聚陰離子卡波姆和Env多肽的免疫原性復(fù)合物及其制造方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及在聚陰離子卡波姆和Env多肽之間形成免疫原性復(fù)合物。描述了在包含誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫的應(yīng)用中免疫原性復(fù)合物的使用。也描述了形成和制造免疫原性復(fù)合物的方法。本發(fā)明也涉及包含低粘度、聚陰離子卡波姆和Env多肽的免疫原性組合物。描述了在包含誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫的應(yīng)用中這樣的免疫原性組合物的使用。也描述了制造這樣的免疫原性組合物的方法。
【專利說明】聚陰離子卡波姆和Erw多肽的免疫原性復(fù)合物及其制造方 法和用途
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請根據(jù)35U.S.C. § 19(e)要求2011年11月14日提交的美國臨時專利申請 第61/559, 512號的優(yōu)先權(quán)。上述申請的公開內(nèi)容通過引用全文納入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本發(fā)明部分在由NIAID、NIH授予的HIVRAD基金5P01AI066287的美國政府資助 下完成。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 描述了包括聚陰離子卡波姆和Env多肽之間的復(fù)合物的免疫原性組合物，以及這 些免疫原性組合物的應(yīng)用和形成和制造這類復(fù)合物的方法。描述了包括低粘度，聚陰離子 卡波姆和Env多肽的免疫原性組合物，以及這些免疫原性組合物的應(yīng)用和形成和制造這類 組合物的方法。
[0006] 背景
[0007] 獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS)被認(rèn)為是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所面對的最大健康威脅之一。 迄今還沒有這種疾病的治愈方法。
[0008] 在1983-1984,三個小組獨(dú)立地鑒定了AIDS的疑似病原。參見，例如 Barre-Sinoussi等，（1983)Science220 :868-871;Montagnier等，在《人T細(xì)胞白血病 病毒》（HumanT-CellLeukemiaViruses)中（Gallo，Essex&Gross，編，1984);Vilmer 等，（1984)TheLancetl:753;Popovic等，（1984)Science224:497-500;Levy等，（1984) Science225 :840-842。這些分離株被不同地稱為淋巴結(jié)病相關(guān)病毒（LAV)、III型人T淋 巴細(xì)胞病毒（HTLV-III)或AIDS相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒（ARV)。所有的這些分離株都是同一種病 毒的毒株，并且隨后統(tǒng)稱為人免疫缺陷病毒（HIV)。隨著相關(guān)的AIDS致病病毒的分離，最 初被稱為HIV的毒株現(xiàn)在稱為HIV-I而相關(guān)的病毒被稱為HIV-2。參見例如，Guyader等， (1987)Nature326:662-669 ;Brun-Vezinet等，（1986)Science233 :343-346;Clavel等， (1986)Nature324:691-695。
[0009] 已經(jīng)產(chǎn)生了大量關(guān)于HIV病毒的信息；然而，至今還沒有鑒定出有效的疫苗。已經(jīng) 檢測了包括由HIV編碼的Env和Gag基因產(chǎn)物的幾個疫苗開發(fā)的靶標(biāo)。Gag基因產(chǎn)物包含， 但不限于Gag-聚合酶和Gag-蛋白酶。Env基因產(chǎn)物包含，但不限于單體gpl20多肽、寡聚 gp140多肽和gp160多肽。
[0010] 已經(jīng)描述了HIVEnv多肽在免疫原性組合物中的應(yīng)用。（參見例如，Hurwitz等 的美國專利號5, 846, 546,描述了包括各自表達(dá)不同HIVenv變體的至少4種不同重組 病毒的混合物的免疫原性組合物；和Vahlne等的美國專利號5, 840, 313,描述了相應(yīng)于 HIV-lgpl20蛋白的表位的肽）。另外，Sia等的美國專利號5, 876, 731描述了針對HIV的候 選疫苗，其包括直接與含有序列GPGR的HIV-I分離株的V3環(huán)蛋白的B細(xì)胞表位的氨基酸序 列相連的Gag的T細(xì)胞表位的氨基酸序列。然而，這些Env多肽基組合物都沒有顯示出提供 足夠的保護(hù)性免疫應(yīng)答以用作有效的疫苗。最近，G.Krashias等（Vaccine. 28 :2482-2489, 2010)描述了包括gpl40 和CARBOPOL(TM)的疫苗。G.Krashias等發(fā)現(xiàn)CARBOPOL(TM)提供 了超過作為佐劑的錯佐劑（alum)的改善的免疫應(yīng)答。然而，G.Krashias等發(fā)現(xiàn)在gpl40和 CARBOPOL(TM)之間沒有可檢測的結(jié)合。
[0011] 概述
[0012] 本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在合適的條件性下，聚陰離子卡波姆可以與Env多肽形成 復(fù)合物。該復(fù)合物顯示超過現(xiàn)有的佐劑化的HIV候選疫苗的改善的免疫原性。
[0013] 本文所述的是聚陰離子卡波姆和Env多肽之間的新型復(fù)合物。本發(fā)明的一個方 面包含包括與聚陰離子卡波姆聚合物形成復(fù)合物的Env多肽的免疫原性組合物。在一個 實(shí)施方式中，Env多肽是HIVEnv多肽或甚至HIV-IEnv多肽。在另一個可以與之前的實(shí) 施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子卡波姆聚合物不含苯。在另一個可以與之前的實(shí)施方 式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子卡波姆聚合物的濃度是約0.01% (w/ν)-約2.0% (w/v)、 約 0. 01 % (w/v)-約 0. 5% (w/v)或約 0. 01 % (w/v)-約 0. 2% (w/v)。在另一個可以與之 前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子聚合物包括CARB0P0L971PNF(TM)、CARB0P0L 974PNF(TM)或其組合，或優(yōu)選CARB0P0L971PNF(TM)。在另一個可以與之前的實(shí)施方式 結(jié)合的實(shí)施方式中，Env多肽是三聚的。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中， Env多肽包括一個或多個突變。在某些可以與之前的具有一個或多個突變的實(shí)施方式結(jié)合 的實(shí)施方式中，該一個或多個突變選自在防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的 切割位點(diǎn)中的突變、在糖基化位點(diǎn)中的突變、Vl區(qū)的缺失、V2區(qū)的缺失以及上述的組合。優(yōu) 選地，一個或多個突變包括在防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位點(diǎn)中 的突變以及V2區(qū)的缺失。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，Env多肽包含 gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽；gpl40Env多肽或衍生自gpl40Env多肽的多 肽；或者gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。在某些實(shí)施方式中，Env多肽包括 與SEQIDNO:22或23具有至少75%序列相同性、至少80%序列相同性、至少85%序列相 同性、至少90 %序列相同性、至少95 %序列相同性、至少97 %序列相同性、至少98 %序列相 同性、或至少99%序列相同性的氨基酸序列。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方 式中，免疫原性組合物還包含選自不同HIV亞型的第二Env多肽作為Env多肽。在某些可 以與之前的包含第二Env多肽的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，第二Env多肽和Env多肽與 聚陰離子卡波姆聚合物形成混合的復(fù)合物。在某些可以與之前的包含第二Env多肽的實(shí)施 方式結(jié)合的實(shí)施方式中，第二Env多肽與第二聚陰離子卡波姆聚合物形成單獨(dú)的復(fù)合物或 者聚陰離子卡波姆聚合物與第二聚陰離子卡波姆聚合物是相同類型的聚合物。在某些可以 與之前的包含第二Env多肽的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，Env多肽和第二Env多肽衍生 自HIVB亞型毒株和HIVC亞型毒株，反之亦然。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí) 施方式中，免疫原性組合物還包含一種或多種額外的HIV多肽。在某些可以與之前的包含 一種或多種額外的HIV多肽的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，一種或多種額外的HIV多肽選 自Gag多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。在 某些可以與之前的包含一種或多種額外的HIV多肽的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，一種或 多種額外的HIV包含減少或消除多肽的活性而不負(fù)面影響額外的HIV多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答的 能力的突變。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫原性復(fù)合物還包含佐 齊[J。在某些可以與之前的包含佐劑的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，佐劑是MF59。
