-5, HMB45、SlOO或酪氨酸酶中的一種或多種(Dillman 等(2011) Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals26:407-415)，但并不限于此。在一個(gè)方面，腫瘤抗原的檢測(cè)使用未暴露于IFN-Y的細(xì)胞，而在另一方面，腫瘤抗原的檢測(cè)在經(jīng)IFN-gamma處理的細(xì)胞上進(jìn)行(參見例如Cornforth等(2011)CancerBiotherapy Radiopharmaceuticals26:345-351 )。本發(fā)明包含表達(dá)一種或多種黑色素瘤抗原或者包含一種或多種分離的黑色素瘤抗原的組合物的黑色素瘤細(xì)胞，如Dubensky的US2007/0207171所公開的，其通過引用以其全文并入本文。
[0106]測(cè)定細(xì)胞凋亡
[0107]可以使用多種試劑來檢測(cè)或測(cè)定細(xì)胞凋亡，例如熒光染料標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白，通過用染料諸如碘化丙烷和7-氨基放線菌素D (7-AAD)染色，通過測(cè)定線粒體內(nèi)膜勢(shì)的損失，通過測(cè)定半胱天冬酶的活化或裂解。參見例如George等(2004)Cytometry PartA.59A:237-2450細(xì)胞凋亡的早期活動(dòng)是磷脂酰絲氨酸暴露于質(zhì)膜的外表面，其可以通過熒光染料標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白檢測(cè)。可用的方法能夠區(qū)分活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。本發(fā)明使用通過7-ADD測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞、通過膜聯(lián)蛋白V測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞、在IFN-Y處理后經(jīng)凋亡性測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞(Dillman 等(2011)Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals26:407-415)、或者通過一種或多種生物標(biāo)志物Bcl-2、半胱天冬酶-3、P53或存活素測(cè)定為非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞(Karam等(2007)Lancet Oncol.8:128-136)。本發(fā)明的藥物組合物、試劑和相關(guān)方法排除經(jīng)IFN-Y處理的凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，其中根據(jù)例如Herlyn等的美國(guó)專利N0.7544465、Thorpe等的美國(guó)專利7714109來測(cè)定細(xì)胞凋亡，其通過引用并入本文。
[0108]測(cè)定自噬
[0109]自噬是用于降解許多蛋白質(zhì)和某些細(xì)胞器的自然存在的過程。自噬倡導(dǎo)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器周轉(zhuǎn)、饑餓應(yīng)答、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡等。與微管相關(guān)的蛋白輕鏈3 (LC3)監(jiān)測(cè)自噬。在一種方法中，可以通過測(cè)量LC3的轉(zhuǎn)化來檢測(cè)自噬，其涉及LC3-1或LC3-1I的轉(zhuǎn)化。LC3-1I的量與自噬體的數(shù)目相關(guān)。具體來說，LC3是細(xì)胞溶質(zhì)的且可溶的，而LC3-1I存在于膜上。LC3-1I具有更大的分子量，因?yàn)槠渑c脂質(zhì)結(jié)合(conjugated)?？梢詼y(cè)量LC3加工，例如通過western印跡,而自曬、自曬小泡和自曬體可以通過顯微鏡測(cè)定。自曬可以是定量的，例如通過檢測(cè)加工的LC3-11、通過早期與晚期自噬性區(qū)室(compartment)之間的比例、或者通過自卩遼體積。參見(Mizushima 和 Yoshimori (2007) Autophagy3:542-546:634-641 ；Tanida等(2008)Methods Mol Biol.445:77-88 ；Eng.等(2010)Autophagy6:634-641)0 在一個(gè)方面，本發(fā)明使用自噬作為篩選工具，用于選擇合適的自噬性癌細(xì)胞，其中可以根據(jù)在一個(gè)或多個(gè)具體階段中自噬的出現(xiàn)來選擇細(xì)胞。這些自噬階段包括:(1)通過自噬體隔離胞質(zhì)區(qū)室，(2)使用溶酶體融合自噬體，以形成自溶酶體，并且(3)通過溶酶體內(nèi)的蛋白酶降解自溶酶體內(nèi)容物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括主要顯示第一階段、主要顯示第二階段、主要顯示第三階段、主要顯示所有三個(gè)階段的細(xì)胞。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明包含顯示第一階段、第二階段、第三階段、第一和第二、第二和第三階段或者顯示所有三個(gè)階段的細(xì)胞。
[0110]干擾素-Y (IFN-Y )信號(hào)傳導(dǎo)
[0111]IFN-Y (II型干擾素)信號(hào)傳導(dǎo)依賴于一些基因的表達(dá)，諸如IFN-Y受體、STATl、STAT2,STATl 同源二聚體、STAT1/STAT2 異源二聚體、IRF-UGAS 和 IRF-E。研究表示 IFN-Y信號(hào)傳導(dǎo)依賴于IFN-Y受體(IFNGR1鏈；IFNGR2鏈)。細(xì)胞表面上IFNGR的低表達(dá)能夠阻斷IFN- Y 信號(hào)傳導(dǎo)的某些方面(Schroder 等(2004) J.Leukocyte boil.75:163-189)。在一個(gè)方面，本發(fā)明排除使用表現(xiàn)出IFNGR的低表面表達(dá)的癌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明篩選表達(dá)STATl同源二聚體的那些癌細(xì)胞，使用這些細(xì)胞，并且基本上排除那些不表達(dá)STATl同源二聚體的細(xì)胞。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明考慮篩選那些具有STATl磷酸化(絲氨酸-727)的細(xì)胞。本發(fā)明還考慮排除來自具有STATl基因中功能突變?nèi)笔У幕颊叩陌┘?xì)胞(參見例如Dupuis 等(2001)Science293:300-303 ;Schroder 等(2004)J.Leukoc.Biol.75:163-189)。下面關(guān)注IRF基團(tuán)家族。RF-l、IRF-2和IRF-9均參與IFN-Y信號(hào)傳導(dǎo)。本發(fā)明涵蓋了使用表達(dá)這些IRF基因族基因中的一種或多種基因的癌細(xì)胞，或者排除未表達(dá)這些基因中一種或多種的癌細(xì)胞。
