促進(jìn)抗原消除的抗原結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明人創(chuàng)作了抗原結(jié)合分子，所述抗原結(jié)合分子含有：在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及，在pH中性范圍條件下Fcγ受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fc區(qū)的Fcγ受體結(jié)合活性相比高的Fcγ受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
【專利說明】促進(jìn)抗原消除的抗原結(jié)合分子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供:使結(jié)合的抗原向細(xì)胞內(nèi)的攝入得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子、使每一分子可結(jié)合的抗原數(shù)目增加的抗原結(jié)合分子、使藥代動力學(xué)得到改善的抗原結(jié)合分子、使在細(xì)胞外結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)的解離得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子、使在不與抗原結(jié)合的狀態(tài)下向細(xì)胞外的釋放得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子、具有使血漿中的總抗原濃度或游離抗原濃度減少的功能的抗原結(jié)合分子，含有該抗原結(jié)合分子的藥物組合物，以及它們的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗體在血漿中的穩(wěn)定性高、副作用也少，因而作為醫(yī)藥品受到關(guān)注。其中，IgG型的抗體藥物有大量上市，現(xiàn)在也正在開發(fā)著數(shù)量眾多的抗體藥物(非專利文獻(xiàn)I和非專利文獻(xiàn)2)。另一方面，作為能適用于第二代抗體藥物的技術(shù)，開發(fā)有各種技術(shù)，報道了使效應(yīng)子功能、抗原結(jié)合能力、藥代動力學(xué)、穩(wěn)定性提高的技術(shù)或者使免疫原性風(fēng)險降低的技術(shù)等(非專利文獻(xiàn)3)。通常，抗體藥物的給藥量非常高，因而作為課題可考慮到難以制作皮下給藥制劑，制備成本高等。作為降低抗體藥物的給藥量的方法，可考慮改善抗體的藥代動力學(xué)的方法和使抗體與抗原的親和性提高的方法。
[0003]作為改善抗體的藥代動力學(xué)的方法，報道有恒定區(qū)的人工氨基酸取代(非專利文獻(xiàn)4和5)。作為增強(qiáng)抗原結(jié)合能力、抗原中和能力的技術(shù)，報道有親和性成熟技術(shù)(非專利文獻(xiàn)6)，通過對可變區(qū)的CDR區(qū)等的氨基酸導(dǎo)入突變可以增強(qiáng)對抗原的結(jié)合活性。通過增強(qiáng)抗原結(jié)合能力，可以使體外的生物活性提高，或者降低給藥量，進(jìn)而也可以使體內(nèi)(機(jī)體內(nèi))的藥效提高(非專利文獻(xiàn)7)。
[0004]另一方面，每一分子抗體能夠中和的抗原量依賴于親和性，可以通過增強(qiáng)親和性來以少的抗體量中和抗原，可以通過各種方法增強(qiáng)抗體的親和性(非專利文獻(xiàn)6)。進(jìn)而，只要可共價地與抗原結(jié)合，使親和性無限大，則可以用一分子的抗體來中和一分子的抗原(二價的情形為二抗原)。但是，迄今為止的方法中，限制是一分子抗體對一分子抗原(二價的情形是二抗原)的化學(xué)計量的中和反應(yīng)，不可能用抗原量以下的抗體量來完全中和抗原。即，在增強(qiáng)親和性的效果方面存在限制(非專利文獻(xiàn)9)。中和抗體的情形中，為了使其中和效果持續(xù)一定期間，需要給予機(jī)體內(nèi)在該期間產(chǎn)生的抗原量以上的抗體量，僅通過上述的抗體藥代動力學(xué)改善或者親和性成熟技術(shù)，在降低必要抗體給藥量方面存在限制。因此，為了用抗原量以下的抗體量來使抗原的中和效果持續(xù)目標(biāo)期間，需要用一個抗體來中和多個抗原。作為實現(xiàn)其的新方法，最近報道了 PH依賴性地與抗原結(jié)合的抗體(專利文獻(xiàn)I)。在血漿中的中性條件下與抗原強(qiáng)結(jié)合、在內(nèi)體內(nèi)的酸性條件下從抗原解離的PH依賴性抗原結(jié)合抗體可以在內(nèi)體內(nèi)從抗原解離。PH依賴性抗原結(jié)合抗體在將抗原解離后，若抗體被FcRn再循環(huán)到血漿中，則可以再次與抗原結(jié)合，因而可以用一個pH依賴性抗原結(jié)合抗體重復(fù)與多個抗原結(jié)合。
[0005]此外，與結(jié)合至FcRn而被再循環(huán)的抗體相比，抗原的血漿中滯留性非常短。這種血漿中滯留性長的抗體與其抗原結(jié)合時，抗體抗原復(fù)合體的血漿中滯留性變得與抗體同樣地長。因此，抗原通過與抗體結(jié)合，不僅血漿中滯留性變長，而且血漿中抗原濃度上升。
[0006]如此，pH依賴性抗原結(jié)合抗體可以用I個抗體與多個抗原結(jié)合，與通常的抗體相t匕，能促進(jìn)抗原從血漿中的消除，因此具有通常的抗體所無法實現(xiàn)的作用。然而，迄今為止尚未報道有該P(yáng)H依賴性抗原結(jié)合抗體的可以重復(fù)與抗原結(jié)合的效果以及使促進(jìn)抗原從血漿中消除的效果進(jìn)一步提高的抗體工程技術(shù)。
[0007]IgG抗體通過與FcRn結(jié)合而具有長的血衆(zhòng)中滯留性。IgG和FcRn的結(jié)合僅在酸性條件下(PH6.0)被觀察到，而在中性條件下(pH7.4)基本觀察不到其結(jié)合。IgG抗體被非特異性地攝入細(xì)胞，但通過在內(nèi)體內(nèi)的酸性條件下與內(nèi)體內(nèi)的FcRn結(jié)合而返回到細(xì)胞表面上，在血漿中的中性條件下從FcRn解離。向IgG的Fe區(qū)導(dǎo)入突變而使其喪失在pH酸性條件下與FcRn的結(jié)合時，變得無法從內(nèi)體內(nèi)再循環(huán)到血漿中，因而抗體的血漿中滯留性顯著受損。作為改善IgG抗體的血漿中滯留性的方法，報道有提高pH酸性范圍條件下對FcRn的結(jié)合的方法。通過向IgG抗體的Fe區(qū)導(dǎo)入氨基酸取代，使pH酸性范圍條件下對FcRn的結(jié)合提高，從內(nèi)體內(nèi)再循環(huán)到血漿中的效率提高，結(jié)果血漿中滯留性改善。
[0008]作為IgG類抗體的效應(yīng)子功能的抗體依賴性細(xì)胞毒活性(以下表示為ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(以下表示為CDC)的研究，迄今為止進(jìn)行了許多，在人IgG類之中，報道了 IgGl亞類的抗體具有最高的ADCC活性、⑶C活性(非專利文獻(xiàn)13)。此外，作為由IgG類抗體介導(dǎo)的靶細(xì)胞的吞噬作用的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)也作為抗體的效應(yīng)子功能之一而被暗示(非專利文獻(xiàn)14、非專利文獻(xiàn)15)。IgGl亞類的抗體可能對腫瘤發(fā)揮這些效應(yīng)子功能，因此使 用IgGl亞類的抗體作為針對癌抗原的大部分的抗體藥物。
[0009]為了使IgG抗體介導(dǎo)ADCC、ADCP活性，有必要使IgG抗體的Fe區(qū)與存在于殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞表面上的抗體受體(以下表示為Fe Y受體或Fe YR)相結(jié)合。作為人的Fe Y受體的蛋白家族，報道有Fe YRIa、Fc YRIIa、Fc YRIIb、FcyRIIIa.FcyRIIIb的同種型，也報道有各自的同種異型(非專利文獻(xiàn)16)。
[0010]增強(qiáng)ADCC和ADCP等細(xì)胞毒性的效應(yīng)子功能，作為有望用于增強(qiáng)抗癌抗體的抗腫瘤效果的手段而被關(guān)注。以抗體的抗腫瘤效果為目的的由Fcy受體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的重要性有使用小鼠模型的報道(非專利文獻(xiàn)17、非專利文獻(xiàn)18)。此外，在對人的臨床效果與Fe Y RIIIa的高親和性多態(tài)性(V158)和低親和性多態(tài)性(F158)之間觀察到了相關(guān)性(非專利文獻(xiàn)19)。根據(jù)這些報道，暗示了:具有優(yōu)化了與特定Fe Y受體的結(jié)合的Fe區(qū)的抗體介導(dǎo)更強(qiáng)的效應(yīng)子功能，由此發(fā)揮有效的抗腫瘤效果。抗體對含有Fe YRIa、Fc YRIIa、Fe y RIIIa、Fc Y RIIIb的活化受體、含有Fe y RIIb的抑制受體各自的親和性的平衡在優(yōu)化抗體的效應(yīng)子功能方面是重要的因素。通過增強(qiáng)對活化受體的親和性，可以對抗體賦予介導(dǎo)更強(qiáng)的效應(yīng)子功能的性質(zhì)(非專利文獻(xiàn)20)，因此作為使針對抗癌抗原的抗體藥物的抗腫瘤活性增強(qiáng)或提高的抗體工程方法，迄今為止有各種的報道。
[0011]已顯示:關(guān)于Fe區(qū)與Fe Y受體的結(jié)合，抗體的鉸鏈區(qū)以及CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的數(shù)個氨基酸殘基以及與CH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的EU編號297位的Asn上所附加的糖鏈?zhǔn)侵匾?非專利文獻(xiàn)13、非專利文獻(xiàn)21、非專利文獻(xiàn)22)。圍繞該結(jié)合位置,迄今為止研究了各種具有Fe Y受體結(jié)合特性的Fe區(qū)的突變體，得到了對活化Fe Y受體具有更高親和性的Fe區(qū)突變體(專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3)。例如，Lazar等人通過將人IgGl的以EU編號表示的239位的Ser,330位的Ala、332位的Ile分別取代成Asp、Leu、Glu，成功地使人IgGl對人Fe y RIIIa(V158)的結(jié)合增加到約370倍(非專利文獻(xiàn)23、專利文獻(xiàn)3)。該改變體與天然型相比，對Fe YRIIIa和Fe YRIIb的結(jié)合之比(A/Ι比)達(dá)到約9倍。此外，Shinkawa等人通過使以EU編號表示的297位的Asn所附加的糖鏈的巖藻糖缺失而成功地使對Fe Y RIIIa的結(jié)合增加到約100倍(非專利文獻(xiàn)24)。通過這些方法，與天然型人IgGl比較，可以使人IgGl的ADCC活性大幅度提高。
[0012]如此，在以膜型抗原為靶標(biāo)的抗體中，F(xiàn)e Y受體結(jié)合活性在細(xì)胞毒活性中發(fā)揮重要的作用，因此，在細(xì)胞毒活性必要的情形下，使用Fe Y R結(jié)合活性高的人IgGl的同種型，并且通過增強(qiáng)Fe Y受體結(jié)合活性而使細(xì)胞毒活性增強(qiáng)的技術(shù)為廣泛使用的技術(shù)。另一方面，在以可溶型抗原為靶標(biāo)的抗體中，F(xiàn)cy受體結(jié)合活性所發(fā)揮的作用仍屬未知，可以認(rèn)為:Fc Y受體結(jié)合活性高的人IgGl和Fe Y R結(jié)合活性低的人IgG2或人IgG4，在效果方面沒有差異。因此，迄今為止在以可溶型抗原為靶標(biāo)的抗體中，就增強(qiáng)Fcy受體結(jié)合活性方面沒有進(jìn)行嘗試，而且沒有關(guān)于該效果的報道。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014]專利文獻(xiàn)
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0043]發(fā)明所要解決的技術(shù)問題
[0044]本發(fā)明基于上述狀況而完成，其目的在于提供:使結(jié)合的抗原向細(xì)胞內(nèi)的攝入得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子、使每一分子可結(jié)合的抗原數(shù)目增加的抗原結(jié)合分子、使藥代動力學(xué)得到改善的抗原結(jié)合分子、使在細(xì)胞外結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)的解離得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子、使在不與抗原結(jié)合的狀態(tài)下向細(xì)胞外的釋放得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子、具有使血漿中的總抗原濃度或游離抗原濃度減少的功能的抗原結(jié)合分子，含有該抗原結(jié)合分子的藥物組合物，以及它們的制備方法。
[0045]用于解決技術(shù)問題的手段
[0046] 本發(fā)明人為了實現(xiàn)上述目的進(jìn)行了深入的研究，創(chuàng)作了含有以下組分的抗原結(jié)合分子:pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及，在pH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了促進(jìn)結(jié)合的抗原向細(xì)胞內(nèi)攝入的方法、使每一分子的抗原結(jié)合分子可結(jié)合的抗原數(shù)目增加的方法、改善抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法、促進(jìn)在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子解離的方法、在不與抗原結(jié)合的狀態(tài)下促進(jìn)向細(xì)胞外釋放的方法和使血漿中的總抗原濃度或游離抗原濃度減少的方法，這些方法包括使上述的抗原結(jié)合分子與表達(dá)Fe Y受體的細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)或機(jī)體外進(jìn)行細(xì)胞接觸的步驟。此外，本發(fā)明人在發(fā)現(xiàn)具有上述性質(zhì)的抗原結(jié)合分子的制備方法的同時，還發(fā)現(xiàn)含有這樣的抗原結(jié)合分子或者通過本發(fā)明的制備方法制備的抗原結(jié)合分子作為有效成分的藥物組合物的有用性，從而完成了本發(fā)明。
[0047]SP，更具體而言，本發(fā)明提供以下的[I]~[46]。
[0048][I]含有抗原結(jié)合分子的藥物組合物，其中，該抗原結(jié)合分子含有:在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及，在PH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0049][2] [I]所述的藥物組合物，其中，上述抗原為可溶型抗原。
[0050][3] [I]或[2]所述的藥物組合物，其中，上述離子濃度為鈣離子濃度。
[0051][4] [3]所述的藥物組合物，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在高鈣離子濃度條件下抗原結(jié)合活性高于在低鈣離子濃度條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0052][5] [I]或[2]所述的藥物組合物，其中，上述離子濃度條件為pH條件。
[0053][6] [5]所述的藥物組合物，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在pH中性范圍條件下的抗原結(jié)合活性高于在PH酸性范圍條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0054][7] [I]~[6]中任一項所述的藥物組合物，其中，上述抗原結(jié)合分子為具有針對上述抗原的中和活性的抗原結(jié)合分子。
[0055][8] [I]~[7]中任一項所述的藥物組合物，其中，上述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
[0056][9] [8]所述的藥物組合物，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中選自以下的至少一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
[0057][10] [9]所述的藥物組合物，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0058]221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個；
[0059]222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0060]223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
[0061]224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0062]225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
[0063]227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；[0064]228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0065]230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
[0066]231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0067]232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0068]233 位的氛基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0069]234 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser λ Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0070]235 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0071]236 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0072]237 位的氨基 酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0073]238 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0074]239 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0075]240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0076]241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個；
[0077]243 位的氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0078]244位的氨基酸為His ；
[0079]245位的氨基酸為Ala ；
[0080]246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0081]247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0082]249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
[0083]250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
[0084]251位的氨基酸為Phe ；
[0085]254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
[0086]255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個；
[0087]256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
[0088]258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
[0089]260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0090]262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；
[0091]263位的氨基酸為Ala、Ile、Met或Thr中的任一個；
[0092]264 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser λ Thr λ Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0093]265 位的氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；[0094]266位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0095]267 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0096]268 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一個；
[0097]269 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0098]270 位的氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一個；
[0099]271 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0100]272 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0101]273位的氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
[0102]274 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0103]275位的氨基酸為Leu或Trp中的任一個；
[0104]276 位的氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0105]278 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
[0106]279位的氨基酸為Ala ；
[0107]280 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0108]281位的氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0109]282位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0110]283 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
[0111]284位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一個；
[0112]285位的氨基酸為Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一個；
[0113]286位的氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
[0114]288位的氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
[0115]290 位的氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個； [0116]291 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0117]292位的氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一個；
[0118]293 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0119]294 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0120]295 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；[0121]296 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
[0122]297 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0123]298 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0124]299 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； [0125]300 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val 或 Trp 中的任一個；
[0126]301位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0127]302位的氨基酸為Ile ；
[0128]303位的氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
[0129]304位的氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個；
[0130]305位的氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；
[0131]311位的氨基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一個；
[0132]313位的氨基酸為Phe ；
[0133]315位的氨基酸為Leu ；
[0134]317位的氨基酸為Glu或Gln ；
[0135]318 位的氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0136]320 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0137]322 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0138]323位的氨基酸為Ile ；
[0139]324 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0140]325 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0141]326 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0142]327 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0143]328 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0144]329 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0145]330 位的氨基酸為 CyS、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；[0146]331 位的氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0147]332 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0148]333 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr> Val或Tyr中的任一個；
[0149]334 位的氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0150]335 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0151]336位的氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
[0152]337位的氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
[0153]339 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0154]376位的氨基酸為Ala或Val中的任一個；
[0155]377位的氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
[0156]378位的氨基酸為Asp ；
[0157]379位的氨基酸為Asn ；
[0158]380位的氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
[0159]382位的氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
[0160]385位的氨基酸為Glu ;
[0161]392位的氨基酸為Thr ；
[0162]396位的氨基酸為Leu ；
[0163]421位的氨基酸為Lys ；
[0164]427位的氨基酸為Asn ；
[0165]428位的氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
[0166]429位的氨基酸為Met ；
[0167]434位的氨基酸為Trp ；
[0168]436位的氨基酸為Ile ;和
[0169]440位的氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
[0170][11] [I]~[10]中任一項所述的藥物組合物，其中，上述EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
[0171][12] [I]~[11]中任一項所述的藥物組合物，其中，上述人Fe Y受體為Fe Y RIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
[0172][13] [I]~[11]中任一項所述的藥物組合物，其中，上述人Fe Y受體為Fe Y RIIb0
[0173] [14] [8]~[13]中任一項所述的藥物組合物，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0174]238位的氨基酸為Asp，或[0175]328位的氨基酸為Glu。
[0176][15]以下⑴~(Vi)的任一項的方法，該方法包括使抗原結(jié)合分子與表達(dá)Fe Y受體的細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)或機(jī)體外進(jìn)行細(xì)胞接觸的步驟，該抗原結(jié)合分子含有:在PH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及，在PH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，
[0177](i)使一分子的抗原結(jié)合分子可結(jié)合的抗原數(shù)目增加的方法；
[0178](ii)使血漿中的抗原消除的方法；
[0179](iii)改善抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法；
[0180](iv)促進(jìn)在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子解離的方法；
[0181](V)促進(jìn)不與抗原結(jié)合的狀態(tài)的抗原結(jié)合分子向細(xì)胞外釋放的方法；或
[0182](vi)使血漿中的總抗原濃度或游離抗原濃度減少的方法。
[0183][16] [15]所述的方法，其中，上述抗原為可溶型抗原。
[0184][17] [15]或 [16]所述的方法，其中，上述離子濃度為鈣離子濃度。
[0185][18] [17]所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于在低鈣離子濃度條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0186][19] [15]或[16]所述的方法，其中，上述離子濃度條件為pH條件。
[0187][20] [19]所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在pH中性范圍條件下的抗原結(jié)合活性高于在PH酸性范圍條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0188][21] [15]~[20]中任一項所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合分子為具有針對上述抗原的中和活性的抗原結(jié)合分子。
[0189][22] [15]~[21]中任一項所述的方法，其中，上述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
[0190][23] [22]所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中選自以下的至少一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、
222位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、
236位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、
250位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、
267位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、
280位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、
294位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434位、436位和440位。
[0191][24] [23]所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0192]221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個；[0193]222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0194]223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
[0195]224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0196]225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
[0197]227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0198]228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0199]230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
[0200]231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0201]232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0202]233 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0203]234 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0204]235 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0205]236 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0206]237 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0207]238 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0208]239 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0209]240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0210]241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個；
[0211]243 位的氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0212]244位的氨基酸為Hi s ；
[0213]245位的氨基酸為Ala;
[0214]246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0215]247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0216]249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
[0217]250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
[0218]251位的氨基酸為Phe ；
[0219]254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
[0220]255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個；
[0221]256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
[0222]258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
