Bcma和cd3的結合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含第一和第二結合結構域的至少雙特異性的結合分子，其中第一結合結構域能夠結合至BCMA的表位簇，且第二結合結構域能夠結合至T細胞CD3受體復合物。此外，本發(fā)明提供編碼所述結合分子的核酸序列，包含所述核酸序列的載體以及用所述載體轉化或轉染的宿主細胞。更進一步地，本發(fā)明提供用于生產本發(fā)明所述結合分子的方法，所述結合分子的醫(yī)學用途以及包含所述結合分子的試劑盒。
【專利說明】BCMA和CD3的結合分子
【背景技術】
[0001]BCMA(B-細胞成熟抗原，TNFRSF17, CD269)是一種屬于TNF受體超家族的跨膜蛋白。BCMA最初報道為人成熟B淋巴細胞的高爾基體內的整合膜蛋白，即，作為細胞內蛋白(Gras 等,(1995) Internat1nal Tmmunol 7 (7):1093-1105),其表明 BCMA 看起來在 B-細胞發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。Gras等的發(fā)現(xiàn)可能與這樣的事實有關，即Gras等描述的BCMA蛋白由于染色體易位是一種BCMA與IL-2之間的融合蛋白。同時，由于其與也稱為TALL-1或TNFSF13B的配體BAFF (B細胞活化因子)和APRIL (增殖誘導配體)推測的必須相互作用，BCMA也被設定為對B-細胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)所必須的B-細胞標記物(Schliemann等，(2001) Science293 (5537):2111-2114)。
[0002]BCMA的表達限于B-細胞譜系且主要存在于漿細胞和漿母細胞上，并在一定程度上存在于記憶B-細胞上，但是實際上不存在于外周和純真B-細胞上。BCMA也在多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞上表達。BCMA與其家族成員跨膜激活劑及親環(huán)蛋白配體作用因子(TACI)和TNF家族受體(BAFF-R)的B細胞活化因子一起調節(jié)體液免疫、B-細胞發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的不同方面。BCMA的表達出現(xiàn)在B-細胞分化作用的較后期并有利于漿母細胞和漿細胞在骨髓中的長期存活。小鼠中BCMA基因的靶向缺失不會影響成熟B-細胞的產生、體液免疫應答的質量和幅度、生發(fā)中心的形成以及短暫壽命的漿細胞的生成。然而，這種小鼠骨髓中長壽命漿細胞的數量顯著降低，這表明了 BCMA對其存活的重要性(O’ Connor等，2004)。
[0003]根據這一發(fā)現(xiàn)，BCMA也支持多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞的生長和存活。Novak等發(fā)現(xiàn)MM細胞系和最新分離的MM細胞在其細胞表面表達BCMA和TACI蛋白并且在其細胞表面具有 BAFF-R 蛋白的可變表達(Novak 等，(2004) Bloodl03 (2):689-694)。
[0004]多發(fā)性骨髓瘤(MM)是第二大常見惡性血液病且其占所有癌癥死亡例的2%。MM是一種異質性疾病并且多數是由t (11 ;14)、t(4 ;14)、t(8 ;14)、del (13)、del (17)(除其他外)的染色體易位引起的(Drach 等，(1998)Blood92(3):802-809 ;Gertz 等，(2005)Bloodl06(8):2837-2840 ;Facon 等:，(2001) Blood97 (6):1566-1571) ? MM 受累患者可能經歷因骨髓浸潤、骨質破壞、腎衰竭、免疫缺陷以及癌癥診斷的心理負擔而經歷多種與疾病相關的癥狀。截至2006年，麗的5年相對生存率約為34%，這表明麗是一種至今無治愈先例的難以治療的疾病。
[0005]令人振奮的新療法，如化療和干細胞移植的方法，已可供使用并且其能提高生存率，但是常常伴有有害的副作用，因此MM仍然難以治療(Lee等，(2004) J Natl Compr CaneNetwS (4) =379-383)。迄今為止，對于多發(fā)性骨髓瘤患者而言兩種最常用的治療選擇是類固醇、沙利度胺、來那度胺、硼替佐米或多種細胞毒素試劑的組合，和對于較年輕的患者采用高劑量化療理念配合自體干細胞移植。
[0006]多數的移植為自體型，即使用患者自身的細胞。這種移植，盡管不具有治愈性，但其顯示延長選定患者的生命。其可在新診斷的患者中作為初始療法或在復發(fā)時進行。有時為了適當的控制疾病，可能會建議選定患者采用一種以上的移植。
[0007]用于治療該疾病的化療試劑是環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和美法侖，與免疫調節(jié)劑如沙利度胺(Thalomid? )、來那度胺(Revlimid? )、硼替佐米(Velcade? )和皮質類固醇(如地塞米松)的組合療法已經成為用于治療新確診患者和化療或移植均失敗的疾病晚期患者中骨髓瘤的重要選擇。
[0008]目前所用療法是通常非治愈性的。因為高齡、其它嚴重疾病的存在或其它身體上的限制，干細胞移植可能不是用于多數患者的選擇?；焹H能部分控制多發(fā)性骨髓瘤，且極少達到完全緩解。因此，迫切需要新的創(chuàng)新療法。
[0009]Bellucci等(Blood, 2005 ；105(10))在已接受供者淋巴細胞輸注(DLI)的多發(fā)性骨髓瘤患者中鑒別出了 BCMA-特異性抗體。這些患者的血清能夠介導由ADCC和CDC對BCMA-特異性細胞裂解并且僅在具有抗腫瘤應答的患者中檢測到(4/9)，而未在非應答患者中檢測到(0/6)。作者推測，BCMA-特異性抗體的誘導作用有利于骨髓瘤細胞的消除和患者的長期緩解。
[0010]Ryan 等(Mo1.Cancer Ther.2007 ；6 (11))報道了一種拮抗型 BCMA-特異性抗體的產生，其阻止與在正常和惡性B-細胞中強效促存活信號轉導通路有關的NF- K B活化。另外，該抗體在體外給多發(fā)性骨髓瘤細胞系賦予強效的抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)，這由Fe-工程化顯著增強。
[0011]在對抗血源性腫瘤或自身免疫性障礙方面的其它方法專注于BAFF和APRIL(即TNF配體超家族的配體)與其由BAFF和/或APRIL活化的受體TAC1、BAFF_R和BCMA之間的相互作用。例如，通過將人免疫球蛋白的Fe-結構域與Zymogenetics公司的TACI融合產生了阿塞西普(TAC1-1g)，來中和這兩種配體并阻止受體的活化。阿塞西普目前正處于用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE，第III期)多發(fā)性硬化癥(MS，第II期)及類風濕性關節(jié)炎(RA，第II期)的臨床試驗中，以及處于用于治療B細胞惡性腫瘤慢性淋巴細胞白血病(CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及麗的第I期臨床試驗中。在臨床前研究中，阿塞西普在體外(Moreaux 等，Blood, 2004,103)和體內(Yaccoby 等，Leukemia, 2008, 22,406-13)降低了初始麗細胞和麗細胞系的生長和存活，這表明了 TACI配體對于麗細胞的相關性。由于多數MM細胞及其衍生的細胞系都表達BCMA和TACI，兩者的受體可能有利于配體介導的生長與存活。這些數據表明，對BCMA和TACI的拮抗作用可能有益于漿細胞障礙的治療。另外，已經描述了與TACI交叉反應的BCMA-特異性抗體(W002/066516)。
[0012]人類基因組科學公司和葛蘭素史克已經開發(fā)出一種稱為貝利木單抗的靶向BAFF的抗體。貝利木單抗阻斷可溶性BAFF與其受體BAFF-R、BCMA及TACI在B細胞上的結合。貝利木單抗不直接結合B細胞，但是通過結合BAFF，貝利木單抗抑制包括自體反應性B細胞的B細胞的存活，并減少B細胞分化為產生免疫球蛋白的漿細胞。
[0013]然而，盡管存在BCMA、BAFF-R和TACI (即屬于TNF受體超家族的B細胞受體)及其配體BAFF和APRIL服從在對抗癌癥和/或自身免疫性障礙中的治療方案這一事實，仍然需要據喲用于治療這種醫(yī)學病癥的其它可用選擇。
【發(fā)明內容】
[0014]因此，本文提供了一種結合分子形式的用于解決這一問題的手段和方法，該結合分子為至少雙特異性的，具有一個與細胞毒性細胞(即細胞毒性T細胞)結合的結合結構域和與BCMA結合的第二結合結構域。
[0015]需要注意的是，除非本文另有明確說明，本文所用單數形式“一種”、“一個”和“該”包含所提及的復數形式。因而，例如，提到“一種試劑”包括此類不同試劑的一種或多種，及提到“該方法”包括提到本領域普通技術人員已知的能夠修飾或取代本文所述方法的等同步驟和方法。
[0016]除非本文另有說明，一系列要素前的術語“至少”應理解為是指這一系列的每個要素。本領域技術人員采用不超出常規(guī)實驗即能認識到或確定許多與本文描述的本發(fā)明具體實施方案的等同情況。本發(fā)明旨在涵蓋這些等同情況。
[0017]本文所用術語“和/或”包括“和”、“或”及“所述術語連接的要素的所有或任意其它組合”的含義。
[0018]本文所用術語“大約”或“接近”表示在給出值或范圍的±20%內，優(yōu)選在±15%內，更優(yōu)選在± 10 %內，最優(yōu)選在± 5 %內。