[0014] 本發(fā)明的另一個方面包含通過（a)將聚陰離子卡波姆聚合物與Env多肽在pH低 于溶液中Env多肽的pi的條件下接觸；(b)將聚陰離子卡波姆聚合物與Env多肽一起孵育 以允許Env多肽形成與聚陰離子卡波姆聚合物的復(fù)合物來產(chǎn)生上述的免疫原性組合物的 方法。在一個實(shí)施方式中，Env多肽是HIVEnv多肽或甚至HIV-IEnv多肽。在某些可以與 之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，pH為3-6 ;3-5或3-4。在另一個可以與之前的實(shí)施方 式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子卡波姆聚合物不含苯。在另一個可以與之前的實(shí)施方式結(jié) 合的實(shí)施方式中，在接觸步驟（a)之后聚陰離子卡波姆聚合物的濃度是約0. 01 % (w/v)-約 2. 0% (w/v)、約 0· 01 % (w/v)-約 0· 5% (w/v)或約 0· 01 % (w/v)-約 0· 2% (w/v)。在另一 個可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子聚合物包括CARB0P0L971PNF(TM)、 CARB0P0L974PNF(TM)或其組合，或優(yōu)選CARB0P0L971PNF(TM)。在另一個可以與之前的實(shí) 施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，Env多肽是三聚的。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方 式中，Env多肽包括一個或多個突變。在某些可以與之前的包含一個或多個突變的實(shí)施方 式結(jié)合的實(shí)施方式中，該一個或多個突變選自在防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41 多肽的切割位點(diǎn)中的突變、在糖基化位點(diǎn)中的突變、Vl區(qū)的缺失、V2區(qū)的缺失以及上述的 組合。優(yōu)選地，一個或多個突變包括在防止gp40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切 割位點(diǎn)中的突變以及V2區(qū)的缺失。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，Env 多肽包含gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽；gpl40Env多肽或衍生自gpl40Env 多肽的多肽；或者gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。在某些可以與之前的實(shí) 施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，Env多肽包括與SEQIDNO:22或23具有至少75%序列相同性、 至少80 %序列相同性、至少85 %序列相同性、至少90 %序列相同性、至少95 %序列相同性、 至少97%序列相同性、至少98%序列相同性、或至少99%序列相同性的氨基酸序列。在某 些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，向溶液加入選自不同HIV亞型的第二Env多 肽作為Env多肽。在某些可以與之前的包含第二Env多肽的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中， 第二Env多肽與含有Env多肽的聚陰離子卡波姆孵育以允許Env多肽和第二Env多肽同時 與聚陰離子卡波姆聚合物形成復(fù)合物。在某些可以與之前的包含第二Env多肽的實(shí)施方式 結(jié)合的實(shí)施方式中，第二Env多肽與第二聚陰離子卡波姆聚合物形成單獨(dú)的復(fù)合物。在某 些可以與之前的包含第二聚陰離子卡波姆聚合物的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子 卡波姆聚合物和第二聚陰離子卡波姆聚合物是相同類型的聚合物。在某些可以與之前的實(shí) 施方式結(jié)合的包含第二Env多肽的實(shí)施方式中，Env多肽和第二Env多肽衍生自HIVB亞 型毒株和HIVC亞型毒株，反之亦然。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，該 方法還包含加入一種或多種額外的HIV多肽的步驟。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合 的包含一種或多種額外的HIV多肽的實(shí)施方式中，一種或多種額外的HIV多肽選自Gag多 肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。在某些可以 與之前的實(shí)施方式結(jié)合的包含一種或多種額外的HIV多肽的實(shí)施方式中，一種或多種額外 的HIV包含減少或消除多肽的活性而不負(fù)面影響額外的HIV多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力的突 變。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，該方法還包含向溶液加入佐劑的步 驟。在某些可以與之前的包含佐劑的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，佐劑是MF59。
[0015] 本發(fā)明的另一個方面包含在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述對象給予按 照之前的組合物方面或由按照前述的方法方面的方法產(chǎn)生的免疫原性組合物，從而產(chǎn)生針 對Env多肽的免疫應(yīng)答。在一個實(shí)施方式中，免疫原性組合物通過肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮 下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)給藥。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的 實(shí)施方式中，對象是哺乳動物。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。在某些可以與之前的實(shí)施方式 結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答包含體液免疫應(yīng)答。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí) 施方式中，免疫應(yīng)答包含細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0016] 本發(fā)明的另一個方面包含通過（a)由用于在允許Env多肽表達(dá)的條件下表達(dá)Env 多肽的基因遞送載體來轉(zhuǎn)染所述對象的細(xì)胞，從而產(chǎn)生針對Env多肽的免疫應(yīng)答；(b)向所 述對象給予按照之前的組合物方面或由按照之前的方法方面的方法產(chǎn)生的免疫原性組合 物，從而增強(qiáng)針對Env多肽的免疫應(yīng)答來在對象中產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的方法。
