新的噬菌體和包括其的抗菌組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新的具有針對(duì)沙門氏菌的特異殺菌活性的噬菌體；用于預(yù)防或治療傳染病的組合物——包括噬菌體作為活性成分；包括噬菌體作為活性成分的抗生素；包括噬菌體作為活性成分的動(dòng)物飼料或飲用水；包括噬菌體作為活性成分的消毒劑或清潔劑。本發(fā)明的新的噬菌體具有針對(duì)豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌的特異殺菌活性而不影響有益細(xì)菌，以及優(yōu)良的耐酸性和耐熱性和耐干燥性。因此，新的噬菌體可用于沙門氏菌病或沙門氏菌屬食物中毒的預(yù)防或治療，并還廣泛用于動(dòng)物飼料、家畜飲用水、消毒劑和清潔劑。
【專利說明】新的噬菌體和包括其的抗菌組合物
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及新的噬菌體和包括其的抗菌組合物。
[【背景技術(shù)】]
[0002]沙門氏菌屬(Salmonella)具有50-52%的平均基因組GC含量——其與大腸桿菌(Escherichia coli)和志賀菌屬(Shigella)相似。沙門氏菌屬是引起家畜以及人感染的致病性微生物。血清學(xué)劃分具有腸道沙門氏菌(Salmonella enterica), —種沙門氏菌，具有許多種血清型——包括雞沙門氏菌(Salmonella gal I inarum)、雞瘟沙門氏菌(Salmonella pullorum)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium) (ST)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis) (SE)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis) (SC)、德比沙門氏菌(Salmonella derby) (SD)。它們之中，豬霍亂沙門氏菌和德比沙門氏菌是適應(yīng)豬的病原體，雞沙門氏菌和雞瘟沙門氏菌是禽適應(yīng)的病原體，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌對(duì)人和動(dòng)物是致病性的，傷寒沙門氏菌是人適應(yīng)的病原體，它們都在其各自的物種中引起疾病，導(dǎo)致對(duì)農(nóng)民和消費(fèi)者的巨大損失(ZoobisesReport ；United Kingdom2003)。 [0003]最近，由于在制造具有沙門氏菌屬——其引起對(duì)豬和肉衛(wèi)生學(xué)的直接損害和在豬的消化道發(fā)現(xiàn)——的家畜產(chǎn)品過程中污染的高度危險(xiǎn)(Jae-gi I Yeh.Characterization and Counterplan of Salmonellosis in Pigs.Monthly Magazine ofPig Husbandry.2004)，從2003年7月I日開始HACCP (危害分析和臨界控制點(diǎn))的執(zhí)行已成為韓國(guó)所有屠宰場(chǎng)的強(qiáng)制性要求。
[0004]副傷寒——豬消化道中由沙門氏菌屬感染引起的急性或慢性傳染病——的特征是胃腸炎和敗血病，并主要發(fā)生在育肥期(fatting period)。特別地，引起該疾病的致病菌中的一些可通過肉攝入引起人食物中毒，因此它是具有主要公共衛(wèi)生重要性的疾病。許多種類型的沙門氏菌可能是致病的。它們之中，已知引起豬霍亂的豬霍亂沙門氏菌和豬傷寒沙門氏菌是急性沙門氏菌屬敗血病的主要原因。急性腸炎發(fā)生在育肥期期間，并伴有無規(guī)律的食欲、嚴(yán)重水瀉、高熱、活力喪失、肺炎和神經(jīng)癥狀。皮膚變色可發(fā)生在一些嚴(yán)重病例中。鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和德比沙門氏菌是慢性腸炎的主要原因。
[0005]沙門氏菌病通過沙門氏菌屬污染的飼料或水經(jīng)口途徑引起，因此應(yīng)預(yù)防這些途徑。污染的飼料、原料或水、或攜帶病原體的成年豬可能是主要傳染源。感染的急性期期間，每克糞便豬脫落多達(dá)IO6個(gè)豬霍亂沙門氏菌或IO7個(gè)鼠傷寒沙門氏菌。然而，許多實(shí)驗(yàn)性感染報(bào)道用IO8至IO11劑量的沙門氏菌的成功的疾病復(fù)制。在將IO3個(gè)沙門氏菌注射進(jìn)豬的實(shí)驗(yàn)中，注射的豬沒有顯示疾病癥狀，但是在同一圈中飼養(yǎng)的其它豬顯示典型的臨床癥狀。這些結(jié)果指示，大量沙門氏菌在自然感染的豬中生長(zhǎng)，導(dǎo)致其它豬感染(Jung-BokLee.Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella and ProliferativeEnteropathy.Korea Swine Association.2009)。
