用于從蛋白質(zhì)溶液中除去病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于從包括一種靶蛋白的溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，從而將丙酮用作沉淀病毒和/或病毒DNA以及該靶蛋白的沉淀劑。
【專利說明】用于從蛋白質(zhì)溶液中除去病毒的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于純化蛋白質(zhì)的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]分離自動物來源的蛋白質(zhì)當(dāng)例如在食品或藥物產(chǎn)品中使用這些蛋白質(zhì)時易于被不需要的病毒顆粒和/或病毒DNA污染。已知用于純化此類蛋白質(zhì)還將降低病毒顆粒和/或病毒DNA的水平的方法，例如層析、過濾、離心、提取或沉淀。然而，在一些情況下，純化一種感興趣的蛋白質(zhì)是困難的、耗時的和/或昂貴的。所以，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于從感興趣的蛋白質(zhì)中除去任何受污染的病毒顆粒和/或病毒DNA的方法。此類方法在工業(yè)規(guī)模中應(yīng)該是快速的、有用的、廉價且有效的。
[0004]胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是一種發(fā)現(xiàn)于許多脊椎動物的消化系統(tǒng)內(nèi)并在其中水解蛋白質(zhì)的絲氨酸蛋白酶。胰蛋白酶在哺乳動物的胰臟中以高數(shù)量可獲得，并且例如豬胰蛋白酶和牛胰蛋白酶可以相當(dāng)容易地純化。因此，胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種生物技術(shù)工藝中。另外，將胰蛋白酶用于嬰兒食品中以預(yù)消化蛋白質(zhì)。
[0005]2型豬環(huán)狀病毒(PCV2)是一種在真核細(xì)胞中自主復(fù)制的小的無包膜病毒。它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病原，該綜合征是一種在豬中新出現(xiàn)的且多因素的疾病。
[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于從提取自豬胰腺的胰蛋白酶中除去PCV2病毒顆粒和/或病毒DNA的方法。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明提供了一種用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括:
[0009]a)將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至該溶液中，
[0010]b)進(jìn)行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分開，
[0011]c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達(dá)到沉淀該靶蛋白的終濃度，并且
[0012]d)從該溶液中收集沉淀的靶蛋白。
[0013]發(fā)明詳細(xì)說明
[0014]本發(fā)明提供了一種用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括:
[0015]a)將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至該溶液中，
[0016]b)進(jìn)行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分開，
[0017]c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達(dá)到沉淀該靶蛋白的終濃度，并且
[0018]d)從該溶液中收集沉淀的靶蛋白。
[0019]為避免任何可能的疑問:以書面順序進(jìn)行這些步驟。即，在步驟b)中進(jìn)行分離，以將步驟a)的沉淀材料與包括該靶蛋白的溶液分開。在步驟c)中，向在步驟b)中獲得的溶液中添加另外量的丙酮。并且在步驟d)中，從該溶液中收集步驟c)的沉淀的靶蛋白。
[0020]該靶蛋白可以是任何蛋白質(zhì)。它可以是一種分離自微生物，例如分離自細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)。它可以是一種分離自植物的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，它是一種分離自動物來源的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)可能易于被例如源自表達(dá)了該蛋白質(zhì)的來源生物的病毒顆粒和/或病毒DNA污染。
[0021]可以從一種哺乳動物來源獲得該靶蛋白。它可以獲得自哺乳動物組織，例如獲得自哺乳動物腺體。在一個優(yōu)選實施例中，該靶蛋白獲得自?；蜇i胰臟。在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白獲得自豬胰臟。
[0022]該靶蛋白可以是一種酶，優(yōu)選是一種活性酶或可以被再活化的酶。
[0023]可以獲得自哺乳動物胰臟(例如獲得自豬胰臟)的酶類包括但不限于:蛋白酶，包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶B、胰肽酶E、羧肽酶A以及羧肽酶B;脂肪酶，包括但不限于甘油酯水解酶(脂肪酶)、磷脂酶Al、磷脂酶A2以及留醇酯水解酶；核酸酶，包括但不限于核糖核酸酶以及脫氧核糖核酸酶；淀粉酶，包括但不限于α-淀粉酶。
[0024]在一個優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是一種蛋白酶，優(yōu)選是一種獲得自哺乳動物來源的蛋白酶，例如獲得自胰臟，優(yōu)選獲得自?；蜇i胰臟，更優(yōu)選獲得自豬胰臟。
[0025]在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，優(yōu)選獲得自胰臟的胰蛋白酶，更優(yōu)選獲得自牛或豬胰臟的胰蛋白酶，甚至更優(yōu)選獲得自豬胰臟的胰蛋白酶。
[0026]包括該靶蛋白的水溶液優(yōu)選地具有一個低的導(dǎo)電性，例如低于3mS或低于ImS。這可以例如通過滲濾獲得，例如使用具有10，OOODa的截留的膜。包括該靶蛋白的水溶液優(yōu)選具有約2-5，例如約3-4，優(yōu)選約3.1-3.9，如約3.5的pH。
