用于預防或治療egfr抑制的不利反應的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了包含重組人超氧化物歧化酶(rhSOD)的藥物組合物，其用于預防或治療受試者中由使用EGFR抑制劑的治療引起的一種或多種不利反應。
【專利說明】用于預防或治療EGFR抑制的不利反應的組合物
[0001]本發(fā)明涉及包含重組人超氧化物歧化酶(rhSOD)的藥物組合物，其用于治療有此需要的受試者中由使用EGFR抑制劑例如抗-EGFR抗體或EGFR酪氨酸激酶抑制劑的治療引起的一種或多種不利反應，特別地痤瘡樣皮膚疹。
[0002]表皮生長因子受體(EGFR)的突變或過表達已被鑒定為許多不同類型的癌癥如癌瘤和膠質(zhì)母細胞瘤(其分別為上皮和神經(jīng)膠質(zhì)來源的腫瘤)的病因?；加写祟惸[瘤的患者可利用EGFR抑制劑來系統(tǒng)性治療，然而這可引起嚴重的炎癥副作用，尤其是在皮膚和腸中，從而通常導致治療失敗。
[0003]EGFR的抑制可通過兩類治療劑來實現(xiàn):酪氨酸激酶抑制劑(TKI)和抗EGFR抗體。
[0004]如Heidary等人，2008 ;和Robert等人，2005中描述的，利用EGFR抑制劑的治療與超過50%的患者中的炎癥性皮膚副作用相關，所述副作用可導致過早的治療終止。重要地，皮膚的炎癥性副作用的強度與抗癌治療成功正相關(Perez-Soler等人，2004)。顯示最強皮膚副作用的患者也是顯示更好的抗腫瘤應答和更長的抗EGFR治療后存活的那些患者。
[0005]接受抗EGFR療法的患者的最常見皮膚副作用是無菌非感染性毛囊炎、痤瘡樣丘疹膿皰性疹，也稱為痤瘡樣皮膚疹(ALSR)，其在治療開始后早期發(fā)生。損傷通常在面部發(fā)生，并且伴隨血液白細胞如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以及T細胞的混合群體的皮膚浸潤。第二大副作用是毛發(fā)變化如異常頭皮(abnormal scalp)、面部毛發(fā)和睫毛生長。此外，用EGFR抑制劑治療的患者非常頻繁地發(fā)生胃腸道紊亂如腹瀉和惡心。
[0006]EGFR療法的上述不利反應極頻繁地導致停藥或劑量減少，損害了患者的生活質(zhì)量，而且還使患者處于二重感染的風險中。
[0007]然而，尚沒有標準治療或指導方案來處理由EGFR抑制引起的不利反應。皮膚相關不利反應的治療目前限于局部抗生素、一般皮膚護理和衛(wèi)生推薦。其它治療選擇例如局部用類固醇的使用由于繼發(fā)副作用而有爭議。局部用維A酸因皮膚干燥和起皮的進一步增加而不被推薦，而痤瘡藥不如類固醇或抗生素有效。用于治療嚴重皮膚或胃腸不利反應的全身性類固醇是有問題的，因為它們可干擾EGFR抑制。
[0008]因此，迫切需要新型治療性策略來控制用EGFR抑制劑治療的患者的不利反應。因此，本發(fā)明的目的是，提供用于預防或治療由使用EGFR抑制劑的治療而引起的一種或多種不利反應的藥物組合物。
[0009]因此，本發(fā)明提供了包含重組人超氧化物歧化酶(rhSOD)的藥物組合物，其用于預防或治療受試者中由使用EGFR抑制劑的治療引起的一種或多種不利反應。
[0010] 使用EGFR抑制劑的治療之后的炎癥背后的病理機制知之甚少。特別地，各種駐留和浸潤性免疫細胞群體的作用和相互作用到目前為止未被研究。在健康皮膚中，特定免疫細胞群體位于不同的皮膚層，構成了皮膚相關淋巴組織。人和小鼠表皮(以及其它物種的表皮)包含郎格漢斯細胞(LC)，其為存在于復層上皮中的樹突細胞(DC)的亞型。真皮中的免疫細胞群體的異質(zhì)程度要高得多。健康真皮包含DC、⑶4+和⑶8+T-細胞、Y δ T-細胞和天然殺傷T-細胞(NKT)、巨噬細胞和肥大細胞。專門亞型的炎癥性DC(IDC)出現(xiàn)在發(fā)炎的人真皮中(如在銀屑病中)并且稱為TIP-DC(〃產(chǎn)生TNFa和iNOS的DC")。在不同的炎癥性皮膚障礙中，典型的Th-細胞亞型可通過它們產(chǎn)生的關鍵細胞因子來鑒定。更近以來，Th-17細胞已被描述為，在慢性炎癥性障礙中是非常重要的。然而，皮膚T細胞對于在正常條件下預防炎癥也是非常重要的。實例是通過經(jīng)LC介導的UV-B輻射對調(diào)節(jié)性T-細胞(Tregs)的誘導,這突顯了皮膚細胞群體之間的復雜相互作用(Yoshiki等人，2010)。
[0011]皮膚肥大細胞被專門配備來感知由皮膚損傷或感染誘導的各種危險信號。它們表達寬范圍的識別受體如TLR、補體-和Fe-受體以及細胞因子受體。除了病原體以外，來源于上皮的危險信號如抗菌肽LL37(其受EGFR調(diào)節(jié))可吸引并活化肥大細胞(Lande等人，2007 ;SChiemann等人，2009)。嗜中性粒細胞/粒細胞被招募至皮膚以響應多種觸發(fā)因子如創(chuàng)傷、細菌感染或在慢性炎癥性皮膚病如銀屑病或系統(tǒng)性紅斑狼瘡過程中。在角質(zhì)形成細胞中，一些負責化學誘導的信號(如IL-8、CCL-2或GM-CSF)可受EGFR調(diào)節(jié)(Mascia等人，2003 ;Roupe等人，2010)。在傷口愈合和感染性疾病中，嗜中性粒細胞是重建所必需的(Lin等人，201 Ib)，然而它們的促炎介體如活性氧(ROS)、髓過氧化酶或白細胞介素_17a的巨大庫可在某些條件下引起自身免疫樣疾病(Lin等人，2011a ；Villanueva等人，2011)。