[0006]目前，嚴(yán)重的病毒感染如豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)和豬環(huán)狀病毒(PCV2)已對(duì)韓國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此疾病管理已集中于這些疾病。由于這些細(xì)菌病可引起由禁止使用飼用抗生素開始的、與病毒疾病相當(dāng)?shù)木薮髶p失，疾病發(fā)生的研究或疾病管理應(yīng)預(yù)先進(jìn)行(Jung-Bok Lee.Control of the Recent Outbreaks of PorcineSalmonella and Proliferative Enteropathy, Infectious Disease Laboratory, Collegeof Veterinary Medicine, Konkuk University, Livestock Product Safety, 2010)(Robert
ff.Wills, Veterinary Microbiology, 1999)。同時(shí)，卩遼菌體(bacteriophage)-也稱作
噬菌體(phage)——是特化類型的病毒，其只感染特定細(xì)菌和控制細(xì)菌生長(zhǎng)，并可只在宿主細(xì)菌內(nèi)自我復(fù)制。噬菌體發(fā)現(xiàn)之后，最初大量努力放在它們用于傳染病治療的用途。然而，當(dāng)廣譜抗生素變得通常使用時(shí)，噬菌體由于具有特異目標(biāo)譜而被看作不必要的?？股鼗蚩刮⑸飫┮褟V泛用于細(xì)菌感染引起的傳染病的治療。雖然如此，抗生素的誤用和過度使用導(dǎo)致關(guān)于抗生素抗性和食物中殘留抗生素的有害作用的日益高漲的關(guān)注。然而，目前飼用抗生素的去除可增加已被抗生素控制的包括沙門氏菌病在內(nèi)的細(xì)菌病的發(fā)生，如實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)或從其它國(guó)家所預(yù)料的。因此，對(duì)建立對(duì)沙門氏菌屬管理的詳細(xì)實(shí)用指南存在迫切需要(Jung-Bok Lee.Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella andProliferative Enteropathy, Infectious Disease Laboratory, College of VeterinaryMedicine, Konkuk University, Livestock Product Safety.2010)。
[0007]這些增長(zhǎng)的關(guān)注已導(dǎo)致對(duì)噬菌體關(guān)注的再現(xiàn)?？刂拼竽c桿菌0157:H的七種噬菌體在美國(guó)專利號(hào)6，485，902 (2002)中公開，控制多種微生物的兩種噬菌體在美國(guó)專利號(hào)6，942，858中公開(2005年授權(quán)于Nymox)。許多公司已積極設(shè)法利用卩遼菌體發(fā)展多種產(chǎn)品。EBI食品系統(tǒng)(歐洲)發(fā)展了用于預(yù)防單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria
monocytogenes)-稱為L(zhǎng)isterix-ΡΙΟΟ-引起的食物中毒的食品添加劑，其是USFDA
批準(zhǔn)的第一個(gè)噬菌體產(chǎn)品?；谑删w的產(chǎn)品LMP-102也被發(fā)展為針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的食品添加劑，被批準(zhǔn)為GRAS (公認(rèn)安全的)。在2007年，發(fā)展了 OmniLytics生產(chǎn)的基于噬菌體的洗滌劑以預(yù)防屠宰期間牛肉的大腸桿菌0157污染，其被USDA食品安全和檢查服務(wù)局(FSIS)批準(zhǔn)。在歐洲，產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌(Clostridium sporogenes)噬菌體NCMB30008 和酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutiricum)噬菌體 NCMB30008 分別在 2003和2005年被注冊(cè)為針對(duì)飼料梭狀芽胞桿菌污染的飼料防腐劑。這樣的研究顯示，對(duì)控制抗生素非易感的細(xì)菌和動(dòng)物傳染病的病原體引起的家畜產(chǎn)品污染的噬菌體的研究目前正在進(jìn)行。