[0223]260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0224]262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；[0225]263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0226]264 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0227]265 位的氛基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0228]266位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0229]267 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0230]268 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一個；
[0231]269 位的氨基 酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0232]270 位的氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一個；
[0233]271 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0234]272 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0235]273位的氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
[0236]274 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0237]275位的氨基酸為Leu或Trp中的任一個；
[0238]276 位的氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0239]278 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
[0240]279位的氨基酸為Ala ；
[0241]280 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0242]281位的氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0243]282位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0244]283 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
[0245]284位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一個；
[0246]285位的氨基酸為Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一個；
[0247]286位的氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
[0248]288位的氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
[0249]290 位的氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0250]291 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0251 ] 292位的氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一個；
[0252]293 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0253]294 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0254]295 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0255]296 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
[0256]297 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0257]298 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0258]299 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0259]300 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一個；
[0260]301位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0261]302位的氨基酸為Ile ；
[0262]303位的氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
[0263]304位的氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個；
[0264]305位的氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；
[0265]311位的氨基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一個；
[0266]313位的氨基酸為Phe ；
[0267]315位的氨基酸為Leu ；
[0268]317位的氨基酸為Glu或Gln ；
[0269]318 位的氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0270]320 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0271]322 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0272]323位的氨基酸為Ile ；
[0273]324 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0274]325 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0275]326 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0276]327 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0277]328 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0278]329 位的氨基酸為 Asp>Glu>Phe>Gly>His> Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0279]330 位的氨基酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0280]331 位的氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0281]332 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0282]333 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser> Thr> Val或Tyr中的任一個；
[0283]334 位的氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0284]335 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0285]336位的氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
[0286]337位的氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
[0287]339 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0288]376位的氨基酸為Ala或Val中的任一個；
[0289]377位的氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
[0290]378位的氨基酸為Asp ；
[0291]379位的氨基酸為Asn ；
[0292]380位的氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
[0293]382位的氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
[0294]385位的氨基酸為Glu ；
[0295]392位的氨基酸為Thr ；
[0296]396位的氨基酸為Leu ；
[0297]421位的氨基酸為Lys ；
[0298]427位的氨基酸為Asn ；
[0299]428位的氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
[0300]429位的氨基酸為Met ；
[0301 ] 434位的氨基酸為Trp ； [0302]436位的氨基酸為Ile ;和
[0303]440位的氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
[0304][25] [15]~[24]中任一項所述的方法，其中，上述EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
[0305][26] [15]~[25]中任一項所述的方法，其中，上述人Fe Y受體為FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。[0306][27] [15]~[25]中任一項所述的方法，其中，上述人Fe Y受體為FcyRIIb。
[0307][28] [22]~[27]中任一項所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0308]238位的氨基酸為Asp，或
[0309]328位的氨基酸為Glu。
[0310][29]以下⑴~(vii)的任一項所述的方法，該方法包括:使抗原結(jié)合分子中的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域在pH中性范圍條件下的Fe Y受體結(jié)合活性較EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)在pH中性范圍條件下的Fe Y受體結(jié)合活性增強(qiáng)的步驟，所述抗原結(jié)合分子含有在PH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性、且對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，
[0311](i)使結(jié)合的抗原向細(xì)胞內(nèi)的攝入得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子的改變方法；
[0312](ii)使一分子的抗原結(jié)合分子可結(jié)合的抗原數(shù)目增加的方法；
[0313](iii)使抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力增大的方法；
[0314](iv)改善抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法；
[0315](V)促進(jìn)在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子解離的方法;
[0316](vi)促進(jìn)在與抗原結(jié)合的狀態(tài)下攝入到細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子在不與抗原結(jié)合的狀態(tài)下向細(xì)胞外釋放的方法；或
[0317](vii)可減少血漿中的總抗原濃度或游離抗原濃度的抗原結(jié)合分子的改變方法。
[0318][30] [29]所述的方法，其中，上述抗原為可溶型抗原。
[0319][31] [29]或[30]所述的方法，其中，上述離子濃度為鈣離子濃度。
[0320][32] [31]所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于在低鈣離子濃度條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0321][33] [29]或[30]所述的方法，其中，上述離子濃度條件為pH條件。
[0322][34] [33]所述的方法，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在pH中性范圍條件下的抗原結(jié)合活性高于在PH酸性范圍條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0323][35] [29]~[34]中任一項所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合分子為具有針對上述抗原的中和活性的抗原結(jié)合分子。
[0324][36] [29]~[35]中任一項所述的方法，其中，上述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
[0325][37] [36]所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中以下的任一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、222位、
223位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、
237位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、
251位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、
268位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、
281位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、
295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434 位、436位和440位。
[0326][38] [33]所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0327]221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個；
[0328]222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0329]223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
[0330]224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0331]225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
[0332]227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0333]228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0334]230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
[0335]231位的氨基酸為 Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0336]232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0337]233 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0338]234 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0339]235 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0340]236 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0341]237 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0342]238 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0343]239 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0344]240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0345]241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個；
[0346]243 位的氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0347]244位的氨基酸為His ；
[0348]245位的氨基酸為Ala;
[0349]246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0350]247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0351]249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
[0352]250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
[0353]251位的氨基酸為Phe ；[0354]254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
[0355]255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個；
[0356]256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
[0357]258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
[0358]260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中 的任一個；
[0359]262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；
[0360]263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0361]264 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0362]265 位的氛基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0363]266位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0364]267 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0365]268 位的氛基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一個；
[0366]269 位的氛基酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0367]270 位的氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一個；
[0368]271 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0369]272 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0370]273位的氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
[0371]274 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0372]275位的氨基酸為Leu或Trp中的任一個；
[0373]276 位的氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0374]278 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
[0375]279位的氨基酸為Ala ；
[0376]280 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0377]281位的氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0378]282位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0379]283 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
[0380]284位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一個；
[0381]285位的氨基酸為Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一個；[0382]286位的氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
[0383]288位的氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
[0384]290 位的氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0385]291 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0386]292位的氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一個；
[0387]293 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Thr> Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0388]294 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Th;r、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0389]295 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Th;r、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0390]296 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
[0391]297 位的氨基酸為 Asp>Glu>Phe>Gly>His> Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0392]298 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0393]299 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0394]300 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val 或 Trp 中的任一個；
[0395]301位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0396]302位的氨基酸為Ile ；
[0397]303位的氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
[0398]304位的氨基酸為Asp、HiS、Leu、Asn或Thr中的任一個；
[0399]305位的氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；
[0400]311位的氨基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一個；
[0401]313位的氨基酸為Phe ；
[0402]315位的氨基酸為Leu ；
[0403]317位的氨基酸為Glu或Gln ;
[0404]318 位的氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0405]320 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser> Thr> Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0406]322 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0407]323位的氨基酸為Ile ;
[0408]324 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr> Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0409]325 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0410]326 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0411]327 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0412]328 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0413]329 位的氨基酸為 Asp>Glu>Phe>Gly>His> Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0414]330 位的氨基 酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0415]331 位的氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0416]332 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0417]333 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser> Thr> Val或Tyr中的任一個；
[0418]334 位的氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0419]335 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0420]336位的氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
[0421]337位的氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
[0422]339 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0423]376位的氨基酸為Ala或Val中的任一個；
[0424]377位的氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
[0425]378位的氨基酸為Asp ；
[0426]379位的氨基酸為Asn ；
[0427]380位的氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
[0428]382位的氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
[0429]385位的氨基酸為Glu ；
[0430]392位的氨基酸為Thr ；
[0431 ] 396位的氨基酸為Leu ；
[0432]421位的氨基酸為Lys ；
[0433]427位的氨基酸為Asn ；
[0434]428位的氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
[0435]429位的氨基酸為Met ；
[0436]434位的氨基酸為Trp ；
[0437]436位的氨基酸為Ile ;和[0438]440位的氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
[0439][39] [29]~[38]中任一項所述的方法，其中，上述EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
[0440][40] [29]~[39]中任一項所述的方法，其中，上述人Fe Y受體為FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
[0441][41] [29]~[39]中任一項所述的方法，其中，上述人Fe Y受體為FcyRIIb。
[0442][42] [36]~[41]中任一項所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0443]238位的氨基酸為Asp，或
[0444]328位的氨基酸為Glu。
[0445][43]抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a)~(f)的步驟:
[0446](a)獲得在高鈣離子濃度條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)乖慕Y(jié)合活性的步驟；
[0447](b)獲得在低鈣離子濃度條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性的步驟；
[0448](c)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟；
[0449](d)使編碼在(C)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且在pH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0450](e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及
[0451](f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
[0452][44]抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a)~(f)的步驟:
[0453](a)獲得在高鈣離子濃度條件下抗體對抗原的結(jié)合活性的步驟；
[0454](b)獲得在低鈣離子濃度條件下抗體的抗原結(jié)合活性的步驟；
[0455](C)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗體的步驟；
[0456](d)使編碼在(C)中選擇的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍具有人FcRn結(jié)合活性，且在pH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0457](e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及
[0458](f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
[0459][45]抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a)~(f)的步驟:
[0460] (a)獲得在pH中性范圍條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)乖慕Y(jié)合活性的步驟；
[0461](b)獲得在pH酸性范圍條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性的步驟；
[0462](c)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟；
[0463](d)使編碼在(C)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且在pH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0464](e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及
[0465](f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
[0466][46]抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a)~(f)的步驟:
[0467](a)獲得在pH中性范圍條件下抗體對抗原的結(jié)合活性的步驟；
[0468](b)獲得在pH酸性范圍條件下抗體對抗原的抗原結(jié)合活性的步驟；
[0469](c)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗體的步驟；
[0470](d)使編碼在(C)中選擇的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且在pH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0471](e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及
[0472](f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
[0473][47] [43]~[46]中任一項所述的制備方法，其中，上述抗原為可溶型抗原。
[0474][48] [43]~[47]中任一項所述的制備方法，其中，上述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
[0475][49] [48]所述的制備方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中選自以下的至少一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
[0476][50] [49]所述的制備方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0477]221位的氨基酸 為Lys或Tyr中的任一個；
[0478]222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；[0479]223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
[0480]224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0481]225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
[0482]227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0483]228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0484]230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
[0485]231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0486]232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0487]233 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； [0488]234 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0489]235 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0490]236 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0491]237 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0492]238 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0493]239 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0494]240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0495]241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個；
[0496]243 位的氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0497]244位的氨基酸為His ；
[0498]245位的氨基酸為Ala;
[0499]246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0500]247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0501]249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
[0502]250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
[0503]251位的氨基酸為Phe ；
[0504]254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
[0505]255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個；
[0506]256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
[0507]258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
[0508]260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0509]262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；
[0510]263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；[0511]264 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0512]265 位的氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0513]266位的氨基酸為Ala、Ile、Met或Thr中的任一個；