[0012]一些可招募樹突細胞(DC)、T細胞和嗜中性粒細胞的促炎介體如CCL-2/MCP-1、CCL-5/RANTES和CXCL-10/IP-10響應EGFR刺激而被下調(diào)。重要地，當EGFR信號傳導被抑制時，這些由細胞因子如TNFa誘導的趨化因子的產(chǎn)生得到增強(Mascia等人，2003)，這提供了嗜中性粒細胞增加的可能解釋，這也是用EGFR抑制劑治療的患者的皮膚中ROS的主要來源之一。不同免疫細胞類型和超氧化物的產(chǎn)生如何促成和合作以誘導在用EGFR抑制劑治療的患者中觀察到的痤瘡樣皮膚疹(ALSR)表型目前仍然知之甚少。
[0013]使用EGFR抑制 劑的治療的胃腸副作用背后的病理機制也知之甚少。不存在EGFR配體TGFa的小鼠顯示增加的對DSS誘導的結腸炎的易感性(Egger等人，1997)36?!?配體響應DSS觸發(fā)的粘膜損傷而增加，并且該響應依賴于TLR4信號傳導(Hsu等人，2010)。已假設TLR4介導的EGFR配體表達的增加對于響應組織損傷的粘膜細胞增殖和修復是非常重要的。骨髓嵌合體小鼠的分析已顯示，對于EGFR配體的增加的釋放，在非造血細胞(推定地粘膜上皮細胞)中需要TLR-銜接分子MyD88，并且具有EGFR的減弱形式(Waved2，velvet突變體)的小鼠對DSS誘導的結腸炎更加易感(Brandl等人，2010 ;Egger等人，2000)。有趣地，EGFR信號轉導似乎還參與與腸道菌群的相互作用。例如，由鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamn0SUS)GG產(chǎn)生的益生菌蛋白p40以EGFR/Akt依賴性方式保護腸上皮細胞免受細胞凋亡(Yan等人，2011)。使用p40治療具有已建立的DSS誘導的結腸炎的小鼠顯著地改善了粘膜屏障功能，且減少了疾病癥狀，這突顯了 EGFR信號轉導在腸動態(tài)平衡中的重要性。
[0014]本發(fā)明中使用的方法是獨特的，因為其使用極其特異性的高度適合的小鼠模型(組織-特異性EGFR敲除小鼠)，其發(fā)展了與經(jīng)歷抗EGFR靶向療法的癌癥患者非常相似的表型。通過使用組織特異性EGFR敲除法，能夠產(chǎn)生特異性地在皮膚和/或腸中缺乏EGFR的小鼠。特異性地在皮膚中缺乏EGFR的小鼠發(fā)展了與ALSR相似的嚴重皮膚炎癥。因此，此類小鼠是研究由EGFR抑制劑誘導的表型背后的機制以及測試目的在于預防和/或治療EGFR抑制劑療法的不利反應的化合物的通用工具。在本發(fā)明中，已在這些小鼠模型中測試了超氧化物歧化酶(SOD)。
[0015]超氧化物歧化酶(SOD)是一類催化超氧陰離子歧化成氧和過氧化氫的酶。因此，它們是幾乎所有暴露于氧的細胞中的重要抗氧化劑防御。在人中(如在所有其它哺乳動物和大多數(shù)脊椎動物中一樣)，存在3種形式的超氧化物歧化酶。SODl位于細胞質(zhì)中，S0D2位于線粒體中，S0D3位于細胞外。第一種是二聚體(由兩個單位組成)，然而其它的是四聚體(4個亞單位)。SODl和S0D3包含銅和鋅，然而S0D2 (線粒體酶)在其反應中心中具有錳。天然人Cu/Zn-S0D1是同二聚體分子(32kDa)。其是通過中和ROS的發(fā)展來保護人細胞免受有害水平的氧化性應激所必需的。它與超氧陰離子(.(V)根(其可用作抗細菌感染的防護甲)特異性反應。雖然基于它們對生物組織的固有的氧化反應性，但它們還能夠誘導不期望的炎癥應答和對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA的致癌修飾。.(V的增加的形成可通過外部環(huán)境因子如輻射源或誘變化學藥品來誘導，或通過在呼吸爆發(fā)后專門的人免疫細胞例如巨噬細胞和中性粒細胞來天然地誘導。
[0016]在本發(fā)明中，已顯示SOD在上述小鼠模型中正面影響幾個受EGFR抑制影響的T細胞相關參數(shù)，從而提供了 SOD用于預防或治療EGFR抑制的不利反應的證據(jù)。因此，本發(fā)明提供了包含重組人超氧化物歧化酶(rhSOD)的藥物組合物，其用于預防或治療有此需要的受試者中由使用EGFR抑制劑的治療引起的一種或多種不利反應。
[0017]本發(fā)明還涉及，通過施用包含重組人超氧化物歧化酶(rhSOD)的藥物組合物，來預防或治療有此需要的受試者中由使用EGFR抑制劑的治療引起的一種或多種不利反應的方法。
[0018]在本發(fā)明的實施方案中，rhSOD是重組人Cu/Zn-SOD，最優(yōu)選重組人SODl。rhSOD可以在大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，優(yōu)選通過使用分批/補料分批發(fā)酵法，并且優(yōu)選以IOOL的體積。在通過離心進行分離后，可通過硫酸銨沉淀和一個或多個層析步驟，優(yōu)選3 個不同的層析步驟，最優(yōu)選基于不同的Sepharose?樹脂的層析步驟來進行純化。隨后，