[0112]IFN-Y應(yīng)答基因
[0113]在一些示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明包含生物材料、組合物、試劑和方法，其要求使用對(duì)IFN-Y應(yīng)答的黑色素瘤細(xì)胞或腫瘤前期的黑色素瘤細(xì)胞。可以通過一種或多種IFN-Y應(yīng)答基團(tuán)的表達(dá)測(cè)定，來確認(rèn)、區(qū)分和選擇黑色素瘤細(xì)胞。已經(jīng)確認(rèn)了許多 IFN- Y 應(yīng)答基團(tuán)(參見例如 Halonen 等(2006) J.Neuroimmunol.175:19-30 ；MacMicking(2004) 11:601-609 ;Boehm等(1997) 15:749-795)。所述測(cè)定可以涉及從患者中去除一種或多種黑色素瘤細(xì)胞、在添加的IFN-Y存在和不存在情況下培養(yǎng)細(xì)胞、并確定對(duì)IFN-y的應(yīng)答。在該測(cè)定中，IFN-Y誘導(dǎo)的基因表達(dá)可以通過對(duì)以下敏感的試驗(yàn)來檢測(cè)，上述試驗(yàn)對(duì)以下敏感:轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到IFN-Y誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子、IFN-Y誘導(dǎo)的基因的mRNA的表達(dá)、表達(dá)的多肽等等。IFN-Y應(yīng)答基因可以包括例如，用于免疫應(yīng)答、編碼轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的基因、細(xì)胞凋亡基因、用于細(xì)胞生長(zhǎng)或維持的基因、用于脂質(zhì)代謝的基因、介導(dǎo)胞吞或胞吐的基因、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)基因、糖代謝基因、細(xì)胞粘附基因以及無確定功能(established function)的基因。
[0114]在一個(gè)方面， 本發(fā)明排除使用IFN-Y處理時(shí)具有以下特點(diǎn)的黑色素瘤細(xì)胞:表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)降低，在MHC II類的表達(dá)方面表現(xiàn)出無可檢測(cè)到的變化，表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)增加10%或更少，表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)增加15%或更少，表現(xiàn)出MHC II類表達(dá)增加20%或更少、25%或更少、30%或更少、40%或更少、50%或更少等等。在一個(gè)方面，百分?jǐn)?shù)的值指的是存在于來自給定受試者或患者的活檢或部分活檢中的黑色素瘤細(xì)胞群落的平均表達(dá)值。
[0115]用于篩選IFN- Y應(yīng)答癌細(xì)胞的IFN- Y誘導(dǎo)基因的非限制性列表
[0116]ab000677, JAB/S0CS1 ；m63961, IFN- Y 誘導(dǎo)蛋白(mag-1) ；m35590,巨噬細(xì)胞炎性蛋白 l-β ；ml9681, MCP-1 (JE) ；y07711, zyxin ；M34815, IFN- y 誘導(dǎo)的單核因子(MIG)；m33266,干擾素誘導(dǎo)蛋白IO(IP-1O) ；U44731,嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白；U88328，細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子 _3 (Sup.0f cytokine signalling-3, S0CS-3) ;M21065,干擾素調(diào)節(jié)因子I ;M63630，GTP 結(jié)合蛋白(IRG-47) ;U19119, G-蛋白樣 LRG-47 ;L27990，Ro 蛋白；M31419, 204干擾素活化蛋白；af022371，干擾素誘導(dǎo)蛋白203 ；U28404, MIP-1 α受體；U43085，糖皮質(zhì)激素減弱反應(yīng)基因 39 (Glucocorticoid-attenuated response39) ；x56123, Talin ；m31419, 204 干擾素活化蛋白；U53219, GTPase IGTP ； 138444, T 細(xì)胞特異蛋白；M31418, 202干擾素活化蛋白；d38417,芳香烴(Arylhydrocarbon)受體；m26071,組織因子(mtf)；D13759, Cot 原癌基因；M18194,纖維連接蛋白；u59463, ICH-3 ；M13945, pim-1 原癌基因；L20450, DNA 結(jié)合蛋白(參見 Gil 等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci98:6680-6685)。本發(fā)明包含 IFN-Y 誘導(dǎo)基因 CIITA (參見例如 Chan 等(2010) J.Leukocyte Biol.88:303-311 ；Kwon等(2007)Mol.1mmunol.44:2841-2849)的用途。
[0117]本發(fā)明包含對(duì)如下IFN-Y誘導(dǎo)基因中一種或多種的表達(dá)的測(cè)量，作為用于確認(rèn)施用藥物的患者的資格或選擇施用藥物的患者的篩選過程。這些基因包括:(基因I)FCGR1A、(基因 2)IL6R、(基因 3)CXCL9、(基因 4) CLCSF14,(基因 5) UBD,(基因 6) C/EBPalpha 和(基因 7)MHC2TA(CIITA)(參見 Waddell 等(2010)PLoS 0NE5:e9753)。還包括這些基因的特定簇在確認(rèn)資格過程中的用途，例如基因I和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、I和3、I和4、I和5、I和6、I和7、2和4、2和5、2和6、2和7、3和5、3和6、3和7、4和6、4和7、5和7以及這些基因的組合，例如1、2、3 ;或3、4、5 ;或4、5、6 ;或5、6、7 ;或1、