[0017] 本發(fā)明的另一個方面包含對象中產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的方法，在允許Env多肽表 達(dá)的條件下，該對象先前已經(jīng)由用于表達(dá)Env多肽的基因的遞送載體轉(zhuǎn)染進(jìn)所述對象的細(xì) 胞，從而已經(jīng)產(chǎn)生對Env多肽的免疫應(yīng)答，該方法包括向所述對象給予按照之前的組合物 方面或由按照之前的方法方面的方法產(chǎn)生的免疫原性組合物，從而增強(qiáng)對Env多肽的免疫 應(yīng)答。在一個實(shí)施方式中，免疫原性組合物通過肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰 道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)給藥。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，對象 是哺乳動物。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式 中，免疫應(yīng)答包含體液免疫應(yīng)答。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫應(yīng) 答包含細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0018] 本文所述的是包含低粘度、聚陰離子卡波姆和Env多肽的新型組合物。本發(fā)明的 一個方面包含包括具有低粘度、聚陰離子卡波姆聚合物的Env多肽的免疫原性組合物。在 一個實(shí)施方式中，Env多肽是HIVEnv多肽或甚至HIV-IEnv多肽。在另一個可以與之前的 實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子卡波姆聚合物不含苯。在另一個可以與之前的實(shí)施 方式結(jié)合的實(shí)施方式中，聚陰離子卡波姆聚合物的濃度是約0.01% (w/ν)-約2.0% (w/v)、 約 0. 01 % (w/v)-約 0. 5% (w/v)或約 0. 01 % (w/v)-約 0. 2% (w/v)。在另一個可以與之 前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，低粘度、聚陰離子聚合物包括具有低于25000cP(25°C，布 氏RVT，20rpm，中和至ρΗ7· 3-7. 8,0· 5重量％膠漿，軸#6)、低于20000cP、低于15000cP的平 均粘度的聚陰離子聚合物，或該低粘度、聚陰離子聚合物是CARB0P0L971PNF(TM)。在另一 個可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，Env多肽是三聚的。在某些可以與之前的實(shí)施 方式結(jié)合的實(shí)施方式中，Env多肽包括一個或多個突變。在某些可以與之前的具有一個或 多個突變的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，該一個或多個突變選自在防止gpl40多肽切割成 gpl20多肽和gp41多肽的切割位點(diǎn)中的突變、在糖基化位點(diǎn)中的突變、Vl區(qū)的缺失、V2區(qū) 的缺失以及上述的組合。優(yōu)選地，一個或多個突變包括在防止gp40多肽切割成gpl20多肽 和gp41多肽的切割位點(diǎn)中的突變以及V2區(qū)的缺失。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的 實(shí)施方式中，Env多肽包含gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽；gpl40Env多肽或 衍生自gpl40Env多肽的多肽；或者gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。在某些 實(shí)施方式中，Env多肽包括與SEQIDNO:22或23具有至少75%序列相同性、至少80%序 列相同性、至少85 %序列相同性、至少90 %序列相同性、至少95 %序列相同性、至少97 %序 列相同性、至少98%序列相同性、或至少99%序列相同性的氨基酸序列。在某些可以與之 前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫原性組合物還包含選自不同HIV亞型的第二Env多 肽作為Env多肽。在某些可以與之前的包含第二Env多肽的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中， Env多肽和第二Env多肽衍生自HIVB亞型毒株和HIVC亞型毒株，反之亦然。在某些可 以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫原性組合物還包含一種或多種額外的HIV多 肽。在某些可以與之前的包含一種或多種額外的HIV多肽的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中， 一種或多種額外的HIV多肽選自Gag多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多 肽、Vpr多肽和Vpu多肽。在某些可以與之前的包含一種或多種額外的HIV多肽的實(shí)施方 式結(jié)合的實(shí)施方式中，一種或多種額外的HIV包含減少或消除多肽的活性而不負(fù)面影響額 外的HIV多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力的突變。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式 中，免疫原性組合物還包含佐劑。在某些可以與之前的包含佐劑的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方 式中，佐劑是MF59。
[0019] 本發(fā)明的另一個方面包含在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括向所述對象給予按 照之前的組合物方面的免疫原性組合物，從而產(chǎn)生針對Env多肽的免疫應(yīng)答。在一個實(shí)施 方式中，免疫原性組合物通過肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服 或靜脈內(nèi)給藥。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，對象是哺乳動物。優(yōu)選 地，所述哺乳動物是人。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答包含體 液免疫應(yīng)答。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答包含細(xì)胞免疫應(yīng) 答。
[0020] 本發(fā)明的另一個方面包含通過（a)由用于在允許表達(dá)Env多肽的條件下表達(dá)Env多肽的基因遞送載體來轉(zhuǎn)染所述對象的細(xì)胞，從而產(chǎn)生針對Env多肽的免疫應(yīng)答；(b)向所 述對象給予按照之前的組合物方面的免疫原性組合物，從而增強(qiáng)針對Env多肽的免疫應(yīng)答 來在對象中產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的方法。
[0021] 本發(fā)明的另一個方面包含在對象中產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的方法，在允許Env多肽 表達(dá)的條件下，所述對象先前已經(jīng)由用于表達(dá)Env多肽的基因的遞送載體轉(zhuǎn)染進(jìn)所述對象 的細(xì)胞，從而已經(jīng)產(chǎn)生對Env多肽的免疫應(yīng)答，該方法包括向所述對象給予按照之前的組 合物方面的免疫原性組合物，從而增強(qiáng)對Env多肽的免疫應(yīng)答。在一個實(shí)施方式中，免疫原 性組合物通過肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)給藥。 在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，對象是哺乳動物。優(yōu)選地，所述哺乳動物 是人。在某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答包含體液免疫應(yīng)答。在 某些可以與之前的實(shí)施方式結(jié)合的實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答包含細(xì)胞免疫應(yīng)答。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1顯示了在孵育各種時間長度之后，Env多肽-CARBOPOL(TM)復(fù)合物的免疫印 跡。組圖㈧從左到右顯示：（1)分子量標(biāo)記物、⑵Env多肽復(fù)合物-0小時、（3)Env多肽 復(fù)合物-在4°C下1小時、（4)Env多肽復(fù)合物-在4°C下2小時、（5)Env多肽復(fù)合物-在 4°C下3小時、和（6)Env多肽復(fù)合物-在4°C下4小時。組圖⑶從左到右顯示：（1)分子 量標(biāo)記物、（2)Env多肽復(fù)合物-在4°C下1小時、（3)Env多肽復(fù)合物-在20°C下1小時、 (4)在PBS中的Env多肽-在室溫（25°C)下1小時、（5)分子量標(biāo)記物、（6)Env多肽復(fù)合 物-在30°C下1小時、（7)Env多肽復(fù)合物-在37°C下1小時、和⑶在PBS中的Env多 肽-在37°C下1小時。在膠中CARBOPOL(TM)的終濃度是約0. 1%。
[0023] 圖2顯示單獨(dú)CARBOPOL(TM)(左）或與Env(gpl40)多肽形成復(fù)合物的 CARBOPOL(TM)的動態(tài)光散射分析（10次測量值取平均）。單獨(dú)CARBOPOL(TM)展示出約68nm 的流體力學(xué)半徑。CARB0P0L(TM)+gpl40顯示約86nm的半徑，表明CARBOPOL(TM)和gpl40 在更高級的復(fù)合物中相互作用。在膠中CARB0P0L(TM)的終濃度為約0. 1%。
[0024]圖 3 顯示測試在室溫（25°C)下用 0· 5 %CARB0P0L(TM)，I:I(v/v) (CARB0P0L(TM) 的終濃度為〇· 25% )孵育1小時（深灰色空心框）或3小時（淺灰色空心框）的Env多 肽的結(jié)合的ELISA試驗(yàn)。也相似地孵育不含CARB0P0L(TM)的Env多肽（作為對照）（實(shí)心 框）。y軸顯示〇D450nm而X-由顯示gpl20的濃度（μg/ml)。（A)顯示與CD4-IgG2 (受體 CD4的替代物）結(jié)合的gpl20樣品。（B)顯示與bl2(CD4-結(jié)合位點(diǎn)中和單克隆抗體，單抗） 結(jié)合的gpl20樣品。（C)顯示在存在或不存在可溶⑶4,s⑶4的情況下與17b單抗（⑶4-誘 導(dǎo)的單克隆抗體）的結(jié)合。⑶4gG2和bl2單抗顯示盡管用CARBOPOL(TM)孵育，構(gòu)象受體結(jié) 合位點(diǎn)是抗原性完整的。17b單抗結(jié)合證實(shí)該蛋白能夠經(jīng)過CD4-誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，這是功 能性Env多肽的關(guān)鍵方面。