可將rhSOD無菌過濾，任選地進行配制?？蓪hSOD貯存在生理PBS中，優(yōu)選以30 ± IOmg/ml的濃度。
[0019]rhSOD可作為游離rhSOD使用，如例如Tsao等人，1991 ；Land等人1994 ；Davis等人1997 ;或Davis等人2003中描述的。在優(yōu)選實施方案中，rhSOD的藥代動力學特征可通過使用藥物遞送系統(tǒng)來改善。在另一個優(yōu)選實施方案中，可以修飾例如PEG化或卵磷脂化rhSOD (Igarashi 等人,1992)。
[0020]在特別優(yōu)選的實施方案中，將rhSOD封裝在脂質(zhì)體中。適當?shù)闹|(zhì)體rhSOD組合物描述于例如W096/14083中，并且可如W02002/036257中所述產(chǎn)生。
[0021]在優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體包含3種不同的脂質(zhì)。可按照本發(fā)明使用的(特別地用于藥物組合物的局部施用的)適當脂質(zhì)描述于例如Braun等人2006中。在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體包含膽固醇和1，2- 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)。在其它優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體中包含的第三脂質(zhì)選自1，2_ 二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-[磷-rac-(l-甘油)](鈉鹽)(DMPG)或1，2- 二棕櫚酰-磷脂酰甘油(DPPG)或卵磷脂酰甘油(EPG)或硬脂酰胺(SA)。在特別優(yōu)選的實施方案中，DPPC和膽固醇以7:2的摩爾比存在。在另一個優(yōu)選實施方案中，膽固醇和第三脂質(zhì)(DMPG、DPPG、EPG或硬脂酰胺)以2:1的比率存在。在一個實施方案中，脂質(zhì)體包含7:2:1的摩爾比的1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、膽固醇和1，2-二肉豆蘧?；?sn-甘油 _3-[磷-rac-(l-甘油)](鈉鹽)(DMPG)。[0022]在另一個優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體是單層的。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體具有小于500nm，或小于350nm，或小于300nm，優(yōu)選220±50nm，更優(yōu)選小于250nm的平均直徑。在更優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體具有200 ± IOnm的平均直徑。
[0023]在一個實施方案中，藥物組合物包含APN201。在一個實施方案中，藥物組合物為APN201。APN201是包含1.6mg/ml脂質(zhì)體rhSOD、lmg/ml對羥基苯甲酸甲酯、5mg/ml卡波姆981NF> 1.44mg/ml磷酸氫二鈉二水合物、0.2mg/ml氯化鉀、0.2mg/ml磷酸鉀(單堿)和8mg/ml氯化鈉的脂質(zhì)體rhSOD制劑。添加高質(zhì)量水至1ml。APN201的脂質(zhì)體包含7:2:1的摩爾比的1，2- 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、膽固醇和1，2- 二肉豆蘧?；?sn-甘油-3-[磷-rac- (1-甘油)](鈉鹽)(DMPG)，并且具有220 土 50nm的平均直徑。脂質(zhì)體rhSOD和產(chǎn)生方法也描述于W01996/14083和W02002/036257中。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可包含透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸(也稱為透明質(zhì)烷)可以以按藥物組合物的重量計0.1至1%的濃度存在于藥物組合物中。透明質(zhì)酸可具有250kDa至1000kDa,優(yōu)選250kDa至500kDa的分子量。在一個實施方案中，透明質(zhì)酸是非動物源穩(wěn)定性透明質(zhì)酸(NASHA)。在一個實施方
案中，NASHA是Synocrom&ff /或Durolane?。適當?shù)耐该髻|(zhì)烷凝膠描述于例如Brown
等人，J Invest Dermatol.1999Nov ; 113 (5): 740-6 中。
[0024]在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于經(jīng)腸施用，優(yōu)選口服施用，并且可以例如以包有腸溶衣的膠囊或片劑的形式施用。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于胃腸外施用例如靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下施用或用于直腸施用(例如作為栓劑)。
