耳廓軟骨組織的制造方法和耳廓軟骨組織的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種能夠制造具有充分的厚度和力學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織的耳廓軟骨組織的制造方法、以及由該耳廓軟骨組織的制造方法制得的耳廓軟骨組織。本發(fā)明的耳廓軟骨組織的制造方法具有：在平均纖維直徑為0.90～7.00μm的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布上接種耳廓軟骨細(xì)胞的細(xì)胞接種工序；和將接種有上述耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布，與由非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架復(fù)合、調(diào)整形狀的成形工序。
【專利說(shuō)明】耳廓軟骨組織的制造方法和耳廓軟骨組織
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及能夠制造具有充分的厚度和力學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織的耳廓軟骨組織的制造方法、以及由該耳廓軟骨組織的制造方法制得的耳廓軟骨組織。
【背景技術(shù)】
[0002]由于近年來(lái)細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，使得培養(yǎng)包括人細(xì)胞在內(nèi)的多種動(dòng)物細(xì)胞成為可能，另外，希望使用這些細(xì)胞重建人的組織和器官的、所謂的再生醫(yī)療的研究迅速發(fā)展。在再生醫(yī)療中，細(xì)胞是否能夠增殖分化以構(gòu)建三維的類生物體組織的構(gòu)造物是重點(diǎn)，有使用細(xì)胞、生長(zhǎng)因子的方法、將作為組織或器官的再生的基礎(chǔ)的支撐體移植至患者的方法等。作為這樣的支撐體，例如，專利文獻(xiàn)I中公開了由膠原單絲構(gòu)成的移植用基材。
[0003]另外，專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)3中公開了生物吸收性材料的發(fā)泡體、由同樣材料加強(qiáng)的心血管類組織培養(yǎng)基材、以及管狀的神經(jīng)再生基材。
[0004]另外，專利文獻(xiàn)4中公開了在海綿狀或無(wú)紡布狀的由高分子材料成形物構(gòu)成的骨架的內(nèi)部具有分散有細(xì)胞的凝膠的醫(yī)用材料。
[0005]作為再生醫(yī)療的對(duì)象之一，可以列舉耳廓軟骨組織的再生。耳廓軟骨組織是大型且具有厚度的組織，除此以外，還要求比較高的力學(xué)強(qiáng)度。但是，利用使用現(xiàn)有的支撐體的生物體組織的制造方法，難以制造這樣的大型且具有厚度的耳廓軟骨組織。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:日本特開2003-193328號(hào)公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)2:日本特開2001-78750號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)3:日本特開2003-19196號(hào)公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)4:日本特開2003-204807號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠制造具有充分的厚度和力學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織的耳廓軟骨組織的制造方法、以及由該耳廓軟骨組織的制造方法制得的耳廓軟骨組織。
[0014]用于解決技術(shù)問題的手段
[0015]本發(fā)明的耳廓軟骨組織的制造方法具有:在平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布上接種耳廓軟骨細(xì)胞的細(xì)胞接種工序；和將接種有上述耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布，與由非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架復(fù)合、調(diào)整形狀的成形工序。