[0514]267 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0515]268 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一個；
[0516]269 位的氛基酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0517]270 位的氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一個；
[0518]271 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0519]272 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0520]273位的氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
[0521]274 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0522]275位的氨基酸為Leu或Trp中的任一個；
[0523]276 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0524]278 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
[0525]279位的氨基酸為Ala ；
[0526]280 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0527]281位的氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0528]282位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0529]283 位的氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
[0530]284位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一個；
[0531]285位的氨基酸為Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一個；
[0532]286位的氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
[0533]288位的氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
[0534]290 位的氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0535]291 位的氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0536]292位的氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一個；
[0537]293 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；[0538]294 位的氨基酸為 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0539]295 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0540]296 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
[0541]297 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0542]298 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0543]299 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0544]300 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一個；
[0545]301位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0546]302位的氨基酸為Ile ；
[0547]303位的氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
[0548]304位的氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個；
[0549]305位的氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；
[0550]311位的氨基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一個；
[0551]313位的氨基酸為Phe ；
[0552]315位的氨基酸為Leu ；
[0553]317位的氨基酸為Glu或Gln ；
[0554]318 位的氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0555]320 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0556]322 位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0557]323位的氨基酸為Ile ；
[0558]324 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0559]325 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0560]326 位的氛基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0561]327 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0562]328 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；[0563]329 位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0564]330 位的氨基酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0565]331 位的氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0566]332 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0567]333 位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser> Thr> Val或Tyr中的任一個；
[0568]334 位的氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0569]335 位的氛基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0570]336位的氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
[0571]337位的氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
[0572]339 位的氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0573]376位的氨基酸為Ala或Val中的任一個；
[0574]377位的氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
[0575]378位的氨基酸為Asp ；
[0576]379位的氨基酸為Asn ；
[0577]380位的氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
[0578]382位的氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
[0579]385位的氨基酸為Glu ；
[0580]392位的氨基酸為Thr ；
[0581 ] 396位的氨基酸為Leu ；
[0582]421位的氨基酸為Lys ；
[0583]427位的氨基酸為Asn ；
[0584]428位的氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
[0585]429位的氨基酸為Met ；
[0586]434位的氨基酸為Trp ；
[0587]436位的氨基酸為Ile ；以及
[0588]440位的氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
[0589][51] [43]~[50]中任一項所述的制備方法，其中，上述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
[0590][52] [43]~[51]中任一項所述的制備方法，其中，上述人Fe Y受體為Fe Y RIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
[0591][53] [43]~[51]中任一項所述的制備方法，其中，上述人Fe Y受體為FcyRIIb。[0592][54] [48]~[53]中任一項所述的制備方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū):
[0593]238位的氨基酸為Asp，或
[0594]328位的氨基酸為Glu。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0595][圖1]是表示與現(xiàn)有的中和抗體相比，通過給予增強(qiáng)了中性pH下的Fcy受體結(jié)合的的離子濃度依賴性地與抗原結(jié)合的抗體，可溶型抗原從血漿中消除的非限定的作用機(jī)制的圖。
[0596][圖2]是顯示將H54/L28_IgGl或pH依賴性地與人IL-6受體結(jié)合的Fv4_IgGl給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0597][圖3]是顯示將pH依賴性地與人IL-6受體結(jié)合的Fv4_IgGl、沒有小鼠FeY R結(jié)合的Fv4-1gGl的改變體即Fv4-1gGl-F760、增強(qiáng)了小鼠Fe Y R結(jié)合的Fv4_IgGl的改變體即Fv4-1gGl-F1022或Fv4_IgGl的低巖藻糖型抗體即Fv4-1gGl_Fuc給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0598][圖4] 是顯示將含有 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1022 和 Fv4-1gGl_F1022 的改變體即提高了 PH酸性范圍的FcRn結(jié)合的Fv4-1gGl-F1093作為重鏈的抗原結(jié)合分子給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0599][圖5]是顯示將含有 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1022 和 Fv4-1gGl_F1022 的改變體即提高了 PH酸性范圍的FcRn結(jié)合的Fv4-1gGl-F1093作為重鏈的抗原結(jié)合分子給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中給予的抗原結(jié)合分子的濃度變化的圖。
[0600][圖6]是顯示將Fv4_IgGl、增強(qiáng)了小鼠FeY R結(jié)合的(特別是對小鼠Fe Y RIIb,小鼠Fe Y RIII的結(jié)合得到增強(qiáng))Fv4-1gGl的改變體即Fv4-1gGl_F1087和增強(qiáng)了小鼠FcyR結(jié)合的(特別是對小鼠Fe Y R1、小鼠Fe y RIV的結(jié)合得到增強(qiáng))Fv4_IgGl的改變體即Fv4-1gGl-F1182給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0601][圖7]是顯示將Fv4-1gGl、Fv4-1gGl_F1087和提高了pH酸性范圍的FcRn結(jié)合的 Fv4-1gGl-F1087 的改變體即 Fv4_IgGl_Fl 180、Fv4-1gGl_F1412 給予人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中給予的抗原結(jié)合分子的濃度變化的圖。
[0602][圖8]是顯示將Fv4_IgGl、Fv4-1gGl_F1182和提高了pH酸性范圍的FcRn結(jié)合的Fv4-1gGl-F1182的改變體即Fv4_IgGl_F1181給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中給予的抗原結(jié)合分子的濃度變化的圖。
[0603][圖9]是顯示將Fv4_IgGl、Fv4-1gGl_F1087和提高了pH酸性范圍的FcRn結(jié)合的 Fv4-1gGl-F1087 的改變體即 Fv4_IgGl_Fl 180、Fv4-1gGl_F1412 給予人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0604][圖10]是顯示將Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1182和提高了pH酸性范圍的FcRn結(jié)合的Fv4-1gGl-F1182的改變體即Fv4_IgGl_F1181給予人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0605][圖 11]是顯示將 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1782 或 Fv4-1gGl_F1087 給予人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1782或Fv4-1gGl_F1087的濃度變化結(jié)果的圖。
[0606][圖 12]是顯示將 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1782 或 Fv4-1gGl_F1087 給予人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠時的該小鼠血漿中的可溶型人IL-6受體濃度變化結(jié)果的圖。
[0607][圖13]是顯示將Fv4_mIgGl、對小鼠FeY RllbjjHllFcYRIII的結(jié)合增強(qiáng)了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl_mF44和對小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)了的Fv4-ml gG I的改變體即Fv4-ml gG 1-mF46給予正常小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0608][圖14]是顯示將Fv4_mIgGl、對小鼠FeY RllbjjHllFcYRIII的結(jié)合增強(qiáng)了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl_mF44和對小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl_mF46給予Fe y RIII缺失小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0609][圖15]是顯示將 Fv4_mIgGl JtjHllFcYRllbdHllFcYRIII 的結(jié)合增強(qiáng)了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl_mF44和對小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl_mF46給予Fe受體\鏈缺失小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0610][圖16]是顯示將？￥41^61、對小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的結(jié)合增強(qiáng)了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl_mF44和對小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)了的Fv4-mIgGl的改變體即Fv4-mIgGl_mF46給予Fe y RIIb缺失小鼠時的該小鼠血漿中的人IL-6受體濃度變化的圖。
[0611][圖17]是顯示使用具有FeY RIIa多態(tài)性(R/Η)的來自供體的血小板的血小板聚集測定中奧馬珠單抗-Gld-v3/IgE免疫復(fù)合體的血小板聚集能力的評價結(jié)果的圖。
[0612][圖18]是顯示使用具有FeY RIIa多態(tài)性(H/H)的來自供體的血小板的血小板聚集測定中奧馬珠單抗-Gld-v3/IgE免疫復(fù)合體的血小板聚集能力的評價結(jié)果的圖。
[0613][圖19]是表示評價洗滌血小板的膜表面的⑶62p表達(dá)的結(jié)果的圖。用黑色涂覆的圖形顯示與PBS反應(yīng)后加入ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果的圖，圖形的中央未涂覆者顯示與免疫復(fù)合體反應(yīng)后用ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果的圖。
[0614][圖20]是表示評價洗滌血小板的膜表面的活性型整聯(lián)蛋白表達(dá)的結(jié)果的圖。用黑色涂覆的圖形顯示與PBS反應(yīng)后加入ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果的圖，圖形的中央未涂覆者顯示與免疫復(fù)合體反應(yīng)后用ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果的圖。
[0615][圖21]是顯示使用具有FeY RIIa多態(tài)性(R/Η)的來自供體的血小板的血小板聚集測定中奧馬珠單抗-Gld-v3/IgE免疫復(fù)合體和奧馬珠單抗_BP230/IgE免疫復(fù)合體的血小板聚集能力的評價結(jié)果的圖。
[0616][圖22]是表示評價洗滌血小板的膜表面的CD62p表達(dá)的結(jié)果的圖。用灰色涂覆的圖形顯示與PBS反應(yīng)后加入ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果的圖，實線顯示與奧馬珠單抗-Gld-v3/IgE免疫復(fù)合體、虛線顯示與奧馬珠單抗_BP230/IgE免疫復(fù)合體反應(yīng)后用ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果。
[0617][圖23]是表示評價洗滌血小板的膜表面的活性型整聯(lián)蛋白表達(dá)的結(jié)果的圖。用灰色涂覆的圖形顯示與PBS反應(yīng)后加入ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果的圖，實線顯示與奧馬珠單抗-Gld-v3/IgE免疫復(fù)合體、虛線顯示與奧馬珠單抗_BP230/IgE免疫復(fù)合體反應(yīng)后用ADP進(jìn)行刺激時的結(jié)果。
[0618][圖24]橫軸表示各H)變體對FeY RIIb的相對結(jié)合活性的值，縱軸表示各H)變體對Fe Y RIIa R型的相對結(jié)合活性的值。將各H)變體對各Fe Y R的結(jié)合量的值除以作為對照的導(dǎo)入改變前的抗體IL6R-F652/IL6R-L(IL6R-F652是SEQ ID NO: 142規(guī)定的含有以EU編號表示的238位的Pro取代成Asp的改變Fe的抗體重鏈)對各Fe Y R的結(jié)合量的值，進(jìn)而乘以100倍，將所得的值作為各H)變體對各Fe Y R的相對結(jié)合活性的值。圖中的F652點圖顯示IL6R-F652/IL6R-L的值。
[0619][圖25]縱軸顯示將各改變導(dǎo)入不具有P238D改變的GpH7_B3(SEQ ID NO: 159)/GpL16-kO (SEQ ID NO: 160)中而得的改變體對Fe Y RIIb的相對結(jié)合活性的值，橫軸顯示將各改變導(dǎo)入具有P238D改變的IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142)/IL6R-L中而得的改變體對FcyRIIb的相對結(jié)合活性的值。應(yīng)予說明，將各改變體對Fe Y RIIb的結(jié)合量的值除以導(dǎo)入改變前的抗體對Fe Y RIIb的結(jié)合量的值，進(jìn)而乘以100倍，將所得的值作為相對結(jié)合活性的值。這里，導(dǎo)入到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形、導(dǎo)入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L中的情形均發(fā)揮對Fe y RIIb的結(jié)合增強(qiáng)效果的改變含有在區(qū)A中；在導(dǎo)入到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形發(fā)揮對Fe y RIIb的結(jié)合增強(qiáng)效果，但在導(dǎo)入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L中的情形不發(fā)揮對Fe y RIIb的結(jié)合增強(qiáng)效果的改變含有在區(qū)B中。
[0620][圖26]表示Fc(P238D)/FcYRIIb胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。
[0621][圖27]表示相對于FeY RIIb胞外區(qū)以及Fe CH2結(jié)構(gòu)域A，通過基于C α原子間距的最小二乘法，使Fe (P238D) /Fe y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)與Fe (WT) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的模型結(jié)構(gòu)疊合的圖。
[0622][圖28]表示對于Fe(P238D) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)與Fe (WT) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的模型結(jié)構(gòu)，以Fe CH2結(jié)構(gòu)域A以及Fe CH2結(jié)構(gòu)域B各自單獨通過基于Ca原子間距的最小二乘法進(jìn)行疊合，并對P238D附近的詳細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較的圖。
[0623][圖29]是示出在Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)中，在Fe CH2結(jié)構(gòu)域A的以EU編號表示的237位的Gly的主鏈和Fe y RIIb的160位的Tyr之間觀察到氫鍵的圖。
[0624][圖30]是示出在Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)中，在Fe CH2結(jié)構(gòu)域B的以EU編號表示的270位的Asp和Fe y RIIb的131位的Arg之間觀察到靜電相互作用的圖。
[0625][圖31]橫軸表示各2Β變體對FeY RIIb的相對結(jié)合活性的值、縱軸表示各2Β變體對Fe Y RIIa R型的相對結(jié)合活性的值。將各2Β變體對各Fe Y R的結(jié)合量的值除以作為對照的導(dǎo)入改變前的抗體(以EU編號表示的238位的Ρι.ο取代成Asp的改變Fe)對各FcyR的結(jié)合量的值，進(jìn)而乘以100倍，將所得的值作為各2Β變體對各Fe Y R的相對結(jié)合活性的值。
[0626][圖32]是表示Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)中Fe鏈A的以EU編號表示的233位的Glu與Fe Y RIIb胞外區(qū)的其周邊殘基的圖。
[0627] [圖33]是表示Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)中Fe鏈A的以EU編號表示的330位的Ala與Fe Y RIIb胞外區(qū)的其周邊殘基的圖。
[0628][圖34]是示出相對于Fe鏈B，通過基于Ca原子間距的最小二乘法，使Fe (P238D) /Fe y RI Ib胞外區(qū)復(fù)合體和Fe (WT) /FcyRIIIa胞外區(qū)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)疊合，F(xiàn)e鏈B的以EU編號表示的271位的Pro的結(jié)構(gòu)的圖。
[0629][圖35]是通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析確定的Fe(P208) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的圖。就Fe部分的CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域各自而言，位于左側(cè)者為結(jié)構(gòu)域A，位于右側(cè)者為結(jié)構(gòu)域B。
[0630][圖36]是將通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析確定的Fc(P208)/FeY RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與Fc(WT)/Fe YRIIa胞外區(qū)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)(PDB碼:3RY6)，在Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域A中，通過基于Ca原子間距的最小二乘法進(jìn)行疊合，并進(jìn)行了比較的圖。圖中，用粗線描畫的部分為Fe (P208)/FcyRIIb胞外區(qū)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，用細(xì)線描畫的部分為Fe (WT)/FcyRIIa胞外區(qū)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。應(yīng)予說明，在Fe (WT) /FcyRIIa胞外區(qū)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中，僅描畫了 Fe部分的CH2結(jié)構(gòu)域A。
[0631][圖37]是顯示在Fc(P208)/FeYRIIb胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)中，與Fe Y RIIb的160位的Tyr在主鏈部分形成氫鍵的Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域A的以EU編號表示的237位的Asp附近的詳細(xì)結(jié)構(gòu)的圖。
[0632][圖38]是顯示在Fc(P208)/FeYRIIb胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)中，與Fe Y RIIb的160位的Tyr在主鏈部分形成氫鍵的Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域A的以EU編號表示的237位的Asp側(cè)鏈周圍的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)的圖。
[0633][圖39]是實施例10中顯示的、將Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)和Fe (P208) /Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)在Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域B中通過基于Ca原子間距的最小二乘法進(jìn)行疊合，對于以EU編號表示的266位~271位的環(huán)周邊進(jìn)行比較的圖。本環(huán)中，F(xiàn)c(P208)與Fc(P238D)比較，以EU編號表示的268位具有H268D改變，以EU編號表示的271位具有P271G改變。
[0634][圖40]是在Fc(P208)/FcYRIIb胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)中，將Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域B的Ser239周邊的結(jié)構(gòu)與通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而得到的作為2Fo_Fc系數(shù)的電子密度一起顯示的圖。
[0635][圖41]是將通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析確定的Fc(P208)/FeYRIIaR胞外區(qū)復(fù)合體的立體結(jié)構(gòu)與Fc(P208)/Fc YRIIb胞外區(qū)復(fù)合體的立體結(jié)構(gòu)，通過基于C α原子間距的最小二乘法進(jìn)行疊合，并進(jìn)行了比較的圖。
[0636][圖42]是將Fe(Ρ208)/Fe Y RIIaR胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)和Fe (Ρ208)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)，在Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域A的以EU編號表示的237位的Asp附近，與通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而得到的作為2Fo-Fc系數(shù)的電子密度一起進(jìn)行比較的圖。
[0637][圖43]是將Fe(Ρ208)/Fe Y RIIaR胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)和Fe (Ρ208)/Fe Y RIIb胞外區(qū)復(fù)合體的X射線晶體結(jié)構(gòu)，在Fe部分CH2結(jié)構(gòu)域B的以EU編號表示的237位的Asp附近，與通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而得到的作為2Fo-Fc系數(shù)的電子密度一起進(jìn)行比較的圖。
[0638][圖44]是將Gld和G4d的恒定區(qū)序列進(jìn)行比較的圖。圖中，用粗框圍起來的氨基酸顯示在Gld和G4d中為不同的氨基酸殘基的位點。
[0639][圖45]是顯示在正常小鼠中的GA2_IgGl和GA2-F1087的血漿中抗體濃度變化的圖。
[0640][圖46]是顯示給予了GA2-1gGl和GA2-F1087的正常小鼠中的血漿中hlgA濃度變化的圖。
[0641][圖47]是顯示在C57BL/6J小鼠中的278-1gGl和278-F1087的血漿中抗體濃度變化的圖。
[0642][圖48]是顯示給予了278-1gGl和278-F1087的C57BL/6J小鼠中的血漿中hIgE(Asp6)濃度變化的圖。
[0643][圖49]是表示通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而確定的6RL#9抗體的Fab片段的重鏈CDR3的結(jié)構(gòu)的圖。(i)顯示在鈣離子存在的結(jié)晶條件下得到的晶體結(jié)構(gòu)的重鏈CDR3。(ii)顯示在鈣離子不存在的結(jié)晶條件下得到的晶體結(jié)構(gòu)的重鏈CDR3。
[0644][圖50]是顯示給予了H54/L28-1gGl抗體、FH4_IgGl抗體和6RL#9_IgGl抗體的正常小鼠的血漿中的 各抗體濃度變化的圖。
[0645][圖51]是顯示給予了H54/L28-1gGl抗體、FH4_IgGl抗體和6RL#9_IgGl抗體的正常小鼠的血漿中的可溶型人IL-6受體(hsIL-6R)的濃度變化的圖。
[0646][圖52]是顯示含有人Vk5_2序列的抗體和含有人Vk5_2序列中的糖鏈附加序列被改變的hVk5-2_L65序列的抗體的離子交換層析圖的圖。實線表示含有人Vk5-2序列的抗體(重鏈:CM_H、SEQ ID N0:67，和輕鏈:hVk5-2、SEQ ID NO:4)的層析圖，虛線表示具有hVk5-2_L65 序列的抗體(重鏈:CM_H(SEQ ID NO: 67)、輕鏈:hVk5_2_L65 (SEQ ID NO:70))的層析圖。
[0647][圖53A]是含有LfVkl_Ca序列的抗體(重鏈:GC_H、SEQID NO: 51，和輕鏈:LfVkl_Ca、SEQ ID NO:83)和含有LfVkl_Ca序列中的Asp⑶殘基改變?yōu)锳la(A)殘基的序列的抗體在5°C保存后(實線)或50°C保存后(虛線)的離子交換層析圖。是將分別在5°C保存后的離子交換層析圖的最高峰作為主峰并用主峰進(jìn)行y軸標(biāo)準(zhǔn)化的圖。是顯示含有LfVkl_Ca(SEQ ID NO:83)作為輕鏈的抗體的層析圖的圖。
[0648][圖53B]是顯示含有LfVkl_Cal(SEQ ID NO:85)作為輕鏈的抗體的層析圖的圖。
[0649][圖53C]是顯示含有LfVkl_Ca2(SEQ ID NO:86)作為輕鏈的抗體的層析圖的圖。
[0650][圖53D]是顯示含有LfVkl_Ca3(SEQ ID NO:87)作為輕鏈的抗體的層析圖的圖。[0651 ][圖54A]是含有LfVkl_Ca序列的抗體(重鏈:GC_H、SEQ ID NO: 51，和輕鏈:LfVkl_Ca、SEQ ID NO: 83)和含有 LfVkl_Ca 序列中的 30 位(Kabat 編號)的 Asp (D)殘基改變?yōu)?Ser(S)殘基的 LfVkl_Ca6 序列(重鏈:GC_H、SEQ ID NO:51，和輕鏈:LfVkl_Ca6、SEQID NO:88)的抗體在5°C保存后(實線)或50°C保存后(虛線)的離子交換層析圖。是將分別在5°C保存后的離子交換層析圖的最高峰作為主峰并用主峰進(jìn)行y軸標(biāo)準(zhǔn)化的圖。是顯示含有LfVkl_Ca(SEQ ID NO:83)作為輕鏈的抗體的層析圖的圖。
[0652][圖54B]是顯示含有LfVkl_Ca6(SEQ ID NO:88)作為輕鏈的抗體的層析圖的圖。
[0653][圖55]是顯示從導(dǎo)入了Ca依賴性地與抗原結(jié)合的抗體基因文庫的大腸桿菌中分離的290克隆的序列信息的氨基酸分布(表示為Library)與設(shè)計的氨基酸分布(表示為Design)的關(guān)系的圖。橫軸表不以Kabat編號表不的氨基酸的位點。縱軸表不氨基酸分布比例。
[0654] [圖56]是表示在高鈣離子濃度條件(1.2mM)下的抗IL-6R抗體(托珠單抗)、6RClIgG_010抗體、6RClIgG_012抗體和6RClIgG_019抗體的傳感圖的圖。橫軸顯示時間，
縱軸顯示RU值。
[0655][圖57]是表示在低鈣離子濃度條件(3μΜ)下的抗IL-6R抗體(托珠單抗)、6RClIgG_010抗體、6RClIgG_012抗體和6RClIgG_019抗體的傳感圖的圖。橫軸顯示時間，
縱軸顯示RU值。
[0656][圖58]是顯示從導(dǎo)入了pH依賴性地與抗原結(jié)合的抗體基因文庫的大腸桿菌中分離的132克隆的序列信息的氨基酸分布(表示為Library)與設(shè)計的氨基酸分布(表示為Design)的關(guān)系的圖。橫軸表不以Kabat編號表不的氨基酸的位點?？v軸表不氨基酸分布比例。
[0657][圖59]是表示抗IL-6R抗體(托珠單抗)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體和6RpH#03
抗體在pH7.4的傳感圖的圖。橫軸顯示時間，縱軸顯示RU值。
[0658][圖60]是表示抗IL-6R抗體(托珠單抗)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體和6RpH#03抗體在pH6.0的傳感圖的圖。橫軸顯示時間，縱軸顯示RU值。
[0659][圖61A]是表示對于天然型Fe和改變Fe、從15或30個獨立的風(fēng)濕病患者中分離的血清的ECL反應(yīng)的圖表的圖。圖表分別表示對天然型Fc(圖61A)Fv4-YTE(圖61B)、Fv4-F1166( = YTE+Q438R/S440E)(圖 61C)、Fv4_F1167( = YTE+S424N)(圖 61D)、Fv4-LS(圖 61E)、Fv4-F1170( = LS+Q438R/S440E)(圖 61F)、Fv4_F1171( = LS+S424N)(圖61G)、Fv4-N434H(圖 61H)、Fv4_F1172( = N434H+Q438R/S440E)(圖 611)、Fv4_F1173(=N434H+S424N)(圖61J)的ECL反應(yīng)的圖表。
[0660][圖61B]是圖61A的續(xù)圖。
[0661][圖61C]是圖61B的續(xù)圖。
[0662][圖61D]是圖61C的續(xù)圖。
[0663][圖61E]是圖61D的續(xù)圖。
[0664][圖61F]是圖61E的續(xù)圖。
[0665][圖61G]是圖61F的續(xù)圖。
[0666][圖61H]是圖61G的續(xù)圖。
[0667][圖611]是圖61H的續(xù)圖。
[0668][圖61J]是圖611的續(xù)圖。
[0669][圖62A]是表示對于改變Fe、從30個獨立的風(fēng)濕病患者中分離的血清的ECL反應(yīng)的圖表的圖。圖表分別表示對Fv4-LS(圖62A)、Fv4_F1380(圖62B)、Fv4_F1384(圖62C)、Fv4-F1385(圖 62D)、Fv4_F1386(圖 62E)、Fv4_F1388(圖 62F)和 Fv4_F1389(圖 62G)的ECL反應(yīng)的圖表。
[0670][圖62B]是圖62A的續(xù)圖。
[0671][圖62C]是圖62B的續(xù)圖。
[0672][圖62D]是圖62C的續(xù)圖。
[0673][圖62E]是圖62D的續(xù)圖。
[0674][圖62F]是圖62E的續(xù)圖。[0675][圖62G]是圖62F的續(xù)圖。
【具體實施方式】
[0676]提供以下的定義和詳細(xì)說明來使本說明書中說明的本發(fā)明容易理解。
[0677]氨基酸
[0678]本說明書中，例如，如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/ff, His/H、Tyr/Y、Ile/1、Val/V 所表示，將氨基酸以單字母密碼或三字母密碼或者這兩者標(biāo)記。 [0679]氨基酸的改變
[0680]為了改變抗原結(jié)合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可適宜采用位點特異性誘變法(Kunkel 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))或重疊延伸 PCR 等公知的方法。通過這些公知的方法可適宜進(jìn)行氨基酸的添加、缺失和/或取代。取代氨基酸殘基是指以通過取代成其它氨基酸殘基例如就以下(a)~(C)的方面進(jìn)行改變?yōu)槟康?
