用于靶向遞送(包括負(fù)載物的透皮遞送)的多孔納米顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(原始細(xì)胞)及其方法【專利摘要】本發(fā)明涉及特異性靶向肝細(xì)胞和其它癌細(xì)胞的原始細(xì)胞，其包含：1)具有受支撐的脂質(zhì)雙層的納米多孔二氧化硅核、至少一種促進癌細(xì)胞死亡的藥劑(例如傳統(tǒng)小分子、大分子負(fù)載物(例如，siRNA或蛋白質(zhì)毒素，如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈)，和/或在納米多孔二氧化硅核中處理的(優(yōu)選超螺旋的以更有效地將DNA封裝入原始細(xì)胞)的組蛋白封裝的質(zhì)粒DNA，所述納米多孔二氧化硅核任選地經(jīng)核定位序列修飾以有助于在癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)定位原始細(xì)胞和表達以下肽的能力：涉及癌細(xì)胞治療(細(xì)胞凋亡/細(xì)胞死亡)的肽，或作為報告子，一種靶向待治療組織中的癌細(xì)胞從而使得原始細(xì)胞和靶細(xì)胞的結(jié)合是特異性的和增強的靶向肽和一種促進原始細(xì)胞和包封的負(fù)載物(包括DNA)的內(nèi)體逃逸的融合肽)。本發(fā)明的原始細(xì)胞可用于治療癌癥，尤其包括使用選擇性結(jié)合肝細(xì)胞組織的新型結(jié)合肽(c-MET肽)治療肝細(xì)胞(肝)癌，或者用于癌癥診斷，包括癌癥治療和藥物發(fā)現(xiàn)?！緦＠f明】用于靶向遞送(包括負(fù)載物的透皮遞送)的多孔納米顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(原始細(xì)胞)及其方法[0001]相關(guān)申請和政府支持[0002]本發(fā)明要求于2011年10月14日提交的、名為“EngineeringNanoporousParticle-SupportedLipidBilayers(<Protocells>)forTransdermalCargoDelivery，，的美國臨時申請61/547，402;于2011年12月21日提交的名為“EngineeringNanoporousParticle-SupportedLipidBilayers(<Protocells>)forTransdermalCargoDelivery，，的美國臨時申請61/578，463的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。[0003]本申請還要求于2011年12月19日提交的、名為“DeliveryofTherapeuticMacromolecularCargosbyTargetedProtocells，，的美國臨時申請61/577，410的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。[0004]本發(fā)明是由政府支持在美國國立衛(wèi)生研究院批準(zhǔn)號PHS2PN2EY016570B、美國國立癌癥研究院批準(zhǔn)號1U01CA151792-01、美國空軍科學(xué)研究室批準(zhǔn)號FA9550-07-1-0054/9550-10-1-0054、美國國家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究院(NIEHS)的1U19ES019528-01、美國國家科學(xué)基金會NSF:EF-0820117和美國國家科學(xué)基金會的DGE-0504276下作出的。美國政府對本申請擁有某些權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域[0005]本發(fā)明的實施方案涉及特異性靶向患者體內(nèi)細(xì)胞的原始細(xì)胞，尤其包括含有以下的肝細(xì)胞和其它癌細(xì)胞:1)納米多孔二氧化硅或金屬氧化物核；2)受支撐的脂質(zhì)雙層；3)至少一種促進癌細(xì)胞死亡的藥劑(例如傳統(tǒng)小分子、大分子負(fù)載物(siRNA、shRNA、其它微RNA,或蛋白質(zhì)毒素,如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈)，和/或DNA,包括雙鏈或線性DNA,質(zhì)粒DNA，其可以是超螺旋和/或經(jīng)如組蛋白封裝并在納米多孔二氧化硅核中處理的(優(yōu)選超螺旋的以更有效地將DNA封裝入原始細(xì)胞)，所述納米多孔二氧化硅核任選地經(jīng)核定位序列修飾以有助于在癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)定位原始細(xì)胞和表達以下肽的能力:涉及癌細(xì)胞治療(細(xì)胞凋亡/細(xì)胞死亡)的肽，或作為報告子，一種靶向待治療組織中的癌細(xì)胞從而使得原始細(xì)胞和靶細(xì)胞的結(jié)合更特異性和增強的靶向肽和一種促進原始細(xì)胞和包封的負(fù)載物(包括DNA)的內(nèi)體逃逸的融合肽)。本發(fā)明的原始細(xì)胞可用于治療癌癥，尤其包括使用選擇性結(jié)合肝細(xì)胞組織的新型結(jié)合肽治療肝細(xì)胞(肝)癌，或者用于癌癥診斷，包括癌癥治療和藥物發(fā)現(xiàn)。[0006]在一些實施方案中，本發(fā)明的原始細(xì)胞促進多種活性成分的遞送。顯著地，這些原始細(xì)胞有效地增強角質(zhì)層通透性并使包括大分子的活性成分透皮遞送。[0007]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的、疏水性的和超疏水性的多孔納米顆粒，其用于在環(huán)境如胃中遞送多種活性成分。[0008]在一些其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于遞送多種活性成分的透皮原始細(xì)胞，所述原始細(xì)胞包含多個裝載有siRNA的中孔納米顆粒二氧化娃核,其中所述siRNA誘導(dǎo)NiV核殼體蛋白(NiV-N)mRNA的序列特異性降解，和促進胃中多種活性成分遞送的胃上浮(gastrically-buoyant)原始細(xì)胞。[0009]發(fā)明背景[0010]包封在納米載體內(nèi)的藥物的靶向遞送可潛在地改善常規(guī)“游離”藥物所呈現(xiàn)的多種問題，包括不良的溶解性、有限的穩(wěn)定性、快速的清除，和尤其地缺乏選擇性，其導(dǎo)致對正常細(xì)胞的非特異性毒性并妨礙清除患病細(xì)胞所需的劑量爬升。被動靶向方案(其依賴于增強的腫瘤脈管系統(tǒng)通透性和降低的腫瘤淋巴系統(tǒng)的引流效能以在腫瘤位點直接蓄積納米載體(所謂的增強的通透性和滯留，或EPR效應(yīng)))克服了很多上述問題，但誘導(dǎo)納米載體細(xì)胞內(nèi)攝作用所需的細(xì)胞特異性相互作用的缺乏降低了治療效果并可導(dǎo)致藥物排出和誘導(dǎo)多重耐藥性。[0011]納米藥物的一個挑戰(zhàn)是越過細(xì)胞膜在高濃度下操縱可有效包封負(fù)載物(例如藥物)的納米結(jié)構(gòu)和材料，并在規(guī)定時間內(nèi)在靶點處可控地釋放所述藥物。最近，無機納米顆粒已成為納米藥物中新一代藥物或治療遞送載體。更最近，采用香豆素、偶氮苯、輪烷、聚合物或納米顆粒的門控方法已被開發(fā)用于在顆粒內(nèi)密封負(fù)載物并允許根據(jù)光學(xué)或電化學(xué)刺激觸發(fā)的釋放。[0012]盡管脂質(zhì)體由于其低免疫原性和低毒性已被廣泛用于藥物遞送中，它們?nèi)孕枰谌舾煞矫孢M行改善。首先，負(fù)載物的裝載僅可在制備脂質(zhì)體的條件下實現(xiàn)。因此，負(fù)載物的濃度和種類可能受限制。其次，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性相對較低。脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層經(jīng)常趨向老化和融合，這改變了脂質(zhì)體的大小和大小分布。第三，在脂質(zhì)體破裂時，脂質(zhì)體中負(fù)載物的釋放是瞬時的，從而使得很難控制釋放。[0013]多孔納米顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(原始細(xì)胞)(通過脂質(zhì)體與納米多孔二氧化硅顆粒的融合形成)是一種新型的納米載體，其解決了與癌癥治療和診斷靶向遞送相關(guān)的多種挑戰(zhàn)。與脂質(zhì)體類似，原始細(xì)胞是生物相容的、生物可降解的和非免疫原性的，但與類似大小的脂質(zhì)體遞送劑相比，其納米多孔二氧化硅核賦予了極大增加的負(fù)載物容量并延長了雙層的穩(wěn)定性?？蛇M一步調(diào)節(jié)該核的孔隙率和表面化學(xué)以促進多種治療劑如藥物、核酸和蛋白質(zhì)毒素的包封?？赏ㄟ^該核的孔徑、化學(xué)組成和二氧化硅的總壓縮度來控制負(fù)載物的釋放率，使得原始細(xì)胞可用于需要突然釋放或控制釋放特點的應(yīng)用中。最后，該原始細(xì)胞的受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)可經(jīng)不同配體的修飾以促進選擇性遞送并經(jīng)PEG修飾以延長循環(huán)時間。[0014]改善化療劑活性和增強癌癥治療的需要一直存在。使用原始細(xì)胞與替代方法的結(jié)合以靶向、結(jié)合、促進癌癥的侵襲并使化療劑在接近其活性位點處滯留是癌癥療法的重要方面。進行本發(fā)明以推進癌癥治療領(lǐng)域并且通過增強癌癥治療劑的給藥或診斷改善可影響治療結(jié)果的藥劑的遞送，促進診斷癌癥和監(jiān)測癌癥治療的方法。[0015]還需要透皮遞送載體，其經(jīng)設(shè)計最適地穿透角質(zhì)層以促進此前受限于通過其它較劣勢途徑給藥的活性成分的遞送。