[0019]在本文整個說明書及以下的權利要求書中，除非上下文另有所指，詞語“包含(comprise) ”及其變形如“包含(comprises) ”和“包含(comprising) ”應理解為意指包括所述整數或步驟或者整數或步驟的組，但不排除任意其它整數或步驟或者整數或步驟的組。本文所用術語“包含”又可用術語“含有”或“包括”替代，或本文所用術語有時可用術語“具有”替代。
[0020]本文所用“由...組成”排除未在要求保護的要素中具體提到的任一要素、步驟或成分。當本文使用“基本上由...:組成”時不排除對權利要求的基本和新特征沒有重大影響的材料或步驟。
[0021]在本文每個實例中任一術語“包含”、“基本上由...組成”和“由...組成”可用其它二詞中任一取代。
[0022]
【發(fā)明內容】
[0023]表位簇1、2、3、4、5、6、7由BCMA的胞外結構域組成?！癇CMA的胞外結構域”或“BCMAECD”是指基本上不含BCMA跨膜結構域及胞質結構域的BCMA的一種形式。技術人員可以理解，鑒定的本發(fā)明所述BCMA多肽的跨膜結構域是根據本領域用于識別這種疏水結構域的常規(guī)采用標準進行鑒別的?？缒そY構域的精確邊界可以變化，但最可能在本文具體提及的結構域的任一末端處變化不超過約5個氨基酸。優(yōu)選的BCMA E⑶示于SEQ ID NO:1007o一種優(yōu)選的鼠ECD示于SEQ ID NO:1008o
[0024]表位簇I對應于人BCMA胞外結構域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸I至7，表位簇2對應于人BCMA胞外結構域(SFQ ID NO:1007)的氨基酸8至21，表位簇3對應于人BCMA胞外結構域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸24至41，表位簇4對應于人BCMA胞外結構域(SEQID NO:1007)的氨基酸42至54，表位簇5對應于人BCMA胞外結構域(SEQ ID NO:1007)氨基酸22，表位簇6對應于人BCMA胞外結構域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸25，表位簇7對應于人BCMA胞外結構域(SEQ ID NO:1007)的氨基酸39。設想到表位簇5至7代表單一氨基酸置換。
[0025]T細胞CD3受體復合物是一種蛋白質復合物，由四個不同的鏈組成。在哺乳動物中，該復合物包含一個⑶3 Y鏈、一個⑶3 δ鏈及兩個⑶3 ε (epsilon)鏈。這些鏈與稱為T細胞受體(TCR)的分子和ζ鏈結合從而在T淋巴細胞中產生活化信號。
[0026] 由雙特異性分子通過募集T細胞導致的靶細胞的重新定向裂解涉及溶細胞突觸的形成和穿孔素及顆粒酶的傳遞。參與的T細胞能夠進行連續(xù)的靶細胞裂解，且不會受到干擾肽抗原處理及傳遞的免疫逃逸機制或克隆T細胞分化的影響；參見，例如，W02007/042261。
[0027]從本公開的意義上說，術語“結合分子”表示能夠(特異性地)與靶分子BCMA和CD3結合、相互作用或識別的任意分子。根據本發(fā)明所述，優(yōu)選的結合分子是多肽。該種多肽可包括蛋白質性部分和非蛋白質性部分(如化學連接物或化學交聯(lián)劑，如戊二醛)。
[0028]如此說來，結合分子為所述一種或多種結合結構域提供了支架，從而使所述結合結構域能與靶分子BCMA和CD3結合/相互作用。例如，這種支架可以由蛋白質A提供，特別是其Z-結構域(親和體)、I_E7 (免疫蛋白)、BPTI/APPI (庫尼茨結構域)、Ras-結合蛋白AF-6 (PDZ-結構域)、卡律布德蝎毒素(蝎毒素)、CTLA-4、Min-23 (打結素)、脂質運載蛋白(anticalin)、新制癌菌素、纖連蛋白結構域、錨蛋白共有重復結構域或硫氧還原蛋白(Skerra, Curr.0pin.B1technol.18,295-304 (2005) ；Hosse 等，Protein Sc1.15,14-27(2006) ；Nicaise 等，Protein Sc1:13，1882-1891 (2004) ；Nygren 和 Uhlen, Curr.0pin.Struc.B1l.7，463-469 (1997))。優(yōu)選的結合分子是抗體。
[0029]也可以設想到本發(fā)明所述結合分子除其與靶分子BCMA和CD3結合的功能外還具有其它功能。在這種情況下，結合分子是三-或多功能結合分子，其通過與BCMA結合靶向漿細胞，通過CD3結合介導細胞毒性T細胞的活性并提供進一步的功能，如通過募集效應細胞如NK細胞來介導抗體-依賴的細胞毒性的功能完整的Fe恒定結構域、標記(熒光等)、治療劑如毒素或放射性核素和/或增強血清半衰期的方式等。
[0030]本文所用術語“雙特異性”是指包含至少第一和第二結合結構域的結合分子，其中第一結合結構域能夠結合至一個抗原或靶標，第二結合結構域能夠結合至另一抗原或靶標。本發(fā)明所述“結合分子”也包含多特異性結合分子，如三特異性結合分子，后者包含三個結合結構域。
[0031]設想到，結合分子由噬菌體展示或文庫篩選方法產生(或可得到)，而不是通過將CDR序列從預先存在的(單克隆)抗體嫁接到支架中，所述支架例如本文所公開的支架。
[0032]術語“結合結構域”與本發(fā)明聯(lián)合表征這樣的結構域，該結構域能夠特異性與靶分子BCMA和CD3上給定的靶表位或給定靶位點結合/相互作用。
[0033]結合結構域可源自結合結構域供體，如抗體、蛋白質A、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI (庫尼茨結構域)、Ras-結合蛋白AF-6(PDZ-結構域)、卡律布德蝎毒素(蝎毒素)、CTLA-4、Min-23 (打結素)、脂質運載蛋白(anticalin)、新制癌菌素、纖連蛋白域、錨蛋白共有重復結構域或硫氧還原蛋白(Skerra, Curr.0pin.B1technol.18, 295-304 (2005)；Hosse 等，Protein Sc1.15，14-27 (2006) ;Nicaise 等，Protein Sc1.13，1882-1891 (2004)；Nygren 和 Uhlen, Curr.0pin.Struc.B1l.7,463-469 (1997))。優(yōu)選的結合結構域源自抗體。設想到，本發(fā)明所述結合結構域包括至少前述結合結構域的任一的所述部分，要求該部分與靶分子BCMA和CD3上給定的靶表位或給定靶位點結合/相互作用。
[0034]設想到，前述結合結構域供體的結合結構域以這些供體的這一部分為特征，該部分負責結合相應的靶標，即當這一部分從結合結構域供體移除時，所述供體就失去了其結合能力。“失去”是指與結合供體相比結合能力至少下降50%。繪制這些結合位點的圖譜的方法為本領域熟知的——因此，其在本領域技術人員定位/繪制結合結構域供體的結合位點且由此從相應的結合結構域供體“衍生”出所述結合結構域的標準知識范圍內。
[0035]術語“表位”是指與結合結構域特異性結合的抗原上的位點，如抗體或免疫球蛋白或者抗體或免疫球蛋白的衍生物或片段?！氨砦弧睘榭乖缘?，因此本文所述術語表位有時也指“抗原性結構”或“抗原決定簇”。因此，所述結合結構域為“抗原-相互作用-位點”。所述結合/相互作用也可理解為定義“特異性識別”。在一個實例中，所述與靶分子BCMA和CD3上給定的靶表位或給定靶位點(特異性)結合/相互作用的結合結構域是抗體或免疫球蛋白，且所述結合結構域為抗體或免疫球蛋白的VH和/或VL區(qū)。“表位”既可由鄰接氨基酸也可由通過蛋白質的三級折疊而并列的非鄰接氨基酸形成。
[0036]“線性表位”是其中氨基酸一級序列含有識別表位的表位。在一個特定的序列中，線性表位通常包括至少3個或至少4個、更通常至少5個或6個或至少7個、例如約8個至約10個氨基酸。
[0037]與線性表位相比，“構象表位”是這樣的表位，其中包含所述表位的氨基酸一級序列不是識別的表位的唯一定義部件(如，其中氨基酸的一級序列不一定被結合結構域識別的表位)。典型的構象表位相對于線性表位包含數量增加的氨基酸。關于構象表位的識別，所述結合結構域識別抗原、優(yōu)選肽或蛋白質或其片段的三維結構(在本發(fā)明的上下文中，任一結合結構域的抗原包含在BCMA蛋白內)。例如，當蛋白分子折疊形成三維結構時，形成構象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架成為并列形式，從而使該抗體能夠識別所述表位。確定表位構象的方法包括、但不限于，X-射線晶體學、二維核磁共振(2D-NMR)譜和定點自旋標記法及電子順磁共振(EPR)光譜。另外，本文提供的實例描述了檢測給定結合結構域是否與給定蛋白、特別是BCMA的一個或多個表位簇結合的進一步的方法。
[0038]本文所用術語“表位簇”表示位于抗原的限定鄰接部分中的表位的整體。表位簇可以包含一個、兩個或更多個表位。在本文中本發(fā)明所定義的在BCMA的胞外結構域中的表位簇如上所述并示于表1。
[0039]術語“(能夠)與...結合”、“特異性識別”、“指向”和“與...相互作用”是指與依照本發(fā)明所述結合結構域能夠特異性與表位的一個或多個、優(yōu)選至少兩個、更優(yōu)選至少三個且最優(yōu)選至少四個氨基酸結合。
[0040]本文所用術語“特異性相互作用”、“特異性結合”或“特異性的結合”是指結合結構域對特定蛋白或抗原表現(xiàn)出可估量的親和性，并且通常不會對除BCMA或CD3之外的蛋白質或抗原表現(xiàn)出顯著的反應性。“可估量的親和性”包括以約10_6M(KD)或更強的親和性結合。優(yōu)選地，當結合親和性為約ΙΟ-12至1H2至1H2至10-10Μ、Kr11至10、、優(yōu)選為約10_n至10_9M時，所述結合被認為是特異性的。尤其是通過將所述結合結構域與靶蛋白或抗原的反應與所述結合結構域與除BCMA或CD3之外的蛋白質或抗原的反應進行比較，可以測定結合結構域是否特異性與靶標反應或結合。優(yōu)選地，本發(fā)明所述結合結構域基本上不結合或不能夠結合除BCMA或CD3以外的蛋白質或抗原(即，第一結合結構域不能與BCMA以外的蛋白質結合且第二結合結構域不能與CD3以外的蛋白質結合)。