[0681](a)折疊結(jié)構(gòu)或螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域中的多肽的主鏈結(jié)構(gòu)；
[0682](b)靶位點中的電荷或疏水性；或
[0683](C)側(cè)鏈的大小。
[0684]氨基酸殘基根據(jù)其結(jié)構(gòu)所含的側(cè)鏈的特性被分類為以下的組:
[0685](I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ；
[0686](2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ;
[0687](3)酸性:Asp、Glu ;
[0688](4)堿性:His> Lys> Arg ；
[0689](5)影響鏈取向的殘基:Gly、Pro ;以及
[0690](6)芳族性:Trp、Tyr、Phe。
[0691]這些的在各組內(nèi)的氨基酸殘基的取代稱為保守取代，而在不同組之間的氨基酸殘基的取代稱為非保守取代。本發(fā)明中的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代，還可以是保守保守取代與非保守取代的組合。此外，作為取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改變方法，也可采用多種公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006) 35，225-249、Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(2003) 100 (11)，6353-6357)。還可適宜使用例如:含有作為終止密碼子之一的UAG密碼子(琥珀密碼子)的互補(bǔ)琥珀抑制基因tRNA上連接有非天然氨基酸而成的tRNA的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)(Clover Direct (ProteinExpress))等。
[0692]此外，作為表示氨基酸改變的表述，可適宜采用:在表示特定位置的數(shù)字的前后使用改變前和改變后的氨基酸的單字母密碼的表述。例如，在抗體恒定區(qū)所含的Fe區(qū)中加入氨基酸取代時，所使用的P238D的改變表示以EU編號表示的238位的Pio取代成Asp。即，數(shù)字表示以EU編號表示的氨基酸的位置，其之前記載的氨基酸的單字母密碼表示取代前的氨基酸，其之后記載的氨基酸的單字母密碼表示取代后的氨基酸。
[0693]和/ 或
[0694]本說明書中，“和/或”用語的含義是指熟語“和/或”的前后用語的組合，含有“和”與“或”適宜組合的所有組合。具體而言，例如，“326位、328位和/或428位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸的改變的變異:
[0695](a) 326 位，(b) 328 位，(c) 428 位，(d) 326 位和 328 位，(e) 326 位和 428 位，(f) 328位和428位，(g) 326位、328位和428位。
[0696]
[0697]本說明書中，“抗原”只要含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的表位，則其結(jié)構(gòu)并不限于特定的結(jié)構(gòu)。換而言之，抗原可以是無機(jī)物也可以是有機(jī)物，優(yōu)選以本發(fā)明的抗原結(jié)合分子可結(jié)合的狀態(tài)存在于機(jī)體的體液中的可溶型抗原。作為抗原，可例示如下所述的分子:17-1A、4-lBB、4Dc、6-酮 _PGFla、8_ 異 _PGF2a、8_ 氧代 _dG、Al 腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIBALK-4、激活素 RIIA、激活素 RIIB、ADAM、ADAMlO, ADAMl2, ADAMl5, ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α -1-抗胰蛋白酶、a -V/ β -1 拮抗劑、ANG、Ang、APAF-l、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 IcUASPARTIC、心房鈉尿因子、av/b3 整聯(lián)蛋白、Axl、b2M、B7-l、B7-2、B7_H、B-淋巴細(xì)胞刺激因子(BlyS)、BACE, BACE-UBad, BAFF, BAFF-R、Bag-UBAK, Bax、BCA-U BCAM,Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2、BMP_2a、BMP-3、成骨蛋白(Osteogenin)、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-l、BMP_7 (0P-1)、BMP_8 (BMP_8a、OP-2)、BMPR、BMPR-1A (ALK-3)、BMPR-1B (ALK-6)、BRK-2、RPK-U BMPR-1I (BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、BPDE, BPDE-DNA, BTC、補(bǔ)體因子3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、CA 125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相關(guān)抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPP1、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CC1、CCK2、CCL、CCLl、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCRl、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla, CDllb, CDllc, CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌(ClostridiumPerfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMVUL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret, CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF, CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLl0, CXCLlU CXCL12、CXCLl3, CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCR, CXCRUCXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細(xì)胞角蛋白腫瘤相關(guān)抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補(bǔ)體抑制因子(衰變促進(jìn)因子)、脫(l-3)-1GF-1 (腦IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-U Dnase,Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-Al、EDA-A2、EDAR、EGF,EGFR(ErbB-1)、EMA,EMMPRIN、ENA、內(nèi)皮素受體、腦啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxinl、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EP0、ERCC、E_ 選擇素、ET-1、因子Ila、因子VI1、因子VIIIc、因子IX、成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcRl、FEN-l、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Fl t-4、促卵胞激素、CXXXC 趨化因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF, GDF-U GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14,CDMP-1)、⑶F-6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F_8 (Myostatin,肌肉生長抑制素)、⑶F-9、⑶F-15(MIC-1)、⑶NF、⑶NF、GFAP、GFRa-1、GFR-a 1、GFR-a 2、GFR-a 3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GR0、生長激素釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF), Hep B gpl20、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSVgD糖蛋白、HGFA,高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA) ,HIV gpl20、HIV IIIB gpl20V3 環(huán)、HLA、HLA_DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)、人生長激素(HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-UI CAM-3, ICE、I COS、IFNg、Ig、IgA 受體、IgE、IGF、IGF 結(jié)合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-1,IGF-1I, IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6, IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF) - a、INF- β、INF- y、抑制素、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素樣生長因子1、整聯(lián)蛋白a 2、整聯(lián)蛋白a 3、整聯(lián)蛋白a4、整聯(lián)蛋白α4 /β1、整聯(lián)蛋白α4/β7、整聯(lián)蛋白a5(aV)、整聯(lián)蛋白α5/β1、整聯(lián)蛋白a 5/β 3、整聯(lián)蛋白a 6、整聯(lián)蛋白β 1、整聯(lián)蛋白β 2、干擾素Y、IP-10、1-TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶L1、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、層連蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛伏型TGF-1、潛伏型TGF-lbpULBP, LDGF, LECT2、Lefty、Lewis-Y 抗原、Lewis-Y 相關(guān)抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo,LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-選擇素、LT_a、LT_b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黃體激素、淋巴毒素 β 受體、Mac-UMAdCAM, MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP, M-CSF,MDC、Mer、金屬蛋白酶、MGDF 受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP_1_ a、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、繆勒管抑制物質(zhì)、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶、神經(jīng)營養(yǎng)素_3、神經(jīng)營養(yǎng)素-4或神經(jīng)營養(yǎng)素 _6、Neurturin、神經(jīng)生長因子(NGF)、NGFR、NGF_P、nN0S、N0、N0S、Npn、NRG_3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG, OPN、OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr,甲狀旁腺激素、PARC、PARP,PBR、PBSF, PCAD, P-鈣黏蛋白、PCNA, PDGF, PDGF, PDK-U PECAM, PEM、PF4、PGE, PGF, PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰島素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp, Ptk, PTN、R51、RANK、RANKL, RANTES,RANTES、松弛素A鏈、松弛素B鏈、腎素、呼吸道合胞體病毒(RSV) F、RSV Fgp、Ret、類風(fēng)濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-U SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-U SLAM、SLPI, SMAC, SMDF, SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-1I, TACE, TACI,TAG-72 (腫瘤相關(guān)糖蛋白-72)、TARC, TCA-3、T細(xì)胞受體(例如，T細(xì)胞受體α / β )、TdT、TECK, TEMU TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸 PLAP 樣堿性磷酸酶、TfR, TGF、TGF- α、TGF- β、TGF-β 泛特異性(TGF-β Pan Specific)、TGF-β RI (ALK-5)、TGF-β RH、TGF-β Rllb、TGF- β RII1、TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4、TGF- β 5、凝血酶、胸腺 Ck-1、促甲狀腺激素、116、11]\^、1'10、組織因子、丁]\^卩卩2、1'115)0、丁]\^1?52、丁,、丁,-0、TNF-α β、TNF_3 2、TNFc, TNF-R1、TNF-RI1、TNFRSF10A (TRAIL RlApo-2、DR4)、TNFRSFIOB (TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSFIOC(TRAIL R3DcRl、LIT、TRID)、TNFRSFIOD (TRAILR4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF1 IB (OPG OCIF、TRl)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSFIA (TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75_80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RII1、TNFCR)、TNFRSF4 (0X40ACT35、TXGPIR)、TNFRSF5 (CD40p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-U APTl、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配體、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF 、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHTHVEM 配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSF1A (TNF_a黏附素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSFlB(TNF-b LTa、TNFSFl)、TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMU IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD 137 配體)、TP-U t_PA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRANCE、運(yùn)鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關(guān)抗原 CA125、腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)病毒Y相關(guān)碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD, VE-鈣黏蛋白、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF, VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI, VM、病毒抗原、VLA、VLA-U VLA-4、VNR整聯(lián)蛋白、馮維勒布蘭德因子、WIF-U WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNTl1、WNT16、XCLl、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP, XPD、HMGBl、IgA、A β、CD81、CD97、CD98、DDRl、DKKl、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽釋放酶原、RON、TMEM16F、S0D1、嗜鉻粒蛋白A、嗜鉻粒蛋白B、tau、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Navl.1、Navl.2、Navl.3、Navl.4、Navl.5、Navl.6、Navl.7、Navl.8、Navl.9、EPCR、CUClq, Clr, Cls、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、備解素、殼硬蛋白(sclerostin)、血纖蛋白原、血纖蛋白、凝血酶原、凝血酶、組織因子、因子V、因子Va、因子VI1、因子Vila、因子VII1、因子Villa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子X1、因子XIa、因子XI1、因子Xlla、因子XII1、因子XIIIa、TFP1、抗凝血酶II1、EPCR、血栓調(diào)節(jié)蛋白、TAP1、tPA、纖溶酶原、纖溶酶、PA1-1、PA1-2、GPC3、多配體蛋白聚糖-1、多配體蛋白聚糖_2、多配體蛋白聚糖-3、多配體蛋白聚糖-4、LPA、S1P、乙酰膽堿受體、AdipoRU AdipoR2、ADP核糖基環(huán)化酶-1、α -4/β-7整聯(lián)蛋白、α-5/β-1整聯(lián)蛋白、α-ν/β-6整聯(lián)蛋白、α / β I整聯(lián)蛋白、血管形成素配體-2、Angptl2、炭疽、鈣粘蛋白、碳酸酐酶-1X、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudinl8、艱難梭菌毒素、CSU δ -樣蛋白配體 4、DHICA 氧化酶、Dickkopf-1配體、二肽基肽酶IV、EPOR、RSV的F蛋白、因子Ia、FasL、葉酸受體α、胰高血糖素受體、胰高血糖素樣肽I受體、谷氨酸羧肽酶I1、GMCSFR、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、鐵調(diào)素(Hepcidin)、IL-17受體、IL-22受體、IL-23受體、IL-3受體、Kit酪氨酸激酶、富亮氨酸a_2糖蛋白I (LRGl)、 溶鞘脂受體、膜糖蛋白0X2、間皮素(Mesothelin)、MET、MICA、MUC-16、髓鞘相關(guān)糖蛋白、神經(jīng)氈蛋白-1、神經(jīng)氈蛋白-2、Nogo受體、PLXNA1、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNBU PLXNB2、PLXNB3、PLXNCU PLXNDl、編程性細(xì)胞死亡配體1、前蛋白轉(zhuǎn)化酶PC9、P-選擇素糖蛋白配體-1、RAGE、Reticulon4、RF、RON-8, SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、志賀樣毒素 I1、1-磷酸鞘氨醇受體-1、ST2、葡萄球菌脂膜酸、生腱蛋白、TG2、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromallymphoprotein)受體、TNF超家族受體12A、跨膜糖蛋白NMB、TREM-U TREM-2、滋養(yǎng)層糖蛋白、TSH受體、TTR、微管蛋白、ULBP2以及用于激素和生長因子的受體中在機(jī)體的體液中不錨定在細(xì)胞上而以可溶型存在的分子。在受體中，例如，在細(xì)胞表面表達(dá)的受體等由于包括蛋白酶的消化等在內(nèi)的任何機(jī)制而存在于機(jī)體的體液中的可溶型抗原也適宜作為本發(fā)明的可溶型抗原。作為這樣的分子的實例，可例示本說明書中記載的可溶型IL-6R分子(J.1mmunol.(1994) 152, 4958-4968)或 CD20, CD52 (Br.J.Haematol.(2003) 123(5),850-857)等。此外，不僅在機(jī)體內(nèi)固有表達(dá)的分子，而且利用病毒等的感染性生物或在這些生物上提呈的抗原、或者屬于朊蛋白等感染性分子存在于機(jī)體的體液中的可溶型抗原也可作為本發(fā)明的可溶型抗原例示。作為體液，可適宜舉出:血液、血漿、血清、尿、淋巴液、唾液、淚液等的體液等。
[0698]mfr
[0699]表示存在于抗原中的抗原決定簇的表位，意指本說明書中公開的抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的抗原上的位點。所以，例如表位可通過其結(jié)構(gòu)來定義。此外，也可以通過相對于識別該表位的抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié)合活性來定義該表位?？乖瓰殡幕蛘叨嚯臅r，還可以通過構(gòu)成表位的氨基酸殘基來規(guī)定表位。此外，表位為糖鏈時，也可以通過特定的糖鏈結(jié)構(gòu)來規(guī)定表位。
[0700]線性表位是下述表位，其含有氨基酸一級序列被識別的表位。線性表位在固有序列中典型地含有至少3個氨基酸，和最普通地含有至少5個、例如約8至約10個、6至20個
氨基酸。
[0701]與線性表位相對地，立體結(jié)構(gòu)表位是這樣的表位，其中，含有表位的氨基酸的一級序列并非是被識別表位的單一規(guī)定成分(例如，氨基酸的一級序列不需要被規(guī)定表位的抗體所識別的表位)。立體結(jié)構(gòu)表位相對于線性表位可以含有增大數(shù)目的氨基酸。關(guān)于立體結(jié)構(gòu)表位的識別，抗體識別肽或蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。例如，蛋白質(zhì)分子折疊形成三維結(jié)構(gòu)時，形成立體結(jié)構(gòu)表位的某氨基酸和/或多肽主鏈變得并排，使得抗體可以識別表位。確定表位的立體結(jié)構(gòu)的方法包括例如:X射線晶體學(xué)、二維核磁共振分光學(xué)以及位點特異性旋轉(zhuǎn)標(biāo)記和電子順磁共振分光學(xué)，但并非限定于此。例如，參照Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology (1996)、第 66 卷、Morris (編)。
[0702]結(jié)合活性
[0703]下述例示了通過含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子來確認(rèn)對表位的結(jié)合的方法，但通過含有針對IL-6R以外的抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子來確認(rèn)對表位的結(jié)合的方法也可以基于下述例示而適宜實施。[0704]例如，含有針對IL-6R抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子識別存在于IL-6R分子中的線性表位，可通過如下所示操作來確認(rèn)。為了上述目的，合成了含有構(gòu)成IL-6R的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的線性肽。該肽可化學(xué)地合成?；蛘?，可以利用IL-6R的cDNA中編碼相當(dāng)于胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的區(qū)域，通過基因工程技術(shù)得到。其次，對含有構(gòu)成胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的線性肽和含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的結(jié)合活性進(jìn)行評價。例如，通過以固定化線性肽作為抗原的ELISA，可以評價該抗原結(jié)合分子對該肽的結(jié)合活性。或者，基于該抗原結(jié)合分子對IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合中的、線性肽造成的抑制水平，也可以明確對線性肽的結(jié)合活性。通過這些試驗，可以明確該抗原結(jié)合分子對線性肽的結(jié)合活性。
[0705]此外，含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子識別立體結(jié)構(gòu)表位，這可如下進(jìn)行確認(rèn)。為了上述目的，制備了表達(dá)IL-6R的細(xì)胞?？膳e出:含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子在與IL-6R表達(dá)細(xì)胞接觸時強(qiáng)烈地與該細(xì)胞結(jié)合，但該抗原結(jié)合分子與經(jīng)固定化的含有構(gòu)成IL-6R胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的線性肽實質(zhì)上不結(jié)合的情形等。這里，實質(zhì)上不結(jié)合是指，對人IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性的80 %以下、通常50%以下、優(yōu)選30%以下、特別優(yōu)選15%以下的結(jié)合活性。
[0706]作為測定對含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性的方法，可舉出例如:Antibodies A Laboratory Manual記載的方法(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420) ? 即，可通過以IL-6R表達(dá)細(xì)胞為抗 原的ELISA或FACS (熒光活化細(xì)胞分選(fluorescence activatedcell sorting))的原理來進(jìn)行評價。
[0707]在ELISA形式中，對含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性，通過比較由酶反應(yīng)生成的信號水平而定量地進(jìn)行評價。即，將被測抗原結(jié)合分子添加至固定有IL-6R表達(dá)細(xì)胞的ELISA板，利用識別被測抗原結(jié)合分子的酶標(biāo)記抗體檢測與細(xì)胞結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子?；蛘咴贔ACS中，制作被測抗原結(jié)合分子的稀釋系列，確定相對于IL-6R表達(dá)細(xì)胞的抗體結(jié)合效價(titer),由此可以比較被測抗原結(jié)合分子對IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性。
[0708]被測抗原結(jié)合分子與懸浮于緩沖液等中的細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原的結(jié)合可以通過流式細(xì)胞儀檢測。作為流式細(xì)胞儀，已知例如如下的裝置:
[0709]FACSCantoTM II
[0710]FACSAriaTM
[0711]FACSArrayTM
[0712]FACSVantageTM SE
[0713]FACSCaliburTM(均為 BD Biosciences 公司的商品名)
[0714]EPICS ALTRA HyPerSort
[0715]Cytomics FC500
[0716]EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
[0717]Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為 Beckman Coulter 公司的商品名)。
[0718]例如，作為含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的優(yōu)選測定方法的一例，可舉出以下方法。首先，將表達(dá)IL-6R的細(xì)胞與被測抗原結(jié)合分子反應(yīng)，將其用識別被測抗原結(jié)合分子的經(jīng)FITC標(biāo)記的二次抗體染色。將被測抗原結(jié)合分子用適宜的優(yōu)選緩沖液稀釋，由此將該抗原結(jié)合分子制備為所期望的濃度來使用。例如，能夠以10 μ g/ml至10ng/ml之間的任意濃度使用。接著,通過FACSCalibur (BD公司)測定熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)?？贵w對該細(xì)胞的結(jié)合量被反映為使用CELL QUEST Software (BD公司)進(jìn)行分析而得的熒光強(qiáng)度即幾何平均值。即，通過得到該幾何平均值，能夠測定由被測抗原結(jié)合分子的結(jié)合量表示的被測抗原結(jié)合分子的結(jié)合活性。
[0719]含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子與某抗原結(jié)合分子共有表位，這可通過兩者對相同表位的競爭來確認(rèn)?？乖Y(jié)合分子間的競爭通過交叉阻斷試驗等來檢測。例如競爭ELISA試驗是優(yōu)選的交叉阻斷試驗。
[0720]具體而言，在交叉阻斷試驗中，包被微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候選競爭抗原結(jié)合分子的存在下或不存在下經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后，添加被測抗原結(jié)合分子。與孔中的IL-6R蛋白結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子的量與競爭結(jié)合相同表位的候選競爭抗原結(jié)合分子的結(jié)合能力間接地相關(guān)。即，競爭抗原結(jié)合分子對相同表位的親和性越大，則被測抗原結(jié)合分子對包被有IL-6R蛋白的孔的結(jié)合活性越降低。