[0008]然而，大多數(shù)噬菌體生物控制研究已集中于大腸桿菌、李斯特菌和梭狀芽胞桿菌的控制。沙門氏菌也是動(dòng)物傳染病的病原體，并且源于該病原體的損害未減少。如上面所提到的，由于沙門氏菌顯示多種抗藥性，全國(guó)性的抗微生物抗性監(jiān)督已在韓國(guó)在關(guān)于接觸性傳染病預(yù)防的強(qiáng)制法令(執(zhí)行命令16961)、關(guān)于接觸性傳染病預(yù)防的強(qiáng)制法令(衛(wèi)生部和福利命令179)和國(guó)立衛(wèi)生研究所組織(執(zhí)行命令17164)下進(jìn)行。相應(yīng)地，存在發(fā)展噬菌體以控制沙門氏菌的需要。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0009][技術(shù)問題]
[0010] 為了克服廣譜抗生素誤用和過度使用后發(fā)生的問題，如抗藥菌和食物中藥物殘留物，本發(fā)明人從天然來源分離了噬菌體，其中噬菌體具有針對(duì)引起家畜中主要疾病的沙門氏菌的特異殺菌活性。因此，他們發(fā)現(xiàn)除了顯示優(yōu)良的耐酸性和耐熱性外，噬菌體具有針對(duì)豬霍亂沙門氏菌(SC)、鼠傷寒沙門氏菌(ST)、德比沙門氏菌(SD)、嬰兒沙門氏菌(Salmonella infantis) (SI)和新港沙門氏菌(Salmonella newport) (SN)的特異殺菌活性而不影響有益細(xì)菌，如針對(duì)其形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和遺傳性質(zhì)所鑒定的。進(jìn)一步，他們發(fā)現(xiàn)噬菌體可應(yīng)用于用于預(yù)防和治療鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的疾病，如家畜沙門氏菌病和沙門氏菌食物中毒的組合物，和應(yīng)用于用于有效預(yù)防和控制沙門氏菌屬細(xì)菌增殖的多種產(chǎn)品，包括家畜飼料添加劑、家畜的飲用水、畜棚消毒劑和肉產(chǎn)品的清潔劑，由此完成本發(fā)明。
[0011][問題的解決方案]
[0012]本發(fā)明的目的是提供具有針對(duì)豬霍亂沙門氏菌的殺菌活性的新的噬菌體。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌引起的傳染病的組合物，包括噬菌體作為活性成分。[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抗生素，包括噬菌體作為活性成分。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供動(dòng)物飼料或飲用水，包括噬菌體作為活性成分。
[0016]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供消毒劑或清潔劑，包括噬菌體作為活性成分。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用噬菌體或組合物預(yù)防或治療豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌引起的傳染病的方法。
[0018][發(fā)明的有益效果]
[0019]本發(fā)明的新的噬菌體具有針對(duì)豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌的特異殺菌活性而對(duì)有益細(xì)菌無影響，和優(yōu)良的耐酸性和耐熱性和耐干燥性。因此，新的噬菌體可用于預(yù)防或治療沙門氏菌病或沙門氏菌食物中毒——其是豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌引起的傳染病，并且還可廣泛用于動(dòng)物飼料、家畜飲用水、消毒劑和清潔劑。
[0020][附圖簡(jiǎn)述]
[0021]圖1是OCJll的電子顯微鏡照片，其屬于形態(tài)型BI的管狀病毒科，特征是等軸的殼體和長(zhǎng)的非收縮性尾；
[0022]圖2是顯示沙門氏菌屬細(xì)菌的菌苔中OCJll蝕斑形成的照片，其中(A、B ;SC、C ；SG、D ;ST、E ;S1、F、G ;SD、H ;SN)，蝕斑形成在SC、ST、S1、SD和SN菌苔中觀察到，但是未在SG菌苔中觀察到；
[0023]圖3是分離的噬菌體OCJll的SDS-PAGE結(jié)果，其中主要蛋白在33kDa、55kDa和69.5kDa 檢測(cè)到,精確蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物(Precision plus protein standard) (BIO-RAD)用作標(biāo)記；