[0016]以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0017] 本發(fā)明的發(fā)明人嘗試了在具有各種材質(zhì)和形狀的支撐體上接種耳廓軟骨細(xì)胞來(lái)再生耳廓軟骨組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在使用平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布的情況下，與使用具有其他材質(zhì)和形狀的支撐體的情況相比，耳廓軟骨組織的再生得到顯著促進(jìn)。進(jìn)一步研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過在平均纖維直徑為0.90~7.0O μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布上接種耳廓軟骨細(xì)胞后，將其與由非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架復(fù)合、進(jìn)行成形，能夠制造具有充分的厚度和力學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織，從而完成了本發(fā)明。
[0018]在使用平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布的情況下，耳廓軟骨組織的再生特別被促進(jìn)的理由尚不清楚。本發(fā)明的發(fā)明人嘗試在由不同平均纖維直徑的多種聚乙醇酸交酯構(gòu)成的無(wú)紡布上接種耳廓軟骨細(xì)胞后，測(cè)定細(xì)胞的附著數(shù)。但是，在平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的情況下，并沒有細(xì)胞特別有意地附著。
[0019]本發(fā)明的耳廓軟骨組織的制造方法具有在平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布(以下，也簡(jiǎn)稱為“無(wú)紡布”)上接種耳廓軟骨細(xì)胞的細(xì)胞接種工序。通過使用這樣的特定的平均纖維直徑、由特定的材質(zhì)構(gòu)成的無(wú)紡布，能夠制造具有充分的厚度和力 學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織。
[0020]上述生物吸收性材料沒有特別限定，例如可以列舉聚乙醇酸交酯、聚丙交酯(D、L、DL體)、聚己內(nèi)酯、乙醇酸-丙交酯(D、L、DL體)共聚物、乙醇酸-ε -己內(nèi)酯共聚物、丙交酯(0、1^、01^體)-￡-己內(nèi)酯共聚物、聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)等。它們可以單獨(dú)使用，也可以將2種以上一并使用。其中，優(yōu)選聚乙醇酸交酯或丙交酯(D、L、DL體)-ε-己內(nèi)酯共聚物，更優(yōu)選聚乙醇酸交酯。
[0021]上述無(wú)紡布的平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m。在上述無(wú)紡布的平均纖維直徑在該范圍的情況下，能夠促進(jìn)耳廓軟骨組織的再生。其中，在上述無(wú)紡布的平均纖維直徑為0.90 μ m的情況下，耳廓軟骨組織的再生能夠得到特別促進(jìn)。
[0022]其中，在本說(shuō)明書中，無(wú)紡布的平均纖維直徑是指:切取無(wú)紡布的布料的中央的一部分，使用電子顯微鏡觀察，隨機(jī)抽取焦點(diǎn)合適的纖維，一邊改變部位一邊測(cè)定纖維的直徑，直至測(cè)定的纖維合計(jì)達(dá)到100根以上，將此時(shí)得到的100根以上的纖維的直徑取平均而得到的值。
[0023]上述無(wú)紡布的單位面積重量的優(yōu)選的下限為lg/m2，優(yōu)選的上限為100g/m2。當(dāng)單位面積重量在該范圍外時(shí)，有時(shí)無(wú)法再生充分的耳廓軟骨組織。上述無(wú)紡布的單位面積重量的更優(yōu)選的下限為5g/m2，更優(yōu)選的上限為50g/m2。
[0024]上述平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布的制造方法沒有特別限定，例如能夠使用靜電紡絲沉積法、熔噴法、針刺法、紡粘法、瞬時(shí)紡絲法、水流交絡(luò)法、氣流成網(wǎng)法、熱粘法、樹脂粘合法、濕式法等現(xiàn)有公知的方法。其中，優(yōu)選熔噴法。
[0025]在上述細(xì)胞接種工序中，在上述無(wú)紡布上接種耳廓軟骨細(xì)胞。
[0026]上述耳廓軟骨細(xì)胞可以利用現(xiàn)有公知的方法采集。例如，可以從由人或動(dòng)物等得到的耳廓，將皮膚、結(jié)締組織、軟骨膜除去后，細(xì)切成5mmX5mm左右的小片后，進(jìn)行膠原酶處理，由此分離耳廓軟骨細(xì)胞。分離出的耳廓軟骨細(xì)胞，可以直接用于本發(fā)明的耳廓軟骨組織的制造方法，也可以在通過培養(yǎng)使其增殖后用于本發(fā)明的耳廓軟骨組織的制造方法。