3、4 ;或 1、3、5，或 1、3、6，或 1、3、7 ;或 1、2、4 ;或 1、2、5 ;或 1、2、6 ;或 1、2、7 等等。(這些基 因編號(hào)是任意的。)
[0118]本發(fā)明排除的是具有以下特征的黑色素瘤細(xì)胞群，其中小于90%是自噬性的、小于80%是自噬性、小于70%是自噬性、小于60%是自噬性、小于50%是自噬性、小于40%是自噬性等等。
[0119]本發(fā)明排除的是具有以下特征的黑色素瘤細(xì)胞群，其中小于90%是非凋亡性的、小于80%是非凋亡性的、小于70%是非凋亡性的、小于60%是非凋亡性的、小于50%是非凋亡性的、小于40%是非凋亡性的等等。
[0120]本發(fā)明排除的是具有以下特征的黑色素瘤細(xì)胞群，其中小于90%是非粘附性的、小于80%是非粘附性的、小于70%是非粘附性的、小于60%是非粘附性的、小于50%是非粘附性的、小于40%是非粘附性的等等。
[0121]測(cè)量MHC II類的表達(dá)
[0122]使用對(duì)MHC II類基因產(chǎn)物特異的抗體或核酸探針，可以測(cè)量MHC II類的表達(dá)。這些 MHC II 類產(chǎn)物包括 HLA-DPAl、HLA-DPBU HLA-DQAl、HLA-DQBU HLA-DRA, HLA-DRBl 以及HLA-DM 和 HLA-D0 (參見例如 Apostolopoulos.等(2008)Human Vaccines4:400_409)。
[0123]例如，本發(fā)明包含試劑、治療方法和診斷方法，其要求黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)STATl和STAT2，從而具有活性STATl信號(hào)傳導(dǎo)通路、具有活性STAT2信號(hào)傳導(dǎo)通路或者具有活性STATl和STAT2信號(hào)傳導(dǎo)通路。
[0124]本發(fā)明提供藥物組合物或藥物試劑、相關(guān)施用方法以及治療方法，其導(dǎo)致以下生存數(shù)據(jù):危害比(hazard ratio, HR)小于1.0,HR小于0.9,HR小于0.8,HR小于0.7,HR小于0.6,HR小于0.5,HR小于0.4,HR小于0.3等。本發(fā)明結(jié)果可以為總生存數(shù)據(jù)、無進(jìn)展生存數(shù)據(jù)、疾病進(jìn)展時(shí)間數(shù)據(jù)等。本發(fā)明還提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6月PFS。此外，本發(fā)明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6月總生存率/期。此外，本發(fā)明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的I年(或2年)PFS。此外，本發(fā)明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的I年(或2年)總生存率(參見例如U.S.Dept, of Health and Human Services.Food and Drug Administration.Guidance for Industry.Clinical trial endpoints for the approval of cancer drugsand biologies(April2005))0
[0125]IFN-y的使用和自噬的誘導(dǎo)
[0126]如通過增加主要組織相容性II類復(fù)合體測(cè)定，可以在IFN- Y處理后自噬的誘導(dǎo)，來確定對(duì)系統(tǒng)性(Systemic)IFN-Y處理的應(yīng)答。如果在暴露于培養(yǎng)基中IFN-Y后，活檢的黑色素瘤腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬而不是細(xì)胞凋亡，則這表明這些患者將有利地對(duì)系統(tǒng)性IFN- Y處理應(yīng)答。此外，如果從活檢中確定了成功細(xì)胞系，患者也會(huì)從細(xì)胞治療產(chǎn)品受益，該細(xì)胞治療產(chǎn)品由來自自噬性但非凋亡性粘附(adherent)群落的經(jīng)IFN-Y處理的純化的腫瘤細(xì)胞系制得。
[0127]本發(fā)明包含分離和表征從自噬性、非凋亡性細(xì)胞所分離的主要組織相容性復(fù)合體,上述細(xì)胞是從用干擾素-Y處理的腫瘤細(xì)胞系收集的。主要組織相容性復(fù)合體包含對(duì)CD4+T細(xì)胞特異的抗原，并且已經(jīng)與抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答相關(guān)。復(fù)合體代表不會(huì)存在于非自噬性細(xì)胞中的大型抗原庫(repertoire)，這是因?yàn)樵谧允尚约?xì)胞中誘導(dǎo)的溶酶體介導(dǎo)的抗原加工活動(dòng)。
[0128]由經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞系所產(chǎn)生的非凋亡性的、自噬性腫瘤細(xì)胞可以與樹突細(xì)胞整合，以增強(qiáng)抗原呈遞，這是因?yàn)樵谧允尚阅[瘤細(xì)胞的表面上高水平的主要組織相容性復(fù)合體。該過程會(huì)得到由兩種細(xì)胞類型融合而產(chǎn)生的新的細(xì)胞產(chǎn)物。
[0129]對(duì)IFN-Y的應(yīng)答時(shí)誘導(dǎo)自噬的過程可以以不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的方式誘導(dǎo)。通過用半胱天冬酶抑制劑和干擾素-Y合并處理腫瘤細(xì)胞，可以阻斷細(xì)胞死亡(并最終阻斷耐受性凋亡細(xì)胞的形成)的過程，而不抑制自噬的誘導(dǎo)或主要組織相容性II類復(fù)合體的增加。
[0130]消除凋亡細(xì)胞同 時(shí)保留有活力的自噬性細(xì)胞的程序
[0131]黑色素瘤的研究表明在臨床試驗(yàn)中凋亡細(xì)胞的存在與差生存率之間具有相關(guān)性(Cornforth等(2011)Cancer Immunol.1mmunother.60:123-131 ;Dillman等(2011)CancerBiother.Radiopharmaceuticals26:407-415)。下面研究調(diào)查了在體外 IFN-Y 處理黑色素瘤腫瘤細(xì)胞后自噬的誘導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和MHC II類分子。