[0016]發(fā)明目的[0017]本發(fā)明的目的涉及提供對原始細(xì)胞技術(shù)，對原始細(xì)胞本身，對包含此類原始細(xì)胞的藥物組合物的改善以及將本發(fā)明的原始細(xì)胞和藥物組合物用于治療和診斷(包括監(jiān)測治療)的方法。[0018]本發(fā)明實施方案的另外的目的涉及新型MET結(jié)合肽，其用于本發(fā)明其它實施方案的藥物組合物和方法。[0019]從本說明書呈現(xiàn)的描述的概覽，可容易地悉知本發(fā)明的這些和/或其它目的。[0020]發(fā)明概述[0021]本發(fā)明的實施方案涉及特異性靶向細(xì)胞(尤其是肝細(xì)胞和其它癌細(xì)胞)的原始細(xì)胞。[0022]在一些方面，本發(fā)明涉及靶向細(xì)胞的多孔原始細(xì)胞，其包含具有受支撐的脂質(zhì)雙層的納米多孔二氧化硅或金屬氧化物核和至少一種選自以下的其它組分:[0023]靶向細(xì)胞的物種；[0024]促進原始細(xì)胞內(nèi)體逃逸的融合肽；[0025]和包封的DNA，以及包含至少一種選自以下的負(fù)載物組分的其它負(fù)載物:[0026]雙鏈線性DNA或質(zhì)粒DNA；[0027]藥物；[0028]顯像劑；[0029]小干擾RNA、小發(fā)夾RNAJiRNA或其組合；[0030]其中所述負(fù)載物組分的一種任選地進一步與核定位序列綴合。[0031]在一些實施方案中，本發(fā)明實施方案的原始細(xì)胞包含具有受支撐的脂質(zhì)雙層的納米多孔二氧化硅核、包含任選促進癌細(xì)胞死亡的至少一種治療劑的負(fù)載物例如傳統(tǒng)小分子、大分子負(fù)載物(例如siRNA，如S565、S7824和/或S10234，其中，shRNA或蛋白質(zhì)毒素，如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈)和/或在納米多孔二氧化硅核中處理的(優(yōu)選超螺旋的以更有效地將DNA封裝入原始細(xì)胞)封裝質(zhì)粒DNA(在一些實施方案中為組蛋白封裝的)，所述納米多孔二氧化硅核任選地經(jīng)核定位序列修飾以有助于在癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)定位或呈現(xiàn)該質(zhì)粒和表達涉及癌細(xì)胞治療(例如癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡/細(xì)胞死亡)的肽的能力，或作為報告子(綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白，其中，本文另有描述)用于診斷應(yīng)用。本發(fā)明的原始細(xì)胞包含祀向治療細(xì)胞(組織中待治療的癌細(xì)胞)從而使得該原始細(xì)胞與祀細(xì)胞的結(jié)合是特異性的和增強的靶向肽，以及促進原始細(xì)胞和包封DNA的內(nèi)體逃逸的融合肽。本發(fā)明的原始細(xì)胞可用于治療和診斷，更具體地用于治療癌癥和其它疾病，包括病毒感染，尤其包括肝細(xì)胞(肝)癌。在本發(fā)明的其它方面，原始細(xì)胞使用選擇性結(jié)合癌組織(包括肝細(xì)胞、卵巢和宮頸癌組織，除外其它組織)的新型結(jié)合肽(MET結(jié)合肽，本文另有描述)用于癌癥的治療和/或診斷，包括癌癥治療和藥物發(fā)現(xiàn)的監(jiān)測。[0032]在一方面，本發(fā)明實施方案的原始細(xì)胞包括多孔納米顆粒原始細(xì)胞，其常包含具有受支撐的脂質(zhì)雙層的納米多孔二氧化硅核。在本發(fā)明的該方面，該原始細(xì)胞包含靶向肽，其常為本文另有描述的MET受體結(jié)合肽，常與該原始細(xì)胞表面上的融合肽結(jié)合。該原始細(xì)胞可裝載有多種治療性和/或診斷性負(fù)載物，包括例如小分子(治療性和/或診斷性的，尤其包括抗癌和/或抗病毒劑(用于治療HBV和/或HCV))，大分子包括多肽和核酸(包括RNA(shRNA和siRNA)或包含核定位序列的超螺旋和組蛋白封裝的質(zhì)粒DNA，其可以是治療性的和/或診斷性的(包括報告子分子，如熒光肽，其中包括綠色熒光蛋白/FGP、紅色熒光蛋白/FRP)。[0033]本發(fā)明的透皮實施方案包括含有以下多孔納米顆粒的原始細(xì)胞:(a)裝載有一種或多種藥學(xué)活性劑和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，其中所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的角質(zhì)層通透性促進劑:單飽和ω-9脂肪酸(油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸(meadacid)、芥酸和神經(jīng)酸,最優(yōu)選油酸)、醇、二醇(最優(yōu)選聚乙二醇(PEG))、R8肽和膜軟化劑(edgeactivator)如膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鏈表面活性劑(例如去氧膽酸鈉)，且其中該原始細(xì)胞具有的平均直徑為約50nm至約300nm，更優(yōu)選約55nm至約270nm,更優(yōu)選約60nm至約240nm、更優(yōu)選約65nm至約210nm、更優(yōu)選約65nm至約190nm、更優(yōu)選約65nm至約160nm、更優(yōu)選約65nm至約130nm、更優(yōu)選約65nm至約lOOnm、更優(yōu)選約65nm至約90nm、更優(yōu)選約65nm至約80nm、更優(yōu)選約65nm至約75nm、更優(yōu)選約65nm至約66、67、68、69、70、71、72、73、74或75nm、最優(yōu)選約70nm。[0034]因此，在一方面，本發(fā)明提供了包含大量多孔納米顆粒的透皮原始細(xì)胞，所述多孔納米顆粒:(a)裝載有一種或多種藥學(xué)活性劑和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，其中所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的角質(zhì)層通透性促進劑:單飽和ω-9脂肪酸、醇、二醇、溶劑、共溶劑、滲透促進肽和核苷酸以及膜軟化劑(edgeactivator),其中該原始細(xì)胞的平均直徑為約50nm至約300nm。該單飽和ω-9脂肪酸可選自油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸、芥酸和神經(jīng)酸，最優(yōu)選油酸，和其混合物。該醇可選自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及它們的混合物，且該溶劑和共溶劑可選自PEG400和DMS0。該二醇可選自乙二醇和丙二醇，以及它們的混合物。該膜軟化劑可選自膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鏈表面活性劑，以及它們的混合物。在一項優(yōu)選實施方案中，該膜軟化劑為去氧膽酸鈉。[0035]與口服和胃腸外途徑相比，透皮給藥途徑是一種更優(yōu)途徑?？诜o予的藥物經(jīng)歷首過代謝并可具有與食物和消化道寬PH范圍的不良相互作用。胃腸外給藥痛苦，產(chǎn)生生物有害性廢物并且不能自行給藥。透皮藥物遞送解決了所有與口服和胃腸外途徑有關(guān)的上述問題。此外，透皮遞送系統(tǒng)(TDDS)允許持續(xù)數(shù)天的可控釋放曲線。然而，與透皮藥物遞送有關(guān)的主要挑戰(zhàn)存在于皮膚表皮的最外層-角質(zhì)層。由于角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)類似于“磚泥結(jié)構(gòu)(brickandmortar)”，其賦予了皮膚屏障功能?！按u”由富含蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂肪酸和膽固醇的扁平的角質(zhì)細(xì)胞組成。包含“泥”的細(xì)胞間隙富含由神經(jīng)酰胺、膽固醇、脂肪酸組成的雙層，并展現(xiàn)類似于丁醇的極性。在過去40年中，已經(jīng)開發(fā)了3代TDDS。第一代系統(tǒng)利用低分子量親脂性化合物的擴散。第二代和第三代系統(tǒng)認(rèn)識到角質(zhì)層的通透性是關(guān)鍵。這些策略除去/繞過角質(zhì)層或利用化學(xué)促進劑、生化促進劑和電動勢來增加角質(zhì)層的通透性。在不同的促進策略中，已顯示脂質(zhì)體可破壞角質(zhì)層高度有序的結(jié)構(gòu)并隨后增加皮膚的通透性。[0036]在本文的一項實施方案中，描述了納米多孔顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(“原始細(xì)胞”)的開發(fā)，以用作TDDS。原始細(xì)胞通過將脂質(zhì)體靜電融合至納米多孔二氧化硅顆粒核而形成。它們協(xié)同地結(jié)合了無機納米顆粒和脂質(zhì)體的優(yōu)點，如可調(diào)的孔隙率、能夠高容量裝載不同類型負(fù)載物的高表面積，和具有可調(diào)的流動性的受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)(其可經(jīng)多種分子修飾)。這些生物物理學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)使得該原始細(xì)胞可被修飾用于不同的應(yīng)用。在我們的前期研究中，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜，我們表明0.1-0.5重量％我們的標(biāo)準(zhǔn)原始細(xì)胞制劑(55%D0PE、30%膽固醇、15%PEG-2000)以8.125mg給藥能夠穿過患者衍生的全層腹部皮膚。此外，我們證明0.3-2.4重量％原始細(xì)胞能夠穿過角質(zhì)層已被除去的斷層皮膚。[0037]所述透皮原始細(xì)胞的納米多孔二氧化硅顆粒核具有高表面積、易變的孔隙率和易于修飾的表面化學(xué)。