[0027]該水溶液的 干物質(zhì)濃度可以是約8% -20%，例如約8% -15%，如約10%。
[0028]在本發(fā)明的方法中，從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA。該病毒可以是病毒顆粒。即，在一個優(yōu)選實施例中，該方法用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒顆粒和/或病毒DNA。在一個更優(yōu)選實施例中，該方法用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒DNA。
[0029]該病毒可以是一種傳染性病毒，例如一種發(fā)現(xiàn)于豬來源的傳染性病毒。
[0030]該病毒可以是一種DNA病毒,例如單鏈DNA病毒,如一種具有單鏈DNA和環(huán)狀DNA的病毒。該病毒可以是一種RNA病毒。
[0031]該病毒可以是一種無包膜病毒，例如一種小的無包膜病毒。它可以是一種無包膜DNA病毒或無包膜RNA病毒。
[0032]該病毒可以是一種在真核細(xì)胞中自主復(fù)制的病毒。
[0033]在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是一種無包膜DNA病毒,例如一種小的無包膜DNA病毒。
[0034]該病毒可以選自下組，該組由以下各項組成:PCV2(豬環(huán)狀病毒2)、PCV1(豬環(huán)狀病毒I)、PPV (豬細(xì)小病毒)、EMCV (豬腦心肌炎病毒)、HEV (豬戊型肝炎病毒)以及SVDV (豬水皰病病毒)。在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是PCV2。
[0035]在本發(fā)明的方法的步驟a)中，將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至包括該靶蛋白的溶液中。它可以是包括沉淀的病毒DNA或與其相關(guān)的病毒顆粒。和/或它可以本身是病毒DNA，例如沉淀的游離病毒DNA。
[0036]選擇性沉淀意指大部分的病毒和/或病毒DNA(即多于50% )被沉淀，同時少于50%的靶蛋白被沉淀。[0037]優(yōu)選地，在步驟a)中，至少60%，例如至少70%、至少80%或至少90%的病毒DNA被沉淀。更優(yōu)選地,在步驟a)中，至少95%，例如至少99%或至少99.9%的病毒DNA被沉淀。
[0038]優(yōu)選地，在步驟a)中，少于40%，例如少于30%的靶蛋白被沉淀。更優(yōu)選地，在步驟a)中，少于25 %，例如少于20 %、少于10 %或少于5 %的靶蛋白被沉淀。
[0039]本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何確定有待在步驟a)中使用的丙酮的濃度。在一個優(yōu)選實施例中，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v)，優(yōu)選是約12%-30% (v/V)，更優(yōu)選是約14%-30% (v/v)，甚至更優(yōu)選是約15%-20% (v/v)。在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶并且在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v)，優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約 14%-30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約 15%-20% (v/v)。在一個甚至更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，該病毒是PCV2并且在步驟a)中的丙酮的濃度是約12% -40% (v/v),優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約14% -30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約15% -20% (v/v)。
[0040]優(yōu)選地，在低于15°C的溫度下進(jìn)行步驟a)中的選擇性沉淀。
[0041]在本發(fā)明的方法中的步驟b)是一個分離步驟，其中將已經(jīng)在步驟a)中沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分離。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行這樣的分離。分離可以包括過濾和/或離心。在一個優(yōu)選實施例中，在步驟b)中的分離包括深層過濾。
[0042]優(yōu)選地，在步驟b)中，至少50%，例如至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的病毒DNA被分離。更優(yōu)選地，在步驟b)中，至少95%，例如至少99%或至少99.9%的病毒DNA被分離。
[0043]在一個優(yōu)選實施例中，在步驟b)中分離出沉淀的材料以后，在包括該靶蛋白的溶液中檢測不到病毒DNA。
[0044]優(yōu)選地，在步驟b)中，少于40%，例如少于30%的靶蛋白被分離。更優(yōu)選地，在步驟b)中，少于25%，例如少于20%、少于10%或少于5%的靶蛋白被分離。
[0045]優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于60%，例如多于70%的靶蛋白。更優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于75%，例如多于80%、多于90%或多于95%的靶蛋白。
[0046]優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于60%，例如多于70%的處于其活性形式的靶蛋白。更優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于75%，例如多于80%、多于90%或多于95%的處于其活性形式的靶蛋白。
[0047]在步驟b)后,可以將該濾液的pH調(diào)至例如約pH4_5,如約pH4.5?？梢允褂萌魏螇A，優(yōu)選是一種弱堿，例如氨水。
[0048]在本發(fā)明的方法的步驟c)中，向包括該靶蛋白的溶液中添加另外量的丙酮。添加丙酮，以達(dá)到沉淀該靶蛋白的終濃度。
[0049]優(yōu)選地，在步驟c)中，存在于步驟b)后的溶液中的多于60%，例如多于70%或多于80%的靶蛋白被沉淀。更優(yōu)選地，在步驟c)中，存在于步驟b)后的溶液中的多于90%，例如多于95 %、多于98 %或多于99 %的靶蛋白被沉淀。