[0132]本項(xiàng)研究的方法如下。在測(cè)定自噬、細(xì)胞凋亡和MHC II類表達(dá)之前，用1000IU/mL的IFN-Y培育自體黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系和模型黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系72小時(shí)。通過采用對(duì)LC3II的抗體的免疫印跡并通過采用Enzo’ s CytolD?自噬檢測(cè)試劑盒的流式細(xì)胞法，來
檢測(cè)自噬。通過使用7-AAD和Annexin-V染色和對(duì)MHC II類的抗體的流式細(xì)胞法，分別測(cè)定細(xì)胞凋亡和MHC II類誘導(dǎo)。
[0133]本研究的結(jié)果證明IFN-Y既誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系中自噬性細(xì)胞群落又誘導(dǎo)凋亡性的細(xì)胞群落。凋亡性的群落主要發(fā)現(xiàn)于非粘附群落中，而自噬性細(xì)胞保持粘附到燒瓶上。用抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻斷自噬會(huì)抑制對(duì)IFN-Y應(yīng)答時(shí)MHC II類陽性細(xì)胞的誘導(dǎo)(39.4%IFN- Y vs.10.0%IFN- y +3_MA)。用泛半胱天冬酶抑制劑Z-VAD抑制半胱天冬酶活性來在經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞中防止細(xì)胞凋亡但不干擾自噬(2.75±0.15IFN-Y vs.3.04±0.27IFN-Y+Z-VAD，倍數(shù)變化)。綜上所述，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與低水平的自噬和MHC II類誘導(dǎo)有關(guān)。本發(fā)明提供消除凋亡性的細(xì)胞同時(shí)保護(hù)有活力的自噬性細(xì)胞的方法或程序，IFN- Y處理后能夠增強(qiáng)這類基于細(xì)胞的免疫治療的有效性。
[0134]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IFN-Y與對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的抑制有關(guān)(參見例如Hallermalm(2008)J.1mmunol.180:3766-3774 ；Romieu-Mourez(2010)Cancer Res.70:7742-7747 ；Lee (2005)Clinical Cancer Res.11:107-112)。
[0135]腫瘤可以是或多或少分化的細(xì)胞的異質(zhì)性群落。腫瘤的黑色素瘤細(xì)胞的IFN-Y處理可以作用于一些較分化的細(xì)胞，這些細(xì)胞更容易細(xì)胞凋亡。通過從抗原源消除這些細(xì)胞，所得到的結(jié)果是接種后對(duì)腫瘤實(shí)體(bulk)的一些影響喪失，這可從腫瘤尺寸的消退變慢或者無明顯消退看出。研究表明凋亡性細(xì)胞不會(huì)活化樹突細(xì)胞(Sauter (2000) J.Exp.Med.191:423-434)。
[0136]IFN-Y可起到使單核細(xì)胞分化從DCs偏離到巨噬細(xì)胞的作用。制劑中IFN-Y的量可通過使表型偏離到較少特化的巨噬細(xì)胞，來影響DCs的不完全分化。
[0137]IFN-Y可用于增強(qiáng)MHC II類分子，并且能對(duì)T細(xì)胞直接呈遞。然而，Ii protein(鈣衛(wèi)蛋白，Calprotectin)與MHC II類分子的聯(lián)合誘導(dǎo)防止內(nèi)源性腫瘤抗原從MHC II類分子呈遞。
[0138]第一研究的材料和方法
[0139]自體樹突細(xì)胞生成
[0140]通過如前所述的塑料粘附法(Choi等(1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ;Luft等(1998)Exp.Hematol.26:489-500)，生成樹突細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將自體采血術(shù)產(chǎn)物進(jìn)行ficoll-hypaque(GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)密度梯度分離。將所得到的外周血單核細(xì)胞置于無抗生素的AIM-V培養(yǎng)基中(Invitrogen, Grand Island, NY),上述培養(yǎng)基補(bǔ)充有在以15X106cells/mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning-Costar，Corning, NY)中各 1000IU/mL 的 IL-4(Ce llGenix, Freisberg, Germany)和 GM-CSF(Beriex, Seattle,WA)(DC培養(yǎng)基)。培育一小時(shí)后，丟棄未粘附群落，并將新鮮DC培養(yǎng)基加入到燒瓶中。第二天早晨，丟棄未粘附細(xì)胞，用室溫PBS將燒瓶洗滌一次，并加入新鮮DC培養(yǎng)基。然后將燒瓶培養(yǎng)6天，在這段時(shí)間進(jìn)行流式細(xì)胞評(píng)估來測(cè)定該方法(負(fù)載DC之前)所產(chǎn)生的DC的百分?jǐn)?shù)和表型。
[0141]自體腫瘤細(xì)胞系生成
[0142]將先前報(bào)道的生成和表征的純腫瘤細(xì)胞擴(kuò)展到2億個(gè)細(xì)胞，然后在15%FBS/ECS 中在 RPMI (完全培養(yǎng)基)中用 1000IU/mL 的 IFN-Y (InterMune, Brisbane, CA)培育72 小時(shí)，用來自銫源的 IOOGy 輻照并凍存(Choi (1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ；Luft(1998)Exp.Hematol.26:489-500 ；Dillman(1993)J.1mmunother.Emphasis TumorImmunol.14:65-69)，如前所述。從凍存中恢復(fù)經(jīng)IFN-y處理且輻照的腫瘤細(xì)胞，用PBS洗滌3次，然后加入體外培養(yǎng)的DC，并培育約24小時(shí)。通過用橡皮淀帚輕輕刮取來收獲負(fù)載了抗原的DC，并以相等的量在9-11個(gè)等份中凍存。獲得細(xì)胞的等分部分，用于流式細(xì)胞評(píng)價(jià)，其代表負(fù)載后的DC細(xì)胞。