[0025]在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于局部施用并且可以以乳液、懸浮液、溶液、洗劑、軟膏或凝膠的形式施用，或使用噴霧裝置通過噴霧施用。
[0026]在本發(fā)明的一個實施方案中，通過從噴霧罐或噴霧瓶噴霧至受累皮膚區(qū)域上將藥物組合物以液體形式施用至皮膚區(qū)域。這避免了受累皮膚與手指或用于施用的另一輔助物的直接接觸，從而減少了額外感染的危險。
[0027]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含0.5-10mg rhS0D/ml藥物組合物，優(yōu)選
1.6 + 0.5mg/ml。
[0028]在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的一個實施方案中，rhSOD以按藥物組合物的重量計
0.01至5%的濃度存在。
[0029]取決于用途和施用方法，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物最優(yōu)選包含，按制備的即用的藥物組合物的重量計，≥0.01%，特別地0.05至5%的濃度的rhSOD。對于局部施用，可使用0.01至2mg rhS0D/cm2皮膚面積或身體表面積的量。在另一方面，口服或胃腸外施用有利地使用0.5至50mg rhS0D/kg體重的rhSOD劑量來進行，在治療過程中對于重復的SOD劑量，有利地將劑量調(diào)整至0.5至IOmg rhS0D/kg/天。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，尤其是當意欲用于局部施用時，還可包含至少一種低脂或無脂肪賦 形劑，優(yōu)選有機或無機水凝膠，和/或透明質(zhì)酸。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含至少一種聚丙烯酸或卡波姆例如卡波普，最優(yōu)選卡波姆981NF?？ú房梢砸园唇K制劑的重量計0.5-2%，優(yōu)選按重量計0.5%的濃度存在。
[0031]其它物質(zhì)例如水、緩沖劑、防腐劑和/或皮膚護理因子也可存在于根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中。優(yōu)選緩沖劑選自磷酸氫二鈉二水合物、氯化鉀、磷酸鉀(單堿)和氯化鈉。優(yōu)選防腐劑劑是對羥基苯甲酸甲酯。
[0032]在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含1.6mg/ml的脂質(zhì)體rhSOD、lmg/ml對羥基苯甲酸甲酯、5mg/ml卡波姆981NF、1.44mg/ml磷酸氫二鈉二水合物、0.2mg/ml氯化鉀、0.2mg/ml磷酸鉀(單堿)和8mg/ml氯化鈉。添加高質(zhì)量的水至1ml。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選每天施用1、2、3、4或5次。
[0034]在本發(fā)明的具體方面，在使用至少一種EGFR抑制劑的治療期之前、期間和/或之后施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在一個實施方案中，將使用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的治療期與EGFR抑制療法一起開始。在另一個實施方案中，在開始EGFR抑制療法之前開始使用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的治療期。在另一個實施方案中，在使用至少一種EGFR抑制劑的治療期期間施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在另一個優(yōu)選實施方案中，在使用至少一種EGFR抑制劑的治療期結束后，施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在一個實施方案中，在使用至少一種EGFR抑制劑的治療期終止后繼續(xù)使用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的治療。在最優(yōu)選的實施方案中，在使用至少一種EGFR抑制劑的治療期之前、期間和之后使用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0035]在一個實施方案中，EGFR抑制劑是可逆或不可逆EGR抑制劑。在一個實施方案中，EGFR抑制劑是酪氨酸激酶抑制劑(TKI)和/或抗-EGFR抗體。在一個實施方案中，TKI是通過終止配體誘導的受體自磷酸化而作用于EGFR的細胞內(nèi)結構域的低分子量分子。在一個實施方案中，抗-EGFR抗體是靶向EGFR的細胞外結構域的單克隆抗體。