[0025] 圖4是顯示通過對單獨(dú)Env多肽或與聚陰離子卡波姆（CARB0P0L(TM))形成復(fù)合 物的Env多肽的表面等離振子共振測量的反應(yīng)單位（RU-y軸）的圖。在左側(cè)用白色柱顯示 與結(jié)合到傳感器芯片的可溶性CD4(sCD4)的結(jié)合。在右側(cè)用灰色柱顯示與結(jié)合到傳感器芯 片上的聚糖依賴性單克隆抗體（2G12)的結(jié)合。
[0026] 圖 5 是顯示來自比較由CARB0P0L(TM)或MF59 (TM)或者CARB0P0L(TM) +MF59 (TM) 佐劑化的Env多肽（SF162gpl40)的兔子研究中的用gpl20-結(jié)合ELISA測量的血清中抗體 (幾何平均效價-y軸）的圖。用白色柱表示在第2次免疫后2周（2wp2)時的幾何平均效 價。用淺灰色柱表示在第3次免疫后2周（2wp3)時的幾何平均效價。用黑色柱表示在第 4次免疫后2周（2wp4)時的幾何平均效價。
[0027]圖6是顯示用硫氰酸銨ELISA評價gpl20_特異性血清抗體的親合力的圖（親合力 指數(shù)_y軸）。血清是來自比較由CARB0P0L(TM)或MF59 (TM)或者CARB0P0L(TM) +MF59 (TM) 佐劑化的Env多肽（SF162gpl40)的兔子研究。用白色柱表示在第2次免疫后2周（2wp2) 時的親合力指數(shù)。用淺灰色柱表示在第3次免疫后2周（2wp3)時的親合力指數(shù)。用黑色 柱表示在第4次免疫后2周（2wp4)時的親合力指數(shù)。
[0028] 圖7A-B顯示從兔子研究中的免疫方案產(chǎn)生的Env-特異性抗體的中和潛力的結(jié) 果，該研究比較由CARBOPOL(TM)或MF59(TM)或者CARB0P0L(TM)+MF59(TM)佐劑化的Env 多肽（SF162gpl40)。每張圖顯示來自（a)用含MF59(TM)的Env多肽的免疫、（b)用Env多 肽-聚陰離子卡波姆復(fù)合物的免疫、和（c)用含MF59 (TM)的Env多肽-聚陰離子卡波姆復(fù) 合物的免疫的第3次（p3)和第4次（p4)免疫后抗體的ID50效價。圖7A顯示針對Ia級 和Ib級分離株的中和潛力。圖7B顯示針對2級分離株和對照的中和潛力。
[0029] 圖8A-B顯示了表示HIV-I假病毒的血清中和的幅度和效力（ID50效價）的熱圖。 顯示了來自每組中5只兔子中每只的結(jié)果。黑色的樣品證明與1000-9999的血清稀釋50% 中和；深灰色的樣品證明與100-999的血清稀釋50%中和；并且淺灰色遮蔽的樣品證明與 20-99的血清稀釋50%中和。圖8A顯示針對Ia級和Ib級分離株的幅度和效力。圖8B顯 示針對2級分離株的幅度和效力。
[0030] 圖9A-E顯示針對各種分離株的中和ID50效價。圖9A顯示針對Ia級分離株 (2wp3(p3)、2wp4(p4)和 2wp5(p5)) :MW965.26(C亞型）和SF162.LS(B亞型）的中和ID50 效價。圖9B顯示針對另一種Ia級分離株（2wp3 (p3)、2wp4 (p4)和2wp5 (p5)) :MN(B亞型） 的中和ID50效價。圖9C顯示針對兩種lb級分離株（2wp3(p3)、2wp4(p4)和2wp5(p5)): Bal. 26 (C亞型）和TVL21 (B亞型）的中和ID50效價。圖9D顯示針對兩種2級分離株 (2wp3(p3)、2wp4(p4)和 2wp5(p5)) :ZM249M.PL1(C亞型）和Dul56. 12(C亞型）的中和ID50 效價。圖9E顯示針對另一種2級分離株（2wp3 (p3)、2wp4 (p4)和2wp5 (p5)) :Du422.I(C亞 型）的中和ID50效價。
[0031] 圖10顯示了由gpl20-結(jié)合ELISA測量的針對TVlgpHOEnv多肽的總抗體結(jié)合效 價。也包含了預(yù)采血（用作對照）的背景效價。通過使用作為包被蛋白的TVlgpHOEnv多 肽來確定抗體效價。顯示數(shù)據(jù)值代表每組中單獨(dú)一式三份試驗(yàn)的5只兔子的幾何平均效價 (GMT) 〇
[0032]圖11顯示來自實(shí)施例6的所有10組兔子收集的血清的抗體親合力，這些兔子用 由MF59(TM)(并且在一例中由MF59(TM)和CARBOPOL(TM))佐劑化的單價或多價的Env多 肽免疫。從左至右的組為：Du422.lgpl40、Dul56. 12gpl40、CAP45gpl40、ZM249M.PLlgpl40、 HIV-25711-2 (EF117272)gpl40、CAP255 (EF203982)gpl40,CAP239 (EF203983)gpl40、 ZM249M.PLlgpl40+CAP239 (EF203983)gpl40+Du422.IgpHO(僅含MF59 (TM))、ZM249E PLlgpl40+CAP239(EF203983)gpl40+Du422.1gpl40(含MF59(TM)和CARBOPOL(TM))、和 TVlgpl40。以增加的灰度顯示了以下每組的親合力（從左到右）：預(yù)采血、第2次免疫后2周 (2wp2)、第3次免疫后2周（2wp3)、第4次免疫后2周（2wp4)和第5次免疫后2周（2wp5)。 如由I.K.Srivastava等，（J.Virol. 2002)所述，使用作為包被抗原的TVlgpHOEnv多肽的 NH4SCN置換ELISA來確定親合力。
[0033] 圖12A-B顯示了表示使用在第3次免疫后2周收集的血清的HIV-I假病毒血清中 和的幅度和效力（ID50效價）的熱圖。黑色的樣品證明與超過10000的血清稀釋50%中 和；有白色數(shù)字的深灰色的樣品證明與1000-9999的血清稀釋50%中和；深灰色的樣品證 明與100-999的血清稀釋50%中和；并且淺灰色遮蔽的樣品證明與20-99的血清稀釋50% 中和。
[0034] 圖13A-C顯示了表示使用在第4次免疫后2周收集的血清對擴(kuò)大組的毒株的 HIV-I假病毒的血清中和的幅度和效力（ID50效價）的熱圖。黑色的樣品證明與1000-9999 的血清稀釋50%中和；深灰色的樣品證明與100-999的血清稀釋50%中和；并且淺灰色遮 蔽的樣品證明與20-99的血清稀釋50%中和。
[0035] 圖14A-E顯示在第3次免疫后（p3) 2周后和第4次免疫后（p4) 2周得到的血清 的ID50中和效價，如使用HIV-I假病毒試驗(yàn)測定。圖14A顯示了針對兩種IA級分離株： MW965. 26(C亞型）（左）和SF162.LS(B亞型）（右）的中和效價。圖14B顯示針對第三種 IA級分離株：麗.2 (B亞型）的中和效價。圖14C顯示了針對兩種IB級分離株：Bal. 26(B 亞型）（左）和TVL21 (C亞型）（右）的中和效價。圖14D顯示了針對兩種2級分離株： ZM249M.PLl(C亞型）（左）和Dul65. 12 (C亞型）（右）的中和效價。圖14E顯示針對第三 種2級分離株：Du422.I(C亞型）的中和效價。
[0036] 圖15顯示用gpl20_結(jié)合ELISA測量的從全部9組收集的兔血清的結(jié)合抗體效 價（幾何平均效價-y軸）。從左至右的組為：〇11156.128?140、〇11422.18?140、2]\1249^PLlgpl40、CAP239gpl40、TVlgpl40,TVlgpHOΛV2、SF162gpl40ΛV2、ZM249M.PLlgpHO+ CAP239gpl40+Du422.lgpl40+TVlgpl40(組 8,多價給予）、和CAP239gpl40/Du422.IgpHO/ ZM249M.PLlgpl40/TVlgpl40 (組9,依次給予）。以增加的灰度顯示了以下每組的幾何平均 效價（從左到右）：預(yù)采血、第2次免疫后2周（2wp2)、第3次免疫后2周（2wp3)、第4次 免疫后2周（2wp4)和放血。
[0037] 圖16顯示從全部9組收集的兔血清的抗體親合力。從左至右的組為： Dul56. 12gpl40、Du422.lgpl40、ZM249M.PLlgpl40、CAP239gpl40、TVlgpl40、TVlgpl40AV2、 SF162gpl40AV2、ZM249M.PLl+CAP239+Du422.1+TVlgpl40(組 8)和CAP239gpl40/ Du422.lgpl40/ZM249M.PLlgpl40/TVlgpl40(組9)。顯示了每組的親合力指數(shù)（從左到右）： 第2次免疫后2周（2wp2)、第3次免疫后2周（2wp3)、第4次免疫后2周（2wp4)和放血。 如由I.K.Srivastava等，（J.Virol. 2002)所述，使用作為包被抗原的TVlgpHOEnv多肽的 NH4SCN置換ELISA來確定親合力。
[0038] 圖17A-F顯示了通過用10種gpl20Env多肽中的每種的免疫和依次免疫實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo) 的抗體針對一組病毒分離株（X-軸）的中和潛力（ID50效價，y-軸）。圖17A顯示Dul56. 12 gpl2〇 (左）和Du422·Igpl2〇 (右）的中和潛力（以ID5O效價計）。圖I7B顯示ZMM9M. PLlgpl2〇 (左）和CAP45 (EF2O396O)gpl2〇 (右）的中和潛力（以ID5O效價計）。圖I7C顯 示CAP84(EF2〇3963)gpl2〇(左）和CAP239(EF2〇3983)gpl2〇(右）的中和潛力（以ID5O效 價計）。圖17D顯示TVlgpl20 (左）和SF162gpl20 (右）的中和潛力（以ID50效價計）。 圖17E顯示TVlgpl40 (左）和SF162gpl40 (右）的中和潛力（以ID50效價計）。圖17F 顯示由CAP239gpl20、Du422.1gpl20、ZM249.PLlgpl20 和TVlgpl20s依次免疫（左）和 在單個圖上顯示的全部測試組（右）的中和潛力（以ID50效價計）。