[0143]流式細(xì)胞法
[0144]使用對(duì)從BD Pharmingen San Diego, CA獲得的表面標(biāo)志物的單克隆抗體:結(jié)合PerCp的MHC II類抗體、結(jié)合APC的⑶IIc抗體，⑶80抗體、⑶83抗體、結(jié)合PE的⑶86抗體，進(jìn)行樹突細(xì)胞群落的表型表征。使用同型對(duì)照來測(cè)定百分陽性細(xì)胞。使用來自BDPharmingen的對(duì)結(jié)合FITC的MHC I和II類的抗體、Annexin-V-PE和7-氨基放線菌素D(7-AAD)，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的流式細(xì)胞法。在每個(gè)批次之前，使用CaliBRITE流式細(xì)胞校準(zhǔn)(BDPharmingen)，并且在流式細(xì)胞數(shù)據(jù)的整個(gè)收集過程中使用相同的儀器設(shè)定。[0145]免疫印跡測(cè)定
[0146]用 Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific, Rockford, IL)加蛋白酶抑制劑混合物(Roche, Indianapolis, IN)以10，000細(xì)胞/uL在冰上，制備細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞裂解物。將大約25uLs/道的細(xì)胞裂解物在12.5%Tris-甘氨酸凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用針對(duì)如下的抗體進(jìn)行探測(cè):鈣網(wǎng)蛋白(MBL，Woburn, MA)、Hsp-60、Hsp-70、Hsp-90 (R&D Systems, Minneapolis, MN)、HMBG-1 (Cell Signaling, Danvers, MA)、ICAM-1 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)、Mel_4、Mart_l(Signet, Emeryville, CA)、酪氨酸酶(Upstate, Lake Placid, NY)和 GADPH(Calbiochem, Darmstadt, Germany)。
[0147]免疫組織化學(xué)
[0148]使用免疫細(xì)胞化學(xué)程序，測(cè)定黑色素瘤系對(duì)一組(panel)抗原的表達(dá)。在存在或不存在 1000IU/mL IFN- Y 的情況下，在 8 室培養(yǎng)載玻片(Thermo Fisher, Rochester, NY)中培養(yǎng)細(xì)胞。72小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，并固定在冷丙酮中。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，用適當(dāng)?shù)膶?duì)所列抗原的一抗(primary antibodies)培育細(xì)胞。使用生物素化抗鼠(anitmouse)或兔免疫球蛋白、結(jié)合超敏感酶的鏈霉親和素標(biāo)記(Super Sensitiveenzyme-conjugated streptavidin Iabeling)和辣根過氧化物酶色原體(chromogen)以及底物試劑盒(Biogenex, San Ramon, CA),進(jìn)行免疫組織化學(xué)。采用同型匹配對(duì)照抗體,研究如下抗人多克隆或單克隆抗體的活性:S_100和HMB-45 (Biogenex, San Ramon, CA)、Mel_2、Mel-5、art_l (Signet, Dedham, MA)、酪氨酸酶和 Mage-1 (Thermo Scientific, Fremont, CA)、Me I an-A > HLA-1 類和 HLA-1I 類(Dako, Denmark)。
[0149]統(tǒng)計(jì)分析
[0150]在雙尾檢驗(yàn)的學(xué)生t檢驗(yàn)中，兩樣本的方差相等。通過？值< 0.05確定顯著差異。
[0151]第一研究的結(jié)果
[0152]在完全培養(yǎng)基中，對(duì)用IFN-Y培育72小時(shí)應(yīng)答時(shí)，在自體黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系中差異地引起細(xì)胞死亡。在經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞上或者未經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞上,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染料測(cè)定，其表明在經(jīng)IFN-Y處理的細(xì)胞中向更低活力的顯著趨勢(shì)(89.1±6.8%vs.84.9±9.3%, p=0.014, N=47)。通過流式細(xì)胞法分析四個(gè)自體黑色素瘤細(xì)胞系的樣本的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(圖1A)，其表明黑色素瘤細(xì)胞對(duì)IFN-Y誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡差異地敏感，其中一些細(xì)胞顯示更遲的細(xì)胞凋亡或“死亡”群落(7-AAD+/AnneXin-V+)，而其他細(xì)胞顯示出更早的細(xì)胞凋亡或“即將死亡”群落(7-AAD-/AnneXin-V+)的信號(hào)。IFN-Y處理后所得到的凋亡性細(xì)胞的存在與無進(jìn)展生存期和總生存期中顯著降低有關(guān)(Comforth (2010) CancerImmunol.1mmunother.Resistance to the proapoptotic effects of interferon-gammaon melanoma cells used in patient-specific dendritic cell immunotherapy isassociated with improved overall survival)。對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test)表明IFN-y處理黑色素瘤腫瘤細(xì)胞后較低的活力與所研究患者中總生存期明顯相關(guān)。