[0027]上述接種的方法沒有特別限定，能夠使用現(xiàn)有公知的接種方法。
[0028]上述接種時(shí)的接種密度沒有特別限定，優(yōu)選的下限為2.0X107CellS/Cm2，優(yōu)選的上限為1.0X 108cells/cm2。當(dāng)細(xì)胞接種密度小于2.0X 107cells/cm2時(shí)，有時(shí)形成具有充分的厚度和力學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織需要花費(fèi)大量的時(shí)間，而即使以超過1.0X 108cellS/cm2
的密度接種細(xì)胞，也看不到更好的效果。細(xì)胞接種密度的更優(yōu)選的下限為5.0X107cells/
2
cm ο
[0029]接種了上述耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布，優(yōu)選靜置10分鐘左右，直至耳廓軟骨細(xì)胞充分地附著。另外，也可以根據(jù)需要進(jìn)行數(shù)小時(shí)到數(shù)天左右的培養(yǎng)。作為進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)液，例如能夠使用在MEM、DMEM等通常的培養(yǎng)液中添加有I~10重量％左右的胎牛血清的添加血清的培養(yǎng)基。
[0030]本發(fā)明的耳廓軟骨組織的制造方法具有將接種有上述耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布，與由非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架復(fù)合、調(diào)整形狀的成形工序。
[0031]耳廓軟骨組織的再生，需要形成大型且具有厚度的組織。另外，調(diào)整為與移植部位匹配的形狀也很重要。由上述非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架，起到將得到的耳廓軟骨組織調(diào)整為任意形狀、任意厚度的作用。
[0032]形成上述網(wǎng)狀的框架的非生物吸收性材料，只要對(duì)生物體沒有毒性、并且具有適度的硬度和彈性，就沒有特別限定，優(yōu)選聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTEF)、尼龍等。
[0033]上述網(wǎng)狀的框架優(yōu)選具備與想要再生的耳廓軟骨組織相對(duì)應(yīng)的形狀。例如，在需要將整個(gè)耳廓再生的情況下，優(yōu)選具備與整個(gè)耳廓相對(duì)應(yīng)的形狀?；蛘撸部梢詫⒄麄€(gè)耳廓分割為多個(gè)部分，做成與其各個(gè)部分相對(duì)應(yīng)的形狀，然后組合來(lái)構(gòu)成整個(gè)耳廓。
[0034]作為接種有上述耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布與網(wǎng)狀的框架的復(fù)合的方法，沒有特別限定，可以將接種有耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布夾在2片網(wǎng)狀的框架間成形為任意形狀，也可以以包入任意形狀的網(wǎng)狀的框架的方式卷繞接種有耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布。
[0035]通過將由本發(fā)明的耳廓軟骨組織的制造方法制得的耳廓軟骨組織移植到生物體內(nèi)，能夠再生具有充分的厚度和力學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織。
[0036]另外，包括接種有耳廓軟骨細(xì)胞的平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布、和由非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架的耳廓軟骨組織，也是本發(fā)明之一。
[0037]發(fā)明效果
[0038]根據(jù)本發(fā)明，提供一種能夠制造具有充分的厚度和力學(xué)強(qiáng)度的耳廓軟骨組織的耳廓軟骨組織的制造方法、以及由該耳廓軟骨組織的制造方法制得的耳廓軟骨組織。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1是實(shí)驗(yàn)例中制作的樣品III的無(wú)紡布的布料的中央部的電子顯微鏡照片。
[0040]圖2是移植5周后的組織再生確認(rèn)用樣品的組織切片的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0041]以下列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方式更詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明，但是本發(fā)明并不僅限定于這些實(shí)施例。