[0039] 圖18A-B顯示了表示使用在第3次免疫后2周收集的血清的HIV-I假病毒的血清 中和的幅度和效力（ID50效價）的熱圖。深灰色的樣品證明與>10000的血清稀釋50%中 和；并且淺灰色的樣品證明與1000-9999的血清稀釋50%中和。
[0040] 圖19顯示用在用C亞型gp120的第4次免疫后2周（第22周）收集的合并兔血 清（I:100稀釋）針對經(jīng)固定的TVlgpHOEnv多肽進(jìn)行的單克隆抗體（單抗）競爭ELISA 的結(jié)果，為了定位免疫后引發(fā)的抗-Env抗體的表位特異性。測試的Env多肽的分離株示于 上方。在競爭試驗(yàn)中使用的表位和單抗沿著左側(cè)顯示。
[0041] 圖20A-F顯示了通過用10種構(gòu)建體中的每種的免疫豚鼠誘導(dǎo)的抗體針對一組病 毒分離株（X-軸）的中和潛力（ID50效價，y-軸）。圖20A顯示Dul56. 12gpl20(左）和 Du422.1gpl20(右）的中和潛力（以ID50效價計）。圖20B顯示ZM249M.PL1gpl20(左）和 CAP45 (EF203960)gpl20 (右）的中和潛力（以ID50 效價計）。圖 20C顯示CAP84 (EF203963) gpl2〇(左）和CAP239(EF2〇3983)gpl2〇(右）的中和潛力。圖 20D顯示TVlgpl2〇(左） 和SF162gpl20(右）的中和潛力（以ID50效價計）。圖20E顯示TVlgpl40(左）和 SF162gpl40(右）的中和潛力（以ID50效價計）。圖20D在單張圖上顯示了所有測試組的 中和潛力。
[0042] 圖21顯示了表示使用在第3次免疫后2周收集的血清的HIV-I假病毒血清中和 的幅度和效力（以ID50效價計）的熱圖。深灰色的樣品證明與>10000的血清稀釋50%中 和；并且淺灰色的樣品證明與1000-9999的血清稀釋50%中和。
[0043] 圖22顯示用來自實(shí)施例10的豚鼠研究的第3次免疫后2周（第14周）收集的 合并兔血清（I:500稀釋）針對經(jīng)固定的TVlgpl40Env多肽進(jìn)行的單克隆抗體（單抗）競 爭ELISA的結(jié)果，為了定位免疫后引發(fā)的抗-Env抗體的表位特異性。測試的Env多肽的分 離株示于上方。在競爭試驗(yàn)中使用的表位和單抗沿著左側(cè)顯示。
[0044] 圖23顯示用來自實(shí)施例10的豚鼠研究的第4次免疫后2周（第26周）收集的 合并兔血清（I:500稀釋）針對經(jīng)固定的TVlgpl40Env多肽進(jìn)行的單克隆抗體（單抗）競 爭ELISA的結(jié)果，為了定位免疫后引發(fā)的抗-Env抗體的表位特異性。測試的Env多肽的分 離株示于上方。在競爭試驗(yàn)中使用的表位和單抗沿著左側(cè)顯示。
[0045] 圖24A-K顯示在免疫開始后的幾個時間點(diǎn)上（y軸），55只用由 MF59 (TM) +CARB0P0L971 (TM)佐劑化的gpl20Env多肽免疫的兔子的體重（y軸）。圖24A顯 示兔1-5。圖24B顯示兔6-10。圖24C顯示兔11-15。圖24D顯示兔16-20。圖24E顯示 兔21-25。圖24F顯示兔26-30。圖24G顯示兔31-35。圖24H顯示兔36-40。圖241顯示 兔41-45。圖24J顯示兔46-50。圖24K顯示兔51-55。
[0046] 優(yōu)選實(shí)施方式詳述
[0047]HIV-I包膜糖蛋白（Env)是暴露于體液免疫反應(yīng)的主要病毒蛋白，因此其是開發(fā) 疫苗的重要靶標(biāo)。使用Env引發(fā)強(qiáng)效抗HIV-I中和抗體已經(jīng)由于各種因素而復(fù)雜化。關(guān)鍵 因素是抗原變異和Env的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。重組Env糖蛋白已經(jīng)顯示出在沒有佐劑的情況下次 佳的免疫原性。因此，除了優(yōu)化Env-免疫原的設(shè)計以外，新型佐劑和/或遞送系統(tǒng)的鑒定 在產(chǎn)生疫苗介導(dǎo)的針對HIV的保護(hù)性免疫應(yīng)答中是重要的。
[0048] 由于Env是特別不穩(wěn)定的并且具有構(gòu)象依賴性中和表位，不使其變性或負(fù)面改變 抗原結(jié)構(gòu)的佐劑是優(yōu)選的。下面的實(shí)施例證明了當(dāng)在與Env多肽的復(fù)合物中使用時，交聯(lián) 的、聚丙烯酸聚合物（聚陰離子卡波姆或CARBOPOL(TM))引發(fā)了強(qiáng)免疫應(yīng)答。聚丙烯酸聚合 物是特別有益的，在于它們可以與其它的諸如MF59 (TM)的佐劑結(jié)合以甚至進(jìn)一步改善免 疫應(yīng)答。重要地，當(dāng)與MF59 (TM) -起使用聚陰離子卡波姆時，實(shí)施例顯示了在中和抗體的 總幅度和強(qiáng)度中的改善?？傊瑢?shí)施例證明聚陰離子卡波姆可以與Env形成復(fù)合物而不改 變多肽的抗原結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性并且復(fù)合物在單獨(dú)接種疫苗或與其它諸如MF59 (TM)的佐劑組 合之后引發(fā)更好的免疫應(yīng)答。盡管不受限于理論，改善的免疫應(yīng)答可能是由于聚陰離子卡 波姆向免疫系統(tǒng)中的特定細(xì)胞導(dǎo)向或呈遞Env多肽和/或聚陰離子卡波姆在儲存期間和接 種疫苗之后使得Env多肽穩(wěn)定。另外，Env多肽可以用低粘度的，具有低于25000cP(25°C， 布氏RVT，20rpm，中和至ρΗ7· 3-7. 8,0· 5 重量％膠漿，軸 #6)、低于 20000cP、低于 15000cP 的平均粘度的聚陰離子聚合物佐劑化。這樣的低粘度，聚陰離子聚合物是優(yōu)選的示例是 CARB0P0L97IPNF(TM)。
[0049] 除非另有說明，公開的組合物和方法的實(shí)施將僅需要化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物 學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法，這些方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充 分描述。參見，例如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remingtor^sPharmaceuticalSciences),第18版 (賓夕法尼亞州伊斯頓（Easton，Pa.):馬克出版公司（MackPublishingCompany) ,1990); 《酶學(xué)方法》（MethodsInEnzymology)(S.Colowick和N.Kaplan編，學(xué)術(shù)出版社有限公司 (AcademicPress，Inc.));《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》（HandbookofExperimentalImmunology)， 第I-IV卷，（D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986,布萊克威爾科學(xué)出版社（Blackwell ScientificPublications));Sambrook等，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊》（MolecularCloning: ALaboratoryManual)(第二版，1989);《分子生物學(xué)簡單方法》（ShortProtocolsin MolecularBiology),第四版，（Ausubel等編，1999，JohnWiley&Sons);《分子生物學(xué)技術(shù)： 強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室課程》（MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourse)， (Ream等編，1998,學(xué)術(shù)出版社）；《PCR(生物技術(shù)叢書引言）》（PCR(Introductionto BiotechniquesSeries)),第二版，（Newton和Graham編，1997,SpringerVerlag) 〇
[0050] 聚陰離子卡波姆聚合物
[0051] 在本文所述的組合物和方法中使用的聚陰離子卡波姆聚合物是丙烯酸聚合物。這 些丙烯酸聚合物可以是均聚物或共聚物。聚陰離子卡波姆聚合物在CARBOPOL(TM)的商品 名下市售可得。丙烯酸聚合物在例如，美國專利號2, 909, 462和3, 790, 665中描述。
[0052] 盡管存在許多待選的從中形成具有改善的免疫原性的復(fù)合物的聚陰離子卡波姆 聚合物，優(yōu)選的聚陰離子卡波姆聚合物是具有較少交聯(lián)并且在苯存在下不形成以避免殘留 的苯的那些聚合物（潛在的更有毒性的有機(jī)化合物）?；趦?yōu)選的特性，選擇CARB0P0L971P NF(TM)聚合物，由于其含有殘留的乙酸乙酯溶劑（按照ICH規(guī)定的III類溶劑）而不是苯。 我們也考慮974PNF，其是化學(xué)上相似的并且有更多的顯示其安全的毒理學(xué)和其它支持性 數(shù)據(jù)，但是由于它是非常高分子量的交聯(lián)的聚丙烯酸，我們決定選擇971PNF，由于其是相 對輕的交聯(lián)聚合物并且會有助于溶劑化。由于可以得到974PNF的法規(guī)和毒理學(xué)信息，并 且它們可能適用于971PNF，我們在我們的研究中滿意地選擇后者。