[0041]人們認為特異性結合受到結合結構域和抗原的氨基酸序列中的特異性基序的影響。因此，結合的發(fā)生是由于其一級、二級和/或三級結構以及所述結構的二級修飾的結果?？乖?相互作用-位點與其特異性抗原之間的特異性相互作用可能導致所述位點與抗原的簡單結合。另外，作為另外一種選擇或除此之外，抗原-相互作用-位點與其特異性抗原的特異性相互作用可能導致信號的啟動，如由于抗原構象的改變、抗原寡聚化等的誘導坐寸O
[0042]術語“基本上不結合”或“不能夠結合”是指本發(fā)明所述結合結構域不結合除BCMA或CD3之外的另一蛋白質或抗原，即當與BCMA或CD3的結合分別設定為100%時，該結合結構域與除BCMA或CD3以外的蛋白或抗原表現(xiàn)出的反應性不超過30%，優(yōu)選不超過20%，更優(yōu)選不超過10%，特別優(yōu)選不超過9%、8%、7%、6%或5%。
[0043]“蛋白質”(包含其片段，優(yōu)選生物活性片段，以及通常具有少于30個氨基酸的肽)包含通過共價肽鍵彼此相連的一個或多個氨基酸(從而產生一個氨基酸鏈)。本文所用術語“多肽”描述了一組由超過30個氨基酸組成的分子。多肽可更進一步形成多聚體如二聚體、三聚體及更高的低聚體，即由多于一個多肽分子組成。形成此類二聚體或三聚體等的多肽分子可以相同或不同。這種多聚體對應的較高階結構因此稱為同源二聚體或異源二聚體，同源三聚體或異源三聚體等。一個異源多聚體的實例是抗體分子，在其天然存在的形式中由兩個相同的輕多肽鏈和兩個相同的重多肽鏈組成。術語“多肽”和“蛋白質”也指經天然修飾的多肽/蛋白，其中所述修飾由如蛋白質翻譯后修飾(如糖基化、乙?；⒘姿峄?產生。本文所提到的“多肽”也可以經化學修飾，如經聚乙二醇化。這些修飾是本領域熟知的。
[0044]術語“氨基酸”或“氨基酸殘基”通常指具有其本領域公知定義的氨基酸，如選自以下的氨基酸:丙氨酸(Ala或A);精氨酸(Arg或R);天冬酰胺(Asn或N);天冬氨酸(Asp或D);半胱氨酸(Cys或C);谷氨酰胺(Gln或Q);谷氨酸(Glu或E);甘氨酸(Gly或G);組氨酸(His或H);異亮氨酸(He或I);亮氨酸(Leu或L);賴氨酸(Lys或K);甲硫氨酸(Met或Μ);苯丙氨酸(Phe或F) ;脯氨酸(Pro或P);絲氨酸(Ser或S);蘇氨酸(Thr或T);色氨酸(Trp或W);酪氨酸(Tyr或Y);及纈氨酸(Val或V)，盡管可以根據需要使用修飾、合成或罕見的氨基酸。通常，可以根據所具有的非極性側鏈(如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val);具有負電荷的側鏈(如Asp、Glu);具有正電荷的側鏈(如Arg、His、Lys)或不帶電荷的極性側鏈(如 Asn、Cys> Gin、Gly、His、Met、Phe> Ser、Thr、Trp 和 Tyr)將氨基酸分組。
[0045]術語“抗體”的定義包括如單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體及人抗體的實施方案。除全長抗體之外，該定義還包括抗體衍生物及抗體片段，尤其是Fab片段?？贵w片段或衍生物進一步包括F (ab' )2、Fv、scFv片段或單結構域抗體如結構域抗體或納米抗體、包含可能為VHH、VH或VL的僅一個可變結構域的單可變結構域抗體或免疫球蛋白單可變結構域，其獨立于其它V區(qū)或結構域特異性結合抗原或表位；參見，例如Harlow和Lane (1988)和(1999),上述引文;Kontermann 和 Diibel, Antibody Engineering, Springer,2nd ed.2010and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, CambridgeUniversity Press2009。所述術語也包括雙鏈抗體或雙親和性再祀向(DART)抗體。進一步設想到(雙特異性)單鏈雙鏈抗體、串聯(lián)雙鏈抗體(Tandab’ s)、由如下所列結構示例的“微抗體”:(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2 或(scFv-CH3_scFv)2 ;“Fc DART 抗體”及“IgG DART”抗體；及多鏈抗體如三鏈抗體。
[0046]免疫球蛋白單可變結構域不僅包括分離的抗體單可變結構域多肽，而且還包括較大多肽，該種多肽含有抗體單可變結構域多肽序列的一個或多個單體。
[0047]免疫球蛋白單可變結構域不僅包括分離的抗體單可變結構域多肽，而且還包括較大多肽，該種多肽含有抗體單可變結構域多肽序列的一個或多個單體。
[0048]本領域已知可以用于這種抗體和/或其片段的生產的各種方法。因此，可以通過模擬肽生產(抗體)衍生物。另外，所述用于生產單鏈抗體的技術(尤其參見美國專利 4，946，778，Kontermann 和 Dubel (2010)，上述引文和 Little (2009)，上述引文)可以適用于生產對所選定的多肽具有特異性的單鏈抗體。此外，轉基因動物可用于表達對本發(fā)明的多肽和融合蛋白具有特異性的人源化抗體。對于單克隆抗體的制備，可以采用提供通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)生產的抗體的任何技術。此類技術的實例包括雜交瘤技術(K0hler和Milstein Nature256 (1975)，495-497)、三源雜交瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor，Immunology Today4 (1983), 72)及用于生產人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc.(1985), 77-96)?？梢允褂肂IAcore系統(tǒng)中的表面等離子體共振來增加噬菌體抗體與靶多肽(例如CD3 ε )的表位結合的效率(Schier, Human Antibodies Hybridomas7 (1996) ,97-105 ；Malmborg,J.1mmunol.Methodsl83 (1995)，7-13)。另外設想到在本發(fā)明的上下文中，術語“抗體”包含可以在下文所述宿主中表達的抗體構建體，如可以通過特別是病毒或質粒載體轉染和/或轉導的抗體構建體。
[0049]另外，本文所用術語“抗體”也涉及本文描述的與所述抗體具有相同特異性的所述抗體的衍生物或變體?！翱贵w變體”的實例包括非人抗體的人源化變體、“親和性成熟的”抗體(參見例如 Hawkins 等.J.Mol.B1l.254,889-896 (1992)和 Lowman 等，B1chemistry30,10832-10837(1991))和效應功能改變的抗體突變體(參見例如美國專利5，648，260，Kontermann 和 Diibel (2010)，上述引文和 Little (2009)，上述引文)。
[0050]一種制備抗體的示例性方法包括蛋白質表達文庫(如噬菌體或核糖體展示文庫)的篩選。噬菌體展示描述于如Ladner等美國專利N0.5，223，409 ；Smith (1985) Science228:1315-1317 ；Clackson 等(1991)Nature, 352:624-628 中。
[0051] 除了展示文庫的使用，所述指定抗原可用于免疫接種非人動物，如嚙齒類動物，如鼠、倉鼠或大鼠。在一個實施例中，所述非人動物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可采用人Ig基因座的大片段對在小鼠抗體生產方面具有缺陷的小鼠品系進行基因工程。使用雜交瘤技術，可以生產和篩選源自具有期望特異性的基因的抗原-特異性單克隆抗體。參見例如 XEN0M0USE?、Green 等.(1994) Nature Genetics7:13-21、US2003-0070185、W096/34096 和 W096/33735。
[0052]抗體或其片段還可以通過特異性缺失人T細胞表位或通過描述于W098/52976和W000/34317中的方法“去免疫化”來修飾。簡言之，可以針對結合MHC-1I類的肽，分析抗體重鏈和輕鏈的可變結構域；這些肽表示潛在T細胞表位(如W098/52976和W000/34317中所定義)。對于潛在T細胞表位的測定，可以應用一種稱為“肽線程”的計算機建模方法，另外可以在人MHC-1I類結合肽的數據庫中搜索存在于VH和VL序列中的基序，如W098/52976和TO00/34317中所描述。這些基序結合至任一 18種主要的MHC-1I類DR同種抗免疫球蛋白，從而構成潛在T細胞表位。可以通過置換可變結構域中的少量氨基酸殘基，或優(yōu)選通過單一氨基酸置換來去除檢測到的潛在T-細胞表位。典型地，進行保守型置換。通?？墒褂门c人生殖細胞系抗體序列中的位置所共有的氨基酸，但不限于此。如描述于Tomlinson等(1992) J.Mol.B1l.227:776-798 ;Cook，G.P.等(1995) Immunol.Today Vol.16(5):237-242 ;和 Tomlinson 等(1995)EMBO J.14:14:4628-4638 中的人生殖細胞系序列。VBASE目錄提供人免疫球蛋白可變區(qū)序列的詳盡目錄(由Tomlinson,LA等MRC Centre forProtein Engineering, Cambridge, UK編匯)。這些序列可用作人序列的來源,如提供框架區(qū)及用于⑶R。也可以使用共有的人框架區(qū)，如美國專利N0.6，300, 064中所述。