[0042](實(shí)驗(yàn)例)
[0043](I)無(wú)紡布的制備
[0044]通過將由熔噴法得到的無(wú)紡布進(jìn)行拉伸、或者將紡絲而得到的筒編布利用針刺法制成無(wú)紡布的方法，得到由平均纖維直徑為0.67μπι(樣品Ι)、0.90μπι(樣品II)、
3.10 μ m (樣品II I)、7.0O μ m (樣品I V)和20.60 μ m (樣品V)的聚乙醇酸交酯構(gòu)成的、厚度
0.13~0.30mm的無(wú)紡布。
[0045]并且，切取樣品III的無(wú)紡布的布料的中央的一部分，將使用電子顯微鏡觀察到的圖像示于圖1 (照片下的橫杠表示30 μ m)。
[0046]如圖1所示，隨機(jī)抽取電子顯微鏡照片中的焦點(diǎn)合適的纖維，測(cè)定各纖維的直徑。一邊改變部位一邊測(cè)定纖維的直徑，直至測(cè)定的纖維合計(jì)達(dá)到100根，將得到的100根纖維的直徑平均，得到3.10 μ m的平均纖維直徑。對(duì)于其他的樣品1、I1、IV、V也通過同樣的方法得到平均纖維直徑。
[0047](2)耳廓軟骨細(xì)胞的分離和接種
[0048]將小獵兔 犬(雌性、6~8周齡)的兩耳廓在麻醉下切斷。從得到的耳廓，將皮膚、結(jié)締組織、軟骨膜除去后，細(xì)切成5mmX 5mm左右的小片。將得到的小片在濃度0.3%的膠原酶溶液中處理I晚后，分離耳廓軟骨細(xì)胞。使分離出的耳廓軟骨細(xì)胞懸浮在磷酸緩沖液中，得到1.0X 108cellS/mL的細(xì)胞懸浮液。
[0049](3)與網(wǎng)狀的框架的復(fù)合
[0050]準(zhǔn)備由聚丙烯構(gòu)成的大小為2cmX2cm、厚度為0.34±0.007mm的片狀的網(wǎng)。
[0051]作為彎曲強(qiáng)度測(cè)定用樣品，將接種有耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布夾在2片片狀網(wǎng)之間進(jìn)行復(fù)合，制作出平板型的支架。
[0052]另一方面，作為三維形狀維持確認(rèn)用樣品，將接種有耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布夾在片狀網(wǎng)之間，將得到的部件成形為耳廓形狀，得到人耳廓形狀的支架。
[0053](4)移植
[0054]將得到的平板型的支架和人耳廓形狀的支架自體移植至同一個(gè)體(小獵兔犬、雌性、6~8周齡)。在全身麻醉后，在后頸部切開，將支架移植至頭部肌肉膜間并固定。在移植后5周后將其宰殺，取出各個(gè)樣品。
[0055](評(píng)價(jià))
[0056](I)彎曲強(qiáng)度的測(cè)定
[0057]對(duì)取出的彎曲強(qiáng)度測(cè)定用樣品，按照ROY等的方法，使用自動(dòng)繪圖儀測(cè)定彎曲強(qiáng)度。即，將夾鉗間調(diào)整為Icm后,將做成20mmX5mm大小的樣品固定在臺(tái)座上,在使垂直板以0.02mm/sec的速度下降的條件下測(cè)定彎曲強(qiáng)度。將結(jié)果示于表1。
[0058][表 I]
【權(quán)利要求】
1.一種耳廓軟骨組織的制造方法，其特征在于，具有: 在平均纖維直徑為0.90~7.0O μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布上接種耳廓軟骨細(xì)胞的細(xì)胞接種工序；和 將接種有所述耳廓軟骨細(xì)胞的無(wú)紡布，與由非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架復(fù)合、調(diào)整形狀的成形工序。
2.如權(quán)利要求1所述的耳廓軟骨組織的制造方法，其特征在于: 由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布的平均纖維直徑為0.90 μ m。
3.如權(quán)利要求1或2所述的耳廓軟骨組織的制造方法，其特征在于: 生物吸收性材料為聚乙醇酸交酯或丙交酯(D、L、DL體)-ε -己內(nèi)酯共聚物。
4.一種耳廓軟骨組織，其特征在于，包括: 接種有耳廓軟骨細(xì)胞的、平均纖維直徑為0.90~7.00 μ m的由生物吸收性材料構(gòu)成的無(wú)紡布；和由非生物吸收性材料構(gòu)成的網(wǎng)狀的框架。
【文檔編號(hào)】A61L27/00GK103957950SQ201280058451
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月2日
【發(fā)明者】磯貝典孝, 伊谷善仁, 萩原明郎, 森田真一郎, 澤井恒祐, 畠山紘一 申請(qǐng)人:郡是株式會(huì)社