[0053] 取決于聚合物的這些聚合物的分子量的范圍被估計為從740000至4-5百萬道爾 頓。沒有測量該類型的交聯(lián)的（即，三維的）聚合物的實(shí)際分子量的方法，因此必須通過其 它諸如動態(tài)光散射等的方式來估計大小。均聚物的主鏈?zhǔn)窍嗤模?，聚合的丙烯酸。?要的差異與交聯(lián)密度和估計的分子量相關(guān)，而不是使用的交聯(lián)劑。采用在交聯(lián)劑密度中非 常小的調(diào)節(jié)，可以產(chǎn)生大量的總分子結(jié)構(gòu)相似但是在應(yīng)用性質(zhì)中，例如粘度不同的聚陰離 子卡波姆聚合物。交聯(lián)密度可以通過在丙烯酸主鏈上交聯(lián)劑位置的少量位移來改變。因?yàn)?實(shí)際交聯(lián)劑本身對特定丙烯酸聚合物的生物性質(zhì)可能有很少的影響，對于這些聚合物，化 妝品、籃洗用品和香精香料協(xié)會（CTFA)已經(jīng)獲得系列專用名（familymonograph)，"卡波 姆（carbomer)"。
[0054]諸如CARB0P0L(TM)、PEMULEN(TM)和N0VE0N(TM)等的聚陰離子卡波姆聚合物是 本發(fā)明范圍內(nèi)的聚合物。這些特定的聚陰離子卡波姆聚合物與聚烯基醚或二乙烯基乙二醇 (divinylglycol)交聯(lián)。
[0055] 聚陰離子卡波姆聚合物是平均約0. 2微米直徑的顆粒的絮凝粉末。每個顆?？梢?被視為通過交聯(lián)互連的聚合物鏈的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。沒有交聯(lián)，初級顆粒會是纏結(jié)的但不是化學(xué) 結(jié)合的線性聚合物鏈的集合。這些線性聚合物在諸如水的極性溶劑中是可溶的。在水中， 當(dāng)暴露于高于4-6的pH環(huán)境中時，聚陰離子卡波姆聚合物相比它們原始的體積溶脹1000 倍（并且10倍于它們的原始直徑）以形成膠。由于這些聚合物的PKa是6±0. 5,在聚合物 主鏈上的羧酸基團(tuán)離子化，導(dǎo)致帶負(fù)電的顆粒之間的排斥，其增加了聚合物的溶脹。交聯(lián)的 聚合物并不溶于水。
[0056] 特定類型的聚陰離子卡波姆聚合物的特性：CARB0P0L934P(TM)是與烯丙基蔗糖 交聯(lián)的并且在溶劑苯中聚合。CARBOPOL971P(TM)(71G，974P)與烯丙基季戊四醇交聯(lián)并 且在乙酸乙酯中聚合。聚卡波非是在二乙烯基乙二醇中交聯(lián)的聚合物并且在溶劑苯中聚 合。所有在乙酸乙酯中制造的聚合物由1-3%氫氧化鉀中和。雖然CARBOPOL971P(TM) 和CARBOPOL974P(TM)在相似條件下通過相同的過程生產(chǎn)；它們之間的差異是CARBOPOL 971P(TM)相比CARBOPOL974P(TM)具有稍低水平的交聯(lián)劑。CARBOPOL71G(TM)是 CARBOPOL(TM)的顆粒形式。
[0057] 盡管結(jié)構(gòu)和性質(zhì)之間的關(guān)系在學(xué)術(shù)上和工業(yè)上都是感興趣的。不同等級的聚陰離 子卡波姆聚合物展現(xiàn)出不同的流變性質(zhì)、粒度的反射、交聯(lián)之間的分子量（Me)、Mc的分布 和總單位的分?jǐn)?shù)，其以末端出現(xiàn)，例如游離的鏈末端。相鄰的交聯(lián)之間的分子量（Mc)與交 聯(lián)劑的密度大概成反比。這些可以由交聯(lián)的單體的官能團(tuán)、丙烯酸與交聯(lián)單體的相對比、和 交聯(lián)反應(yīng)的效率計算，假設(shè)可忽略鏈端。另外，分子量可以與溶脹膠的和/或來自平衡溶脹 率的流變性質(zhì)定性比較。簡單來說，諸如CARBOPOL971P(TM)的低粘度、低剛性聚合物有 較高的Me。相反，它們有較低的交聯(lián)劑密度。交聯(lián)劑水平越高，平衡溶脹率越低。在彈性的 網(wǎng)絡(luò)理論中，彈性模量G與交聯(lián)之間的分子量（Me)成反比。
[0058]CARBOPOL971P(TM)提供了非常低的粘度和在低用量水平下的出色屈服值。由 CARBOPOL971P(TM)形成的懸浮液會有較長的流變性。CARBOPOL71G(TM)聚合物會提供 與CARBOPOL971P(TM)相同的粘度和流變性，但是由于其顆粒性質(zhì)，它易于處理和分散。
[0059] 詳細(xì)毒性：像其它高分子量聚合物，聚陰離子卡波姆聚合物證明基于它們的物理 和化學(xué)性質(zhì)的低毒性和刺激潛力。因此，已經(jīng)由設(shè)計這些產(chǎn)品的合適的監(jiān)管機(jī)構(gòu)或非監(jiān)管 機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)這樣交聯(lián)的，高分子量丙烯酸聚合物在多種化妝品、去污劑和藥物應(yīng)用中是安全 的。
[0060] 卡波姆是USP-NF、美國采用名委員會（USAN)和CTFA采用的各種CARBOPOL(TM) 聚合物的通用（即，非專利）名稱?；瘖y品原料審查（CIR)專家組在他們的用于化妝品 原料的卡波姆的安全性的評價中如下概述了卡波姆的毒性：用大鼠、豚鼠、小鼠和狗的急 性口服研究顯示當(dāng)攝取時，卡波姆910、-934、-940和-941有低毒性。在大白鼠中，卡波 姆910的吸入LC5tl是1.71mg/l。暴露于卡波姆910的大鼠的皮膚LC5tl為超過3.0g/kg。 在靜脈內(nèi)注射5ml/kg的劑量的水溶液中1 %、2%或3%卡波姆934的兔子中沒有出現(xiàn)死 亡。當(dāng)用100%卡波姆910或934測試時，兔子顯示出最小的皮膚刺激，并且當(dāng)用卡波姆 910、-934、-934P、-940、-941、和/或他們的各種鹽在0· 20-100%的濃度下測試時，零到中 等的眼睛刺激。用高至5. 0g/kg/天卡波姆934的大鼠的亞慢性喂食（49天）和高至進(jìn)食 中5. 0%卡波姆934P的大鼠和狗的亞慢性喂食（21和/或90天）導(dǎo)致低于正常體重。在 以5. 0 %的進(jìn)食水平喂食卡波姆934P維持90天的大鼠中，絕對肝重和肝與身體和腦的重量 比降低，但是沒有觀察到病理學(xué)變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)選擇在本文所述的組合物和方法 中使用的聚陰離子卡波姆聚合物時容易考慮這樣的問題。
[0061] 用卡波姆934 (CARB0P0L934 (TM))及其各種鹽進(jìn)行的臨床研究顯示這些聚合物在 0. 5%、5. 0%、10. 0%和100%的濃度下有低的皮膚刺激和致敏的潛力。當(dāng)用1. 0%濃度在 人上測試時，卡波姆940、941及其各種鹽也證明低的皮膚刺激和致敏潛力。另外，含有高至 0. 25%卡波姆934的制劑證明低的人皮膚刺激、致敏、光毒性和光接觸變應(yīng)原性的潛力。用 于評價卡波姆940和-941的皮膚刺激和致敏潛力的臨床數(shù)據(jù)被限于僅1. 0 %的濃度被測試 的研究中。用于評價光毒性和光接觸變應(yīng)原性的臨床數(shù)據(jù)被限于僅0. 25%濃度的卡波姆 934被測試的制劑研究。
[0062] CIR專家組注意到作為卡波姆中雜質(zhì)的苯的存在并且推薦努力將它減少到可能 的最低水平。在該目標(biāo)的追求中，盧比作先進(jìn)材料公司（LubrizolAdvancedMaterials,Inc.)已經(jīng)開發(fā)了新的使用替代的聚合溶劑體系（例如，乙酸乙酯、環(huán)己烷等）的 CARBOPOL(TM)聚合物。因此，優(yōu)選使用諸如在苯存在下不形成的CARB0P0L971PNF(TM)的 聚陰離子卡波姆聚合物。這些聚陰離子卡波姆聚合物與苯聚合的聚陰離子卡波姆聚合物是 化學(xué)上相同的，并且因此列在美國環(huán)保局的TSCA名錄上作為丙烯酸聚合物或丙烯酸共聚 物。
[0063] 對于乙酸乙酯聚合的聚合物的初步毒性測試結(jié)果與之前的產(chǎn)品基本相似。在人重 復(fù)貼片測試中，他們不是首要的刺激物或致敏物。在兔子中，皮膚LD50超過2000mg/kg體 重。相似地，其對于兔眼刺激最小。不能得到急性口服LD50,因?yàn)樽銐虻木酆衔锏牟骞苁遣?可能的。在乙酸乙酯中制造的聚陰離子卡波姆聚合物上的結(jié)果與這些聚合物的期望結(jié)果是 一致的。即，它不是兔子皮膚的刺激物；未稀釋的聚合物對兔子眼是溫和到中等的刺激物， 而1 %溶液（中和或未中和的）不是眼刺激物；施涂與人皮膚不會造成任何皮膚刺激或致 敏。在大鼠中的LD50超過5000mg/kg并且在兔子中皮膚LD50超過2000mg/kg。
[0064] 考慮到聚陰離子卡波姆聚合物的物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)中的相似性，本領(lǐng)域技術(shù)人員會 認(rèn)為聚陰離子卡波姆聚合物會產(chǎn)生與CARB0P0L971PNF(TM)相似的結(jié)果。因此，本領(lǐng)域技 術(shù)人員容易選擇任意數(shù)量的可得的聚陰離子卡波姆聚合物來產(chǎn)生本文中基于前述的令人 驚訝的結(jié)果。
[0065] 當(dāng)選擇低粘度，聚陰離子聚合物時，平均粘度低于25000cP(25°C，布氏RVT， 20rpm，中和至ρΗ7· 3-7. 8,0· 5重量％膠漿，軸#6)、低于20000cP或低于15000cP。低粘度， 聚陰離子聚合物是優(yōu)選的示例是CARB0P0L971PNF(TM)。
[0066]Env多肽
[0067]Env多肽包含衍生自包膜蛋白，優(yōu)選衍生自HIVEnv的分子。HIV-I的包膜蛋白是 約160kDa的糖蛋白（gpl60)。在宿主細(xì)胞的病毒感染期間，由宿主細(xì)胞蛋白酶切割gpl60 來形成gpl20和整合?旲蛋白，gp41。gp41蛋白被鋪定（并且跨越）在病毒顆粒的?旲雙層中， 而gpl20部分凸入周圍的環(huán)境中。由于在gpl20和gp41之間沒有共價連接，從病毒顆粒和 感染的細(xì)胞的表面釋放游離的gpl20。Env多肽也可以包含gpl40多肽。Env多肽可以單體 或三聚體存在。