[0053]VH和VL的成對一起形成單一抗體結合位點。最接近VH的CH結構域稱為CHl。每個L鏈通過一個共價二硫鍵連接至H鏈，而基于H鏈同工型，兩個H鏈通過一個或多個二硫鍵相互結合。VH和VL結構域由被稱為框架區(qū)的相對保守的四個區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)組成，其形成高變序列的三個區(qū)(互補決定區(qū)即OTR)的支架。所述⑶R包含負責抗體與抗原特異性相互作用的大多數殘基。⑶R稱為⑶RU⑶R2和⑶R3。因此，重鏈上的⑶R組分稱為H1、H2及H3，而輕鏈上的⑶R組分稱為L1、L2及L3。
[0054]術語“可變的”是指免疫球蛋白結構域的在其序列中表現(xiàn)出變異性的且涉及決定特定抗體的特異性和結合親和性的部分(即，“可變結構域”)。變異性并非均勻分布于抗體的整個可變結構域；其集中在重鏈及輕鏈可變區(qū)的子結構域中。
[0055]這些子結構域被稱為“高變”區(qū)或“互補決定區(qū)” (OTR)。可變結構域的較保守(即非高變的)部分被稱為“框架”區(qū)(FRM)。天然存在的重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FRM區(qū)，所述四個FRM區(qū)大多采用β-折疊結構，其由三個高變區(qū)連接形成環(huán)狀連接，并且在某些情況下形成β折疊結構的部分。FRM使得每條鏈的高變區(qū)與其它鏈的高變區(qū)靠近在一起，從而有助于抗原-結合位點的形成(參見Kabat等，上述引文)。恒定結構域并不直接涉及于抗原結合，但表現(xiàn)出多種效應物功能，如，例如抗體-依賴性的、細胞-介導的細胞毒性及補體活化。
[0056]本文所用術語“高變區(qū)”(也被稱為“互補決定區(qū)”或⑶R)是指位于免疫球蛋白的V-區(qū)結構域(通常是具有極端序列變異性的三個或四個短區(qū))的抗體的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基形成抗原-結合位點并是抗原特異性的主要決定因素。至少有兩種方法來鑒別CDR殘基:(I)基于跨物種序列變異性的方法(即Kabat等，上述引文);和(2)基于抗原-抗體復合物的晶體學研究的方法(Chothia，C:等，J.Mol.B1l.196:901-917 (1987))。然而，就兩個殘基鑒別技術界定重疊區(qū)而非相同區(qū)而言，可將其組合以定義雜合CDR。但是，一般而言，所述CDR殘基的鑒別優(yōu)選根據所謂的Kabat (編號)系統(tǒng)進行。
[0057]本文所用術語“抗原-結合結構域”、“抗原-結合片段”及“抗體結合區(qū)”是指抗體分子的一部分，該部分包含負責抗體與抗原之間特異性結合的氨基酸。被抗體特異性識別和結合的抗原的一部分稱為本文上述的“表位”。如上所述，抗原-結合結構域可以典型地包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH);但是其不必同時包含兩個可變區(qū)。例如，F(xiàn)d片段具有兩個VH區(qū)，其常常保留完整抗原-結合結構域的某個抗原-結合功能?？贵w的抗原-結合片段的實例包括(I) Fab片段，其是一種具有VL、VH、CL及CHl結構域的單價片段；(2)F(ab' )2片段，其為具有由在絞鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個Fab片段的一種二價片段；(3) Fd片段，其具有兩個VH和CHl結構域；(4) Fv片段，其具有抗體單臂的VL和VH結構域；(5)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，其具有VH域；(6)分離的互補決定區(qū)(CDR)，及(7)單鏈FV(scFv)，優(yōu)選為后者(例如源自scFV文庫)。盡管Fv片段的兩個結構域即VL和VH是由獨立的基因編碼的，但是使用重組的方法可以將其連接，通過合成的連接子能夠使它們成為單一蛋白鏈，該蛋白鏈中的VL和VH區(qū)成對形成單價分子(稱為單鏈 Fv(scFv);參見例如 Huston 等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。這些抗體片段采用本領域技術人員已知的常規(guī)技術得到，并且根據與完整抗體相同的方法來評估這些片段的功能。
[0058]本文所用術語“單克隆抗體”是指從基本上為均質性抗體的群中得到的一種抗體，即，除去可能少量存在的可能天然發(fā)生的突變和/或翻譯后修飾(如異構化、酰胺化)，組成該群的單個抗體是相同的。單克隆抗體具有高度特異性的，其針對單一的抗原位點。另外，與典型地包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物相比，每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點在于其通過雜交瘤培養(yǎng)合成，從而未被其它免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆”是指從基本上為均質性抗體的群中得到的抗體的特性，而不應當解釋為要求通過任何特定的方法來生產抗體。例如，依據本發(fā)明所使用的單克隆抗體可以首先通過描述于Kohler等，Nature, 256:495(1975)中的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法制備(參見例如美國專利N0.4，816，567)。例如，所述“單克隆抗體”還可采用Clackson等,Nature, 352:624-628 (1991)和Marks等，J.Mol.B1l.,222:581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離。
[0059]本發(fā)明的單克隆抗體具體地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其重鏈和/輕鏈的部分與源自特定物種或屬于特定抗體類型或亞類的抗體的相應序列是相同的或是同源的，而其鏈的剩余部分與源自另一物種或屬于另一抗體類型或亞類的抗體的相應序列是相同的或是同源的，以及這種抗體的片段，只要其能表現(xiàn)出期望的生物活性即可(美國專利N0.4，816，567 ；Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984))。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長類動物化”抗體，該抗體包含源自非人靈長動物類(如舊世界猴、猿(Ape)等)和人恒定區(qū)序列的可變結構域抗原-結合序列。
[0060]單克隆抗體可以從非人動物中獲得，然后可使用本領域已知的重組DNA技術生產進行經修飾如人源化、去免疫化、嵌合化的。已經描述了用于制備嵌合抗體的多種方法。參見例如 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81:6851,1985 ；Takeda 等，Nature314:452，1985，Cabilly 等，美國專利 N0.4，816，567 ；Boss 等，美國專利 N0.4，816，397 ；Tanaguchi 等，EP0171496 ；EP0173494, GB2177096。
[0061]非人(如鼠)抗體的“人源化”形式是大部分人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體的其它抗原-結合亞序列)，其包含極少數的源自非人免疫球蛋白的序列。多數情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(qū)(即CDR)的殘基被來自如具有所需特異性、親和性和能力的小鼠、大鼠或兔的非人物種(供體抗體)的高變區(qū)的殘基替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應的非人殘基替代。此外，本文所用“人源化抗體”可還包括既不存在于受體抗體也不存在于供體抗體中的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進和優(yōu)化抗體的性能。所述人源化抗體可選的還包括，免疫球蛋白(特別是人免疫球蛋白)恒定區(qū)(Fe)的至少一部分。關于進一步的細節(jié)，參見Jones等,Nature, 321:522-525(1986) ；Reichmann等，Nature, 332:323-329(1988);和 Presta,Curr.0p.Struct.B1l.，2:593-596 (1992)。人源化抗體還可使用如轉基因小鼠生產，所述小鼠表達人重鏈和輕鏈基因，而不能表達內源小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因。Winter描述了一種可以用于制備本文所述人源化抗體的示例性⑶R-移植方法(美國專利N0.5，225，539)。特定人抗體的的所有⑶R都可被非人CDR的至少一部分替代，或僅僅某些CDR可被非人CDR替代。其只需替代人源化抗體與預定抗原結合所需的CDR數目。