[0050]本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何確定有待在步驟c)中使用的丙酮的濃度。在一個優(yōu)選實施例中，在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是60%-70% (v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。在另一個優(yōu)選實施例中，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/V)，優(yōu)選是約12 % -30 % (v/V),更優(yōu)選是約14-30 % (v/v),甚至更優(yōu)選是約15 % -20 % (v/V)，并且在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是60%-70% (v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12% -40% (v/v),優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約14% -30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約15%-20% (v/v)，并且在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是60%-70%(v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。在一個甚至更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，該病毒是PCV2，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v)，優(yōu)選是約12%-30% (v/v)，更優(yōu)選是約14%-30% (v/v)，甚至更優(yōu)選是約15%-20% (v/v)，并且在步驟c)中的丙酮的終濃度是45% -95%,優(yōu)選是60% -70% (v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。
[0051]優(yōu)選地，在低于15°C的溫度下進(jìn)行步驟c)。
[0052]在本發(fā)明的方法的步驟d)中，從該溶液中收集沉淀的靶蛋白?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行沉淀的靶蛋白的這樣的收集。沉淀的靶蛋白的收集可以包括過濾和/或離心。
[0053]在收集以后，可以將該靶蛋白洗滌、干燥、研磨和/或標(biāo)準(zhǔn)化。
[0054]在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及一種用于從豬胰蛋白酶的制劑(優(yōu)選是豬胰腺胰蛋白酶)中選擇性地除去PCV2病毒和/或PCV2病毒DNA的方法，所述方法包括: [0055]a)向包括該胰蛋白酶的水溶液中添加丙酮，以達(dá)到12% -30% (v/v)的丙酮濃度，
[0056]b)進(jìn)行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括胰蛋白酶的溶液分開，
[0057]c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達(dá)到45% -95% (v/v)，優(yōu)選是60% -70%(v/v)的終濃度，并且
[0058]d)從該溶液中收集沉淀的胰蛋白酶。
[0059]優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法將至少50 %，例如至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %的病毒DNA與該靶蛋白分開。更優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法將至少95%，例如至少99%或至少99.9%的病毒DNA與該祀蛋白分開。
[0060]優(yōu)選地，與以相同方式純化但是未使用本方法的步驟a)和b)的靶蛋白相比，通過本發(fā)明的方法純化的靶蛋白包括少于50%病毒DNA。更優(yōu)選地，與以相同方式純化但是未使用本方法的步驟a)和b)的靶蛋白相比，通過本發(fā)明的方法純化的靶蛋白包括少于40%，例如少于30%、少于20%或少于10%病毒DNA。甚至更優(yōu)選地，與以相同方式純化但是未使用本方法的步驟a)和b)的靶蛋白相比，通過本發(fā)明的方法純化的靶蛋白包括少于5%，例如少于I %、少于0.5%或少于0.1 %病毒DNA。
[0061]在一個優(yōu)選實施例中，在步驟d)中收集的沉淀的靶蛋白不包括可檢測的病毒DNA。
[0062]可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法檢測或量化病毒DNA?？梢允褂脤崟rPCR。
[0063]可以使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中的DNA提取來提取DNA?？梢允褂每缮藤彽腄NA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后可以使用實時PCR檢測病毒DNA的存在。
[0064]在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是PCV2并且使用可商購的PCV2檢測試劑盒進(jìn)行實時 PCR。
[0065]通過實時PCR量化DNA的一般原理依賴于在對數(shù)尺度上相對于循環(huán)數(shù)目繪制的熒光。將用于檢測基于DNA的熒光的閾值設(shè)置地稍微高于背景并且將循環(huán)閾值(Ct)定義為熒光信號超過該閾值(即超過背景水平)所需的循環(huán)數(shù)目。在指數(shù)式擴(kuò)增階段過程中，DNA靶標(biāo)的序列每個循環(huán)都加倍。例如,其Ct領(lǐng)先于另一個樣品的Ct3個循環(huán)的DNA樣品包含23 = 8倍多的模板。
[0066]在一個實施例中，當(dāng)在經(jīng)歷40個擴(kuò)增循環(huán)并且使用特異性針對該相關(guān)病毒DNA的引物的實時PCR測定中進(jìn)行分析時，可以在提取自步驟d)中收集的沉淀的靶蛋白的總DNA中檢測到的病毒DNA的量導(dǎo)致至少38，優(yōu)選是至少39，更優(yōu)選是40的Ct值。