[0153]將在存在或不存在IFN-Y的情況下發(fā)育的細(xì)胞裂解物進(jìn)行各種分子的免疫印跡，這些分子可能是免疫的重要介導(dǎo)物(圖1B)。在用IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞的設(shè)定中，熱休克蛋白似乎被差異性地調(diào)控，但基本上仍存在于細(xì)胞制劑中，尤其是在hsp-70的情況下。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白、鈣網(wǎng)蛋白和高遷移率族蛋白I(HMGB-1)似乎在某些情況下IFN-Y處理后被正調(diào)節(jié)(圖1B)。相反，普通黑色素瘤抗原(mel-4、Mart-l和酪氨酸酶)通常似乎被IFN-y負(fù)調(diào)節(jié)，而ICAM-1被顯著正調(diào)節(jié)(圖1C)，ICAM-1是一種與對(duì)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感度有關(guān)的淋巴細(xì)胞黏附分子(Hamai (2008) Cancer Res.68:9854-9864)。事實(shí)上發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性更敏感。此外，一組黑色素瘤相關(guān)抗原的免疫組織化學(xué)表明，IFN- Y導(dǎo)致在許多考查的抗原中抗原表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)(表1)。
[0154]IFN-Y的使用導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體I類和II類的正調(diào)節(jié)(Bohn(1998)J.1mmunol.161:897-908)。如圖1D中所示，用IFN-y處理自體黑色素瘤細(xì)胞導(dǎo)致幾乎普遍的且顯著的MHC I類正調(diào)節(jié)(ρ=2.8X 10_8),中值倍數(shù)誘導(dǎo)(median fold induction)為
2.91 + 1.13(95%C.1.)。此外，MHC II類的平均熒光強(qiáng)度也顯著較高，但稍遜色(p=0.039)，中值誘導(dǎo)為4.23±2.66 (95%C.1.)。在自體黑色素瘤細(xì)胞表面上MHC II類分子的水平通常低于MHC I類分子，但在70%的情況下，對(duì)IFN- Y處理應(yīng)答時(shí)對(duì)于MHC II類分子來說誘導(dǎo)高2倍，這是因?yàn)镸HC II類表達(dá)的低初始水平。在抗原負(fù)載到樹突細(xì)胞上時(shí)，腫瘤細(xì)胞上這些分子的存在可以提供將MHC復(fù)合體“易裝”(“cross dressing”)到抗原呈遞細(xì)胞上的機(jī)會(huì)(Dolan (2006) J.1mmunol.277:6018-6024，Dolan (2006) J.1mmunol.176:1447-1455)。
[0155]用IFN- y培育一組四個(gè)代表性自體黑色素瘤細(xì)胞系，并等量負(fù)載到樹突細(xì)胞上，然后通過流式細(xì)胞法測(cè)定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II類的表達(dá)。結(jié)果表明，在負(fù)載經(jīng)IFN-Y處理的黑色素瘤細(xì)胞后，觀察到表達(dá)⑶83的樹突細(xì)胞的陽性群落百分?jǐn)?shù)的小幅但明顯增加(圖2)。此外，在⑶86散點(diǎn)圖(左上象限)中標(biāo)出更多的未經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞，結(jié)果是⑶86陽性群落百分?jǐn)?shù)明顯減少，表明未經(jīng)IFN-Y處理的腫瘤細(xì)胞仍然存在。此效果最可能地是由于IFN-Y誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因?yàn)榈蛲鲂约?xì)胞更可能被之前報(bào)告的樹突細(xì)胞吞噬。
[0156]如圖3中所示，負(fù)載前DC的樣本表明其表達(dá)CD80(39.0 + 16.2%)、CD83 (7.1 ±6.9%)、CD86(73.6±19.5%)并且是 MHC II 類陽性的，并且具有 96.2±5.0% 活力。負(fù)載的DC具有顯著更高百分?jǐn)?shù)的⑶83 (9.4±7.1%, p=0.019)和顯著更高的平均熒光強(qiáng)度(172.9±79.0, p=0.0009)，表明用經(jīng)輻照的、IFN- Y處理的腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC在一些樹突細(xì)胞中誘導(dǎo)成熟(圖3B)。
[0157]第一研究討論
[0158]在抗腫瘤免疫的上下文中，抗原負(fù)載、成熟和施用的方案以及在基于樹突細(xì)胞(DC)的免疫治療的指導(dǎo)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這種類型的治療包含經(jīng)純化的自體腫瘤細(xì)胞作用抗原的來源的用途，并且包含與腫瘤相關(guān)抗原的患者特異庫(repertoire) (Selvan(2010)Melanoma Res.20:280-292 ；DiIIman(2007)CancerBiother.Radiopharm.22:309-321)。一些臨床試驗(yàn)使用未純化的自體實(shí)體(bulk)腫瘤。這種抗原來源可能具有已污染的成纖維細(xì)胞和壞死組織(0’ROUrke(2007)Melanoma Res.17:316-322)。與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)的抗原可以存在于經(jīng)純化的細(xì)胞系中(Dillman(2006)New Engl.J.Med.355:1179-1181)。IFN-Y 處理提高 MHC II 類分子的表達(dá)。MHC II類分子對(duì)于對(duì)基于樹突細(xì)胞的治療的應(yīng)答非常重要。存在于吞噬物質(zhì)中的分子(諸如鈣網(wǎng)蛋白、HMGB- 1和熱休克蛋白)可對(duì)成熟信號(hào)有貢獻(xiàn)，該貢獻(xiàn)可以是除細(xì)胞因子混合物貢獻(xiàn)之外的貢獻(xiàn)。本發(fā)明中DCs的制備表現(xiàn)出成熟的趨勢(shì)，其可與晚期凋亡性細(xì)胞的吞噬有關(guān)(Ip(2004)J.1mmunol.173:189-196)。