[0721]經(jīng)由IL-6R蛋白而與孔結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子的量可以通過預(yù)先標(biāo)記抗原結(jié)合分子來容易地測定。例如，經(jīng)生物素標(biāo)記的抗原結(jié)合分子通過使用親和素過氧化酶結(jié)合物和合適的底物來測定。利用過氧化酶等酶標(biāo)記的交叉阻斷試驗特別被稱為競爭ELISA試驗?？乖Y(jié)合分子能夠用可檢測或可測定的其它標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。具體而言，公知的是放射標(biāo)記或突光標(biāo)記等。
[0722]與在候選競爭抗原結(jié)合分子的不存在下實施的對照試驗中得到的結(jié)合活性進(jìn)行比較，競爭抗原結(jié)合分子只要可以阻斷至少20%、優(yōu)選至少20~50%、進(jìn)一步優(yōu)選至少50%的含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子的結(jié)合，則該被測抗原結(jié)合分子是與競爭抗原結(jié)合分子實質(zhì)上結(jié)合于相同表位或者競爭結(jié)合于相同的表位的抗原結(jié)合分子。
[0723]在鑒定含有針對IL-6R的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的被測抗原結(jié)合分子所結(jié)合的表位的結(jié)構(gòu)時，被測抗原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子共有表位，這可通過比較兩者的抗原結(jié)合分子對在構(gòu)成該表位的肽中導(dǎo)入氨基酸突變而得的肽的結(jié)合活性來進(jìn)行評價。
[0724]作為這種測定結(jié)合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通過比較被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子對導(dǎo)入了突變的線性肽的結(jié)合活性來測定。作為ELISA以外的方法，通過使被測抗原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子流過該柱后，對洗脫液中洗脫的抗原結(jié)合分子進(jìn)行定量，也可以測定對結(jié)合于柱的該突變肽的結(jié)合活性。使突變肽作為例如與GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
[0725]此外，鑒定的表位為立體表位時，被測抗原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子共有表位，這可通過以下方法來評價。首先，制備表達(dá)IL-6R的細(xì)胞和表達(dá)在表位中導(dǎo)入了突變的IL-6R的細(xì)胞。將這些細(xì)胞懸浮于PBS等適當(dāng)?shù)木彌_液中，向所得細(xì)胞懸浮液中添加被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子。其次，用合適的緩沖液洗滌，向所得細(xì)胞懸浮液中添加能夠識別被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子的經(jīng)FITC標(biāo)記的抗體。被標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)通過FACSCalibur (BD公司)來測定。被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子的濃度通過合適的緩沖液適當(dāng)稀釋，由此可以制備為所期望的濃度來使用。例如，能夠以10 μ g/ml至10ng/ml之間的任意濃度使用。標(biāo)記抗體對該細(xì)胞的結(jié)合量被反映為使用CELL QUEST Software (BD公司)進(jìn)行分析而得的熒光強(qiáng)度即幾何平均值。即，通過得到該幾何平均值，可以測定由標(biāo)記抗體的結(jié)合量表示的被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子的結(jié)合活性。
[0726]本方法中，例如“實質(zhì)上不與突變IL-6R表達(dá)細(xì)胞結(jié)合”可通過以下方法判斷。首先，用標(biāo)記抗體染色與表達(dá)突變IL-6R的細(xì)胞結(jié)合的被測抗原結(jié)合分子和對照抗原結(jié)合分子。接著，檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。熒光檢測中使用作為流式細(xì)胞儀的FACSCalibur時，所得的熒光強(qiáng)度可以使用CELL QUEST Software進(jìn)行分析。由抗原結(jié)合分子存在下和不存在下的幾何平均值，根據(jù)下述的計算式算出該比較值(AGeo-Mean)，由此可以求出抗原結(jié)合分子的結(jié)合所帶來的熒光強(qiáng)度的增加比例。
[0727]Δ Geo-Mean = Geo-Mean (抗原結(jié)合分子存在下)/Geo-Mean (抗原結(jié)合分子不存在下)
[0728]將通過分析得到的、反映被測抗原結(jié)合分子對突變IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合量的幾何平均比較值(突變IL-6R分子AGeo-Mean值)與反映被測抗原結(jié)合分子對IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合量的AGeo-Mean比較值進(jìn)行比較。此時，計算相對于突變IL-6R表達(dá)細(xì)胞和IL-6R表達(dá)細(xì)胞的AGeo-Mean比較值時使用的被測抗原結(jié)合分子的濃度特別優(yōu)選制備為相互相同或者 實質(zhì)上相同的濃度。預(yù)先確定了識別IL-6R中的表位的抗原結(jié)合分子被用作對照抗原結(jié)合分子。
[0729]被測抗原結(jié)合分子相對于突變IL-6R表達(dá)細(xì)胞的AGeo-Mean比較值只要小于被測抗原結(jié)合分子相對于IL-6R表達(dá)細(xì)胞的AGeo-Mean比較值的至少80%、優(yōu)選50%、進(jìn)一步優(yōu)選30%、特別優(yōu)選15%，則認(rèn)為“實質(zhì)上不與突變IL-6R表達(dá)細(xì)胞結(jié)合”。求出Geo-Mean值(幾何平均)的計算式記載于 CELL QUEST Software User’s Guide (BD biosciences 公司)。通過對比較值進(jìn)行比較，只要是能夠?qū)⑵鋵嵸|(zhì)上視為相同的程度，則能夠評價被測抗原結(jié)合分子與對照抗原結(jié)合分子的表位相同。
[0730]抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域
[0731]本說明書中，“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”只要與目標(biāo)抗原結(jié)合，則可以使用任意結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域。作為這類結(jié)構(gòu)域的實例，可優(yōu)選舉出例如:抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)、機(jī)體內(nèi)存在的細(xì)胞膜蛋白Avimer中所含的35個氨基酸左右的被稱為A結(jié)構(gòu)域的組件(W02004/044011、W02005/040229)、含有與在細(xì)胞膜表達(dá)的糖蛋白纖連蛋白中的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域10Fn3結(jié)構(gòu)域的Adnectin(W02002/032925)、以構(gòu)成蛋白A的含有58個氨基酸的3個螺旋束(bundle)的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域為支架的Affibody (W01995/001937)、具有含33個氨基酸殘基的轉(zhuǎn)角和2個反向平行螺旋以及環(huán)的亞基重復(fù)重疊而成的結(jié)構(gòu)的錨蛋白重復(fù)序列(ankyrin repeat:AR)的分子表面露出的區(qū)域DARPins (DesignedAnkyrin Repeat proteins) (W02002/020565)、支持嗜中性粒細(xì)胞明膠酶結(jié)合脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂質(zhì)運(yùn)載蛋白分子中高度保守的8個反向平行鏈在中央方向扭曲的桶結(jié)構(gòu)的單側(cè)的4個環(huán)區(qū)即Anticalin等(W02003/029462)、作為七鰓鰻、八目鰻等無顎類的獲得免疫系統(tǒng)且不具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的可變性淋巴細(xì)胞受體(variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸殘基的重復(fù)(leucine-rich-repeat (LRR))組件重復(fù)重疊而成的馬蹄鐵形的結(jié)構(gòu)內(nèi)部的平行型片結(jié)構(gòu)的凹陷區(qū)域(W02008/016854)。作為本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選實例，可舉出含有抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。作為這種抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實例，優(yōu)選可舉出“scFv (單鏈 Fv) ”、“單鏈抗體”、1￥”、“8。?￥2(單鏈？￥2) ”、“Fab” 或 “F(ab，)2” 等。
[0732]本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與相同的表位結(jié)合。這里，相同的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)中。此外，可以存在于含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的第20位至第365位氨基酸的蛋白質(zhì)中。或者，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與相互不同的表位結(jié)合。這里，不同的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)中。此外，可以存在于含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的第20位至第365位氨基酸的蛋白質(zhì)中。
[0733]特異件
[0734]特異性是指特異性地結(jié)合的分子的一方的分子對于其一個或多個結(jié)合對象分子以外的分子不顯示任何顯著性結(jié)合的狀態(tài)。此外，也可以用于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)δ晨乖兴亩鄠€表位中特定的表位為特異性的情形。此外，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的表位含有在多個不同的抗原中時，具有該抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子可以與含有該表位的各種抗原結(jié)合。
[0735]杭體
[0736]本說明書中，抗體是指天然的免疫球蛋白或者通過部分或完全合成制備得到的免疫球蛋白?？贵w可從天然存在其的血漿或血清等天然資源或產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離得到，或者通過使用基因重組等方法而部分或完全合成。作為抗體的實例，優(yōu)選可舉出:免疫球蛋白的同種型和這些同種型的亞類。作為人的免疫球蛋白，已知有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM這9種類型(同種型)。本發(fā)明的抗體中可含有這些同種型中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。IgG的恒定區(qū)中也含有由此自然產(chǎn)生的突變體等。作為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗體的恒定區(qū)，基因多態(tài)性所致的多個的同種異型序列記載于 Sequences of proteins of immunological interest, NIH PublicationN0.91-3242中，本發(fā)明可以是其中的任一個序列。特別是作為人IgGl的序列，EU編號356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。
[0737]制備具有所期望結(jié)合活性的抗體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。以下例示與IL-6R結(jié)合的抗體(抗IL-6R抗體)的制作方法。與IL-6R以外的抗原結(jié)合的抗體也可以根據(jù)下述例示而適宜制作。
[0738]抗IL-6R抗體可以使用公知的方法以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。作為抗IL-6R抗體，可優(yōu)選制作來源于哺乳動物的單克隆抗體。來源于哺乳動物的單克隆抗體含有:由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體和利用基因工程技術(shù)通過用含有抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體等。應(yīng)予說明，本申請發(fā)明的單克隆抗體包括“人源化抗體”和“嵌合抗體”。
[0739]產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以通過使用公知技術(shù)，例如如下所示的方法來制作。即，使用IL-6R蛋白作為敏化抗原，按照通常的免疫方法來免疫哺乳動物。通過通常的細(xì)胞融合法，將所得免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合。其次，通過通常的篩選方法篩選單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞，由此可以選擇出產(chǎn)生抗IL-6R抗體的雜交瘤。
[0740]具體而言，單克隆抗體的制作例如如下所示地進(jìn)行。首先，表達(dá)其核苷酸序列公開在SEQ ID N0:2中的IL-6R基因，由此可得到由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，其用作敏化抗原用于抗體制備。即，將編碼IL-6R的基因序列插入公知的表達(dá)載體，由此轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。以公知的方法從該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清中純化所期望的人IL-6R蛋白。為了從培養(yǎng)上清中獲得可溶型的IL-6R，代替由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，表達(dá)了例如，如 Mullberg 等(J.1mmunol.(1994) 152 (10), 4958-4968)所記載的可溶型 IL-6R、即 SEQID NO:1表示的IL-6R多肽序列中、含有第I位至357位氨基酸的蛋白。此外，純化的天然IL-6R蛋白也可以同樣地用作敏化抗原。
[0741]作為用于免疫哺乳動物的敏化抗原，可使用該純化IL-6R蛋白。此外，IL-6R的部分肽也可以用作敏化抗原。此時，該部分肽也可以根據(jù)人IL-6R的氨基酸序列通過化學(xué)合成獲得。此外，也可以通過將IL-6R基因的一部分整合至表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)來獲得。進(jìn)而，還可以使用蛋白質(zhì)分解酶分解IL-6R蛋白來獲得，用作部分肽的IL-6R肽的區(qū)域和大小并不特別限于特定的方案。對于優(yōu)選的區(qū)域，可以從SEQ ID NO:1的氨基酸序列中相當(dāng)于第20-357位氨基酸的氨基酸序列中選擇任意的序列。構(gòu)成作為敏化抗原的肽的氨基酸的數(shù)目優(yōu)選為至少5個以上、例如6個以上、或7個以上。更具體而言，可以將8~50、優(yōu)選10~30個殘基的肽用作敏化抗原。
[0742]此外，也可以將IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽與不同的多肽進(jìn)行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。為了制備用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以優(yōu)選利用抗體的Fe片段或肽標(biāo)簽等。表達(dá)融合蛋白的載體可如下制作:將編碼所期望的兩種或兩種以上的多肽片段的基因框內(nèi)融合，將該融合基因如前所述地插入表達(dá)載體。融合蛋白的制作方法記載于 Molecular Cloning2nd ed.(Sambrook, J et al., Molecular Cloning2nded., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.press)。用作敏化抗原的 IL-6R 的獲得方法和使用它的免疫方法也具體記載于W02003/000883、W02004/022754、W02006/006693等中。
[0743]作為用該敏化抗原免疫的哺乳動物，并不限定于特定的動物，優(yōu)選考慮與細(xì)胞融合中使用的親本細(xì)胞的相容性來選擇。通常適宜使用嚙齒類的動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔、猴等。
[0744]按照公知的方法將上述動物用敏化抗原免疫。例如，作為通常的方法，通過將敏化抗原注射給予至哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下來實施免疫。具體而言，將用PBS(磷酸緩沖鹽水(Phosphate-Buffered Saline))或生理鹽水等以適當(dāng)稀釋倍率稀釋的敏化抗原根據(jù)需要與通常的佐劑、例如弗氏完全佐劑混合，在乳化后將該敏化抗原對哺乳動物每4至21天給予數(shù)次。此外，敏化抗原免疫時可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。特別是將分子量小的部分肽用作敏
化抗原時，有時期望將與白蛋白、匙孔蜮.血藍(lán)蛋白等載體蛋白質(zhì)結(jié)合的該敏化抗原肽進(jìn)行免疫。
[0745]此外，產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤也可通過使用DNA免疫如下所示來制作。DNA免疫是指下述免疫方法:被給予了以能在免疫動物中表達(dá)編碼抗原蛋白的基因的方式構(gòu)建的載體DNA的該免疫動物中，敏化抗原在該免疫動物的機(jī)體內(nèi)表達(dá)，由此賦予免疫刺激。與將蛋白質(zhì)抗原給予免疫動物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下優(yōu)越性:
[0746]-能夠維持如IL-6R的膜蛋白的結(jié)構(gòu)而賦予免疫刺激
[0747]-無需純化免疫抗原。[0748]為了通過DNA免疫獲得本發(fā)明的單克隆抗體，首先，對免疫動物給予表達(dá)IL-6R蛋白的DNA。編碼IL-6R的DNA可通過PCR等公知方法合成。將所得DNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，給予免疫動物。作為表達(dá)載體，可優(yōu)選利用例如PCDNA3.1等市售的表達(dá)載體。作為將載體給予機(jī)體的方法，可采用通常所使用的方法。例如，將吸附有表達(dá)載體的金顆粒用基因槍導(dǎo)入免疫動物個體的細(xì)胞內(nèi)，由此進(jìn)行DNA免疫。進(jìn)而，識別IL-6R的抗體的制作也可以采用國際公開W02003/104453中記載的方法來制作。
[0749]如此將哺乳動物免疫，確認(rèn)到血清中與IL-6R結(jié)合的抗體效價的上升后，從哺乳動物采集免疫細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。作為優(yōu)選的免疫細(xì)胞，特別可使用脾細(xì)胞。
[0750]作為與前述免疫細(xì)胞融合的細(xì)胞，可使用哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選具備用于篩選的適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記物。選擇標(biāo)記物是指賦予細(xì)胞能夠在特定培養(yǎng)條件下存活(或死亡)的性質(zhì)。選擇標(biāo)記物中，公知的是次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶缺失(以下簡稱為HGPRT缺失)或胸苷激酶缺失(以下簡稱為TK缺失)等。具有HGPRT、TK缺失的細(xì)胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下簡稱為HAT敏感性)。HAT敏感性的細(xì)胞不能在HAT選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行DNA合成而會死亡，但若與正常細(xì)胞發(fā)生融合，則可利用正常細(xì)胞的補(bǔ)救途徑繼續(xù)DNA的合成，因此在HAT選擇培養(yǎng)基中也會生長。
[0751]HGPRT缺失、TK缺失的細(xì)胞各自可通過含有6_硫代鳥嘌呤、8_氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)或5’溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基來選擇。DNA中整合有這些嘧啶類似物的正常細(xì)胞會死亡。而無法整合這些嘧啶類似物的缺乏上述酶的細(xì)胞則可以在選擇培養(yǎng)基中存活。此外，被稱為G418抗性的選擇標(biāo)記物可通過新霉素抗性基因賦予針對2-脫氧鏈霉胺系抗生素(慶大霉素類似物)的抗性。細(xì)胞融合中優(yōu)選的各種骨髓瘤細(xì)胞是公知的。
[0752]作為這類骨髓瘤細(xì)胞，可適宜使用例如P3 (P3x63Ag8.653) (J.1mmunol.(1979) 123 (4), 1548-1550)> P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiologyand Immunology (1978)81, 1-7)、NS-1 (C.Eur.J.1mmunol.(1976)6 (7)，511-519)、MPC-1l (Cell (1976) 8 (3)，405-415)、SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685)，269-270)、FO (J.1mmunol.Methods (1980) 35 (1-2), 1-21) , S194/5.ΧΧ0.BU.1 (J.Exp.Med.(1978) 148 (I)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0753]基本上，根據(jù)公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，進(jìn)行前述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合。
[0754]更具體而言，例如，可以在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下，在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施前述細(xì)胞融合。作為融合促進(jìn)劑，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，進(jìn)而為了提高融合效率，根據(jù)期望添加二甲基亞砜等助劑使用。
[0755]免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的使用比例可以任意設(shè)定。例如，相對于骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選使免疫細(xì)胞為I至10倍。作為用于前述細(xì)胞融合的培養(yǎng)液，使用例如適于前述骨髓瘤細(xì)胞株的生長的R PMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、以及用于此種細(xì)胞培養(yǎng)的通常的培養(yǎng)液，進(jìn)而可優(yōu)選添加胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)液。
[0756]對于細(xì)胞融合，將規(guī)定量的前述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在前述培養(yǎng)液中充分混合，將預(yù)先加熱至37 °C左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60% (w/v)的濃度添加。混合液通過緩慢混合而形成所期望的融合細(xì)胞(雜交瘤)。其次，依次添加上述列舉的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，通過重復(fù)進(jìn)行離心除去上清的操作，可以除去對雜交瘤的生長不利的細(xì)胞融合劑等。
[0757] 這樣得到的雜交瘤可通過用通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)培養(yǎng)來進(jìn)行選擇。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可持續(xù)足夠所期望的雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡的時間(通常，所述足夠的時間為數(shù)天至數(shù)周)。其次，通過通常的有限稀釋方法，實施產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0758]如此得到的雜交瘤可通過使用對應(yīng)于用于細(xì)胞融合的骨髓瘤所具有的選擇標(biāo)記物的選擇培養(yǎng)液來進(jìn)行選擇。例如，具有HGPRT或TK缺失的細(xì)胞可以通過用HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)培養(yǎng)來進(jìn)行選擇。即，在細(xì)胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤細(xì)胞時，在HAT培養(yǎng)液中，與正常細(xì)胞的細(xì)胞融合成功了的細(xì)胞可選擇性地生長。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可以持續(xù)足夠所期望的雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡的時間。具體而言，通常通過數(shù)天至數(shù)周的培養(yǎng)，可以選擇所期望的雜交瘤。其次，可通過通常的有限稀釋方法，實施產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0759]所期望抗體的篩選和單克隆優(yōu)選可通過公知的基于抗原抗體反應(yīng)的篩選方法來實施。例如，與IL-6R結(jié)合的單克隆抗體可以與細(xì)胞表面表達(dá)的IL-6R結(jié)合。這樣的單克隆抗體可通過例如FACS (熒光活化細(xì)胞分選)來篩選。FACS是可以通過用激光分析與熒光抗體接觸的細(xì)胞并測定各細(xì)胞發(fā)出的熒光來測定抗體對細(xì)胞表面的結(jié)合的系統(tǒng)。
[0760]為了利用FACS來對產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤進(jìn)行篩選，首先制備表達(dá)IL-6R的細(xì)胞。優(yōu)選用于篩選的細(xì)胞是強(qiáng)制表達(dá)IL-6R的哺乳動物細(xì)胞。作為對照，通過使用用作宿主細(xì)胞的未轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，可以選擇性地檢測抗體對細(xì)胞表面的IL-6R的結(jié)合活性。即，通過選擇產(chǎn)生不與宿主細(xì)胞結(jié)合、而與IL-6R強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抗體的雜交瘤，可以獲得產(chǎn)生IL-6R單克隆抗體的雜交瘤。
[0761]或者，可以基于ELISA的原理來評價抗體對固定化的IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性。例如，將IL-6R表達(dá)細(xì)胞固定于ELISA板的孔中。使雜交瘤的培養(yǎng)上清與孔內(nèi)的固定化細(xì)胞接觸，檢測與固定化細(xì)胞結(jié)合的抗體。單克隆抗體來源于小鼠時，與細(xì)胞結(jié)合的抗體可通過抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。通過這些篩選選擇出的、產(chǎn)生具有抗原結(jié)合能力的所期望的抗體的雜交瘤可以通過有限稀釋方法等進(jìn)行克隆。
[0762]這樣制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。此外，該雜交瘤可以在液氮中長期保存。
[0763]按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤，可從其培養(yǎng)上清中獲得所期望的單克隆抗體?；蛘?，可以將雜交瘤給予和其具有相容性的哺乳動物并使其生長，從其腹水中獲得單克隆抗體。前者的方法適于獲得高純度的抗體。
[0764]也可以適宜地使用由從該雜交瘤等抗體產(chǎn)生細(xì)胞克隆的抗體基因編碼的抗體。將克隆的抗體基因整合至適當(dāng)?shù)妮d體中，導(dǎo)入宿主，由此表達(dá)由該基因所編碼的抗體。用于抗體基因的分離、向載體中的導(dǎo)入以及宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)由例如Vandamme等確立(Eur.J.Biochem.(1990) 192 (3)，767-775)。此外，如下所述的重組抗體的制備方法也是公知的。
[0765]例如，由產(chǎn)生抗IL-6R抗體的雜交瘤細(xì)胞獲得編碼抗IL-6R抗體的可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。為此,通常首先從雜交瘤提取總RNA。作為用于從細(xì)胞提取mRNA的方法,例如可使用如下所述的方法:[0766]-胍超離心法(Biochemistry(1979) 18 (24)，5294-5299)