[0036]在本發(fā)明的 優(yōu)選實施方案中，EGFR抑制劑是抗-EGFR抗體，包括但不限于，西妥昔
單抗(Erbitux?)和帕木單抗OTeetibix'?)、馬妥珠單抗(也稱為EMD72000)、奈昔木單抗和扎蘆木單抗。
[0037]在另一個優(yōu)選實施方案中，EGFR抑制劑是酪氨酸激酶抑制劑，特別是低分子量EGFR酪氨酸激酶抑制劑。此類低分子量EGFR酪氨酸激酶抑制劑包括例如厄洛替尼
(Tarceva?)，吉非替尼(Iressa⑧)、拉帕替尼(Tyverb?/Tykerb?)、卡紐替尼、
培利替尼(也稱為EKB-569)、Afatinib和凡德他尼。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療有此需要的受試者中由使用EGFR抑制劑的治療引起的一種或多種不利反應的包含rhSOD的藥物組合物。
[0038]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，EGFR抑制的不利反應是皮膚用藥毒性反應，即影響皮膚、指甲、粘膜或毛發(fā)的不利反應。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，EGFR抑制的不利反應是疹，尤其是痤瘡樣皮膚疹(ALSR)。痤瘡樣皮膚疹，如本文中使用的，包括異名例如痤瘡狀疹、痤瘡樣丘疹膿皰性疹、丘疹膿皰皮疹、痤瘡型皮疹、丘疹狀疹(pimple-likerash)、丘疫狀皮疫(pimple-like eruptions)和毛囊炎。ALSR開始為面部紅腫，隨后為主要在面部和上軀干上的丘疹(小結節(jié)性紅斑)和膿皰(小袋的膿液)。與真的痤瘡不同，膿皰是無菌的(它們不包含細菌)。因此，如本文中所用，術語ALSR還將包括ALSR的不同時期，例如面部紅腫、丘疹和膿皰。痤瘡樣皮膚疹的特征可在于，異常上皮細胞周轉、毛囊閉鎖、毛囊破裂、基底角質(zhì)形成細胞的過早分化、基底角質(zhì)形成細胞的生長停止、角質(zhì)形成細胞的一種或多種炎癥性介體的釋放(例如細胞因子和/或趨化因子)、角質(zhì)形成細胞的細胞凋亡以及被破壞的表皮屏障功能，或可與上述相關。痤瘡樣皮膚疹可按照CommonToxicity Criteria Common or Terminology Criteria of Adverse Events (CTCAE),例如 Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) 3.0 版，DCTD, NCI, NIH, DHHS, 2003-3-31(2006-8-9 公布)(http://ctep.cancer, gov/protocoldevelopmentelectronic_applications/docs/ctcaev3.pdf)> National Cancer Institute(NCI)的CTC (例如 NCI CTC 標準 2.0、3.0 或 4.0 版)、世界衛(wèi)生組織(WHO)的 CTC、South WestOncology Group (SffOG)的 CTC 或由 Skin Toxicity Study Group of the MultinationalAssociation of Supportive Care in Cancer 開發(fā)的 MASCC EGFR Inhibitor SkinToxicity Tool (MESTT)(www.mascc.0rg)(也參見 Supportive Care in Cancer,第 19卷，Number8, 1079-1095，DO1: 10.1007/s00520-011-1197-6)來進行分級。
[0039]在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的EGFR抑制劑的不利反應是不利反應，例如根據(jù)上述CTC或CTCAE (例如，根據(jù)NCI的CTC)的1、2和/或3級的痤瘡樣皮疹。在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的EGFR抑制劑的不利反應是不利反應，例如根據(jù)上述CTC或CTCAE (例如，根據(jù)NCI的CTC)的2和/或3級的痤瘡樣皮診。在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的EGFR抑制劑的不利反應是不利反應，例如根據(jù)上述CTC或CTCAE (例如，根據(jù)NCI的CTC)的2級的痤瘡樣皮診。在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的EGFR抑制劑的不利反應是不利反應，例如根據(jù)上述CTC或CTCAE (例如，根據(jù)NCI的CTC)的3級的痤瘡樣皮診。