[0062]人源化抗體或其片段可以例如通過替代Fv可變結構域的序列來產生，所述Fv可變結構域的序列不直接涉及抗原與來自人Fv可變結構域的等價序列的結合。Morrison(1985)Science229:1202-1207 ;0i 等.(1986)B1Techniques4:214 ;和US5, 585，089 ；US5, 693，761 ；US5, 693，762 ；US5, 859，205 ;和 US6, 407，213 提供了用于生產人源化抗體或其片段的示例性方法。這些方法包括分離、操縱及表達編碼來自重鏈或輕鏈至少一個的所有或部分免疫球蛋白Fv可變結構域的核酸序列。這種核酸可以從雜交瘤中獲得，該雜交瘤產生如上所述的針對預定靶標的抗體，也可從其它來源獲得。編碼人源化抗體分子的重組DNA隨后可被克隆至合適的表達載體中。
[0063]可以通過保守置換、共有序列置換、種系置換和/或回復突變的引入來優(yōu)化人源化抗體。這類免疫球蛋白分子的改變可以通過本領域已知的數種技術中任一種來實現(xiàn)(如 Teng 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，80:7308-7312,1983 ；Kozbor 等，ImmunologyToday, 4:7279,1983 ;01sson 等，Meth.Enzymo1.,92:3_16，1982)，并且也可依據 EP239400的教導實現(xiàn)。
[0064]術語“人抗體”包括具有基本上與本領域已知的人生殖細胞系免疫球蛋白序列相應的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體，包含如由Kabat等(參見Kabat等(1991)上述引文)描述的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括并非由人生殖細胞系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如在體內通過隨機或位點特異性誘變引入或在體內通過體細胞突變引入的突變)，在如CDR中，特別是在CDR3中。 人抗體可具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多個被并非由人生殖細胞系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基替代的位點。
[0065]本文所用“體外產生的抗體”是指可變區(qū)(如至少一個⑶R)的全部或部分是在無免疫力的細胞篩選(如體外噬菌體展示、蛋白質芯片或其它任何能夠測定候選序列與抗原結合能力的方法)中產生的抗體。因此該術語優(yōu)選不包括在免疫細胞中由基因組重排產生的序列。
[0066]“雙特異性”或“雙功能性”抗體或免疫球蛋白是具有兩個不同重/輕鏈對及兩個不同結合位點的人工雜交抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體可以通過包括雜交瘤的融合技術或Fab’片段連接技術在內的多種方法生產。參見例如Songsivilai&Lachmann, Clin.Exp.1mmunol.79:315-321 (1990)。本領域已知的許多方法可用來得到抗體或其抗原-結合片段。例如可以采用重組DNA法來生產抗體(美國專利N0.4，816，567)。根據已知的方法單克隆抗體也可以通過雜交瘤的產生來生產(參見例如Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495-499)。以這種方式形成的雜交瘤之后通過標準方法(如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和表面等離子共振(BIAC0RE?)分析法)進行篩選，從而識別一個或多個雜交瘤，所述雜交瘤產生與指定抗原特異性結合的抗體。所述指定抗原的任一形式都能用作免疫原，如重組抗原、天然存在的形式、任一變體或其片段以及其抗原肽。
[0067]術語“⑶R”及其復數形式“⑶Rs”，是指互補決定區(qū)(OTR)，其中三個構成輕鏈可變區(qū)的結合特性(⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3)，三個構成重鏈可變區(qū)的結合特性(OTRHUDRffi和CDRH3)。CDR有助于抗體分子的功能活性并被構成骨架或框架區(qū)的氨基酸序列分隔。確切定義上的CDR的邊界及長度受到不同分類和編號系統(tǒng)的影響。因此，所述CDR可以參考Kabat, Chothia、接觸或其他任何邊界的定義，包括本文描述的編號系統(tǒng)。盡管具有不同的邊界，這些系統(tǒng)的每一個在構成可變序列中的所謂“高變區(qū)”時有一定程度的重疊。因此依據這些系統(tǒng)的CDR定義可以就臨近的框架區(qū)在長度和邊界區(qū)方面有所不同。參見如Kabat、ChothiaJP / 或 MacCalIum(Kabat 等，上述引文；Chothia 等，J.Mol.B1l, 1987,196:901 ；和MacCallum等.，J.Mol.B1l，1996，262:732)。但是，依據所謂的Kabat系統(tǒng)的編號是優(yōu)選的。
[0068]典型地，⑶R形成一個可以分類為經典結構的環(huán)形結構。術語“經典結構”是指抗原結合(CDR)環(huán)所采用的主鏈構象。通過比較結構的研究發(fā)現(xiàn)，六個抗原結合環(huán)中的五個僅具有限制性譜的可用構象。每個經典結構的特征可在于多肽骨架的扭轉角。因此，抗體之間對應的環(huán)可以具有非常相似的三維結構，盡管這些環(huán)的大部分都具有高度氨基酸序列變異性(Chothia 和 Lesk, J.Mol.B1l.，1987，196:901 ；Chothia 等，Nature, 1989，342:877 ；Martin和Thornton, J.Mol.B1l, 1996,263:800,它們中的每一個均通過全文引用并入)。此外，在采用的環(huán)結構與其周圍的氨基酸序列之間存在聯(lián)系。特定經典類型的構象是由環(huán)的長度和位于環(huán)內以及保守框架區(qū)(即環(huán)外部分)內關鍵位置的氨基酸殘基決定的。因此，經典類型的分配可以在這些關鍵氨基酸殘基存在的情況下進行。術語“經典結構”還可包括關于抗體的線性序列的考慮，如由Kabat進行的編目分類(Kabat等，上述引文)。Kabat編號方案(系統(tǒng))是廣泛認可的以一致的方式編碼抗體可變結構域的氨基酸殘基的標準，且是如本文別處提到的優(yōu)選的用于本發(fā)明的方案。其它結構方面的考慮因素也可用于抗體經典結構的測定。例如，不能由Kabat編號全部反映的這些差異可以通過Chothia等的編號系統(tǒng)描述和/或通過其它技術(例如晶體學和二維或三維計算機建模)揭示。因此，一個給定的抗體序列能被置于經典類型，除其它事項外，該經典類型允許識別合適的基礎(chassis)序列(如基于期望在文庫中包含多種經典結構)。抗體氨基酸序列的Kabat編號和如Chothia等(上述引文)描述的結構考慮因素以及其對抗體結構的經典方面分析的影響都描述于文獻中。
[0069]CDR3是典型的抗體-結合位點中分子多樣性的最大來源。例如H3，可以短至兩個氨基酸殘基或超過26個氨基酸殘基。不同類型的免疫球蛋白的亞基結構和三維構象是本領域熟知的。關于抗體結構的綜述參見Antibodies:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, eds.Harlow等，1988。本領域技術人員能夠認識到每個亞基結構(如CH、VH、CL、VL、⑶R、FR結構)都包含活性片段，如結合至抗原結合的VH、VL或⑶R亞基的部分，即抗原-結合片段，或，如結合至和/或激活如Fe受體和/或補體的CH亞基的部分。CDR典型地指Kabat CDR,如描述于 Sequences of Proteins of immunological Interest,US Department of Health and Human Services (1991), eds.Kabat 等。另一個用于表征抗原結合位點的標準是指如由Chothia描述的高變環(huán)。參見如Chothia,等(1987 ;J.Mo1.B1l.227:799-817);和 Tomlinson 等(1995)EMBO J.14:4628_4638。還有另外一種標準是Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用的AbM定義。整體參見例如Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains.1n:Antibody Engineering LabManual (Ed.:Duebel, S.和 Kontermann, R.，Springer-Verlag, Heidelberg)?？蛇x擇地用所述的關于Chothia高變環(huán)或AbM定義環(huán)的相似的關系實施關于Kabat CDR所述實施方案。
[0070]在組裝和體細胞突變后抗體基因的序列是高度可變的，并且這些可變的基因預計編碼 101° 種不同的抗體分子(Immunoglobulin Genes, 2nd ed.，eds.Jon1 等，AcademicPress, San Diego，CA，1995)。因此，免疫系統(tǒng)提供免疫球蛋白的譜。術語“譜”是指全部或部分源自至少一個編碼至少一種免疫球蛋白的序列的至少一個核苷酸序列。所述序列可以通過在體內重鏈的V、D和J節(jié)段及輕鏈的V和J節(jié)段的重排而產生?；蛘?，所述序列可以在響應于例如體外刺激發(fā)生重排的細胞中產生。或者，所述序列的部分或全部可通過DNA剪接、核苷酸合成、誘變及其它方法得到。參見如，美國專利5，565，332。一個譜可包括僅一個序列或可包括多個序列，包括在基因多樣性集合中的所述序列。