[0767]-AGPC法(Anal.Biochem.(1987) 162(I)，156-159)。
[0768]提取的mRNA 可使用 mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience 制)等進(jìn)行純化?；蛘哌€市售有 QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience制)等這樣的用于從細(xì)胞直接提取總mRNA的試劑盒。使用這種試劑盒，可從雜交瘤獲得mRNA ο可以使用反轉(zhuǎn)錄酶由所得mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA。cDNA可通過AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA SynthesisKit (生化學(xué)工業(yè)社制)等合成。此外，為了 cDNA的合成和擴(kuò)增，可以適宜采用使用了 SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech制)和 PCR 的 5’-RACE 法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1988)85(23), 8998-9002,Nucleic AcidsRes.(1989) 17 (8) ,2919-2932)。進(jìn)而，可以在這種cDNA的合成過程中向cDNA的兩末端導(dǎo)入后述適合的限制酶位點。
[0769]從所得PCR產(chǎn)物純化出目標(biāo)cDNA片段，接著與載體DNA連接。如此制作重組載體，并導(dǎo)入大腸桿菌等中，選擇菌落后，可以由形成該菌落的大腸桿菌制備所期望的重組載體。而且，對于該重組載體是否具有目標(biāo)cDNA的堿基序列，可以通過公知的方法例如雙脫氧核苷酸鏈終止法等來確認(rèn)。
[0770]為了獲得編碼可變區(qū)的基因，簡便的是利用5’ -RACE法，其中使用了可變區(qū)基因擴(kuò)增用的引物。首先 ，將從雜交瘤細(xì)胞提取的RNA作為模板來合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA文庫。5’-RACE cDNA文庫的合成中可適宜地使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒等市售的試劑盒。
[0771]以所得的5’_RACE cDNA文庫為模板，通過PCR法擴(kuò)增抗體基因?；诠目贵w基因序列，可設(shè)計小鼠抗體基因擴(kuò)增用的引物。這些引物根據(jù)免疫球蛋白的亞類而具有不同的堿基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠單克隆抗體同種型分型試劑盒(RocheDiagnostics)等市售試劑盒來預(yù)先確定亞類。
[0772]具體而言，例如為了獲得編碼小鼠IgG的基因時，可以使用能夠擴(kuò)增編碼作為重鏈的Y?、Y 2a> Y 2b> Y3、作為輕鏈的κ鏈和λ鏈的基因的引物。為了擴(kuò)增IgG的可變區(qū)基因，通常，3’側(cè)的引物采用會退火到相當(dāng)于接近可變區(qū)的恒定區(qū)的部分上的引物。而5’側(cè)的引物則采用5’ RACE cDNA文庫制作試劑盒所附帶的引物。
[0773]利用如此擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，可以重構(gòu)由重鏈和輕鏈的組合構(gòu)成的免疫球蛋白。將經(jīng)重構(gòu)的免疫球蛋白針對IL-6R的結(jié)合活性作為指標(biāo)，可篩選所期望的抗體。例如，為了獲得針對IL-6R的抗體時，進(jìn)一步優(yōu)選抗體對IL-6R的結(jié)合是特異性的。與IL-6R結(jié)合的抗體可例如如下所述進(jìn)行篩選:
[0774](I)使含有由雜交瘤獲得的cDNA所編碼的V區(qū)的抗體與IL-6R表達(dá)細(xì)胞接觸的步驟；
[0775](2)檢測IL-6R表達(dá)細(xì)胞與抗體的結(jié)合的步驟；以及
[0776](3)選擇與IL-6R表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抗體的步驟。
[0777]檢測抗體和IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合的方法是公知的。具體而言，通過如前所述的FACS等方法，可檢測抗體與IL-6R表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合。為了評價抗體的結(jié)合活性，可適宜利用IL-6R表達(dá)細(xì)胞的固定標(biāo)本。
[0778]作為以結(jié)合活性為指標(biāo)的抗體的篩選方法，還可適宜采用淘選法，其利用了噬菌體載體。從多克隆抗體表達(dá)細(xì)胞群以重鏈和輕鏈的亞類的文庫的形式獲得抗體基因時，有利的是利用噬菌體載體的篩選方法。編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因通過用適當(dāng)?shù)慕宇^序列連接，可形成單鏈Fv(ScFv)。通過將編碼scFv的基因插入噬菌體載體，可以獲得在表面表達(dá)scFv的噬菌體。該噬菌體與所期望的抗原接觸后，回收與抗原結(jié)合的噬菌體，從而可以回收編碼具有目標(biāo)結(jié)合活性的scFv的DNA。通過根據(jù)需要重復(fù)該操作，可以濃縮具有所期望結(jié)合活性的scFv。
[0779]得到編碼抗IL-6R抗體的V區(qū)的目標(biāo)cDNA后，通過識別插入在該cDNA的兩末端的限制酶位點的限制酶，將該cDNA消化。優(yōu)選的限制酶會識別并消化在構(gòu)成抗體基因的堿基序列中出現(xiàn)頻率低的堿基序列。進(jìn)而，為了將I拷貝的消化片段以正確方向插入載體，優(yōu)選插入能提供粘性末端的限制酶。將如上所述消化的編碼抗IL-6R抗體的V區(qū)的cDNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，由此可獲得抗體表達(dá)載體。此時，只要將編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的基因和編碼前述V區(qū)的基因框內(nèi)融合，則可獲得嵌合抗體。這里，嵌合抗體是指恒定區(qū)和可變區(qū)的來源不同。因此，除了小鼠-人等異種嵌合抗體之外，人-人同種嵌合抗體也含有在本發(fā)明的嵌合抗體中。通過在預(yù)先具有恒定區(qū)的表達(dá)載體中插入前述V區(qū)基因，可以構(gòu)建嵌合抗體表達(dá)載體。具體而言，例如，可在保持有編碼所期望抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達(dá)載體的5’側(cè)適宜地配置消化前述V區(qū)基因的限制酶的限制酶識別序列。對經(jīng)相同組合的限制酶消化的兩者進(jìn)行框內(nèi)融合，由此構(gòu)建嵌合抗體表達(dá)載體。 [0780]為了制備抗IL-6R單克隆抗體，以在表達(dá)調(diào)控區(qū)的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)的方式，將抗體基因整合至表達(dá)載體中。用于表達(dá)抗體的表達(dá)調(diào)控區(qū)含有例如增強(qiáng)子和啟動子。此外，可以在氨基末端添加合適的信號序列，以使表達(dá)的抗體分泌到細(xì)胞外。在后述實施例中，作為信號序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:3)的肽，除此之外也可以添加合適的信號序列。表達(dá)的多肽在上述序列的羧基末端部分被切斷，被切斷的多肽能夠以成熟多肽的形式分泌到細(xì)胞外。其次，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，由此可以獲得表達(dá)編碼抗IL-6R抗體的DNA的重組細(xì)胞。
[0781]為了表達(dá)抗體基因，編碼抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA被分別整合于不同的表達(dá)載體中。通過用整合有H鏈和L鏈的載體共轉(zhuǎn)化(co-transfect)相同的宿主細(xì)胞，可以表達(dá)具備H鏈和L鏈的抗體分子。或者，也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合于單一表達(dá)載體中，并用其轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參照國際公開W01994/011523)。
[0782]用于將分離的抗體基因?qū)脒m當(dāng)?shù)乃拗鱽碇谱骺贵w的宿主細(xì)胞和表達(dá)載體的多個組合是公知的。這些表達(dá)系統(tǒng)均可用于分離本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。將真核細(xì)胞用作宿主細(xì)胞時，可適宜使用動物細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。具體而言，動物細(xì)胞可例示下述細(xì)胞。
[0783](I)哺乳類細(xì)胞:CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela、Vero、HEK(人胚腎)293、Freestyle?293 等
[0784](2)兩棲類細(xì)胞:非洲爪蟾卵母細(xì)胞等
[0785](3)昆蟲細(xì)胞:sf9、sf21、Tn5 等。
[0786]或者，作為植物細(xì)胞，公知有基于來源于煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬的細(xì)胞的抗體基因表達(dá)系統(tǒng)。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中，可以適宜使用進(jìn)行了愈傷組織培養(yǎng)的細(xì)胞。[0787]進(jìn)而，作為真菌細(xì)胞，可以使用如下細(xì)胞:
[0788]-酵母:釀酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母(Saccharomyces)屬、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)等畢赤酵母屬
[0789]-絲狀真菌:黑曲霉菌(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)屬。
[0790]此外，利用原核細(xì)胞的抗體基因表達(dá)系統(tǒng)也是公知的。例如，使用細(xì)菌細(xì)胞時，可適宜利用大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌等細(xì)菌細(xì)胞。通過轉(zhuǎn)化向這些細(xì)胞中導(dǎo)入含有目標(biāo)抗體基因的表達(dá)載體。通過在體外培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可以從該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物中獲得所期望的抗體。
[0791]除了上述宿主細(xì)胞之外，重組抗體的產(chǎn)生也可以利用轉(zhuǎn)基因動物。即，可以從導(dǎo)入有編碼所期望抗體的基因的動物獲得該抗體。例如，抗體基因可以通過框內(nèi)插入編碼乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因的內(nèi)部，而構(gòu)建為融合基因。作為分泌至乳汁中的蛋白質(zhì)，可利用例如山羊β酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再將該進(jìn)行了注入的胚胎導(dǎo)入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的轉(zhuǎn)基因山羊(或其后代)產(chǎn)生的乳汁中，能夠以與乳汁蛋白的融合蛋白的形式獲得所期望的抗體。此外，為了使由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所期望抗體的乳汁量增加，可以對轉(zhuǎn)基因山羊給予激素(Bio/Technology (1994), 12(7)，699-702)。
[0792]對人給予本說明書中記載的抗原結(jié)合分子時，作為該分子中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以適宜采用來源于基因重組型抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該基因重組型抗體為了降低針對人的異源抗原性等目的已進(jìn)行了人工改變。基因重組型抗體含有例如人源化(Humanized)抗體等。這些改變抗體可使用公知方法適宜制備。
[0793]用于制作本說明書中記載的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體可變區(qū)通常由被4個框架區(qū)域(FR)保持的3個互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determining region ；CDR)構(gòu)成。CDR是實質(zhì)上決定抗體的結(jié)合特異性的區(qū)域。CDR的氨基酸序列富有多樣性。另一方面，構(gòu)成FR的氨基酸序列即便是在具有不同結(jié)合特異性的抗體之間也多顯示高度的同一性。因此，通常認(rèn)為可以通過CDR的移植來將某抗體的結(jié)合特異性移植到其它抗體。
[0794]人源化抗體也被稱為重構(gòu)(reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動物例如小鼠抗體的CDR移植到人抗體中的人源化抗體等是公知的。用于獲得人源化抗體的通常的基因重組方法也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重疊延伸PCR。重疊延伸PCR中，用于合成人抗體FR的引物中添加有編碼待移植小鼠抗體CDR的堿基序列。針對4個FR分別準(zhǔn)備引物。通常，對于將小鼠CDR移植到人FR中，選擇與小鼠FR同一性高的人FR，在維持CDR功能方面認(rèn)為有利。即，通常優(yōu)選利用下述人FR，其含有與待移植小鼠CDR的相鄰FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
[0795]此外，連接的堿基序列被設(shè)計為相互框內(nèi)連接。通過各引物單獨地合成人FR。結(jié)果得到各FR上添加有編碼小鼠CDR的DNA的產(chǎn)物。各產(chǎn)物的編碼小鼠CDR的堿基序列被設(shè)計為相互重疊。接著，使以人抗體基因為模板合成的產(chǎn)物的重疊CDR部分相互退火，進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)。通過該反應(yīng)，人FR通過小鼠⑶R序列而連接。
[0796]最終3個⑶R和4個FR連接得到的V區(qū)基因，通過會與其5’末端和3’末端發(fā)生退火并添加有適當(dāng)?shù)南拗泼缸R別序列的引物而擴(kuò)增出其全長。將如上所述得到的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA以進(jìn)行框內(nèi)融合的方式插入表達(dá)載體中，由此可以制作人型抗體表達(dá)用載體。將該整合載體導(dǎo)入宿主建立重組細(xì)胞后，培養(yǎng)該重組細(xì)胞，通過表達(dá)編碼該人源化抗體的DNA，從而在該培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生該人源化抗體(參照歐州專利公開EP239400、國際公開 W01996/002576)。
[0797] 通過定性或者定量地測定并評價如上所述制作的人源化抗體的抗原結(jié)合活性，可以適宜地選擇人抗體FR，以便通過CDR連接時該CDR形成良好的抗原結(jié)合位點。根據(jù)需要，也可以按照重構(gòu)人抗體CDR形成合適抗原結(jié)合位點的方式來取代FR的氨基酸殘基。例如，可以應(yīng)用將小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR導(dǎo)入氨基酸序列的突變。具體而言，可以向會與FR發(fā)生退火的引物中導(dǎo)入部分堿基序列的突變。通過這樣的引物合成的FR中導(dǎo)入了堿基序列的突變。通過用上述方法測定并評價進(jìn)行了氨基酸取代的突變型抗體的抗原結(jié)合活性，可以選擇具有所期望性質(zhì)的突變FR序列(Cancer Res., (1993) 53，851-856)。
[0798]此外，將具有人抗體基因的全部組成成分的轉(zhuǎn)基因動物(參照國際公開W01993/012227, W01992/003918, W01994/002602, W01994/025585, W01996/034096、W01996/033735)作為免疫動物，可以通過DNA免疫獲得所期望的人抗體。
[0799]進(jìn)而，使用人抗體文庫通過淘選獲得人抗體的技術(shù)也是已知的。例如,人抗體的V區(qū)以單鏈抗體(scFv)的形式通過噬菌體展示法表達(dá)在噬菌體的表面?？梢赃x擇表達(dá)與抗原結(jié)合的scFv的噬菌體。通過對選擇的噬菌體的基因進(jìn)行分析，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體V區(qū)的DNA序列。確定與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列后，將該V區(qū)序列與所期望的人抗體C區(qū)序列框內(nèi)融合后，插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，由此可以制作表達(dá)載體。將該表達(dá)載體導(dǎo)入上述列舉的適宜表達(dá)細(xì)胞中，通過使編碼該人抗體的基因表達(dá)，可以獲得該人抗體。這些方法已經(jīng)公知(參照國際公開W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、W01993/011236、W01993/019172、W01995/001438、W01995/015388)。
[0800]此外，作為獲得抗體基因的方法，除了上述之外，還可適宜地使用如Bernasconi等(Science (2002) 298，2199-2202)或TO2008/081008中記載的B細(xì)胞克隆(各抗體的編碼序列的鑒定和克隆、其分離、以及用于制備各抗體(特別是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的表達(dá)載體構(gòu)建用的用途等)的方法。
[0801]EU編號和Kabat編號
[0802]根據(jù)本發(fā)明中使用的方法，分配給抗體的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat規(guī)定(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute ofHealth, Bethesda, Md., 1987年和1991年)。本說明書中，抗原結(jié)合分子為抗體或抗原結(jié)合片段時，可變區(qū)的氨基酸按照Kabat編號來表示，恒定區(qū)的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU編號來表不。
[0803]離子濃度備件
[0804]金屬離子濃度條件
[0805]本發(fā)明的一個方式中，離子濃度是指金屬離子濃度?！敖饘匐x子”是指屬于除了氫以外的堿金屬和銅族等第I族、堿土類金屬和鋅族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和硅之外的第IV族、鐵族和鉬族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亞族的元素以及銻、鉍、針等金屬元素的離子。金屬原子具有釋放出原子價電子而形成陽離子的性質(zhì)，稱這為離子化傾向。認(rèn)為離子化傾向大的金屬富有化學(xué)活性。
[0806]作為本發(fā)明中優(yōu)選的金屬離子的實例，可舉出鈣離子。鈣離子參與許多生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，鈣離子參與骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收縮，白細(xì)胞的運(yùn)動和吞噬等的活化，血小板的變形和分泌等的活化，淋巴細(xì)胞的活化，組胺的分泌等肥大細(xì)胞的活化，兒茶酚胺α受體或乙酰膽堿受體介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答，胞吐作用，遞質(zhì)從神經(jīng)元末端的釋放，神經(jīng)元的軸漿流等。作為細(xì)胞內(nèi)的鈣離子受體，已知具有多個鈣離子結(jié)合位點、且認(rèn)為在分子進(jìn)化上來源于共同起源的肌鈣蛋白C、鈣調(diào)蛋白、小白蛋白、肌球蛋白輕鏈等，其結(jié)合模體也大量已知。還熟知例如，鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域、鈣調(diào)蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2結(jié)構(gòu)域、凝血蛋白因子IX所含的Gla結(jié)構(gòu)域、脫唾液酸糖蛋白受體或甘露糖結(jié)合受體所含的C型凝集素、LDL受體所含的A結(jié)構(gòu)域、膜聯(lián)蛋白、血小板反應(yīng)蛋白3型結(jié)構(gòu)域和EGF樣結(jié)構(gòu)域。
[0807]本發(fā)明中，在金屬離子為鈣離子時，作為鈣離子濃度條件，可舉出低鈣離子濃度條件和高鈣離子濃度條件。結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化是指，低鈣離子濃度和高鈣離子濃度條件的不同導(dǎo)致抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性發(fā)生變化?？膳e出例如，高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性高于低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的情形。此外還可舉出，低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性高于高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的情形。
[0808]本說明書中，高鈣離子濃度并不特別限于統(tǒng)一的數(shù)值，可以是優(yōu)選選自100μΜ至IOmM之間的濃度。此外，在其它方案中，可以是選自200 μ M至5mM之間的濃度。此外，在不同的方案中，可以是選自500μΜ至2.5mM之間的濃度，在其它的方案中也可以是選自200 μ M至2mM之間的濃度。進(jìn)而，還可以是選自400μΜ至1.5mM之間的濃度。特別優(yōu)選可舉出選自與機(jī)體內(nèi)血漿中(血中)的鈣離子濃度接近的500μΜ至2.5mM之間的濃度。
[0809]本說明書中，低鈣離子濃度并不特別限于統(tǒng)一的數(shù)值，可以是優(yōu)選選自0.ΙμΜ至30μΜ之間的濃度。此外，在其它方案中，可以是選自0.2μΜ至20μΜ之間的濃度。此外，在不同的方案中，可以是選自0.5 μ M至10 μ M之間的濃度，在其它的方案中也可以是選自ΙμΜ至5μΜ之間的濃度。進(jìn)而，還可以是選自2μΜ至4μΜ之間的濃度。特別優(yōu)選可舉出選自與機(jī)體內(nèi)的早期內(nèi)體內(nèi)的離子化鈣濃度接近的I μ M至5 μ M之間的濃度。
[0810]本發(fā)明中，低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性意指，抗原結(jié)合分子在選自0.ΙμΜ至30μΜ之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性弱于選自100μΜ至IOmM之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性。優(yōu)選意指抗原結(jié)合分子在選自0.5 μ M至10 μ M之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性弱于在選自200 μ M至5mM之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性，特別優(yōu)選意指機(jī)體內(nèi)的早期內(nèi)體內(nèi)的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性弱于機(jī)體內(nèi)的血漿中的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性，具體意指抗原結(jié)合分子在選自ΙμΜ至5μΜ之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性弱于在選自500 μ M至2.5mM之間的鈣離子濃度下的抗原結(jié)合活性。
[0811]抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨金屬離子濃度條件而變化與否可以通過使用例如前述結(jié)合活性項目中所記載的公知測定方法來確定。例如，為了確認(rèn)與低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性相比高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性變得更高，對低鈣離子濃度和高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性進(jìn)行比較。
[0812]進(jìn)而，本發(fā)明中，“低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性”的表述也可以表述為抗原結(jié)合分子的高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性。應(yīng)予說明，本發(fā)明中有時也將“低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性”記載為“低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合能力弱于高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合能力”，此外，有時也將“使低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性”記載為“使低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合能力弱于高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合能力”。
[0813]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜選擇測定抗原結(jié)合活性時的鈣離子濃度以外的條件，沒有特別限定。例如，可以在HEPES緩沖液、3 7 °C的條件下進(jìn)行測定。例如，可以使用Biacore (GE Healthcare)等進(jìn)行測定。對于抗原結(jié)合分子和抗原的結(jié)合活性的測定，在抗原為可溶型抗原時，通過對固定有抗原結(jié)合分子的芯片流過作為分析物的抗原，由此可以評價對可溶型抗原的結(jié)合活性，在抗原為膜型抗原時，通過對固定有抗原的芯片流過作為分析物的抗原結(jié)合分子，由此可以評價對膜型抗原的結(jié)合活性。
[0814]本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中，只要低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性弱于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性，則低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性和高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性之比沒有特別限定，優(yōu)選相對于抗原的低鈣離子濃度條件下的KD (Dissociation constant:解離常數(shù))和高鈣離子濃度條件的KD之比KD (Ca3 μ M) /KD (Ca2mM)的值為2以上，進(jìn)一步優(yōu)選KD (Ca3 μ M)/KD (Ca2mM)的值為10以上，進(jìn)一步優(yōu)選KD (Ca3 μ M) /KD (Ca2mM)的值為40以上。KD (Ca3 μ Μ) /KD (Ca2mM)的值的上限沒有特別限定，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)可以制作，則可以是400、1000、10000等任意的值。此外，也可以特定10)(0&3 4]\0/1(0(0&1.21111)的值。BP,KD(Ca3 μ M)/KD(Ca1.2mM)的值為 2 以上，進(jìn)一步優(yōu)選 KD (Ca3 μ M) /KD (Ca1.2mM)的值為 10 以上，進(jìn)一步優(yōu)選 KD (Ca3 μ M) /KD (Ca1.2mM)的值為40以上。KD (Ca3 μ M) /KD (Ca1.2mM)的值的上限沒有特別限定，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)可以制作，則可以是400、1000、10000等任意的值。
[0815]作為抗原結(jié)合活性的值，在抗原為可溶型抗原時可以使用KD (解離常數(shù))，而在抗原為膜型抗原時可以使用表觀KD (Apparent dissociation constant:表觀解離常數(shù))。KD(解離常數(shù))和表觀KD(表觀解離常數(shù))可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德圖(Scatchard plot)、流式細(xì)胞儀等。
[0816]此外，作為示出本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性和高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性之比的其它指標(biāo)，還可適宜使用例如解離速率常數(shù)即kd (Dissociation rate constant:解離速率常數(shù))。代替KD (解離常數(shù))而使用kd (解離速率常數(shù))來作為示出結(jié)合活性之比的指標(biāo)時，相對于抗原的低鈣濃度條件下的kd(解離速率常數(shù))和高鈣濃度條件下的kd(解離速率常數(shù))之比即kd(低鈣濃度條件)/kd(高鈣濃度條件)的值優(yōu)選為2以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10以上，更優(yōu)選為30以上。kd(低鈣濃度條件)/kd(高鈣濃度條件)的值的上限沒有特別限定，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識可以制作，則可以為50、100、200等任意的值。