[0040]在一個實 施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的一種或多種不利反應的特征在于，表皮和/或真皮的細胞中的造血細胞(例如CD45陽性細胞)的增加。在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的一種或多種不利反應的特征在于，角質(zhì)形成細胞中誘集嗜中性粒細胞的趨化因子(例如CCL2和/或CCL5)的升高的表達水平。在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的一種或多種不利反應的特征在于，表皮和/或真皮的細胞中的特定亞組的⑶45陽性造血細胞，即⑶llb+Gr-Ι高的細胞(嗜中性粒細胞)的升高的水平。在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的一種或多種不利反應的特征在于，記憶T細胞(例如CD44陽性細胞)的減少。在一個實施方案中，待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的一種或多種不利反應的特征在于，TCRy 3-0036高的細胞和/或1'0?￥ S-CD3e低的細胞的減少。
[0041]待根據(jù)本發(fā)明預防或治療的其它優(yōu)選不利反應包括但不限于，甲溝炎、龜裂、色素沉著過多、色素沉著不足、干燥病(干性皮膚)、瘙癢癥、脫皮、粘膜炎、口炎、過敏性反應、脫發(fā)、睫毛粗長癥、多毛癥、手足皮膚反應(異名:手-足綜合征、肢端紅斑、掌跖紅斑、手-足綜合征、Burgdorf反應、掌跖紅腫疼痛、掌跖感覺遲鈍、掌跖紅皮病、掌和跖的中毒性紅斑)、延遲的毛發(fā)生長、彌漫性脫發(fā)和/或毛發(fā)結構的改變，例如脆性(關于此類皮膚用藥不利事件的進一步描述，參見例如Cancer Management:第14版；Dermatologic AdverseEvents Associated With Targeted Therapies ；Mario E.Lacouturej December2011 ；Munk和El-Helou2012，Dermatology Rounds第7卷，Issue3，Targeted Molecular Therapies -What are the Associated Cutaneous Risks ^BSaif MW 等人 2010，Journal of thePancreasll(2):176-182)。
[0042]本發(fā)明進一步通過下列實施例和附圖來舉例說明，但不限于下列實施例和附圖。
[0043]附圖[0044]圖1顯示出生后第2天(P2 ；A)、PlO (B)和P20 (C)的EGFRdEP突變體(以星號標示)和對照同窩出生仔畜的表型。圖1D和E顯示EGFRdEP_EK小鼠逐漸脫發(fā)，并在處理開始后2_4周內(nèi)發(fā)展炎癥。
[0045] 圖2顯示EGFRtffip小鼠的皮膚的炎癥性浸潤。通過流式細胞術對浸潤入表皮(A)和真皮(B)的造血細胞的數(shù)目的定量分析顯示，EGFR突變體皮膚的炎癥性細胞的大量浸潤。造血細胞使用抗小鼠⑶45抗體來進行染色；n = 3。
[0046]圖3顯示EGFRdEP角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生誘集嗜中性粒細胞的趨化因子。定量實時PCR分析顯示，升高水平的CCL-2和CCL-5，然而GM-CSF的產(chǎn)量在來自EGFRdEP的培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞中略微減少(相較于同窩出生仔畜對照小鼠)；n = 3。
[0047]圖4顯示嗜中性粒細胞浸潤入真皮。描述了 3-4月齡的EGFRdEP小鼠的真皮浸潤的分析(與同窩出生仔畜對照相相較)，所述分析顯示增加的CDllb+Gr-1high嗜中性粒細胞的數(shù)目；n = 3。
[0048]圖5顯示EGFRdEP_EK敲除小鼠中Y _ δ T-細胞U δ -T-細胞)的表皮亞群的改變的活化的一個代表性實例；η = 2。
[0049]圖6顯示EGFRdEP_EK敲除相較于同窩出生仔畜對照的Y δ-T-細胞-⑶3e高和低表達細胞中的CD44表面標志的減少的表達的一個代表性實例。顯示了相對于安慰劑(藍線/條塊)，APN201 (脂質(zhì)體rhSOD)(紅線/條塊)處理對EGFRdEP_EK中的⑶44表面表達的恢復效應；n = 2。
[0050]圖7顯示兩個小鼠模型中rhSOD對皮膚的郎格漢斯細胞(真皮和表皮的細胞提取物)的效應。小鼠用APN201處理16天，η = 3 (除兩個EGFRdEP組外，其中η為I (對于安慰劑處理)和2 (對于SOD處理))。EGFRdEP_EK小鼠已如上所述用TX處理8周，隨后開始APN201處理。兩種安慰劑處理的敲除模型顯示，皮膚中升高的郎格漢斯細胞的水平，然而SOD處理的敲除顯示，顯著更低的水平，與EGFR野生型小鼠中的狀況相似。
實施例
[0051 ] 實施例1:小鼠動物模型