[0071]術語“框架區(qū)”是指本領域已知的存在于較高變異度(即高變的)⑶R之間的抗體可變區(qū)的部分。典型地，這種框架區(qū)被稱為框架I至4(FR1、FR2、FR3和FR4)并在三維空間中為六個CDR (三個來自重鏈及三個來自輕鏈)的呈現(xiàn)提供支架，從而形成抗原-結合表面。
[0072]本發(fā)明的結合分子優(yōu)選是“分離的”結合分子。當“分離的”用于描述本文所公開的結合分子時，是指結合分子已經從其生成環(huán)境的組分中被識別、分離和/或重新獲得。優(yōu)選地，分離的結合分子不含有與其生成環(huán)境相關的其它組分。其生成環(huán)境的污染組分，如由重組轉染細胞產生的，是將典型地干擾多肽診斷或治療用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白質性或非蛋白質性的溶質。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述結合分子將純化至(I)足以通過使用轉杯測序儀獲得N-末端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(2)在非還原或還原條件下通過SDS-PAGE使用考馬斯亮藍或優(yōu)選的銀染得到均一性。然而，通常一個分離的抗體是通過至少一個純化步驟制備的。
[0073]設想到本文所結合分子的氨基酸序列的修飾。例如，提高抗體的結合親和性和/或其它生物性能可以是可取的。所述結合分子的氨基酸序列變體是通過在結合分子核酸序列中引入適當的核苷酸變化或通過肽的合成作用制備的。
[0074]這種修飾包括，例如，結合分子氨基酸序列內殘基的缺失和/或插入和/或置換?？蛇M行缺失、插入和置換的任意組合以進入最終的構建體中，條件是最終的構建體具有期望特性。氨基酸的改變也可改變結合分子的翻譯后過程，如改變糖基化位點的數目或位置。在CDR中，優(yōu)選1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸可被置換，而在框架區(qū)(FR)中，優(yōu)選1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 25 個氨基酸可被置換。本文所述的置換優(yōu)選為保守性置換。除此之外或作為另外一種選擇，在每個CDR中可以插入或缺失1、2、3、4、5或6個氨基酸(當然，取決于⑶R的長度)，而在每個FR中可以插入或缺失
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 25 個氨基酸。
[0075]—種用于識別結合分子的某些殘基或區(qū)域為誘變發(fā)生的優(yōu)選位置的有用方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，該方法由Cunningham和Wells在Science，244:1081-1085(1989)中描述。在該方法中，識別出結合分子中的一個殘基或一組祀殘基(如帶電荷殘基，如arg、asp、his、Iys及glu)并被中性或帶負電荷氨基酸(最優(yōu)選為丙氨酸或聚丙氨酸)替代從而影響氨基酸與表位的相互作用。
[0076]然后顯示出對于置換具有功能敏感性的這些氨基酸位置通過在置換位點的進一步或其它變體的引入進行精制。因此，盡管用于引入氨基酸序列變化的位點是預先確定的，但是突變本身的性質無需預先確定。例如，為了分析突變在給定位點的表現(xiàn)，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機誘變并篩選具有所期望活性的表達的結合分子變體。
[0077]優(yōu)選地，氨基酸序列插入包括長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基到包含一百個或更多個殘基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入作用。所述結合分子的插入變體包括向抗體的N-或C-與酶的融合或與增加抗體血清半衰期的多肽的融合。
[0078]另一種類型的變體是氨基酸置換變體。優(yōu)選地，這些變體具有結合分子中至少1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10個的氨基酸殘基被不同的殘基替代。最感興趣的取代型誘變位點包括重鏈及/或輕鏈的CDR，尤其是高變區(qū)，但亦設想到重鏈及/或輕鏈中的FR改變。
[0079]例如，如果⑶R序列包含6個氨基酸，設想到這些氨基酸中的一個、兩個或三個被置換。類似地，如果⑶R序列包含15個氨基酸，設想到這些氨基酸中的一個、兩個、三個、四個、五個或六個被置換。
[0080]通常，如果重鏈及/或輕鏈的一個或多個或全部CDR的氨基酸被置換，則獲得的“經置換的”序列與“原始”⑶R序列的同一性優(yōu)選為至少為60%，更優(yōu)選為65%，甚至更優(yōu)選為70%，特別優(yōu)選為75%，更特別優(yōu)選為80%。其含義是“經置換的”序列與“原始”序列的同一性程度取決于CDR的長度。例如，一個具有5個氨基酸的CDR與其置換序列的同一性優(yōu)選為80%，這是為了至少有一個被置換的氨基酸。因此，結合分子的CDR與其經置換的序列可以具有不同程度的同一性，如，⑶RLl可具有80%，而⑶RL3可具有90%。
[0081]優(yōu)選的置換(或替代)是保守性置換。然而，設想到任何置換(包括非-保守性置換或一個或多個列于下文中表1的“示例性置換”)，只要結合分子保持其通過第一結合結構域與BCMA結合以及通過第二結合結構域與CD3 ε結合的能力，和/或結合分子的CDR與隨后被置換的序列具有同一性(與“原始”⑶R序列的同一性至少為60%，更優(yōu)選為65%，甚至更優(yōu)選為70%，特別優(yōu)選為75%，更特別優(yōu)選為80% )。
[0082] 保守性置換示于表1中“優(yōu)選的置換”的標題下。如果這種置換導致生物活性的改變，則可以引入較大幅度的改變(在表1中稱為“示例性置換”，或在下文中參照氨基酸類型進一步描述)并對產物進行期望特征的篩選。
[0083]表1:氨基酸置換
[0084]
【權利要求】
1.一種至少雙特異性的結合分子，所述結合分子包含第一結合結構域和第二結合結構域，其中: (a)所述第一結合結構域能夠結合至BCMA的表位簇3和表位簇4;和 (b)所述第二結合結構域能夠結合至T細胞CD3受體復合物；且 其中所述BCMA的表位簇3對應于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸殘基24至41，所述BCMA的表位簇4對應于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸殘基42至54。
2.根據權利要求1所述的結合分子，其中所述第一結合結構域不能夠結合至如SEQIDNO:1015中所示的BCMA的嵌合的胞外結構域。
3.根據權利要求1或2所示的結合分子，其中所述第一結合結構域還能夠結合至獼猴BCMA0
4.根據前述權利要求中任一項所述的結合分子，其中所述第二結合結構域能夠結合至CD3 ε。
5.根據前述權利要求中任一項所述的結合分子，其中所述第二結合結構域能夠結合至人⑶3和獼猴⑶3。
6.根據前述權利要求中任一項所述的結合分子，其中所述第一結合結構域和/或所述第二結合結構域源自抗體。
7.根據權利要求6所述的結合分子,其選自(scFv)2、(單結構域mAb)2、scFv-單結構域HlAb、雙鏈抗體和它們的寡聚體。
8.根據前述權利要求中任一項所述的結合分子，其中所述第一結合結構域包含VH區(qū)和VL區(qū)，所述VH區(qū)含有選自以下的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，所述VL區(qū)含有選自以下的 CDR-Ll、CDR-L2 以及 CDR-L3: (a)如SEQ ID NO:231 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:232 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:233 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:234 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:235 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:236中所示的CDR-L3 ； (b)如SEQ ID NO:241 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:242 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:243 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:244 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:245 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:246中所示的CDR-L3 ； (c)如SEQ ID NO:251 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:252 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:253 