[0067]Ct值為40意指在40個擴(kuò)增循環(huán)后，未超過用于檢測基于DNA的熒光的閾值，即從未檢測到信號。此外，稍微低于40的Ct值非?？赡苁羌訇栃缘牟⑶乙虼瞬坏扔诓《綝NA的檢測。
[0068]在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是PCV2，并且當(dāng)在經(jīng)歷40個擴(kuò)增循環(huán)并且使用特異性針對PCV2 DNA的引物的實時PCR測定中進(jìn)行分析時，可以在提取自步驟d)中收集的沉淀的靶蛋白的總DNA中檢測到的PCV2 DNA的量導(dǎo)致至少38，優(yōu)選是至少39，更優(yōu)選是40的Ct值。
[0069]實例
[0070]實例I
[0071]來源:通過水性提取豬胰腺得到PCV2陽性胰蛋白酶批次。
[0072] 將該胰蛋白酶批次溶解于冷的自來水中，至11%溶液。通過添加鹽酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至3.5。添加丙酮至20% v/v的終濃度，隨后添加1%助濾劑(Kieselguhr HyfloSuper Cel? )。在添加丙酮和助濾劑下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細(xì)菌濾板(SeitzEKS)的壓濾機(jī)上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質(zhì)。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調(diào)節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現(xiàn)沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機(jī)上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機(jī)中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0073]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進(jìn)行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現(xiàn)干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陰性。
[0074]實例2
[0075]來源:通過水性提取豬胰腺得到PCV2陽性液體胰蛋白酶批次。添加助濾劑(Kieselguhr Hyflo Super Cel? )并且在具有Seitz HS9000濾板的壓濾機(jī)上進(jìn)行過濾。滲濾該濾液(使用具有10，OOODa的截留的膜)，直到導(dǎo)電性低于lmS。將濃度調(diào)節(jié)至10%干物質(zhì)并且用鹽酸將PH調(diào)節(jié)至3.5。將該批次分為2個相等的部分。
[0076]a)添加丙酮至15 % v/v的終濃度，隨后添加I %助濾劑(KieselguhrHyfloSuper Cel? )。在添加丙酮和助濾劑下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細(xì)菌濾板(SeitzEKS)的壓濾機(jī)上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質(zhì)。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將pH調(diào)節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現(xiàn)沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機(jī)上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機(jī)中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0077]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進(jìn)行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現(xiàn)干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陰性(Ct:40)。
[0078]b)向該溶液中添加I %助濾劑(KieselguhrHyfloSuper Cel.?)。在添加助濾劑
下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細(xì)菌濾板(Seitz EKS)的壓濾機(jī)上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質(zhì)。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調(diào)節(jié)至
4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現(xiàn)沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機(jī)上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機(jī)中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0079]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進(jìn)行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現(xiàn)干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陽性(Ct:36)。
[0080]實例3
[0081]來源:通過水性提取豬胰腺得到PCV2陽性液體胰蛋白酶批次。添加助濾劑(Kieselguhr Hyflo Super CeiK )并且在具有Seitz HS9000濾板的壓濾機(jī)上進(jìn)行過濾。滲濾該濾液(使用具有10，OOODa的截留的膜)，直到導(dǎo)電性低于lmS。將濃度調(diào)節(jié)至10%干物質(zhì)并且用鹽酸將PH調(diào)節(jié)至3.5。將該批次分為2個相等的部分。