[0024]圖4是分離的噬菌體OCJll的PFGE結(jié)果，其中OCJll的總基因組大小是大約140kbp, CHEF DNA 大小標(biāo)準(zhǔn) λ 系列梯狀物(Size Standard Lambda Ladder) (Bio-Rad)用作DNA大小標(biāo)記；
[0025]圖5是利用針對(duì)OCJll基因組DNA的每個(gè)引物組進(jìn)行的PCR結(jié)果，其中A:SEQ IDNOs.5 和 6 引物組，B:SEQ ID NOs.7 和 8 引物組，C:SEQ ID NOs.9 和 10 引物組，和 D =SEQID NOs.11和12引物組，所有A、B、C和D泳道具有大約Ikbp或更大至2kbp或更小的PCR產(chǎn)物；
[0026]圖6是對(duì)噬菌體OCJll耐酸性試驗(yàn)的結(jié)果，顯示在pH2.1,2.5,3.0,3.5,4.0,5.5、
6.4、6.9、7.4、8.0、9.0、9.8和11.0下存活的噬菌體數(shù)，其中直到ρΗ5.5噬菌體OCJll沒有喪失其活性，但是與對(duì)照相比，噬菌體OCJll在ρΗ4和ρΗ3.5顯示減少的活性，并在ρΗ3.0或更低完全喪失其活性；
[0027]圖7是噬菌體OCJll耐熱性試驗(yàn)的結(jié)果，顯示在37、45、53、60和70°C下0、10、30、60和120分鐘存活的噬菌體數(shù)，其中噬菌體OCJll即使暴露于60°C長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)仍保持其活性；
[0028]圖8是在SpeedVac濃縮器輔助下干燥的噬菌體OCJll耐干燥性試驗(yàn)的結(jié)果，其中當(dāng)將在干燥條件下的滴度變化相對(duì)于預(yù)干燥滴度測(cè)定時(shí)，將活性保持在60°C長(zhǎng)達(dá)I小時(shí)；和
[0029]圖9是斯普拉-道來(Sprague-Dawley)大鼠單一口服施用OCJll之后由于毒性的體重變化結(jié)果，其中在施用OCJll之前和施用OCJll之后1、3、7、10和14天之后體重變化的觀察與對(duì)照組相比沒有顯示顯著的變化(;雄性對(duì)照，□ ; OCJll雄性，.;雌性對(duì)照，〇;OCJl I雌性)。
[0030][實(shí)施發(fā)明的最佳方式]
[0031]在實(shí)現(xiàn)以上目的的一個(gè)方面，本發(fā)明提供新的具有針對(duì)豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌的特異殺菌活性的噬菌體。
[0032]本發(fā)明人從豬圈收集糞便和污水樣品，并從中分離可裂解宿主細(xì)胞SC的噬菌體。他們還發(fā)現(xiàn)這些噬菌體可裂解ST、SD、SI和SN(圖2和表1)。電子顯微鏡下的形態(tài)學(xué)檢查證實(shí)，噬菌體(OCJll)屬于形態(tài)型BI的管狀病毒科(圖1)。另外，發(fā)現(xiàn)噬菌體OCJll具有大約69.5kDa, 55kDa和33kDa的主要結(jié)構(gòu)蛋白，如蛋白模式分析所測(cè)量的(圖3)，并且基因組分析顯示OCJll具有大約97-145.5kbp的總基因組大小(圖4)。此外，分析其遺傳特征的結(jié)果顯示，噬菌體包括總基因組內(nèi)由SEQ ID NOs.1至4表示的核酸分子(實(shí)施例
6)。基于SEQID NOs.1至4，比較與其它物種的遺傳相似性。發(fā)現(xiàn)，噬菌體顯示與已知噬菌體非常低的遺傳相似性，指示該噬菌體是新的噬菌體(表2)。為了更詳細(xì)分析遺傳特征，OCJll-特異性引物組，即，SEQ ID NOs.5 和 6，SEQ ID NOs.7 和 8，SEQ ID NOs.9 和 10，和SEQ ID NOs.11和12用于進(jìn)行PCR。發(fā)現(xiàn)每種PCR產(chǎn)物具有1.4kbp、l.2kbp、l.25kbp和1.5kbp的大小(圖5)。
[0033]同時(shí)，當(dāng)用ΦCJlI感染SC、ST、SD、SI和SN時(shí)，觀察到噬菌斑(在軟瓊脂上由一個(gè)噬菌體的宿主細(xì)胞溶解產(chǎn)生的亮區(qū))(圖2)。在多種溫度和pH條件下檢查OCJll的穩(wěn)定性，結(jié)果OCJll在pH3至pHll的寬范圍pH環(huán)境(圖6)和37°C至70°C的溫度環(huán)境(圖
7)，并且甚至在干燥之后(圖8)穩(wěn)定地保持。并且，還發(fā)現(xiàn)野生型菌株SC、ST、SD、SI和SN落入OCJll的宿主細(xì)胞范圍(表3)。