[0068]Env多肽包含衍生自Env多肽的gpl20區(qū)的分子。gpl20的一級氨基酸序列是具有 約60000道爾頓的多肽核心的大約511個氨基酸。多肽由N-連接的糖基化廣泛修飾以增 加分子的表觀分子量至120000道爾頓。gpl20的氨基酸序列（和因此的gpl40和gpl60) 含有由5個高變的結(jié)構(gòu)域分散的5個相對保守的結(jié)構(gòu)域。在HIV-1hxb_2毒株的gpl20 -級 序列中18半胱氨酸殘基的位置，和在gpl20序列中24N-連接的糖基化位點(diǎn)的13的位置對 于如果不是全部的大多數(shù)gpl20序列是共同的。高變結(jié)構(gòu)域含有廣泛的氨基酸取代、插入 和缺失。盡管有這種變異，如果不是全部的大多數(shù)gpl20序列保留了病毒結(jié)合到病毒受體 CD4的能力。
[0069]Env多肽（例如，gpl20、gpl40和gpl60)包含形成β-折疊的4條反向平行的 β-鏈（β-2、β-3、β-20和β-21)的"橋連的片層"。從一對β-鏈（β-2和β-3)擠出 的是兩個環(huán)，Vl和V2。β-2折疊大約出現(xiàn)在氨基酸殘基113(Cys)到氨基酸殘基117(Thr) 而β-3大約出現(xiàn)在氨基酸殘基192(Ser)到氨基酸殘基194(Ile)，相對于SF-162。"V1/V2 區(qū)"大約出現(xiàn)在氨基酸位置120 (Cys)到殘基189 (Cys)，相對于SF-162。（參見例如Wyatt 等，（1995)J.Virol. 69 :5723-5733;Stamatatos等，（1998)J.Virol. 72 :7840-7845)。從第 二對β-鏈（β-20和β-21)擠出的是一個"小環(huán)"結(jié)構(gòu)，本文中也稱為"橋連片層小環(huán)"。 根據(jù)本文的教導(dǎo)和W000/39303,小環(huán)和橋連片層小環(huán)的位置可以相對于ΗΧΒ-2確定。表1 提供了一列編碼基于SF162鏈和相應(yīng)的SEQIDNO的代表性Env多肽的合成基因。
[0070]表 1 :
[0071]
[

【權(quán)利要求】
1. 一種免疫原性組合物，所述組合物包含與聚陰離子卡波姆聚合物形成復(fù)合物的Env 多肽。
2. -種免疫原性組合物，其包含含有低粘度、聚陰離子卡波姆聚合物的Env多肽。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述聚陰離子卡波姆聚合物 不含苯。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述聚陰離子卡波 姆聚合物的濃度為約〇. 01% (w/ν)-約2. 0% (w/v)。
5. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述聚陰離子卡波 姆聚合物的濃度為約〇. 01% (w/ν)-約0. 5% (w/v)。
6. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述聚陰離子卡波 姆聚合物的濃度為約〇. 01% (w/ν)-約0. 2% (w/v)。
7. 如權(quán)利要求1和3-6中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述聚陰離子聚 合物包含 CARBOPOL971P NF(TM)、CARBOPOL974P NF(TM)或其組合。
8. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述聚陰離子聚合 物包含 CARBOPOL971P NF(TM)。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述Env多肽是三聚 的。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述Env多肽包含 一個或多個突變。
11. 如權(quán)利要求10所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述一個或多個突變選自在 防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位點(diǎn)中的突變、在糖基化位點(diǎn)中的突 變、VI區(qū)的缺失、V2區(qū)的缺失以及上述的組合。
12. 如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述一個或多個突變包含在 防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位點(diǎn)中的突變以及V2區(qū)的缺失。
13. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述Env多肽包含 gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽。
14. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述Env多肽包含 gpl40Env多肽或衍生自gpl40Env多肽的多肽。
15. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述Env多肽包含 gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。
16. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述Env多肽包含 與SEQ ID NO :22或23有至少90%序列相同性的氨基酸序列。
17. 如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還包 含選自與所述Env多肽不同HIV亞型的第二Env多肽。
18. 如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還包 含選自與所述Env多肽相同HIV亞型的不同毒株的第二Env多肽。
19. 如權(quán)利要求17或18所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述第二Env多肽和所 述Env多肽與所述聚陰離子卡波姆聚合物形成混合的復(fù)合物。
20. 如權(quán)利要求17或18所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述第二Env多肽與第 二聚陰離子卡波姆聚合物形成單獨(dú)的復(fù)合物。
21. 如權(quán)利要求20所述的免疫原性復(fù)合物，其特征在于，所述聚陰離子卡波姆聚合物 和所述第二聚陰離子卡波姆聚合物是相同類型的聚合物。
22. 如權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述Env多肽和 所述第二Env多肽衍生自HIV B亞型毒株和HIV C亞型毒株或反之亦然。
23. 如權(quán)利要求1-22中任一所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還包含 一種或多種額外的HIV多肽。
24. 如權(quán)利要求23所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述一種或多種額外的HIV多 肽選自Gag多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。
25. 如權(quán)利要求23或24所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述一種或多種額外的 HIV多肽包含降低或消除所述多肽的活性而不負(fù)面影響所述額外的HIV多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答 的能力的突變。
26. 如權(quán)利要求1-25所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還包含佐劑。
27. 如權(quán)利要求26所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述佐劑是水包油乳液。
28. 如權(quán)利要求27所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述水包油乳液是包含角鯊 烷的亞微米制劑。
29. 產(chǎn)生按照權(quán)利要求1和3-28中任一項(xiàng)的免疫原性組合物的方法，所述方法包含： (a) 在pH低于溶液中所述Env多肽的pi的條件下將所述聚陰離子卡波姆聚合物與所 述Env多肽接觸； (b) 所述聚陰離子卡波姆聚合物與所述Env多肽一起孵育使得所述Env多肽形成與所 述聚陰離子卡波姆聚合物形成復(fù)合物。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述pH為3至6之間。
31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述pH為3至5之間。
32. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述pH為3至4之間。
33. 如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在接觸步驟（a)后所述聚陰 離子卡波姆聚合物的濃度為約〇. 01% (w/ν)-約2. 0% (w/v)。
34. 如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在接觸步驟（a)后所述聚陰 離子卡波姆聚合物的濃度為約〇. 01% (w/ν)-約0. 5% (w/v)。