[0082]a)添加丙酮至10 % v/v的終濃度，隨后添加I %助濾劑(KieselguhrHyfloSuper Cel? ) ?在添加丙酮和助濾劑下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細(xì)菌濾板(SeitzEKS)的壓濾機(jī)上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質(zhì)。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調(diào)節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現(xiàn)沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機(jī)上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機(jī)中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0083]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進(jìn)行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現(xiàn)干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陽性(Ct:35)。
[0084]b)向該溶液中添加1%助濾劑(KieselguhrHyflo Super Cel? )。在添加助濾劑
下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細(xì)菌濾板(Seitz EKS)的壓濾機(jī)上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質(zhì)。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調(diào)節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現(xiàn)沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機(jī)上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機(jī)中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0085]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進(jìn)行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存 在。發(fā)現(xiàn)干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陽性(Ct:36)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于從包括一種靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括: a)將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至該溶液中， b)進(jìn)行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分開， c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達(dá)到沉淀該靶蛋白的終濃度，并且 d)從該溶液中收集該沉淀的靶蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v),優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約14% -30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約15% -20% (v/V)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟a)中的丙酮的濃度是約15%(v/v) ο
4.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是 60%-70% (v/v)，更優(yōu)選是約 66% (v/v)。
5.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該靶蛋白獲得自一種哺乳動物來源。
6.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該靶蛋白是胰蛋白酶。
7.如以上權(quán)利要 求中任一項所述的方法，其中在低于15°C的溫度下進(jìn)行步驟a)中的選擇性沉淀。
8.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中的分離包括過濾和/或離心。
9.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中的分離包括深層過濾。
10.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟d)包括過濾和/或離心。
11.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該病毒是一種無包膜病毒。
12.如以上權(quán)利要求所述的方法，其中該病毒是PCV2。
13.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中，少于25%的靶蛋白被分離。
14.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中，至少50%，優(yōu)選至少90%的病毒DNA被分離。
15.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，該方法是一種用于從包括一種靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒DNA的方法。
【文檔編號】A61L2/00GK104023752SQ201280061308
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月20日
【發(fā)明者】P·約翰森, C·J·克普卡 申請人:諾維信公司