[0034]最后，對(duì)無特定病原體的(SPF)新西蘭白兔中OCJll的皮膚和眼睛刺激試驗(yàn)的結(jié)果顯示原發(fā)刺激指數(shù)(PU)是0.33，指示沒有刺激，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間在沖洗和未沖洗組中急性眼睛刺激指數(shù)(IAOI)是0，指示沒有刺激。OCJll 口服施用的結(jié)果顯示體重增長(zhǎng)沒有變化(圖9)。同樣，沒有觀察到死亡率、全身癥狀(表4)和器官異常(表5)，表示沒有毒性。[0035]相應(yīng)地，本發(fā)明人將噬菌體稱作“噬菌體OCJll”，其中該噬菌體從來自豬圈的糞便和污水樣品分離和具有針對(duì)SC、ST、SD、SI和SN的特異殺菌活性和以上特性，并在2011年9月9日保存在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(361-221, Honjel, Seodaemun, Seoul)KCCMl 1208P
登錄號(hào)下。
[0036]在實(shí)現(xiàn)以上目的的另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療一種或多種選自豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和新港沙門氏菌的沙門氏菌屬細(xì)菌引起的傳染病的組合物，其包括噬菌體作為活性成分。
[0037]具有針對(duì)豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和新港沙門氏菌的特異殺菌活性，本發(fā)明的噬菌體可用于預(yù)防或治療這些細(xì)菌引起的疾病的目的。優(yōu)選，傳染病的實(shí)例包括豬霍亂沙門氏菌或鼠傷寒沙門氏菌引起的豬沙門氏菌病和沙門氏菌屬食物中毒，和德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、新港沙門氏菌引起的急性或慢性豬腸炎，但是不限于此。
[0038]如本文所用，術(shù)語“沙門氏菌病”指沙門氏菌感染之后的癥狀，如發(fā)熱、頭痛、腹瀉和嘔吐。即，沙門氏菌病是沙門氏菌屬細(xì)菌的感染，其由兩種臨床形式限定:與傷寒癥相似的急性敗血病形式和急性胃腸炎——包括腸炎、食物中毒、和急性敗血病。
[0039]如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”指所有這樣的行為，其中疾病過程通過組合物的施用而被抑制或減緩。
[0040]如本文所用，術(shù)語“治療”指所有這樣的行為，其中狀況向著更好方面發(fā)生轉(zhuǎn)變或由組合物的施用而 被抑制或有利地改變。
[0041]本發(fā)明的組合物包括I X IO2至I X 1012PFU/mL,優(yōu)選I X IO6至I X 1010PFU/mL量的OCJll。
[0042]另一方面，本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。
[0043]如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指對(duì)生物體不引起顯著刺激和不消除施用的化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。為了將組合物配制成液體制劑，可使用藥學(xué)上可接受的載體——其是無菌和生物相容的，如鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖生理鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和其一種或多種混合物。需要時(shí)，可加入其它常規(guī)添加劑如抗氧化劑、緩沖劑和抑菌劑。進(jìn)一步，可另外將稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑加入組合物以制備可注射的制劑如水溶液、懸浮液和乳狀液，或口服制劑如丸劑、膠囊、顆?；蚱瑒?。
[0044]本發(fā)明的預(yù)防或治療性組合物可施加于或噴霧到受害區(qū)域，或通過口服或腸胃外途徑施用。腸胃外施用可包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或局部施用。
[0045]適合施加、噴霧或施用本發(fā)明的組合物的劑量將取決于多種因素，包括配制方法、施用方式、正被治療的患者或動(dòng)物的年齡、重量、性別、狀況和飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速度和反應(yīng)敏感性。具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)師或獸醫(yī)可容易地確定需要的組合物的有效量和開處方。