已經(jīng)知曉凋亡性細(xì)胞的使用與樹突細(xì)胞的生成有關(guān)，與負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物或負(fù)載壞死細(xì)胞的樹突細(xì)胞相比，該樹突細(xì)胞在刺激淋巴細(xì)胞IFN-Y分泌方面更有效，表明負(fù)載了凋亡性細(xì)胞的樹突細(xì)胞在體內(nèi)更有效。對(duì)IFN- Y的促凋亡(proapoptotic)作用的耐性與更好的臨床結(jié)果有關(guān)(Cornforth (2010)Cancer Immunol.1mmunother.60:123-131 )0 成熟 DC 分泌的白細(xì)胞介素-12 (IL-12)可以導(dǎo)致細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL ;CD8+T細(xì)胞)穩(wěn)健的活性。活體外成熟是否導(dǎo)致持久的腫瘤免疫的問題已經(jīng)得到解決。也已經(jīng)表明，通過未成熟DC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)(抑制抗原特異性CTLs)發(fā)生在使用細(xì)胞因子成熟的DC時(shí)。本文調(diào)查導(dǎo)致成熟的信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)的順序的重新評(píng)估，以改善DC成熟方案。因此，在本研究中在不需要體外細(xì)胞因子成熟的情況下經(jīng)輻照的腫瘤細(xì)胞作為抗原來源的用途可能是DC免疫治療的更優(yōu)選的方法，因?yàn)楸疚闹械淖C據(jù)表明DC已經(jīng)開始成熟過程。注射后，這些“正在成熟”("maturing")的DCs可以通過分泌趨化因子，來完成成熟過程，該趨化因子會(huì)吸引表達(dá)許可(licensing)、抗原特異性⑶40L的⑶4+T細(xì)胞。已經(jīng)證明，諸如樹突細(xì)胞在對(duì)佐劑GM-CSF應(yīng)答時(shí)所產(chǎn)生的CCL17/TARC的血清趨化因子與更好的無進(jìn)展生存率有關(guān)。在某些情況下，樹突細(xì)胞活化淋巴細(xì)胞可能需要諸如⑶80和⑶86的輔助刺激分子的表達(dá)。作為成熟的標(biāo)志物，⑶83表達(dá)在成熟樹突細(xì)胞上，并且可對(duì)應(yīng)于能夠誘導(dǎo)更有效免疫應(yīng)答的樹突細(xì)胞(Prazma(2008) Immunol.Lett.115:1-8)。這表示在藥物組合物中所有細(xì)胞中的一部分。在任何藥物團(tuán)中，成熟DCs單獨(dú)的數(shù)目可以與更好的患者應(yīng)答有關(guān)或者可以與更好的患者應(yīng)答無關(guān)。
[0159]第一研究的表
[0160]表1:使用患者特異性細(xì)胞基于樹突細(xì)胞的治療中黑色素瘤細(xì)胞系中對(duì)干擾素-Y應(yīng)答時(shí)與普通腫瘤相關(guān)的抗原表達(dá)水平的變化。
【權(quán)利要求】
1.哺乳動(dòng)物樹突細(xì)胞群落，其包含: 黑色素瘤特異性肽，其來自從患有黑色素瘤的受試者采集的黑色素瘤細(xì)胞； 其中所述黑色素瘤特異性肽由樹突細(xì)胞從所述黑色素瘤細(xì)胞體外獲得； 其中所述黑色素瘤細(xì)胞未經(jīng)IFN-Y或IFN-Y模擬物體外處理； 其中超過60%的未經(jīng)IFN- Y或IFN- Y模擬物體外處理的所述黑色素瘤細(xì)胞是自噬性和非凋亡性的，并且 其中樹突細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞來自相同受試者。
2.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞群落，其中: 超過80%的未經(jīng)IFN- Y或IFN- Y模擬物體外處理的所述黑色素瘤細(xì)胞是自噬性和非凋亡性的。
3.用于如權(quán)利要求1所述受試者的疫苗，其包含如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞群落。
4.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞，其中基本上所有的未經(jīng)IFN-Y或IFN-Y模擬物處理的所述黑色素瘤細(xì)胞均不能細(xì)胞分裂。
5.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞，其中基本上所有的未經(jīng)IFN-Y或IFN-Y模擬物處理的所述黑色素瘤細(xì)胞受到輻照且不能細(xì)胞分裂。
6.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞，其中至少80%的未經(jīng)IFN-Y或IFN- Y模擬物處理的黑色素瘤細(xì)胞受到輻照且不能細(xì)胞分裂。
7.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞，其中至少80%的未經(jīng)IFN-Y或IFN- Y模擬物處理的黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)核酸交聯(lián)劑處理且不能細(xì)胞分裂。
8.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞，其包含一種或多種衍生自黑色素瘤特異性抗原的肽，所述黑色素瘤特異性抗原為 S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、Mel-5、MAGE-l、ART-l 或酪氨酸酶。
9.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞，其中所給定的受試者是人受試者。
10.如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞，其中所給定的受試者是非人的哺乳動(dòng)物。
11.黑色素瘤疫苗，其包含: 至少一種成熟樹突細(xì)胞，所述成熟樹突細(xì)胞來自患有黑色素瘤的受試者； 其中已經(jīng)將所述至少一種成熟樹突細(xì)胞與來自相同受試者的至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞接觸； 其中與所述至少一種成熟樹突細(xì)胞接觸的所述至少黑色素瘤腫瘤細(xì)胞是未分裂的、自噬性的和非凋亡性的。