這些性質(zhì)使得原始細(xì)胞核能夠高容量裝載多種不同類型的負(fù)載物。所述原始細(xì)胞的受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)具有固有的低免疫原性。此外，SLB提供可與肽、聚合物和其它分子綴合的液體表面從而促進靶細(xì)胞攝取。這些生物物理學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)使得原始細(xì)胞對特定環(huán)境最優(yōu)化，促進其穿透進入角質(zhì)層并隨后經(jīng)透皮途徑遞送不同類型的負(fù)載物。治療癌癥的方法是本發(fā)明透皮原始細(xì)胞治療用途的一個實例。還描述了相關(guān)的藥物組合物。[0038]在一項實施方案中，本發(fā)明提供了原始細(xì)胞，其包含可經(jīng)含胺硅烷如N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)修飾的大量帶負(fù)電荷的、納米多孔的、納米顆粒的二氧化硅核，所述二氧化硅核(a)裝載有siRNA或蓖麻毒素A鏈和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的脂質(zhì):1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、I,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油酰基_sn_甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)U,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂?；鵠-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚?；?2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，且其中所述脂質(zhì)雙層包含陽離子脂質(zhì)和一種或多種兩性離子磷脂。[0039]在前述章節(jié)的實施方案中，所述脂質(zhì)優(yōu)選選自1，2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)或1,2-二油?；?sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物，且所述原始細(xì)胞具有至少一個以下特征:BET表面積大于約600m2/g、孔體積分?jǐn)?shù)為約60%至約70%、由具有平均直徑為約20nm至約30nm的孔組成的多模式孔形態(tài)學(xué)、通過具有平均直徑為5nm至約15nm的孔互相連接的表面可及的孔。優(yōu)選地，所述原始細(xì)胞每101°納米顆粒二氧化娃核包封約IOnMsiRNA。[0040]在另一項實施方案中，本發(fā)明提供了原始細(xì)胞，其包含可經(jīng)含胺硅烷如AEPTMS修飾的大量帶負(fù)電荷的、納米多孔的、納米顆粒的二氧化硅核，所述二氧化硅核(a)裝載有一種或多種靶向周期蛋白超家族成員(其選自細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白E)的siRNA;和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的脂質(zhì):1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、I,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)U,2-二油酰基-sn-甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS)U,2-二油?；鵢3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:lPEG-2000PE)、l，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油酰基~2-[12-[(7~硝基-2-1,3-苯并噁二唑~4~基)氨基]月桂?；鵠-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚?；鵢2_{12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPO、膽固醇和其混合物/組合，且其中(I)所述脂質(zhì)雙層裝載有SP94和內(nèi)體裂解肽，和(2)所述原始細(xì)胞選擇性的與肝細(xì)胞癌細(xì)胞結(jié)合。[0041]在前述章節(jié)的實施方案中，所述脂質(zhì)雙層優(yōu)選包含約為55:5:30:10質(zhì)量比的D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000。[0042]治療癌癥如肝癌的方法是本發(fā)明AEPTMS修飾的原始細(xì)胞治療用途的一個實例。還描述了相關(guān)藥物組合物。[0043]在另一項實施方案中，本發(fā)明提供包含大量納米多孔的、納米顆粒二氧化硅核的原始細(xì)胞，所述二氧化硅核:(a)裝載有誘導(dǎo)Nipah病毒(Niv)核殼體蛋白(NiV-N)mRNA序列特異性降解的siRNA，和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的脂質(zhì):1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(D0PC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油酰基_3_三甲基銨-丙烷(18:10(^卩)、1，2-二油?；?811-甘油-3-磷酸化-(1’-以(3-甘油)(D0PG)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油_3_磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油?；鵢2-[12-[(7_硝基-2-1,3-苯并噁二唑~4~基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚?；鵢2_{12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。[0044]在前述章節(jié)的原始細(xì)胞的一些實施方案中，所述脂質(zhì)雙層包含1，2_二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC),1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇(PEG)、靶向肽、和R8，且所述中孔、納米顆粒二氧化硅核各自平均直徑為約lOOnm，平均表面積大于1，OOOmVg和平均直徑為約20nm至約25nm的表面可及的孔，并且每101°顆粒裝載約IμΜsiRNA或更多。所述靶向肽優(yōu)選為結(jié)合ephrinΒ2(ΕΒ2)的肽，且最優(yōu)選為TGAILHP(SEQIDNO:18)。[0045]最優(yōu)選地，所述原始細(xì)胞包含約0.01至約0.02重量的TGAILHP、約10重量％的PEG-2000和約0.500重量％的R8。[0046]治療被Nipah病毒(NiV)感染或有NiV感染風(fēng)險的受試者的方法是本發(fā)明包含誘導(dǎo)Nipah病毒(NiV)核殼體蛋白(NiV-N)mRNA序列特異性降解的siRNA的原始細(xì)胞治療用途的一個實例。還描述了相關(guān)的藥物組合物。[0047]本發(fā)明實施方案的其它方面涉及藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含原始細(xì)胞群，其可以是相同或不同的并且與藥學(xué)上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合配制。所述原始細(xì)胞可單獨配制或與另一種生物活性劑(如額外的抗癌劑或抗病毒劑)組合配制，取決于所治療的疾病和給藥途徑(本文另有描述)。這些組合物包含經(jīng)修飾用于特定目的(例如，治療，包括癌癥治療，或診斷，包括癌癥治療的監(jiān)測)的原始細(xì)胞。藥物組合物包含有效群體的原始細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合用于特定目的和給藥途徑。[0048]本發(fā)明的實施方案還涉及利用本文所述的新型原始細(xì)胞的方法。因此，在替代實施方案中，本發(fā)明涉及治療疾病和/或病癥的方法，其包括向有需要的患者或受試者給予有效量的本文另有描述的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物具體地用于治療多種疾病狀態(tài)，尤其包括癌癥和繼發(fā)于癌癥或為癌癥起因的疾病狀態(tài)或病癥(具體地，HBV和/或HCV感染)。[0049]在其它替代方面，本發(fā)明涉及診斷癌癥的方法，所述方法包括給予包含原始細(xì)胞群的藥物組合物，所述原始細(xì)胞經(jīng)修飾以遞送對癌細(xì)胞具有選擇性的診斷劑或報告子顯像劑從而確定患者的癌癥。在該方法中，本發(fā)明的原始細(xì)胞可通過包含至少一種與癌細(xì)胞結(jié)合的靶向肽以適于靶向癌細(xì)胞，所述癌細(xì)胞表達多肽或更普遍地，表達表面受體或細(xì)胞膜組分，其為所述靶向肽的目標(biāo)，并且通過包含靶向所述癌細(xì)胞的原始細(xì)胞的報告子組分(包括顯像劑)，可用于通過與具有標(biāo)準(zhǔn)信號的報告子比較信號確認(rèn)患者或受試者中癌性組織的存在和大小。所述標(biāo)準(zhǔn)信號可例如自健康患者或作出診斷的已知具有疾病的患者的群體獲得。一旦診斷，可實施含有本發(fā)明藥物組合物的適當(dāng)治療或替代治療。