[0046]包括本發(fā)明的組合物作為活性成分的口服劑型的實(shí)例包括片劑、錠劑、糖錠、水性或乳狀懸浮劑、粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、糖漿或酏劑。對(duì)于制劑如片劑和膠囊，以下是有用的:粘合劑如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉或甘薯淀粉；和潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酰富馬酸鈉或聚乙二醇蠟。對(duì)于膠囊，除了上面提到的化合物，可進(jìn)一步使用液體載體如脂質(zhì)。
[0047]包括本發(fā)明的組合物作為活性成分的胃腸外劑型可被配制成通過皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑的注射劑、栓劑、或通過呼吸道可吸入的噴霧劑，如氣霧劑。注射形式可通過使本發(fā)明的組合物與穩(wěn)定劑或緩沖劑在水中溶解或懸浮和將溶液或懸浮液裝入安瓿或小瓶單位形式而制備。對(duì)于噴霧劑，如氣霧劑，用于噴霧水分散的濃縮物的推進(jìn)劑或可濕性粉劑可與添加劑組合使用。
[0048]在實(shí)現(xiàn)以上目的的另一方面，本發(fā)明提供包括噬菌體作為活性成分的抗生素。
[0049]如本文所用，術(shù)語“抗生素”指施加給動(dòng)物以殺死病原體的任何藥物，并在本文用作防腐劑、殺菌劑和抗菌劑的一般術(shù)語。動(dòng)物是包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的噬菌體，與常規(guī)的抗生素不同，對(duì)沙門 氏菌屬具有高特異性以殺死特定病原體而不影響有益細(xì)菌，而且不引起抗藥性，以便它可作為具有相對(duì)長(zhǎng)的生命周期的新的抗生素而被提供。
[0050]在實(shí)現(xiàn)以上目的的另一方面，本發(fā)明提供包括噬菌體作為活性成分的動(dòng)物飼料或飲用水。
[0051]期望畜牧業(yè)和漁業(yè)中使用的飼用抗生素預(yù)防感染。然而，大多數(shù)目前可用的飼用抗生素是有問題的，因?yàn)橛捎跉埩粼谛螽a(chǎn)品中，它們易于引起抗性株的出現(xiàn)，并可傳遞給人。攝取這樣的殘留抗生素可可使人病原體的對(duì)抗生素有抵抗力，導(dǎo)致疾病傳播。另外，由于存在許多種飼用抗生素，多藥抗性株的漸增的全球出現(xiàn)是嚴(yán)重的憂慮。因此，本發(fā)明的噬菌體可用作飼用抗生素，其是更生態(tài)友好的和能解決以上問題。
[0052]本發(fā)明的動(dòng)物飼料可通過將噬菌體直接或以單獨(dú)的飼料添加劑形式加入到動(dòng)物飼料而制備。本發(fā)明的噬菌體可作為液體或以固體的形式，優(yōu)選以干粉包含在動(dòng)物飼料中。干燥處理可通過空氣干燥、自然干燥、噴霧干燥和冷凍干燥進(jìn)行，但不限于此。本發(fā)明的噬菌體可作為粉末形式以基于動(dòng)物飼料的重量按重量計(jì)0.05至10%，優(yōu)選按重量計(jì)0.1至2%的量加入。除了本發(fā)明的噬菌體，動(dòng)物飼料還可包括其它常規(guī)添加劑用于長(zhǎng)期保存。
[0053]本發(fā)明的飼料添加劑可另外包括其它非致病性微生物。可用的另外的微生物可
選自枯草桿菌(Bacillus subtilis)-其可產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶，乳桿菌屬某種
(Lactobacillus sp.)菌株——其可在缺氧條件下，如在牛胃中發(fā)揮分解的生理活性和功
能，絲狀真菌-包括米曲霉菌(Aspergillus oryzae) (J Animal Sci43:910-926，1976),
其可增加家養(yǎng)動(dòng)物的重量，提高奶產(chǎn)量和輔助飼料的消化和吸收，和酵母——包括釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)(J Anim Sci56:735-739， 1983)。
[0054]本發(fā)明的包括OCJll的飼料可包括植物基飼料，如谷類、堅(jiān)果、食物副產(chǎn)品、海藻、纖維、藥物副產(chǎn)品、油、淀粉、膳食和谷類副產(chǎn)品，和動(dòng)物基飼料如蛋白質(zhì)、無機(jī)物質(zhì)、月旨肪、礦物、脂肪、單細(xì)胞蛋白質(zhì)、浮游動(dòng)物，和食物廢物，但不限于此。
[0055]本發(fā)明的包括OCJll的飼料添加劑可包括粘合劑、乳化劑和用于預(yù)防品質(zhì)退化的防腐齊?、氨基酸、維生素、酶、有益菌種、調(diào)味料、非蛋白質(zhì)氮、硅酸鹽、緩沖齊?、著色齊?、提取物和用于有效性改善的寡糖、和其它飼料預(yù)混合物，但是不限于此。
[0056]另外，混合有本發(fā)明的噬菌體的飲用水的供應(yīng)可減家畜少腸中沙門氏菌屬細(xì)菌的數(shù)目，由此獲得無沙門氏菌屬的家畜。