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:254 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:255 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:256中所示的CDR-L3 ； (d)如SEQ ID NO:261 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:262 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:263 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:264 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:265 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:266中所示的CDR-L3 ； (e)如SEQ ID NO:271 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:272 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:273 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:274 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:275 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:276中所示的CDR-L3 ； (f)如SEQ ID NO:281 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:282 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:283 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:284 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:285 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:286中所示的CDR-L3 ；(g)如SEQ ID NO:291 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO:292 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:293 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:294 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:295 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:296中所示的CDR-L3 ； (h)如SEQ ID NO:301 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:302 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:303 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:304 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:305 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:306中所示的CDR-L3 ； ⑴如 SEQ ID NO:391 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:392 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:393 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:394 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:395 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:396中所示的CDR-L3 ； (k)如 SEQ ID NO:401 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:402 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:403 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:404 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:405 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:406中所示的CDR-L3 ； (I)如 SEQ ID NO:411 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:412 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:413 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:414 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:415 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:416中所 示的CDR-L3 ； (m)如 SEQ ID NO:421 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:422 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:423 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:424 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:425 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:426中所示的CDR-L3 ； (η)如 SEQ ID NO:431 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:432 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:433 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:434 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:435 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:436中所示的CDR-L3 ； (ο)如 SEQ ID NO:441 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:442 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:443 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:444 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:445 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:446中所示的CDR-L3 ； (P)如 SEQ ID NO:451 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:452 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:453 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:454 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:455 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:456中所示的CDR-L3 ； (q)如 SEQ ID NO:461 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:462 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:463 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:464 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:465 