[0050]在本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明的組合物可用于監(jiān)測特定疾病狀態(tài)和/或病癥的治療過程，包括含有本發(fā)明組合物的治療。在本發(fā)明的該方面，可向正在進行治療的患者或受試者給予包含特異性結(jié)合癌細(xì)胞并含有報告子組分的原始細(xì)胞群的組合物從而可監(jiān)測所述疾病狀態(tài)治療的進展。[0051]本發(fā)明的替代方面涉及五(5)種新型MET結(jié)合肽，本文另有描述，其可因在多種癌細(xì)胞(包括肝細(xì)胞、宮頸和卵巢細(xì)胞，在癌性組織為數(shù)眾多的其它細(xì)胞中)中結(jié)合MET蛋白的優(yōu)勢用作本發(fā)明一些實施方案的原始細(xì)胞上的靶向肽或用于藥物組合物中。本發(fā)明的一項實施方案涉及五(5)種不同的7肽，其顯示作為MET受體(也稱為肝細(xì)胞生長因子受體，由c-MET基因表達)的新型結(jié)合肽活性。這五(5)種7肽如下:[0052]ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)SEQIDNO:1[0053]TATFffFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)SEQIDNO:2[0054]TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)SEQIDNO:3[0055]IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)SEQIDNO:4[0056]WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)SEQIDNO:5[0057]這些肽的每一種可單獨使用或與上述組內(nèi)的其它MET結(jié)合肽或一系列其它靶向肽(例如，如本文所述的SP94肽)(其可協(xié)助將本發(fā)明實施方案的原始細(xì)胞與癌細(xì)胞(包括肝細(xì)胞癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞，在無數(shù)癌細(xì)胞中)結(jié)合)組合使用。這些結(jié)合肽還可單獨作為MET結(jié)合肽用于藥物組合物以治療癌癥和在其它方面抑制肝細(xì)胞生長因子結(jié)合受體。這些肽可單獨配制或與其它生物活性劑組合配制以提供預(yù)期結(jié)果。藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合的有效量的上文確認(rèn)的五(5)種MET結(jié)合肽中的至少一種，任選與額外的生物活性劑(其可包括抗癌劑、抗病毒劑或其它生物活性劑)組合。[0058]附圖簡述[0059]圖1顯示可改變本發(fā)明所用的一項實施方案的納米顆粒(其通過氣溶膠輔助EISA方法制備)以控制顆粒大小和分布。[0060]圖2顯示根據(jù)一項實施方案經(jīng)設(shè)計定制用于多種類型負(fù)載物的孔徑和框架并且氣溶膠化輔助組分易于滲入。[0061]圖2A顯示圖2的a、b、c和e是被CTAB、B58、P123和PS+B56模板化的。A、B、D和E是被CTAP+NaCl、3%重量P123、3%重量P123+聚(丙二醇丙烯酸酯)、微乳劑和CTAB(NH4)2SO4模板化的。[0062]圖3顯不孔表面化學(xué)(即，電荷和疏水性)和孔徑主要由有機硅烷和娃酸的共縮合通過一項實施方案的共自組裝或后自組裝衍生控制。參見Lin等人，Chem.Mater.15，4247-562003；Liu,J.等人，J.Phys.Chem.，104，8328-2339，2000；Fan,H.等人，Nature,405，56-60，2000和Lu,Y.等人，J.Am.Chem.Soc.，122，5258-5261，2000。[0063]圖4描述了使用組蛋白封裝CBl質(zhì)粒。[0064](A)示意圖描述了用于將CBl質(zhì)粒(pCBl)超螺旋，使用H1、H2A、H2B、H3和H4封裝超螺旋PCB1，并使用促進通過核孔易位的核定位序列(NLS)修飾所得pCBl-組蛋白復(fù)合物的方法。(B)和⑶CBl質(zhì)粒⑶和組蛋白封裝的pCBl(D)的原子力顯微鏡(AFM)圖像。比例尺=lOOnm。(C)和(E)分別對應(yīng)于⑶和(D)中紅線的高度剖面圖。[0065]圖5描述了裝載有組蛋白封裝的pCBl的MC40-靶向中孔二氧化硅納米顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(原始細(xì)胞)的合成。(A)示意圖描述了用于生成DNA-裝載的、肽靶向的原始細(xì)胞的方法。通過簡單地將顆粒浸入PCBl-組蛋白復(fù)合物溶液中將組蛋白-封裝的pCBl裝載至形成原始細(xì)胞核的中孔二氧化硅顆粒中。然后將PEG化的脂質(zhì)體與DNA-裝載的核融合以形成受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)(其進一步經(jīng)結(jié)合HCC的靶向肽(MC40)和促進內(nèi)化原始細(xì)胞內(nèi)體逃逸的內(nèi)體裂解肽(H5WYG)修飾)。巰基-胺交聯(lián)子(間隔臂=9.5nm)用于將經(jīng)C-端半胱氨酸殘基修飾的肽綴合至SLB的DOPE部分。(B)可用作原始細(xì)胞核的中孔二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖像。比例尺=200nm。插入圖=掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，其證明15_25nm孔是表面可及的。插入圖比例尺=50nm。(C)中孔二氧化娃納米顆粒的大小分布，其由動態(tài)光散射(DLS)測定。(D，左軸)中孔二氧化硅納米顆粒的累積孔體積圖，其使用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型由圖S-4A所示的氮吸附等溫線的吸附支計算得到。Φ，右軸)pCBl-組蛋白復(fù)合物的大小分布，其通過DLS測定。[0066]圖6顯示中孔二氧化硅納米顆粒對組蛋白封裝的pCBl具有高容量，且根據(jù)一項實施方案，所得的原始細(xì)胞僅在模擬內(nèi)體環(huán)境的條件下釋放包封的DNA。(A)可包封在未經(jīng)修飾的中孔二氧化硅納米顆粒U=-38.5mV)或經(jīng)APTES(—種含胺硅烷)修飾的中孔二氧化硅納米顆粒(ζ=+11.5mV)內(nèi)的pCBl或組蛋白封裝的pCBl(“復(fù)合物”)的濃度。(B)當(dāng)IxlO6細(xì)胞/mL與1x109MC40-靶向的、pCBl-裝載的原始細(xì)胞一起在37°C孵育24小時時，對ZsGreen(—種由pCBl編碼的綠色熒光蛋白)變得陽性的H印3B的百分?jǐn)?shù)。X軸詳細(xì)說明了原始細(xì)胞核是否經(jīng)APTES修飾和pCBl是否經(jīng)組蛋白預(yù)封裝。將經(jīng)DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物封裝的pCBl包括在(A)和(B)中作為對照。(C)和(D)暴露于模擬體液(C)或pH5緩沖液(D)后，組蛋白封裝的pCBl從未經(jīng)修飾的中孔二氧化硅納米顆粒和相應(yīng)原始細(xì)胞的時間依賴性釋放。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000組成，且對于(B)，經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0067]圖7提供了描述MC40靶向的原始細(xì)胞將組蛋白封裝的pCBl遞送至HCC的方法的不意圖。[I]由于祀向肽向Met(其被多種HCC系過表達)的募集，MC40祀向的原始細(xì)胞高親和性地與Hep3B細(xì)胞結(jié)合。流體DOPCSLB提高肽的活動性，因此使經(jīng)低MC40密度修飾的原始細(xì)胞保持對H印3B的高特異性親和性(見圖8A)。[2]MC40靶向的原始細(xì)胞經(jīng)受體介導(dǎo)胞吞作用被H印3B內(nèi)化(見圖8B和圖15A)。[3]內(nèi)體條件使SLB[插入天然材料參考]去穩(wěn)定并引起H5WYG內(nèi)體裂解肽質(zhì)子化，這兩種情況使得組蛋白封裝的pCBl在H印3B細(xì)胞質(zhì)中變得分散(見圖16B)。[4]當(dāng)pCBl-組蛋白復(fù)合物經(jīng)核定位序列(NLS)修飾時，其在~24小時內(nèi)在H印3B細(xì)胞的細(xì)胞核中變得濃縮，這使得分裂和非分裂癌細(xì)胞能夠有效轉(zhuǎn)染(見圖17)。[0068]圖8顯示MC40靶向的原始細(xì)胞高親和性地與HCC結(jié)合并被Hep3B而不是正常的肝細(xì)胞內(nèi)化。㈧當(dāng)暴露于H印3B或肝細(xì)胞時，MC40靶向的原始細(xì)胞的表觀解離常數(shù)(Kd)；Kd值與特異性親和性負(fù)相關(guān)并且從飽和結(jié)合曲線(見圖S-11)測定。誤差棒表示η=5的95%置信區(qū)間(1.96σ)。⑶和(C)在37°C暴露于1000倍過量MC40靶向原始細(xì)胞I小時的H印3B(B)和肝細(xì)胞(C)的共聚焦熒光顯微鏡圖像。Met經(jīng)AlexaFluor?488標(biāo)記的單克隆抗體(綠色)染色，原始細(xì)胞核經(jīng)AlexaFluor?594(紅色)染色，且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)染色。比例尺=20μm。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％(A-C)或0.500重量％(A)的MC40靶向肽修飾。[0069]圖9顯示MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞在皮摩爾濃度誘導(dǎo)HCC的細(xì)胞凋亡但對正常肝細(xì)胞的活力具有最小的影響。