[0057]仍在實(shí)現(xiàn)以上目的的另一方面，本發(fā)明提供包括噬菌體作為活性成分的消毒劑或清潔劑。[0058]仍在實(shí)現(xiàn)以上目的的另一方面，本發(fā)明提供利用噬菌體或組合物治療由豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌引起的傳染病的方法。
[0059]詳細(xì)地,本發(fā)明的治療方法包括將治療有效量的噬菌體或組合物施加給具有由豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌或新港沙門氏菌引起的傳染病的個(gè)體的步驟。
[0060]本發(fā)明的噬菌體或組合物可以以藥物制劑的形式施用給動(dòng)物或可以作為與動(dòng)物飼料或飲用水的混合物并優(yōu)選作為與動(dòng)物飼料的混合物由動(dòng)物攝取。
[0061]只要它到達(dá)靶組織，任何途徑，不論口服或胃腸外，都可采用用于施用本發(fā)明的噬菌體或組合物。詳細(xì)地，本發(fā)明的組合物可以以通常方式通過任何途徑如口服、直腸、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)和吸入途徑施用。
[0062]對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的是，將通過治療方法施用的本發(fā)明的噬菌體或組合物的日總劑量應(yīng)通過醫(yī)師的適當(dāng)醫(yī)學(xué)判斷來確定。優(yōu)選，給定患者的治療有效量可根據(jù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中所周知的多種因素而改變，該多種因素包括將接受的反應(yīng)的種類和程度、患者狀況如年齡、體重、健康狀態(tài)、性別和飲食、施用時(shí)間和途徑、組合物的分泌速度、治療時(shí)期、根據(jù)是否其它劑與其使用或不與其使用的具體組合物等。
[0063][發(fā)明方式]
[0064]在下文中，本發(fā)明將參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述。然而，這些實(shí)施例僅用于說明的目的，本發(fā)明不意欲受這些實(shí)施例的限制。
[0065]實(shí)施例1:沙門氏菌噬菌體的分離
[0066]實(shí)施例1-1:噬菌體篩選和單個(gè)噬菌體分離
[0067]將50mL來自糞便和污水流出物的樣品轉(zhuǎn)移至離心管，并以4000rpm離心10分鐘。然后，將上清液利用0.45 μ m濾器過濾。將18mL樣品濾液與150 μ I豬霍亂沙門氏菌(“SC”)振蕩培養(yǎng)基(0D_ = 2)和2mL10XLB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L和NaC110g/L:LB培養(yǎng)基)混合。將混合物在37°C培養(yǎng)18小時(shí)，并將培養(yǎng)基以4000rpm離心10分鐘。將上清液利用0.2 μ m濾器過濾。將3mL0.7%瓊脂(w/v)和150 μ I SC振蕩培養(yǎng)基(0D_ = 2)混合，并置于LB板上(“頂層瓊脂”)，并允許固化。將10 μ I培養(yǎng)濾液鋪在其上，并在37°C培養(yǎng)18小時(shí)，噬菌體裂解物的滴定在頂層瓊脂上進(jìn)行，稱作軟瓊脂覆蓋方法。
[0068]將含有噬菌體裂解物的樣品培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，并與150 μ I SC振蕩培養(yǎng)基(0D_=2)混合，之后是軟瓊脂覆蓋方法，以獲得單個(gè)蝕斑。單個(gè)蝕斑表示一個(gè)噬菌體，因此，為了分離單個(gè)噬菌體，將一個(gè)噬菌斑加入到400 μ I SM溶液(NaCl，5.8g/L、MgS047H20, 2g/LUM Tris-Cl (pH7.5) 50mL)，置于室溫4小時(shí)以分離單個(gè)噬菌體。為了大量純化噬菌體，將100 μ I上清液從單個(gè)噬菌體溶液中取出，并與12mL0.7%瓊脂和500 μ I SC振蕩培養(yǎng)基(OD600 = 2)混合，接著是在具有150_直徑的LB板上的軟瓊脂覆蓋方法。當(dāng)溶解結(jié)束時(shí)，將15mL SM溶液加入板。將板于室溫輕輕搖動(dòng)4小時(shí)以從頂層瓊脂流出噬菌體。將含有流出的噬菌體的SM溶液回收，加入氯仿至I %的終體積，并充分混合10分鐘。將溶液以4000rpm離心10分鐘。將獲得的上清液利用0.45 μ m濾器過濾，并儲(chǔ)存在冰箱中。