35. 如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在接觸步驟（a)后所述聚陰 離子卡波姆聚合物的濃度為約〇. 01% (w/ν)-約0. 2% (w/v)。
36. 如權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述聚陰離子卡波姆聚合物 不含苯。
37. 如權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述聚陰離子聚合物包含 CARB0P0L971P NF(TM)、CARB0P0L974P NF(TM)或其組合。
38. 如權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述聚陰離子聚合物包含 CARB0P0L971P NF(TM)。
39. 如權(quán)利要求29-38中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Env多肽是三聚的。
40. 如權(quán)利要求29-39中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含一個或多 個突變。
41. 如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述一個或多個突變選自在防止gpl40多 肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位點(diǎn)中的突變、在糖基化位點(diǎn)中的突變、VI區(qū)的缺 失、V2區(qū)的缺失以及上述的組合。
42. 如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述一個或多個突變包含在防止gpl40多 肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位點(diǎn)中的突變以及V2區(qū)的缺失。
43. 如權(quán)利要求29-42中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含gpl60Env 多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽。
44. 如權(quán)利要求29-42中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含gpl40Env 多肽或衍生自gpl40Env多肽的多肽。
45. 如權(quán)利要求29-42中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含gpl20Env 多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。
46. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含與SEQ IDNO :22或23 有至少90%序列相同性的氨基酸序列。
47. 如權(quán)利要求29-46中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包含選自與所述 Env多肽不同HIV亞型的第二Env多肽。
48. 如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述第二Env多肽與含有所述Env多肽的 所述聚陰離子卡波姆聚合物孵育使得所述Env多肽和所述第二Env多肽同時與所述聚陰離 子卡波姆聚合物形成復(fù)合物。
49. 如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述第二Env多肽與第二聚陰離子卡波姆 聚合物形成單獨(dú)的復(fù)合物。
50. 如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述聚陰離子卡波姆聚合物和所述第二 聚陰離子卡波姆聚合物是相同類型的聚合物。
51. 如權(quán)利要求47-50中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Env多肽和所述第二 Env多肽衍生自HIV B亞型毒株和HIV C亞型毒株或反之亦然。
52. 如權(quán)利要求29-51中任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包含加入一種或多 種額外的HIV多肽。
53. 如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述一種或多種額外的HIV多肽選自Gag 多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。
54. 如權(quán)利要求52或53所述的方法，其特征在于，所述一種或多種額外的HIV多肽包 含降低或消除所述多肽的活性而不負(fù)面影響所述額外的HIV多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力的 突變。
55. 如權(quán)利要求29-54中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包含向所述溶液 加入佐劑。
56. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述佐劑是水包油乳液。
57. 如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述水包油乳液是包含角鯊?fù)榈膩單⒚?制劑。
58. -種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含向所述對象給予按照權(quán)利要求 1-28中任一項(xiàng)或按照權(quán)利要求29-57中任一項(xiàng)的方法制備的免疫原性組合物，從而產(chǎn)生對 所述Env多肽的免疫應(yīng)答。
59. 如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述免疫原性組合物通過肌肉內(nèi)、粘膜 內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)給藥。
60. 如權(quán)利要求58或59中所述的方法，其特征在于，所述對象是哺乳動物。
61. 如權(quán)利要求58-60中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
62. 如權(quán)利要求58-61中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包含體液免疫 應(yīng)答。
63. 如權(quán)利要求58-62中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包含細(xì)胞免疫 應(yīng)答。
64. -種在對象中產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含： (a) 在允許Env多肽表達(dá)的條件下，由用于表達(dá)所述Env多肽的基因遞送載體轉(zhuǎn)染所述 對象的細(xì)胞，從而產(chǎn)生對所述Env多肽的免疫應(yīng)答； (b) 向所述對象給予按照權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)或按照權(quán)利要求29-57中任一項(xiàng)的方 法制備的免疫原性組合物，從而增強(qiáng)對所述Env多肽的免疫應(yīng)答。
65. -種在對象中產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的方法，在所述對象中先前已經(jīng)在允許Env多 肽表達(dá)的條件下由用于表達(dá)Env多肽的基因遞送載體轉(zhuǎn)染進(jìn)所述對象的細(xì)胞，從而已經(jīng)產(chǎn) 生對所述Env多肽的免疫應(yīng)答，所述方法包含向所述對象給予按照權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng) 或按照權(quán)利要求29-57中任一項(xiàng)的方法制備的免疫原性組合物，從而增強(qiáng)對所述Env多肽 的免疫應(yīng)答。
66. 如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述免疫原性組合物通過肌肉內(nèi)、粘膜 內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)給藥。
67. 如權(quán)利要求65或66中所述的方法，其特征在于，所述對象是哺乳動物。
68. 如權(quán)利要求65-67中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
69. 如權(quán)利要求65-68中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包含體液免疫 應(yīng)答。
70. 如權(quán)利要求65-69中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包含細(xì)胞免疫 應(yīng)答。
【文檔編號】A61K39/385GK104271155SQ201280055731
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月14日
【發(fā)明者】S·W·巴尼特, A·德伊 申請人:諾華股份有限公司