[0052]如中Natarajan等人2007所述產(chǎn)生攜帶兩側連接1xP (f1xed)的EGFR的等位基因的小鼠。這些小鼠允許通過將它們培育成以組織特異性的方式表達Cre重組酶的轉基因小鼠來在任何給定的細胞類型中缺失EGFR，所述Cre重組酶識別和重組兩側連接1xP的DNA序列。對于EGFR的表皮特異性缺失，使用兩個轉基因品系。在K5_Cre轉基因品系(Tarutani等人，1997)中，Cre重組酶從胚胎期E14.5在復層上皮(如在皮膚或食管中)的基底細胞中是有活性的。因此，EGFR在出生時在皮膚中已被敲除。為了能夠在幼小或成年小鼠中敲除EGFR，可使用K5-CreER小鼠(Metzger和Chambon, 2001)。在這些小鼠中，將Cre重組酶融合于突變的雌激素受體(ER)，這防止Cre重組酶穿梭進入細胞核，除非雌激素類似物4-OH他莫昔芬結合ER。因此，可在全身性他莫昔芬處理后在幼小或成年小鼠中誘導EGFR的不存在。為了引發(fā)，腹膜內(nèi)(1.p.)注射Img他莫昔芬/25g體重(Sigma ;IOmg/ml的向日葵籽油/乙醇混合物(10:1))，進行連續(xù)5天，外加每周期(I周期=I周)之間間隔2天。為了在所述引發(fā)后維持敲除角質(zhì)形成細胞，每周1.p.注射Img他莫昔芬/25g體重2次。在分析未處理的小鼠之前或在起始APN201處理之前，小鼠已用他莫昔芬處理至少8周。
[0053]對于腸上皮中的EGFR的條件缺失，可通過將EGFR f 1xed小鼠分別培育成Vil-Cre和Vil-CreERCreER轉基因小鼠來應用這兩種方法(組成型和誘導型缺失)(elMarjou等人，2004 ；Madison等人，2002)。對于Vil-Cre/CreER小鼠，可在小腸和大腸的所有隱窩細胞和絨毛上皮細胞中缺失EGFR。
[0054]特異性地在皮膚或腸中缺乏EGFR的小鼠是研究EGFR在各自組織中的功能的通用工具。在這些組織中缺乏EGFR的小鼠與用EGFR抑制劑全身性治療的癌癥患者的癥狀的驚人重疊一方面使得這些小鼠成為研究由EGFR抑制劑誘導的表型背后的機制的理想工具，另一方面它們提供了用于測試目的在于減少抑制劑治療的副作用的化合物的理想工具。
[0055]實施例2:在表皮和腸中缺乏EGFR的小鼠的產(chǎn)生和表征
[0056]EGFR突變小鼠顯示各種上皮缺陷，不能產(chǎn)生毛表皮并且生命的前幾周內(nèi)死亡。此外，對于K5-Cre轉基因品系(Tarutani等人，1997)，在復層上皮中特異性缺乏EGFR的條件敲除小鼠(EGFRtffip小鼠)產(chǎn)生了與EGFR+小鼠相似的表型。EGFRdEP突變體出生時眼睛張開，不能產(chǎn)生毛表皮并且僅少數(shù)小鼠在出生后存活超過I個月(圖1A-C)。前4周存活的這些小鼠可生長至6月齡，并且是無毛發(fā)的，顯示肉眼可見和用顯微鏡可見的皮膚炎癥體征。此外，到4周 齡時，這些小鼠顯著小于對照。關于進一步的方法描述，例如真皮和上皮細胞懸浮物的分離和流式細胞術分析，參見實施例4和Holcmann M, Stoitner P等人；JImmunol.2009Jull5 ；183(2):1133-43。
[0057]已通過將EGFRfim小鼠培育成可誘導的K5_CreER轉基因小鼠(Metzger和Chambon, 2001)來產(chǎn)生其中可在全身性或局部施用雌激素類似物他莫昔芬(TX)后誘導EGFR的缺失的小鼠。因此，能夠在任何期望的給定的時間點上，例如在幼小或成年小鼠中從表皮缺失EGFR。EGFRdEP-ER小鼠失去毛發(fā)(與EGFRtffip小鼠相當)，顯示皮膚炎癥，但未顯示過早死亡(圖1D和E)。
[0058]在表皮中缺乏EGFR的小鼠產(chǎn)生與在使用EGFR抑制劑治療的癌癥患者中觀察到的皮膚炎癥相似的皮膚炎癥。皮膚樣品的分析顯示，炎癥細胞在EGFR突變皮膚中的大量浸潤(圖2)。浸潤性造血細胞的總體百分比在EGFRdEP小鼠的表皮(圖2A)和真皮(圖2B)中增加幾乎3倍。
[0059]先前已報導，用EGFR抑制劑處理的人角質(zhì)形成細胞上調(diào)趨化因子CCL2/MCP-1和CCL5/RANTES,而 GM-CSF 被下調(diào)(Mascia 等人，2010 ；Mascia 等人，2003)。在 EGFRdEP 小鼠的角質(zhì)形成細胞中，我們也發(fā)現(xiàn)，升高的水平的CCL-2和CCL-5，而GM-CSF的產(chǎn)量略微減少(圖3)，這表明小鼠表型模擬在EGFR抑制劑處理的人樣品中觀察到的狀況。
[0060]CCL-2和CCL-5是負責誘集嗜中性粒細胞和T細胞的趨化因子。我們隨后研究，我們是否可在EGFRtffip小鼠的皮膚浸潤中檢測到這些細胞。與用EGFR抑制劑治療的患者的受累皮膚中描述的嗜中性粒細胞依賴性毛囊炎類似，我們發(fā)現(xiàn)，除了 DC以外，增加數(shù)目的⑶llb+Gr-Ι高的嗜中性粒細胞和T細胞浸潤入真皮，而巨噬細胞的數(shù)目不受影響(圖4，且另外的數(shù)據(jù)未顯示)。
[0061]由于與在EGFR抑制劑治療后發(fā)生的人皮膚病理狀況高度重疊，因此EGFRdEP、EGFRdEP_EK小鼠反映了嚴重的不利藥物事件“痤瘡樣皮膚疹(ALSR) ” (其在人癌癥患者中在
用Tarceva? (厄洛替尼)、Erbitux? (西妥昔單抗)、Vectibix? (帕木單抗)或其它EGFR抑制劑治療后被描述)，從而代表了用于研究SOD處理對由EGFR信號轉導的缺乏引起的炎癥表型的作用的有價值的工具。