12.刺激對(duì)黑色素瘤特異性抗原免疫應(yīng)答的方法，其包括給受試者施用免疫刺激量的如權(quán)利要求1所述的樹突細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中被刺激的所述免疫應(yīng)答包括CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答中的一種或多種。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中可通過ELISPOT測(cè)定、通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定、通過四聚體測(cè)定、或者通過檢測(cè)抗原特異性抗體的產(chǎn)生來測(cè)定所述CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答或B細(xì)胞應(yīng)答。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括含有2年總生存率(OS)的生存時(shí)間，并且其中所述2年總生存率至少為60%。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述施用包括皮下注射所述疫苗。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述施用包括將每周給予的所述疫苗注射三個(gè)月，然后每月給予的所述疫苗注射五個(gè)月。
18.制備樹突細(xì)胞疫苗的方法，其包含來自相同受試者的黑色素瘤細(xì)胞和樹突細(xì)胞，所述方法包括: 用防止細(xì)胞分裂的試劑處理一種或多種黑色素瘤細(xì)胞； 不對(duì)所述一種或多種黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行干擾素-Y (IFN- Y )或IFN- Y模擬物體外處理； 選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞； 丟棄非自噬性和凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞；并且其中向一種或多種自體樹突細(xì)胞提供自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞，或者其中向一種或多種自體樹突細(xì)胞提供衍生自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞的肽。
19.組合物，其包含: 至少一種來自第一受試者的未經(jīng)干擾素-Y (IFN-y)處理的黑色素瘤細(xì)胞，和至少一種來自相同第一受試者的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，其中所述黑色素瘤細(xì)胞是: 自噬性的；且 非凋亡性的。
20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞能表達(dá)MHCII類。
21.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述APCs是樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述至少一種黑色素瘤細(xì)胞包含黑色素瘤特異性肽，并且其中所述黑色素瘤特異性肽基本不包含于所述APCs中，而且黑色素瘤特異性肽基本不被所述APCs加工。
23.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞包含黑色素瘤特異性肽，并且其中所述黑色素瘤特異性肽基本包含于所述APCs中，而且所述黑色素瘤特異性肽部分地或基本上在APCs中被加工。
24.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞被負(fù)載到APC中。
25.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述黑色素瘤細(xì)胞未被負(fù)載到APC中。
26.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中自噬是通過如下測(cè)試證明的，該測(cè)試測(cè)定微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3)。
27.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中使用7-氨基放線菌素D(7-AAD)試劑或Annexin試劑中至少一種來證明所述細(xì)胞是非凋亡性的。
28.在受試者中刺激免疫應(yīng)答的方法，所述受試者患有黑色素瘤且包含黑色素瘤細(xì)胞，其中所述受試者是與第一受試者相同的受試者，包括施用免疫有效量的如權(quán)利要求19所述的組合物。
29.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中至少90%的黑色素細(xì)胞未經(jīng)IFN-Y體外處理，并且小于10%的黑色素細(xì)胞經(jīng)IFN-Y體外處理。
30.制造如權(quán)利要求1的疫苗或權(quán)利要求19的組合物的方法，其包括將至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞與至少一種抗原呈遞細(xì)胞(APC)接觸，其中所述至少一種黑色素瘤腫瘤細(xì)胞來自第一人受試者，并且其中所述至少一種APC來自相同的第一人受試者。
31.制備樹突細(xì)胞疫苗的方法，其包括:用防止細(xì)胞分裂的試劑處理從第一受試者獲得的黑色素瘤細(xì)胞；其中不對(duì)所述黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行IFN-Y或IFN-Y模擬物體外處理；選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細(xì)胞；并且將所選擇的黑色素瘤細(xì)胞與來自相同第一受試者的自體樹突細(xì)胞接觸。
32.組合物，其包含通過如權(quán)利要求31所述的方法制得的樹突細(xì)胞疫苗。
33.刺激 對(duì)黑色素瘤特異性抗原免疫應(yīng)答的方法，其包括給患有黑色素瘤的受試者施用如權(quán)利要求31所述的組合物。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103917246SQ201280051799
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月20日
【發(fā)明者】安德魯·康福思, 羅伯特·迪爾曼 申請(qǐng)人:加利福尼亞干細(xì)胞公司