[0817]作為抗原結(jié)合活性的值，在抗原為可溶型抗原時可以使用kd(解離速率常數(shù))，在抗原為膜型抗原時可以使用表觀kd (Apparent dissociation rate constant:表觀解離速率常數(shù))。kd(解離速率 使用Biacore (GE healthcare)、流式細(xì)胞儀等。應(yīng)予說明,本發(fā)明中，在測定不同鈣離子濃度下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性時，鈣濃度以外的條件優(yōu)選為相同。
[0818]例如，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可通過包括以下步驟(a)~(C)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的篩選來獲得:
[0819](a)獲得低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性的步驟；
[0820](b)獲得高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性的步驟；以及
[0821](c)選擇低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性低于高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的步驟。
[0822]進(jìn)而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可通過包括以下步驟(a)~(C)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體或其文庫的篩選來獲得:
[0823](a)在高鈣濃度條件下使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體或其文庫與抗原接觸的步驟；
[0824](b)將在前述步驟(a)中與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體置于低鈣濃度條件下的步驟；以及
[0825](C)對在前述步驟(b)中解離的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體進(jìn)行分離的步驟。
[0826]此外，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可通過包括以下步驟(a)~(d)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體或其文庫的篩選來獲得:
[0827](a)在低鈣濃度條件下使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的文庫與抗原接觸的步驟；
[0828](b)選擇在前述步驟(a)中不與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的步驟；
[0829](c)使在前述步驟(b)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在高鈣濃度條件下與抗原結(jié)合的步驟；以及
[0830](d)對在前述步驟(C)中與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體進(jìn)行分離的步驟。
[0831]進(jìn)而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可通過包括以下步驟(a)~(C)的篩選方法來獲得:
[0832](a)在高鈣濃度條件下使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的文庫與固定有抗原的柱接觸的步驟；
[0833](b)將在前述步驟(a)中與柱結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在低鈣濃度條件下從柱洗脫的步驟；以及
[0834](C)對在前述步驟(b)中洗脫的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體進(jìn)行分離的步驟。
[0835]進(jìn)而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可通過包括以下步驟(a)~(d)的篩選方法來獲得:
[0836](a)在低鈣濃度條件下使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的文庫通過固定有抗原的柱的步驟；
[0837](b)對在前述步驟(a)中不與柱結(jié)合而洗脫的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體進(jìn)行回收的步驟；
[0838](C)使在前述步驟(b)中回收的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在高鈣濃度條件下與抗原結(jié)合的步驟；以及
[0839] (d)對在前述步驟(C)中與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體進(jìn)行分離的步驟。
[0840]進(jìn)而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可通過包括以下步驟(a)~(d)的篩選方法來獲得:
[0841](a)在高鈣濃度條件下使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的文庫與抗原接觸的步驟；
[0842](b)獲得在前述步驟(a)中與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的步驟；
[0843](c)將在前述步驟(b)中獲得的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體置于低鈣濃度條件下的步驟；以及
[0844](d)對前述步驟(C)中抗原結(jié)合活性弱于前述步驟(b)中進(jìn)行選擇的標(biāo)準(zhǔn)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體進(jìn)行分離的步驟。
[0845]應(yīng)予說明，前述步驟可以重復(fù)2次以上。所以，根據(jù)本發(fā)明，可提供通過上述篩選方法中進(jìn)一步包括將(a)~(C)或(a)~(d)的步驟重復(fù)2次以上的步驟的篩選方法而獲得的低鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性低于高鈣離子濃度條件的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。(a)~(C)或(a)~(d)的步驟的重復(fù)次數(shù)沒有特別限定，通常為10次以內(nèi)。
[0846]本發(fā)明的篩選方法中，低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性只要是離子化鈣濃度為0.1 μ M~30 μ M之間的抗原結(jié)合活性則沒有特別限定，作為優(yōu)選的離子化鈣濃度，可舉出0.5μΜ~10 μ M之間的抗原結(jié)合活性。作為更優(yōu)選的離子化鈣濃度,可舉出機(jī)體內(nèi)的早期內(nèi)體內(nèi)的離子化鈣濃度，具體可舉出ΙμΜ~5μΜ下的抗原結(jié)合活性。此外，高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性只要是離子化鈣濃度為100μΜ~IOmM之間的抗原結(jié)合活性則沒有特別限定，作為優(yōu)選的離子化鈣濃度，可舉出200 μ M~5mM之間的抗原結(jié)合活性。作為更優(yōu)選的離子化鈣濃度，可舉出機(jī)體內(nèi)的血漿中的離子化鈣濃度，具體可舉出0.5mM~2.5mM時的抗原結(jié)合活性。
[0847]抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測定，對于離子化鈣濃度以外的條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜確定。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性可以作為KD(Dissociation constant:解離常數(shù))、表觀KD(Apparentdissociation constant:表觀解離常數(shù))、解離速率即kd (Dissociation rate:解離速率常數(shù))或表觀kd (Apparent dissociation:表觀解離速率常數(shù))等來進(jìn)行評價。它們可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來測定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德圖、FACS等。
[0848]本發(fā)明中，選自高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的步驟，與選擇低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性低于高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的步驟含義相同。
[0849]只要高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性，則高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性與低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性之差沒有特別限定，優(yōu)選高鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性是低鈣濃度條件下的抗原結(jié)合活性的2倍以上、進(jìn)一步優(yōu)選為10倍以上、更優(yōu)選為40倍以上。
[0850]通過前述篩選方法篩選得到的本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可以是任意的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，例如，可以篩選上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。例如，可以篩選具有天然序列的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，也可以篩選氨基酸序列被取代的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。
[0851]f庫
[0852]根據(jù)一個方案，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可以由文庫獲得，該文庫主要由多種抗原結(jié)合分子形成，所述多種抗原結(jié)合分子的序列相互不同，并且其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有至少一個使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的氨基酸殘基。作為離子濃度的實例，優(yōu)選可舉出金屬離子濃度或氫離子濃度。
[0853]本說明書中，“文庫”是指多種抗原結(jié)合分子或含有抗原結(jié)合分子的多種融合多肽、或編碼它們的序列的核酸、多核苷酸。文庫中所含的多種抗原結(jié)合分子或含有抗原結(jié)合分子的多種融合多肽的序列并非單一的序列，而是序列相互不同的抗原結(jié)合分子或含有抗原結(jié)合分子的融合多肽。
[0854]本說明書中，序列相互不同的多種抗原結(jié)合分子的記載中的“序列相互不同”這一術(shù)語意指文庫中的各抗原結(jié)合分子的序列相互不同。即，文庫中的相互不同的序列的數(shù)量反映文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量，有時也被視為“文庫大小”。通常的噬菌體展示文庫為IO6至1012，通過使用核糖體展示法等公知的技術(shù)，可將文庫大小放大至1014。然而，噬菌體文庫的淘選選擇時使用的噬菌體顆粒的實際數(shù)目通常比文庫大小大10至10，000倍。該過量倍數(shù)也稱為“文庫當(dāng)量數(shù)”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能夠存在10至10，000個。所以，本發(fā)明中的“序列相互不同”這一術(shù)語意指文庫當(dāng)量數(shù)除外的文庫中的各抗原結(jié)合分子的序列相互不同，更具體意指序列相互不同的抗原結(jié)合分子存在IO6至IO14個分子、優(yōu)選IO7至IO12個分子、進(jìn)一步優(yōu)選IO8至IO11個分子、特別優(yōu)選IO8至IO12個分子。
[0855]此外，本發(fā)明的主要由多種抗原結(jié)合分子形成的文庫這一記載中的術(shù)語“多種”，對于例如本發(fā)明的抗原結(jié)合分子、融合多肽、多核苷酸分子、載體或病毒來說，通常是指這些物質(zhì)的2種以上的集合。例如，只要某2個以上的物質(zhì)在特定形態(tài)方面相互不同，則表示該物質(zhì)存在2種以上。作為實例，可舉出氨基酸序列中的特定氨基酸位置觀察到的突變體氨基酸。例如，當(dāng)除了柔性殘基以外或除了露出于表面的超變氨基酸位置的特定突變體氨基酸以外，序列實質(zhì)上相同、優(yōu)選相同的本發(fā)明的2個以上的抗原結(jié)合分子存在時，則本發(fā)明的抗原結(jié)合分子存在多種。在其它實施例中，當(dāng)除了編碼柔性殘基的堿基以外或除了編碼露出于表面的超變氨基酸位置的特定突變體氨基酸的堿基以外實質(zhì)上相同、優(yōu)選相同的序列的本發(fā)明的2個以上的多核苷酸分子存在時，則本發(fā)明的多核苷酸分子存在多種。
[0856]進(jìn)而，本發(fā)明的主要由多種抗原結(jié)合分子形成的文庫的記載中的“主要由...形成”的表述反映出文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量中抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而不同的抗原結(jié)合分子的數(shù)量。具體而言，優(yōu)選表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子在文庫中至少存在IO4個分子。此外，更優(yōu)選本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子至少存在IO5個分子的文庫中獲得。進(jìn)一步優(yōu)選本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子至少存在IO6個分子的文庫中獲得。特別優(yōu)選本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子至少存在IO7個分子的文庫中獲得。還優(yōu)選本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子至少存在IO8個分子的文庫中獲得。其它表述中，也可適宜地表述為文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量中的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而不同的抗原結(jié)合分子的比例。具體而言，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由表現(xiàn)出這種結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子占文庫中序列不同的獨立克隆的數(shù)量的0.1%至80%、優(yōu)選0.5%至60%、更優(yōu)選I %至40 %、進(jìn)一步優(yōu)選2 %至20 %、特別優(yōu)選4%至10 %的文庫中獲得。融合多肽、多核苷酸分子或載體的情形也與上述相同，可以用分子的數(shù)量或全部分子中的比例來表述。此外，病毒的情形也與上述相同，可以用病毒個體的數(shù)量或全部個體中的比例來表述。
[0857]抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸
[0858]通過前述篩選方法篩選的本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可用任意方法制備，例如，在金屬離子為鈣 離子濃度的情形中，可以使用預(yù)先存在的抗體、預(yù)先存在的文庫(噬菌體文庫等)、由對動物進(jìn)行免疫得到的雜交瘤或來自免疫動物的B細(xì)胞制得的抗體或文庫、向這些抗體或文庫導(dǎo)入能螯合鈣的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突變而得的抗體或文庫(能螯合鈣的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文庫或者在特定位置導(dǎo)入能夠螯合鈣的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突變而得的文庫等)等。
[0859]如前所述，作為使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的氨基酸的實例，例如，在金屬離子為鈣離子時，只要是形成鈣結(jié)合模體的氨基酸即可，不論其種類如何。鈣結(jié)合模體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的，并且有詳細(xì)記載(例如Springer 等(Cell (2000) 102，275-277)、Kawasaki 和 Kretsinger (Protein Prof.(1995)2，305-490),Moncrief等(J.Mol.Evo1.(1990)30，522-562),Chauvaux等(Biochem.J.(1990)265，261-265)、Bairoch 和 Cox(FEBS Lett.(1990) 269，454-456)、Davis (NewBiol.(1990)2，410-419)、Schaefer等(Genomics(1995)25，638 ~643),Economou 等(ΕΜΒ0J.(1990)9，349-354)、Wurzburg 等(Structure.(2006) 14,6，1049-1058))。即，本發(fā)明抗原結(jié)合分子中可以含有ASGPR，⑶23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知鈣結(jié)合模體。作為這種鈣結(jié)合模體的優(yōu)選實例，除了上述之外，還可舉出SEQ ID N0:62所述的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中所含的鈣結(jié)合模體。
[0860]此外，作為抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸的實例，還可適宜使用具有金屬螯合作用的氨基酸。作為具有金屬螯合作用的氨基酸的實例，優(yōu)選可舉出例如:絲氨酸(Ser(S))、蘇氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gin (Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。
[0861]含有前述氨基酸的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的位置并不限于特定的位置，只要是使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化，則可以是形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中的任意位置。即，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由重鏈的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。此外，在其它非限定的方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由重鏈的CDR3中含有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在其它非限定的方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由重鏈的CDR3的以Kabat編號表示的95位、96位、IOOa位和/或101位含有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。[0862]此外，在本發(fā)明的非限定的一個方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。此外，在其它方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDRl中含有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在其它方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDRl的以Kabat編號表示的30位、31位和/或32位含有該氨基酸、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0863]此外，在其它非限定的方式中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDR2中含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在其它方案中，提供下述文庫，該文庫主要由輕鏈的CDR2的以Kabat編號表示的50位含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。 [0864]進(jìn)而，在其它非限定的方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDR3中含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。在其它方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的CDR3的以Kabat編號表示的92位含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0865]此外，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫作為本發(fā)明的不同方案來獲得，該文庫主要由選自上述記載的輕鏈的CDRl、CDR2和CDR3中的2個或3個CDR含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。進(jìn)而，本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由下述文庫獲得，該文庫主要由輕鏈的以Kabat編號表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一個以上含有該氨基酸殘基、且序列相互不同的抗原結(jié)合分子形成。
[0866]在特別優(yōu)選的實施方案中，理想的是抗原結(jié)合分子的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的框架序列具有人的種系框架序列。因此，在本發(fā)明的一個方案中，若框架序列完全為人的序列，則認(rèn)為在給予人(例如疾病的治療)時，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子基本或完全不會引起免疫原性反應(yīng)。根據(jù)上述含義，本發(fā)明的“含有種系序列”意指本發(fā)明的框架序列的一部分與任意的人的種系框架序列的一部分相同。例如，在本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的重鏈FR2的序列為多個不同的人的種系框架序列的重鏈FR2序列組合得到的序列時，也是本發(fā)明的“含有種系序列”的抗原結(jié)合分子。
[0867]作為框架的實例，優(yōu)選可舉出例如:V_Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網(wǎng)站中所包括的、現(xiàn)在已知的完全人型框架區(qū)域的序列。這些框架區(qū)域的序列能夠適宜用作本發(fā)明的抗原結(jié)合分子中所含的種系序列。種系序列可基于其相似性來分類(Tomlinson 等(J.Mol.Biol.(1992) 227，776-798)Williams 和 Winter(Eur.J.1mmunol.(1993)23，1456-1461)和 Cox 等(Nat.Genetics (1994) 7, 162-168))?？梢詮姆诸悶?7 個亞類的Vk、分類為10個亞類的V λ、分類為7個亞類的VH中適宜選擇合適的種系序列。
[0868]完全人型VH序列并不僅限于下述，可適宜舉出例如:VH1亞類(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1_69)、VH2 亞類(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3 亞類(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4 亞類(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5 亞類(VH5-51)、VH6 亞類(VH6-1)、VH7 亞類(VH7-4、VH7_81)的 VH 序列等。它們也記載于公知文獻(xiàn)(Matsuda等(J.Exp.Med.(1998) 188, 1973-1975))等中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于它們的序列信息適宜設(shè)計本發(fā)明的抗原結(jié)合分子。還可適宜使用它們以外的完全人型框架或框架的亞區(qū)(sub-region)。
[0869]完全人型VK序列并不僅限于下述，可適宜舉出例如:分類為Vkl亞類的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、Lll、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、02、04、08、012、014、018 ;分類為 Vk2 亞類的 Al、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、01、011 ；分類為Vk3 亞類的 All、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25 ;分類為 Vk4 亞類的 B3 ;分類為 Vk5 亞類的B2 (本說明書中也稱為Vk5-2);分類為VK6亞類的A10、A14、A26等(Kawasaki等(Eur.J.1mmunol.(2001) 31，1017-1028)、Schable 和 Zachau (Biol.Chem.HoppeSeyler (1993)374, 1001-1022)和 Brensing-Kuppers ^ (Gene (1997) 191，173-181))。
[0870]完全人型的VL序列并不僅限于下述，可適宜舉出例如:分類為VLl亞類的V1-2、Vl-3、Vl-4、Vl-5、Vl-7、Vl-9、Vl-ll、Vl-13、Vl-16、Vl-17、Vl-18、Vl-19、Vl-20、Vl-22 ;分類為 VLl 亞類的 V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19 ;分類為 VL3 亞類的 V3-2、V3-3、V3-4 ;分類為 VL4 亞類的 V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6 ;分類為VL5 亞類的 V5-l、V5-2、V5-4、V5-6 等(Kawasaki 等(Genome Res.(1997)7,250-261))。
[0871]通常這些框架序列根據(jù)一個或更多個氨基酸殘基的區(qū)別而相互不同。這些框架序列可以與本發(fā)明的“使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基”一起使用。作為與本發(fā)明的“使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基”一起使用的完全人型框架的實例，并不僅限于此，此外還可舉出:KOL、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY、POM 等(例如，前述的 Kabat 等(1991)和 Wu 等(J.Exp.Med.(1970) 132,211-250))。
[0872]本發(fā)明并不受特定理論的束縛，認(rèn)為種系序列的使用有望排除大多數(shù)個體中有害免疫反應(yīng)的一個原因如下所述。通常的免疫反應(yīng)中產(chǎn)生的親和性成熟階段的結(jié)果造成免疫球蛋白的可變區(qū)頻繁地產(chǎn)生體細(xì)胞的突變。這些突變主要產(chǎn)生在其序列為超變的⑶R的附近，對框架區(qū)域的殘基也造成影響。這些框架的突變在種系的基因中不存在，而成為患者的免疫原性的可能性也小。其是由于:通常的人類種群暴露于種系的基因所表達(dá)的框架序列的大多數(shù)，作為免疫耐受性的結(jié)果，預(yù)測這些種系的框架在患者中的免疫原性低或為非免疫原性。為了使免疫耐受性的可能性最大，編碼可變區(qū)的基因可以從通常存在的功能性種系基因的集合中選擇。
[0873]為了制作本發(fā)明的、前述框架序列中含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸的抗原結(jié)合分子，可適宜采用位點特異性誘變法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))或重疊延伸 PCR 等公知方法。
[0874]例如，通過將被選擇作為預(yù)先含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基的框架序列的輕鏈可變區(qū)、與被制作為隨機(jī)可變區(qū)序列文庫的重鏈可變區(qū)組合 ，由此可以制作含有本發(fā)明的多種序列相互不同的抗原結(jié)合分子的文庫。作為這樣的非限定性實例，在離子濃度為鈣離子濃度時，可適宜舉出例如:將SEQ IDN0:62(Vk5-2)所述的輕鏈可變區(qū)序列所代表的屬于Vk5-2家族的輕鏈可變區(qū)序列和被制作作為隨機(jī)可變區(qū)序列文庫的重鏈可變區(qū)組合而成的文庫。
[0875]此外，也可以進(jìn)行設(shè)計，以使前述被選擇作為預(yù)先含有使抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性隨鈣離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基的框架序列的輕鏈可變區(qū)的序列中含有作為該氨基酸殘基以外的殘基的各種氨基酸。本發(fā)明中，這樣的殘基也被稱為柔性殘基。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性只要隨離子濃度條件而變化，則該柔性殘基的數(shù)目和位置并不限于特定的方案。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可以含有一個或更多個的柔性殘基。例如，在離子濃度為鈣離子濃度時，作為導(dǎo)入SEQ IDN0:62(Vk5-2)所述的輕鏈可變區(qū)序列中的柔性殘基的非限定性實例，可舉出表1或表2中所述的氨基酸殘基。