在37°CHep3B持續(xù)暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞后，細(xì)胞周期蛋白BImRNA和細(xì)胞周期蛋白BI蛋白質(zhì)表達的劑量(A)和時間(B)依賴性降低。將細(xì)胞在(A)中暴露于多種pCBl濃度48小時和在(B)中暴露于5pMpCBl多種時間周期。納入肝細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白BI和H印3B中ZsGreen的表達作為對照。分別采用實時PCR和免疫熒光測定細(xì)胞周期蛋白BImRNA和蛋白質(zhì)濃度。(C)在37°C持續(xù)暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞([pCBl]=5pM)多種時間周期后，停留在G2/M期的Hep3B的百分?jǐn)?shù)。G2/M期的肝細(xì)胞和S期的H印3B的百分?jǐn)?shù)納入用于比較。在細(xì)胞周期分析前，細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342染色。(D)在37°C持續(xù)暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞([PCBl]=5pM)多種時間周期后，凋亡的H印3B的百分?jǐn)?shù)。對凋亡標(biāo)記物呈陽性的肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)納入作為對照。對AlexaFluor?647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V呈陽性的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的早期，而對膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶均呈陽性的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的晚期。通過添加單-和雙陽性細(xì)胞的數(shù)目測定凋亡細(xì)胞的總數(shù)。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96ο)。[0070]圖10顯示MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞較相應(yīng)的脂質(zhì)復(fù)合物(Iipoplex)2500倍更有效地誘導(dǎo)HCC的選擇性凋亡。(A)DOPC原始細(xì)胞、經(jīng)10重量％PEG-2000(18:1)修飾的DOPC原始細(xì)胞、由pCBl以及DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物組成的脂質(zhì)復(fù)合物，和經(jīng)10重量％PEG-2000修飾的D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物的ζ電勢值。所有?電勢測量在0.5XPBS(pH7.4)中進行。(B，左軸)在37°C持續(xù)暴露于經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞或脂質(zhì)復(fù)合物遞送的5pMpCBl48小時后，凋亡的!fep3B和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(B，右軸)在37°C在48小時內(nèi)誘導(dǎo)90%IxlO6H印3B細(xì)胞凋亡所需的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞或脂質(zhì)復(fù)合物的數(shù)目。對于(B)，細(xì)胞經(jīng)AlexaFluor''647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠染色；單-和雙-陽性細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡的。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(當(dāng)標(biāo)明時)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)10重量％的PEG-2000(當(dāng)標(biāo)明時)、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。在所有實驗中,pCBl經(jīng)NLS修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0071]圖11顯示MC40靶向的原始細(xì)胞選擇性地將高濃度的紫杉醇、Bcl-2-特異性siRNA和pCBl遞送至HCC而不影響肝細(xì)胞的活力。(A)紫杉醇、使Bcl_2表達沉默的siRNA的濃度，和可包封于IO12原始細(xì)胞、脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物的CBl質(zhì)粒的濃度。紅棒表示當(dāng)紫杉醇和PCBl均裝載于原始細(xì)胞內(nèi)時，紫杉醇和pCBl濃度如何變化。藍棒表示當(dāng)紫杉醇、siRNA和pCBl均裝載于原始細(xì)胞或當(dāng)siRNA和pCBl裝載于脂質(zhì)復(fù)合物內(nèi)時，紫杉醇、siRNA和pCBl濃度如何變化。(B)共聚焦熒光顯微鏡圖像顯示在經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞遞送至Hep3B后，OregonGreen?488標(biāo)記的紫杉醇(綠色)、AlexaFluor*594標(biāo)記的siRNA(紅色)和Cy5標(biāo)記的pDNA(白色)的細(xì)胞內(nèi)分布。細(xì)胞在37°C與1000倍過量的MC40靶向的原始細(xì)胞一起孵育24小時，然后經(jīng)Hoechst33342(藍色)固定和染色。比例尺=IOym0(C)在37°C暴露于IOnM紫杉醇和/或5pMpCBl48小時后，停留G2/M期的H印3B、SNU-398和肝細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。將分?jǐn)?shù)對^/M中對數(shù)生長細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)化。⑶在37°C暴露于IOnM紫杉醇、250pMBcl-2-特異性siRNA和/或5pMpCBl48小時后，對AlexaFluor:<647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白和碘化丙錠(PI)變得陽性的H印3B、SNU-398和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在(C)和(D)中，‘PCB1’指的是使用DOTAP和D0PE(1:1重量/重量)的化合物封裝并非特異性地遞送至細(xì)胞的pCBl。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％D0PE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。脂質(zhì)體由DSPC和5重量％DMPE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(16:0)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。脂質(zhì)復(fù)合物由DOTAP:DOPE(1:1重量/重量)混合物組成，且經(jīng)10重量％PEG-2000,0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0072]圖12提供了CBl質(zhì)粒的載體圖。所述CBl質(zhì)粒(pCBl)由RNA1-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen載體(ClontechLaboratories,Inc.；MountainView,CA)和pNEB193載體(NewEnglandBioLabs,Inc.；Ipswich,MA)構(gòu)建。pCBl編碼細(xì)胞周期蛋白BI特異性小發(fā)夾RNA(shRNA)和Zoanthussp.綠色熒光蛋白(ZsGreen)。組成型shRNA表達由RNApolII1-依賴的人U6啟動子(Pu6)驅(qū)動，而組成型ZsGreen表達由巨細(xì)胞病毒(Pcmvie)的立即早期啟動子驅(qū)動。Ori和八!1^元件使得E.coli中的質(zhì)粒能夠傳播。編碼細(xì)胞周期蛋白BI特異性的shRNA的有義和反義鏈的DNA序列被下劃線標(biāo)出并且側(cè)面有用于將dsDNA寡核苷酸引入PSIREN載體的限制性酶切位點(紅色為BamHI，藍色為EcoRI)。[0073]圖13描述了組蛋白封裝的pCBl的特征。(A)暴露于升高濃度的組蛋白(H1、H2A、H2B、H3和H4的摩爾比為1:2:2:2:2)的pCBl的電泳遷移率變動分析。給出泳道3_6的pCBl:組蛋白的摩爾比。泳道I包含DNA梯帶，而泳道2包含未添加組蛋白的pCBl。(B)組蛋白封裝的pCBl(l:50pCBl:組蛋白摩爾比)的TEM圖像。比例尺=50nm。[0074]圖14顯示去負(fù)載和pCBl裝載的中孔二氧化硅納米顆粒的氮吸附分析。(A)裝載組蛋白封裝的PCBl前后中孔二氧化硅納米顆粒的氮吸附等溫線。(B)裝載組蛋白封裝的pCBl前后中孔二氧化娃納米顆粒的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面積。