[0062]上述TX可誘導的K5_CreER轉基因小鼠已用于在表皮中特異性消除EGFR。如上所述，該小鼠模型在EGFR缺失后發(fā)生皮膚炎癥，并且反映了接受EGFR抑制劑的人癌癥患者中的嚴重不利的藥物事件“痤瘡樣皮膚疹(ALSR) ”。該小鼠模型已用于測試脂質(zhì)體包裝的rhSOD (APN201)的水凝膠制劑的抗炎潛能。
[0063]實施例3: SOD在組織特異性EGFR敲除小鼠模型中的作用
[0064]小鼠已按照表1中給定的處理方案用APN201 (脂質(zhì)體rhSOD)和安慰劑(媒介物對照)進行了局部處理，并且已研究了對炎癥表型的影響。在處理期結束時，處死小鼠，對新鮮分離的皮膚組織材料進行FACS分析，所述皮膚組織材料已針對T淋巴細胞和嗜中性粒細胞的細胞表面標志物的表達進行了染色。
[0065]表1:
[0066]
【權利要求】
1.包含重組人超氧化物歧化酶(rhSOD)的藥物組合物，其用于預防或治療受試者中由使用EGFR抑制劑的治療引起的一種或多種不利反應。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述rhSOD為重組人Cu/Zn-SOD。
3.前述權利要求的任一項的藥物組合物,其中所述rhSOD為重組人SODl。
4.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述rhSOD被封裝在脂質(zhì)體中。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述脂質(zhì)體為單層脂質(zhì)體。
6.權利要求4或5的任一項的藥物組合物,其中所述脂質(zhì)體具有小于500nm,或小于350nm，或小于300或小于250nm的平均直徑。
7.權利要求6的藥物組合物，其中所述脂質(zhì)體具有220±50nm或200±10nm的平均直徑。
8.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物為APN201。
9.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述組合物用于全身性施用。
10.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述組合物用于口服施用。
11.權利要求1至8的任一項的藥物組合物，其中所述組合物用于局部施用。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所述組合物以乳液、懸浮液、溶液、洗劑、軟膏或凝膠的形式施用，或通過使用噴霧裝置進行噴霧來施用。
13.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述rhSOD以按藥物組合物的重量計0.01至5%的濃度存在。
14.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含0.5-10mg rhSOD/g藥物組合物。
15.前述權利要求的任一項的藥物組合物,其中所述藥物組合物包含1.6±0.5mg/g的rhS0D/g藥物組合物。
16.前述權利要求的任一項的藥物組合物,其中所述rhSOD以0.01至2mg rhSOD/cm2皮膚面積或身體表面的濃度用于局部施用，或以0.5-50mg rhS0D/kg體重的濃度用于口服施用。
17.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中藥物組合物還包含至少一種低脂或無脂肪賦形劑。
18.權利要求16的藥物組合物，其中所述賦形劑為有機或無機水凝膠，和/或透明質(zhì)酸。
19.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物每天施用1、2、3、4或5次。
20.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中在使用至少一種EGFR抑制劑的治療期之前、期間和/或之后施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。
21.前述權述權利要求的任一項的藥物組合物，其中所述EGFR抑制劑為抗-EGFR抗體或EGFR酪氨酸激酶抑制劑。
22.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中EGFR抑制的不利反應選自痤瘡樣皮膚疹、甲溝炎、龜裂、色素沉著過多、色素沉著不足、干燥病(干性皮膚)、粘膜炎、口炎、過敏性反應、脫發(fā)、睫毛粗長癥、多毛癥和/或毛發(fā)結構的改變。
23.前述權利要求的任一項的藥物組合物，其中EGFR抑制的不利反應為痤瘡樣皮膚疹。
【文檔編號】A61K38/44GK103974717SQ201280060097
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2012年12月6日 優(yōu)先權日:2011年12月6日
【發(fā)明者】H·盧比內(nèi)爾, H·施尼達 申請人:阿派隆生物制劑股份公司