[0876][表 I]
【權(quán)利要求】
1.含有抗原結(jié)合分子的藥物組合物，其中，所述抗原結(jié)合分子含有:在PH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及，在PH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，上述抗原為可溶型抗原。
3.權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中，上述離子濃度為鈣離子濃度。
4.權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在高鈣離子濃度條件下抗原結(jié)合活性高于在低鈣離子濃度條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中，上述離子濃度條件為pH條件。
6.權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在pH中性范圍條件下抗原結(jié)合活性高于在pH酸性范圍條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1飛中任一項所述的藥物組合物，其中，上述抗原結(jié)合分子為具有針對上述抗原的中和活性的抗原結(jié)合分子。
8.權(quán)利要求f 7中任一項所述的藥物組合物，其中，上述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中選自以下的至少一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
10.權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): 221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個； 222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個； 224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個； 227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個； 231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys> Pro或Tyr中的任一個； 232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；`233位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； `234位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； ` 235位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； `236位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； ` 237位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； `238位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任 個； ` 239位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； `240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； `241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個； `243位的氨基酸為Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一個； `244位的氨基酸為His; `245位的氨基酸為Ala; ` 246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； ` 247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個； ` 249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個； ` 250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個； `251位的氨基酸為Phe; ` 254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個； `255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個； `256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個； `258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個； `260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； `262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個； ` 263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； ` 264位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr λ Trp或Tyr中的任一個； `265位的氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； ` 266位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； ` 267位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；`268位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或
11.權(quán)利要求1-10中任一項所述的藥物組合物，其中，上述EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
12.權(quán)利要求1-11中任一項所述的藥物組合物，其中，上述人Fe Y受體為FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
13.權(quán)利要求1-11中任一項所述的藥物組合物，其中，上述人Fe Y受體為FcYRIIb。
14.權(quán)利要求8~13中任一項所述的藥物組合物，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): .238位的氨基酸為Asp，或 .328位的氨基酸為Glu。
15.以下(i)-(vi)中任一項的方法，該方法包括使抗原結(jié)合分子與表達(dá)FeY受體的細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)或機(jī)體外進(jìn)行細(xì)胞接觸的步驟，所述抗原結(jié)合分子含有:在PH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及，在PH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(i)使一分子的抗原結(jié)合分子可結(jié)合的抗原數(shù)目增加的方法； (ii)使血漿中的抗原消除的方法； (iii)改善抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法； (iv)促進(jìn)在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子解離的方法; (V)促進(jìn)不與抗原結(jié)合的狀態(tài)的抗原結(jié)合分子向細(xì)胞外釋放的方法；或 (vi)使血漿中的總抗原濃度或游離抗原濃度減少的方法。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中，上述抗原為可溶型抗原。
17.權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，上述離子濃度為鈣離子濃度。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于在低鈣離子濃度條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，上述離子濃度條件為pH條件。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在pH中性范圍條件下的抗原結(jié)合活性高于在pH酸性范圍條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
21.權(quán)利要求15~20中任一項所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合分子為具有針對上述抗原的中和活性的抗原結(jié)合分子。
22.權(quán)利要求15~21中任一項所述的方法，其中，上述FeY受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中選自以下的至少一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、222位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434位、436位和440位。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): 221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個； 222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個； 224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個； 227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；.230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個； .231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個； .232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； . 233位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； . 234位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .235位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .236位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 237位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .238位的氨基酸 為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .239位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； .241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個； .243位的氨基酸為Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一個； . 244位的氨基酸為His ； .245位的氨基酸為Ala; . 246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； .247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個； .249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個； .250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個； .251位的氨基酸為Phe; .254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個； .255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個； .256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個； .258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個； . 260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； .262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個； .263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； . 264位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr λ Trp或Tyr中的任一個； .265位的氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 266位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
25.權(quán)利要求15~24中任一項所述的方法，其中，上述EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
26.權(quán)利要求15~25中任一項所述的方法，其中，上述人Fcy受體為FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
27.權(quán)利要求15~25中任一項所述的方法，其中，上述人FeY受體為FcyRIIb。
28.權(quán)利要求22~27中任一項所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): .238位的氨基酸為Asp，或 .328位的氨基酸為Glu。
29.以下(i廣(vii)的任一項所述的方法，該方法包括:使抗原結(jié)合分子中的Fcy受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域在PH中性范圍條件下的Fe Y受體結(jié)合活性較EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)在pH中性范圍條件下的Fe Y受體結(jié)合活性增強(qiáng)的步驟，所述抗原結(jié)合分子含有在PH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性、且對抗原的結(jié)合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域， (i)使結(jié)合的抗原向細(xì)胞內(nèi)的攝入得到促進(jìn)的抗原結(jié)合分子的改變方法； (?)使一分子的抗原結(jié)合分子可結(jié)合的抗原數(shù)目增加的方法； (iii)使抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力增大的方法； (iv)改善抗原結(jié)合分子的藥代動力學(xué)的方法； (v)促進(jìn)在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子解離的方法; (vi)促進(jìn)在與抗原結(jié)合的狀態(tài)下攝入到細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子在不與抗原結(jié)合的狀態(tài)下向細(xì)胞外釋放的方法；或 (vii)可減少血漿中的總抗原濃度或游離抗原濃度的抗原結(jié)合分子的改變方法。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中，上述抗原為可溶型抗原。
31.權(quán)利要求29或30所述的方法，其中，上述離子濃度為鈣離子濃度。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性高于在低鈣離子濃度條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
33.權(quán)利要求29或30所述的方法，其中，上述離子濃度條件為pH條件。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為在pH中性范圍條件下的抗原結(jié)合活性高于在pH酸性范圍條件下對該抗原的結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
35.權(quán)利要求29~34中任一項所述的方法，其中，上述抗原結(jié)合分子為具有針對上述抗原的中和活性的抗原結(jié)合分子。
36.權(quán)利要求29~35中任一項所述的方法，其中，上述FeY受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中以下的任一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、222位、223位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、281位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434 位、436位和440位。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): 221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個； 222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；. 223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；. 224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； . 225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個； . 227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；. 228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；. 230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個； .231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個； . 232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； . 233位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個； . 234位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 235位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；. 236位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；. 237位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個； . 238位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個； . 239位的氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .240位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； .241位的氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個； .243位的氨基酸為Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一個； .244位的氨基酸為His ； . 245位的氨基酸為Ala; .246位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； .247 位的氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個； . 249位的氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個； . 250位的氨基酸為Glu或Gln中的任一個； .251位的氨基酸為Phe ； . 254位的氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個； . 255位的氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個； . 256位的氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個； . 258位的氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個； . 260位的氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； . 262位的氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個； . 263位的氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
39.權(quán)利要求29~38中任一項所述的方法，其中，上述EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
40.權(quán)利要求29~39中任一項所述的方法，其中，上述人FeY受體為Fe Y RIa,Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
41.權(quán)利要求29~39中任一項所述的方法，其中，上述人FeY受體為FcyRIIb。
42.權(quán)利要求36~41中任一項所述的方法，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): 238位的氨基酸為Asp，或 328位的氨基酸為Glu。
43.抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a廣(f)的步驟: (a)獲得在高鈣離子濃度條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)乖慕Y(jié)合活性的步驟； (b)獲得在低鈣離子濃度條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性的步驟； (C)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟； (d)使編碼在(C)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼FeY受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且在PH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及 (f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
44.抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a廣(f)的步驟: (a)獲得在高鈣離子濃度條件下抗體對抗原的結(jié)合活性的步驟； (b)獲得在低鈣離子濃度條件下抗體的抗原結(jié)合活性的步驟； (C)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗體的步驟； (d)使編碼在(C)中選擇的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼FeY受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍具有人FcRn結(jié)合活性，且在PH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及 (f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
45.抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a廣(f)的步驟: (a)獲得在pH中性范圍條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)乖慕Y(jié)合活性的步驟； (b)獲得在pH酸性范圍條件下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性的步驟； (C)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的步驟； (d)使編碼在(C)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼FeY受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且在PH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及 (f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
46.抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下(a廣(f)的步驟: (a)獲得在pH中性范圍條件下抗體對抗原的結(jié)合活性的步驟； (b)獲得在pH酸性范圍條件下抗體對抗原的抗原結(jié)合活性的步驟；(C)選擇在(a)中獲得的抗原結(jié)合活性高于在(b)中獲得的抗原結(jié)合活性的抗體的步驟； (d)使編碼在(C)中選擇的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸與編碼FeY受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸連接的步驟，所述Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是:在pH酸性范圍條件下具有人FcRn結(jié)合活性，且在pH中性范圍條件下Fe Y受體結(jié)合活性與EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)的Fe Y受體結(jié)合活性相比高的Fe Y受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (e)培養(yǎng)導(dǎo)入了有效連接有在(d)中獲得的多核苷酸的載體的細(xì)胞的步驟；以及 (f)從在(e)中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中回收抗原結(jié)合分子的步驟。
47.權(quán)利要求43~46中任一項所述的制備方法，其中，上述抗原為可溶型抗原。
48.權(quán)利要求43~47中任一項所述的制備方法，其中，上述FeY受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有抗體的Fe區(qū)。
49.權(quán)利要求48所述的制備方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中選自以下的至少一個以上的氨基酸與天然型Fe區(qū)的對應(yīng)位點的氨基酸不同的Fe區(qū):221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
50.權(quán)利要求49所述的制備方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有選自以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): 221位的氨基酸為Lys或Tyr中的任一個； 222位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 223位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個； 224位的氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 225位的氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個； 227位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 228位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 230位的氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個； 231位的氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個； 232位的氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
233位的氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個；
234位的氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>
51.權(quán)利要求43~50中任一項所述的制備方法，其中，上述EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgG的Fe區(qū)是:EU編號297位連接的糖鏈為含巖藻糖糖鏈的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一個的Fe區(qū)。
52.權(quán)利要求43~51中任一項所述的制備方法，其中，上述人Fcy受體為FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
53.權(quán)利要求43~51中任一項所述的制備方法，其中，上述人FeY受體為FcyRIIb。
54.權(quán)利要求48~53中任一項所述的制備方法，其中，上述Fe區(qū)是在Fe區(qū)的以EU編號表示的位點中含有以下的至少一個以上的氨基酸的Fe區(qū): 238位的氨基酸為Asp，或 328位的氨基酸為Glu。
【文檔編號】A61P37/02GK103974721SQ201280058920
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】井川智之, 前田敦彥, 原谷健太, 巖柳有起, 橘達(dá)彥 申請人:中外制藥株式會社