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:466中所示的CDR-L3 ； (r)如 SEQ ID NO:471 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:472 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:473 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:474 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:475 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:476中所示的CDR-L3 ； (s)如 SEQ ID NO:481 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:482 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:483 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:484 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:485 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:486中所示的CDR-L3 ； (t)如 SEQ ID NO:491 中所示的 CDR-HlJ SEQ ID NO:492 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:493 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:494 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:495 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:496中所示的CDR-L3 ;和(u)如 SEQ ID NO:501 中所示的 CDR-HU SEQ ID NO:502 中所示的 CDR-H2、如 SEQID NO:503 中所示的 CDR-H3、如 SEQ ID NO:504 中所示的 CDR-L1、如 SEQ ID NO:505 中所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO:506中所示的CDR-L3。
9.根據前述權利要求中任一項所述的結合分子，其中所述第一結合結構域包含VH區(qū)，所述VH區(qū)選自如以下序列中所示的VH區(qū):SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:257、SEQID NO:267、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:397,SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:417、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:437、SEQ IDNO:447,SEQ ID NO:457、SEQ ID NO:467、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:497和 SEQ ID NO:507o
10.根據前述權 利要求中任一項所述的結合分子，其中所述第一結合結構域包含VL區(qū)，所述VL區(qū)選自如以下序列中所示的VL區(qū):SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:258、SEQID NO:268、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:398,SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:438、SEQ IDNO:448,SEQ ID NO:458、SEQ ID NO:468、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:488、SEQ ID NO:498和 SEQ ID NO:508o
11.根據前述權利要求中任一項所述的結合分子，其中所述第一結合結構域包含選自以下的VH區(qū)和VL區(qū):
⑴如SEQ ID NO:497中所示的VH區(qū)，和如SEQ ID NO:498中所示的VL區(qū)；和 (U)如SEQ ID NO:507中所示的VH區(qū)，和如SEQ ID NO:508中所示的VL區(qū)。
12.根據權利要求10所述的結合分子，其中所述第一結合結構域包含選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:.279、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:309、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:419,SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:459、SEQ IDNO:469, SEQ ID NO:479、SEQ ID NO:489、SEQ ID NO:499 和 SEQ ID NO:509。
13.根據權利要求1-7中任一項所述的結合分子，其具有示于SEQID NO:300或SEQID NO:500的氨基酸序列。
14.一種編碼根據權利要求1至13中任一項所定義的結合分子的核酸序列。
15.—種包含根據權利要求14所定義的核酸序列的載體。
16.一種采用根據權利要求14所定義的核酸序列或根據權利要求15所定義的載體轉化或轉染的宿主細胞。
17.一種用于生產根據權利要求1至13中任一項所述的結合分子的方法，所述方法包括在允許根據權利要求1至13中任一項所定義的結合分子表達的條件下培養(yǎng)根據權利要求16所定義的宿主細胞并從培養(yǎng)物中回收產生的結合分子。
18.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據權利要求1至13中任一項所述的結合分子或包含根據權利要求17所述的方法生產的結合分子。
19.根據權利要求1至13中任一項所述的結合分子或根據權利要求17所述的方法生產的結合分子，所述結合分子用于預防、治療或改善選自漿細胞障礙、其它與BCMA表達有關的B細胞障礙和自身免疫性疾病的疾病。
20.一種用于治療或改善選自漿細胞障礙、其它與BCMA表達有關的B細胞障礙和自身免疫性疾病的疾病的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用根據權利要求1至13中任一項所述的結合分子或根據權利要求17所述的方法生產的結合分子。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述漿細胞障礙選自:多發(fā)性骨髓瘤、漿細胞瘤、漿細胞白血病、巨球蛋白血癥、淀粉樣變性、華氏巨球蛋白血癥、孤立性骨漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重鏈病、意義不明確的單克隆丙種球蛋白病以及郁積型多發(fā)性骨髓瘤。
22.根據權利要求20所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是全身性紅斑狼瘡。
23.—種試劑盒，所述試劑盒包含根據權利要求1至13中任一項所定義的結合分子、根據權利要求14所定義的核酸分子、根據權利要求15所定義的載體和/或根據權利要求16所定義的宿主細胞。
24.BCMA的表位簇3和表位簇4在結合分子生產中的用途，所述結合分子優(yōu)選為能夠結合至BCMA的抗體，其中BCMA的表位簇3對應于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸殘基24至41，BCMA的表位簇4對應于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸殘基42至54。
25.一種用于生產抗體，所述抗體優(yōu)選為能夠結合至BCMA的結合分子的方法，所述方法包括: (a)用包含BCMA的表位簇3和表位簇4的多肽免疫動物，其中BCMA的表位簇3對應于如SEQ ID NO:1002中所示序列的氨基酸殘基24至41，BCMA的表位簇4對應于如SEQ IDNO:1002中所示序列的氨基酸殘基42至54 ; (b)獲得所述抗體，和 (c)可選地，將所述抗體轉化為結合分子，所述結合分子能夠結合至人BCMA，優(yōu)選結合至T細胞⑶3受體復合 物。
【文檔編號】A61K39/395GK104169300SQ201280056358
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2012年11月15日 優(yōu)先權日:2011年11月15日
【發(fā)明者】彼得·庫菲, 托拜厄斯·勞姆, 帕特里克·霍夫曼, 羅曼·基謝爾, 拉爾夫·魯特布瑟, 桃瑞絲·芳, 保羅·亞當, E·伯格斯, B·赫比斯, 蘇珊娜·希普 申請人:安進研發(fā)（慕尼黑）股份有限公司, 貝林格爾·英格海姆國際有限公司