[0069]實(shí)施例1-2:噬菌體的大規(guī)模批次[0070]利用SC將選擇的噬菌體大量培養(yǎng)。將SC振蕩培養(yǎng)，并將1.5X IOiciCfu(菌落形成單位)的等分部分以4000rpm離心10分鐘，并將沉淀重懸于4mL SM溶液中。將
9.0 X IO8PFU (蝕斑形成單位)的噬菌體接種其中(Μ0Ι:感染復(fù)數(shù)=0.001)，并置于37°C 20分鐘。將溶液接種進(jìn)150mL LB培養(yǎng)基中，并在37°C培養(yǎng)5小時(shí)。加入氯仿至1%的終體積，并將培養(yǎng)溶液搖動(dòng)20分鐘。分別加入DNase I和RNase A到I μ g/mL的終濃度。將溶液置于37°C 30分鐘。分別加入NaCl和PEG(聚乙二醇)到IM和10% (w/v)的終濃度，并另外置于4°C 3小時(shí)。將溶液在4°C以12，OOOrpm離心20分鐘，丟棄上清液。將沉淀物重懸于5mL SM溶液，并置于室溫20分鐘。將4mL氯仿加入其中和充分混合，之后在4°C以4000rpm離心20分鐘。將上清液利用0.2 μ m濾器過濾，并將噬菌體通過甘油密度梯度超速離心(密度:40%、5%甘油，在35，000rpm，4°C I小時(shí))純化。純化的噬菌體被稱作“噬菌體OCJl 1”，并重懸浮于300 μ I SM溶液中，之后滴定。將噬菌體OCJll在2011年9月9日保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(361-221，Honjel, Seodaemun, Seoul)登錄號(hào)KCCM11208P下。
[0071]實(shí)施例2:對(duì)沙門氏菌屬的CCJll感染的檢杳
[0072]為了分析選擇的噬菌體對(duì)除SC外的沙門氏菌屬種類的溶解活性，進(jìn)行了與其它沙門氏菌屬種類的交叉感染的嘗試。結(jié)果，OCJll感染SC (豬霍亂沙門氏菌)、ST (鼠傷寒沙門氏菌)、SD (德比沙門氏菌)、SN (新港沙門氏菌)、SI (嬰兒沙門氏菌)、SA (亞利桑那沙門氏菌(Salmonella arizonae))和 SB(邦戈沙門氏菌(Salmonella bongori)),但是不感染SE (腸炎沙門氏菌)、SG (雞傷寒沙門氏菌(Salmonella gal I inarum))和SP (Salmonellapullorum)(表 I 和圖 2)。
[0073][表 I] [0074]沙門氏菌屬的Φ CJl I感染
【權(quán)利要求】
1.分離的噬菌體，具有針對(duì)豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)的特異殺菌活性，其由登錄號(hào)KCCMl 1208P確定。
2.用于預(yù)防或治療由選自豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、德比沙門氏菌(Salmonella derby)、嬰兒沙門氏菌(Salmonella infantis)、新港沙門氏菌(Salmonella newport)和其組合的沙門氏菌屬細(xì)菌引起的傳染病的組合物，包括權(quán)利要求1所述的噬菌體作為活性成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述由豬霍亂沙門氏菌或鼠傷寒沙門氏菌引起的傳染病是沙門氏菌病或沙門氏菌屬食物中毒，所述由德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和新港沙門氏菌引起的傳染病是細(xì)菌感染型沙門氏菌屬食物中毒。
4.抗生素,包括權(quán)利要求1所述的噬菌體作為活性成分。
5.動(dòng)物飼料或飲用水，包括權(quán)利要求1所述的噬菌體作為活性成分。
6.消毒劑或清潔劑，包括權(quán)利要求1所述的噬菌體作為活性成分。
7.用于預(yù)防或治療由一種或多種選自豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、新港沙門氏菌和其組合的沙門氏菌屬細(xì)菌引起的傳染病的方法，包括將權(quán)利要求1所述的噬菌體施用給需要其的動(dòng)物。
8.用于預(yù)防或治療由一種或多種選自豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、德比沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、新港沙門氏菌和其組合的沙門氏菌屬細(xì)菌弓丨起的傳染病的方法，包括將權(quán)利要求2所述的組合 物施用給需要其的動(dòng)物。
【文檔編號(hào)】A61K35/76GK103946399SQ201280056649
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月20日
【發(fā)明者】梁時(shí)容, 金載沅, 趙英郁, 金英師, 申恩美 申請(qǐng)人:Cj 第一制糖株式會(huì)社