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0075]圖15顯示DOPC原始細(xì)胞的中子小角散射(SANS)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)擬合通過使用具有等厚共形殼的多分散多孔二氧化硅球體模型獲得，并且顯示所述二氧化硅顆粒表面跨越多個孔開口的3(νΛ雙層的存在。納入雙層厚度為0、20和60A的模擬SANS數(shù)據(jù)用于比較。測量的雙層厚度36A與其它在平面支撐的脂質(zhì)雙層上進行的中子研究(33-38Α)—致,且在這些對比條件下，主要表示從所述脂質(zhì)雙層的富氫烴核的散射。[0076]圖16顯示原始細(xì)胞保護包封的DNA免遭核酸酶降解。DNA酶I處理的pCBl(泳道3)、組蛋白封裝的pCBl(泳道5)、DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封裝的pCBl(泳道7)、裝載于具有陽離子核的原始細(xì)胞中的pCBl(泳道9)、和裝載于具有陰離子核的原始細(xì)胞中的組蛋白封裝的PCBl(泳道11)的瓊脂糖凝膠電泳。納入裸pCBl(泳道2)、從組蛋白釋放的PCBl(泳道4)、從D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物釋放的pCBl(泳道6)、從具有陽離子核的原始細(xì)胞釋放的PCBl(泳道8)、和從具有陰離子核的原始細(xì)胞釋放的組蛋白封裝的pCBl(泳道10)用于比較。泳道I包含DNA梯帶。樣品與DNA酶I(每50ngDNAI單位)在室溫一起孵育30分鐘，并使用I%SDS刺激pCBl釋放。[0077]圖17顯示中孔二氧化硅納米顆粒(“未經(jīng)修飾的核”)、在室溫浸泡于20%(體積/體積)APTES中12小時的中孔二氧化硅納米顆粒(“APTES修飾的核”)、CBl質(zhì)粒(、081”)、組蛋白封裝的？081(“pCBl-組蛋白復(fù)合物U^DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封裝的pCBl(“D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物”)的ZetaU)電勢值。(電勢測量在0.5XPBS(pH7.4)中進行。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0078]圖18顯示用于測定圖6和24中對ZsGreen表達呈陽性的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的代表性前向散射-側(cè)向散射(FSC-SSC)圖和FL-1直方圖。(A)-(D)門控㈧或非門控(C)排出細(xì)胞殘骸的ZsGreen陰性細(xì)胞的FSC-SSC圖(Α和C)和相應(yīng)的FL-1直方圖(分別為B和D)。FL-1通道的平均熒光強度(MFI)值在(B)和(D)中給出。(E)-(H)門控(E)或非門控(G)排出細(xì)胞殘骸的ZsGreen陽性細(xì)胞的FSC-SSC圖(Ε和G)和相應(yīng)的FL-1直方圖(分別為F和H)。(F)和⑶上的門對應(yīng)于具有MFI(282的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，即100ΧZsGreen陰性細(xì)胞的MFI(見D圖)。[0079]圖19顯示MC40靶向肽的鑒別。圖中所述的示意圖描述了用于選擇MC40靶向肽的方法。lxlOnpfu/mL的肽在室溫與IOOnM融合至人IgGFe域的重組人Met(rhMet)—起孵育I小時。蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G包被的磁性顆粒用于親和捕捉Met-噬菌體復(fù)合物并隨后用TBS(含有150mMNaCl的50mMTris-HCl，pH7.4)洗滌10次以除去未結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬菌體克隆經(jīng)低PH緩沖液(含lmg/mLBSA的0.2M甘氨酸，pH2.2)洗脫，并且洗脫液經(jīng)宿主細(xì)菌(E.coliER2738)感染而擴增。[0080]圖20顯示MC40靶向肽的特征。㈧第5輪選擇后的肽序列比對；顯性序列ASVHFPP(SEQIDNO:1)與此前鑒定的Met特異性12體YLFSVHWPPLKA，SEQIDNO:15(Zhao等人，ClinCancerRes2007；13(206049-6055))的emboldened部分相似。將顯不祀不相關(guān)的HAIYPRH肽(~10%)(SEQIDNO:16，Brammer等人，Anal.Biochem.373(2008)88-98)的噬菌體克隆從序列比對中略去。(B)和(C)親和選擇的噬菌體克隆與rhMet結(jié)合的程度經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測定。(B)中所述的ELISA示意圖描述于材料與方法部分。ELISA結(jié)果如(C)所示。(D)除去未與Met結(jié)合的肽后的序列比對。從該比對測定圖S-9中所述的共有序列。(E)和(F)暴露于⑴抗Met和不相關(guān)噬菌體克隆(TPDWLFP)(SEQIDNO:17)的AlexaFluor?488標(biāo)記的單克隆抗體和抗M13噬菌體的AlexaFluor*6546標(biāo)記的單克隆抗體(藍點)或(2)抗Met和MC40克隆的AlexaFluor?488標(biāo)記的單克隆抗體和抗M13噬菌體的AlexaflL10r'546標(biāo)記的單克隆抗體(橙點)的H印3B(E)和肝細(xì)胞(F)的流式細(xì)胞儀散點圖。未處理細(xì)胞(紅點)用于設(shè)置FL-1(AlexaFluor*488熒光)和FL-2(AlexaFluor?546熒光)通道的電壓參數(shù)。[0081]圖21顯示暴露于H印3B的MC40靶向的原始細(xì)胞的樣品結(jié)合曲線。為測定圖5A中的解離常數(shù)，lxl06Hep3B或肝細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞松馳素D預(yù)處理以抑制胞吞并在37°C與多種濃度的AlexaFiuor:647標(biāo)記的、MC40靶向的原始細(xì)胞一起孵育I小時。流式細(xì)胞儀用于測定所得細(xì)胞群的平均熒光強度，其對原始細(xì)胞濃度作圖以獲得總結(jié)合曲線。在飽和濃度的未標(biāo)記的肝細(xì)胞生長因子的存在下，通過將細(xì)胞與AlexaFluor647標(biāo)記的、MC40靶向的原始細(xì)胞一起孵育來測定非特異性結(jié)合。通過從總結(jié)合曲線減去非特異性結(jié)合曲線獲得特異性結(jié)合曲線；從特異性結(jié)合曲線計算Kd值。在本圖所述的實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％(~6肽/顆粒)的MC40靶向肽修飾；相應(yīng)的Kd值為1050±142pM。所有誤差棒表示η=5的95%置信區(qū)間(1.96ο)。[0082]圖22顯示MC40靶向的原始細(xì)胞經(jīng)受體介導(dǎo)的胞吞作用內(nèi)化，并且在不存在H5WYG肽的情況下定向至溶酶體。㈧在37°C在I小時內(nèi)被Hep3B或肝細(xì)胞各自內(nèi)化的MC40靶向原始細(xì)胞的平均數(shù)。IxlO6細(xì)胞在不存在(-)或存在(+)飽和濃度(100yg/mL)的人肝細(xì)胞生長因子(HGF)的情況下與多種濃度的原始細(xì)胞一起孵育，而流式細(xì)胞儀用于測定與各細(xì)胞有關(guān)的顆粒的平均數(shù)。原始細(xì)胞經(jīng)NBD和pHrodo?標(biāo)記以從那些內(nèi)化至酸性細(xì)胞內(nèi)隔室的顆粒區(qū)別表面結(jié)合顆粒(分別地)。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。(B)原始細(xì)胞和⑴Rab5、⑵Rab7、(3)溶酶體相關(guān)的膜蛋白I(LAMP-1)、或(4)Rablla之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)(r值)。H印3B細(xì)胞在37。。與1000倍過量的AlexaFluor*594標(biāo)記的原始細(xì)胞一起孵育I小時，然后固定，透化，并與AlexaFHiorli488標(biāo)記的抗Rab5、Rab7、LAMP-1、或Rablla抗體一起孵育。SlideBook軟件用于測定r值，其以η=3x50細(xì)胞的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。微分干涉對比(DIC)圖像用于定義H印3Β的邊界從而當(dāng)計算r值時可忽視細(xì)胞邊界外的像素。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0083]圖23顯示當(dāng)經(jīng)NLS修飾并經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞遞送時，組蛋白封裝的pCBl在HCC細(xì)胞核中以時間依賴性的方式濃縮。(A)-(C)在37°C暴露于1000倍過量的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞15分鐘(A)、12小時⑶、或24小時(C)的!fep3B細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡圖像。對于(B)，在~2小時后，原始細(xì)胞的內(nèi)體逃逸和pCBl的胞質(zhì)分散是明顯的；然而直至12-16小時，ZsGreen表達仍然不可檢測。在24小時，Cy5標(biāo)記的pCBl仍然分布于整個細(xì)胞；然而在(C)中胞質(zhì)染色不可見，因為Cy5通道的增益被減小以避免位于細(xì)胞核內(nèi)的像素飽和。二氧化硅核經(jīng)AlexaFluoP'594(紅色)標(biāo)記，pCBl經(jīng)Cy5(白色)標(biāo)記，且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)復(fù)染。比例尺=20μm。(D)對于Cy5標(biāo)記的pCBl和Hoechst33342標(biāo)記的H印3B細(xì)胞核，皮爾森相關(guān)系數(shù)(r值)對時間的作圖。SlideBook軟件用于測定r值，其以η=3x50細(xì)胞的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。微分干涉對比(DIC)圖像用于定義ifep3B的邊界從而當(dāng)計算r值時可忽視細(xì)胞邊界外的像素。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0084]圖24顯示當(dāng)經(jīng)NLS修飾并經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞遞送時，組蛋白封裝的pCBl以接近100%的有效性，選擇性地轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的HCC細(xì)胞。(A)、(C)和(E)在37°C暴露于1000倍過量的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞24小時的Hep3B細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡圖像。在㈧中Ifep3B細(xì)胞正在分裂而在(C)和(E)中~95%匯合；在所有圖像中，pCBl經(jīng)組蛋白預(yù)封裝，且在(E)中該pCBl-組蛋白復(fù)合物進一步經(jīng)NLS修飾。二氧化娃核經(jīng)AlexaFIUOf"594(紅色)標(biāo)記，pCBl經(jīng)Cy5(白色)標(biāo)記,且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)復(fù)染。比例尺=20μm。(B)、(D)和(F)在37°C持續(xù)暴露于1x109MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞(“PC”)24小時后，ZsGreen表達呈陽性的lxl06!fep3B和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在(B)中細(xì)胞正在分裂而在(D)和(F)中~95%匯合；X軸表示無論CBl質(zhì)粒(“pCBl”)和pCBl-組蛋白復(fù)合物(“復(fù)合物”)是否經(jīng)NLS修飾。單獨pCBl，以及經(jīng)DOTAP和DOPE1:1(重量/重量)混合物封裝的pCBl用作對照。細(xì)胞被暴露于20mg/mL的麥胚凝集素(WGA)以阻斷NLS修飾的pCBl通過核孔復(fù)合物易位。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96(0。(G)-⑴分別為(A)、(C)和(E)中所采用細(xì)胞的細(xì)胞周期直方圖。給出了各直方圖GcZG1期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0085]圖25顯示在37°C暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞I小時或72小時的Hep3B細(xì)胞(A)和肝細(xì)胞(B)的共聚焦熒光顯微鏡圖像；在所有實驗中pCBl濃度維持在5pM。(B)中的箭頭指示有絲分裂細(xì)胞。細(xì)胞周期蛋白BI經(jīng)AlexaFluor?594標(biāo)記的單克隆抗體(紅色)標(biāo)記，而細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)染色。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有比例尺=20μm。[0086]圖26顯示在37°C暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞I小時或72小時的Hep3B細(xì)胞(A)和肝細(xì)胞(B)的共聚焦熒光顯微鏡圖像；在所有實驗中pCBl濃度維持在5pM。細(xì)胞分別經(jīng)AlexaFUioK647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(白色)和碘化丙錠(紅色)染色以分析早期和晚期凋亡，而且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)復(fù)染。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有比例尺=20μm。[0087]圖27顯示含有兩性離子脂質(zhì)組成的SLB的原始細(xì)胞誘導(dǎo)最小的非特異性細(xì)胞毒性。在37°C持續(xù)暴露于IxIO9APTES修飾的中孔二氧化硅納米顆粒、含APTES修飾核的DOPC原始細(xì)胞、裝載有編碼亂序shRNA序列的質(zhì)粒(“亂序pCBl”)的DOPC原始細(xì)胞或裝載有亂序pCBl的D0TAP/D0PE(1:1重量/重量)脂質(zhì)復(fù)合物48小時后，lxl06Hep3B變得細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù)。原始細(xì)胞和脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)10重量％PEG-2000,0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。使用正-和負(fù)-電荷聚苯乙烯納米顆粒(分別為“胺-PS”和“羧基-PS”)作為陽性對照，而使用暴露于IOmM抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)或Ipmol游離pCBl的Hep3B作為陰性對照。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0088]圖1X2顯示作為pH函數(shù)的伊馬替尼的水溶解度。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)上弱堿性官能團的離子化，藥物的溶解度隨PH降低而升高。[0089]圖2X2顯示pH7時不同制劑中伊馬替尼的溶解度。與其它制劑相比，含有10%乙醇的制劑表現(xiàn)出最高的溶解度。還發(fā)現(xiàn)伊馬替尼高度溶于DMSO中。[0090]圖3X2顯示溶劑系統(tǒng)在24小時內(nèi)對伊馬替尼滲透的影響。與對照(水，pH7)相比，所有含有共溶劑的制劑顯示對皮膚的更高的穿透性。DMSO顯示最高的滲透。(N12-186PCT2012-032-01Provisional.PDF)。[0091]圖4X2顯示溶劑系統(tǒng)對伊馬替尼通量(透皮滲透率)的影響。含有DMSO的制劑顯示所研究制劑中最高的通量。[0092]圖1X3。示意圖描述了用于合成siRNA或蛋白質(zhì)毒素裝載的納米多孔顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(原始細(xì)胞)的方法。為形成裝載有大分子治療劑并靶向肝細(xì)胞癌(HCC)的原始細(xì)胞，首先將經(jīng)含胺硅烷(AEPTMS)修飾的納米多孔二氧化硅核浸入小干擾RNA(SiRNA)或蛋白質(zhì)基毒素(蓖麻毒素A鏈)的溶液中。然后將由DOPC、DOPE、膽固醇和18:1PEG-2000PE(55:5:30:10質(zhì)量比)組成的脂質(zhì)體與負(fù)載物裝載的核融合。所得受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)經(jīng)與HCC結(jié)合的靶向肽(SP94)和促進內(nèi)化原始細(xì)胞的內(nèi)體/溶酶體逃逸的內(nèi)體裂解肽(H5WYG)修飾。經(jīng)甘氨酸-甘氨酸(GG)間隔區(qū)和C-端半胱氨酸殘基修飾的肽經(jīng)由含9.5-nm聚乙二醇(PEG)間隔區(qū)異雙功能交聯(lián)子(SM(PEG)24)與DOPE中存在的伯胺綴合。實施例3引用了由Lo等人65和Moore等人66報道的SP94和H5WYG序列，以紅色標(biāo)出。[0093]圖2X3。形成原始細(xì)胞核的納米多孔二氧化硅顆粒的特征。(A)基于尺寸的分離前后，多形二氧化硅顆粒的動態(tài)光散射(DLS)。分離后，顆粒的平均顆粒直徑為~165nm。(B)多形顆粒的氮吸附等溫線。滯后的存在與由較小孔互相連接的較大孔的網(wǎng)狀構(gòu)造一致。(C)孔直徑對由(e)中的吸附等溫線計算得到的孔體積作圖，表明大(20-30nm)孔和小(6-12nm)孔的存在。[0094]圖3X3。原始細(xì)胞對siRNA具有高容量，siRNA的釋放由酸性pH觸發(fā)。(A)可裝載于101°原始細(xì)胞和脂質(zhì)復(fù)合物的siRNA濃度。在0.5XPBS(pH7.4)中未經(jīng)修飾和AEPTMS修飾的二氧化硅核的ζ電勢值分別為_32mV和+12mV。(B)和(C)在37°C暴露于pH7.4模擬體液(B)或pH5.0緩沖液(C)后，siRNA從含AEPTMS修飾的核的DOPC原始細(xì)胞、DOPC脂質(zhì)復(fù)合物和DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物釋放的速率。siRNA裝載的原始細(xì)胞、DOPC脂質(zhì)復(fù)合物和DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物的平均直徑分別為178nm、135nm、和144nm。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0095]圖4X3。siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞沉默HCC中而不是肝細(xì)胞中多種細(xì)胞周期蛋白家族成員。㈧和⑶在H印3B暴露于siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞后，細(xì)胞周期蛋白A2、B1、D1、和E蛋白的表達上劑量㈧和時間⑶依賴的降低。IxlO6細(xì)胞在(A)中持續(xù)暴露于多種濃度的siRNA48小時而在(B)中持續(xù)暴露于125pM的siRNA不同時期。(C，左軸)在lxl06!fep3B或肝細(xì)胞暴露于125pMsiRNA48小時后，殘余的初始細(xì)胞周期蛋白A2蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。(C，右軸)必須與lxl06Hep3B細(xì)胞一起孵育以降低細(xì)胞周期蛋白A2蛋白至10%初始濃度的siRNA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞、DOPC脂質(zhì)復(fù)合物和DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物的數(shù)目。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000組成，且經(jīng)0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修飾。DOPC(和D0TAP)通過使用55:5:30:10比例的DOPC(或DOTAP):D0PE:膽固醇:PEG_2000PE制備并經(jīng)0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修飾。所有實驗均在37°C于完全生長培養(yǎng)基中進行。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96(0。[0096]圖5X3。在37°C暴露于siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞I小時或48小時后，Hep3B(A)和肝細(xì)胞(B)的共聚焦熒光顯微鏡圖像。細(xì)胞與10倍過量的AlexaFluor647標(biāo)記的原始細(xì)胞(白色)一起孵育，然后固定、透化，并經(jīng)Hoechst33342(藍色)和AlexaFluor488標(biāo)記的抗細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白Dl或細(xì)胞周期蛋白E(綠色)染色。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％D0PE、30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000組成，且經(jīng)0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修飾。比例尺=20μm。[0097]圖6X3。裝載有細(xì)胞周期蛋白特異性siRNA混合物的SP94靶向的原始細(xì)胞誘導(dǎo)HCC中的細(xì)胞凋亡而不影響肝細(xì)胞活力。(A)在37°C暴露于裝載有細(xì)胞周期蛋白特異性siRNA混合物的SP94靶向的原始細(xì)胞不同時期后，對AlexaFluor488標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和/或碘化丙錠(PD呈陽性的lxl06Hep3B和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。對膜聯(lián)蛋白呈陽性的細(xì)胞被視為處于細(xì)胞凋亡早期，而對膜聯(lián)蛋白V和PI均呈陽性的細(xì)胞被視為處于細(xì)胞凋亡晚期；通過添加早期細(xì)胞凋亡和晚期細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)目測定凋亡細(xì)胞的總數(shù)?？俿iRNA濃度維持在~125pM。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。(B)和(C)在37°C暴露于siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞I小時或48小時后H印3B(B)和肝細(xì)胞(C)的共聚焦熒光顯微鏡圖像。細(xì)胞與10倍過量的AlexaFluor647標(biāo)記的原始細(xì)胞(白色)一起孵育，然后經(jīng)Hoechst33342(藍色)、AlexaFluor488標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(綠色)和碘化丙錠(紅色)染色。微分干涉對比(DIC)圖像被納入以顯示細(xì)胞形態(tài)學(xué)。比例尺=20μπι。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000組成，且經(jīng)0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修飾。[0098]圖7X3。原始細(xì)胞包封高濃度的蓖麻毒素A鏈(RTA)并僅在酸性pH下釋放。(A)可包封于101°原始細(xì)胞和脂質(zhì)體的RTA的濃度。在0.5XPBS(pH7.4)中未經(jīng)修飾和AEPTMS修飾的二氧化硅核的ζ電勢值分別為_32mV和+12mV。去糖基化RTA的等電點(PI)為~7。(B)和(C)在37°C含AEPTMS修飾的核的DOPC原始細(xì)胞和DOPC脂質(zhì)體暴露于pH7.4模擬體液⑶或PH5.0緩沖液(C)后RTA的時間依賴性釋放。RTA裝載的原始細(xì)胞和脂質(zhì)體的平均直徑分別為184nm和140nm。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0099]圖8X3。RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞抑制HCC中而不是肝細(xì)胞中蛋白質(zhì)生物合成。(A)和(B)在H印3B暴露于RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞后，初生蛋白合成的劑量㈧和時間⑶依賴性降低。IxlO6細(xì)胞在㈧中持續(xù)暴露于多種濃度的RTA48小時和在⑶中持續(xù)暴露于25pMRTA不同時期。使用AlexaFluor488標(biāo)記的甲硫氨酸衍生物定量初生蛋白的合成。(C，左軸)在lxl06!fep3B或肝細(xì)胞暴露于25pMRTA48小時后，殘余的初始初生蛋白濃度的百分?jǐn)?shù)。(C，右軸)必須與lxl06Hep3B細(xì)胞一起孵育以使蛋白質(zhì)生物合成降低90%的RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞和脂質(zhì)體的數(shù)目。原始細(xì)胞和脂質(zhì)體雙層由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000組成，且經(jīng)0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修飾。所有實驗在37°C于完全生長培養(yǎng)基中進行。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0100]圖9X3。在37°C暴露于RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞I小時或48小時后，Hep3B(A)和肝細(xì)胞(B)的共聚焦熒光顯微鏡圖像。細(xì)胞與10倍過量的AlexaFluor647標(biāo)記的原始細(xì)胞(白色)一起孵育，然后經(jīng)Hoechst33342(藍色)和Click-1TAHAAlexaFluor488蛋白質(zhì)合成試劑盒(綠色)染色。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000組成，且經(jīng)0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修飾。比例尺=20μm。[0101]圖10X3。裝載有RTA的SP94靶向的原始細(xì)胞誘導(dǎo)HCC選擇性細(xì)胞凋亡。㈧在370C暴露于RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞不同時期后，對半胱天冬酶_9、半胱天冬酶_3活性呈陽性的lxl06!fep3B和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)?？俁TA濃度維持在~25pM。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。⑶和(C)在37°C暴露于RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞I小時或48小時后H印3B(B)和肝細(xì)胞(C)的共聚焦熒光顯微鏡圖像。細(xì)胞與10倍過量的AlexaFluor647標(biāo)記的原始細(xì)胞(白色)一起孵育，然后經(jīng)Hoechst33342(藍色)、CaspGLOff熒光素活性半胱天冬酶-9染色試劑盒(綠色)和CaspGLOW紅色活性半胱天冬酶-3染色試劑盒(紅色)染色。納入微分干涉對比(DIC)圖像以顯示細(xì)胞形態(tài)學(xué)。比例尺=20μm。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％D0PE、30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000組成，且經(jīng)0.015重量％SP94和0.500重量％H5WYG修飾。[0102]圖1X5示意圖描述了SC的“磚和泥”結(jié)構(gòu)以及被動透皮擴散的三條途徑。細(xì)胞間擴散被廣泛的接受為主要途徑，然而其通常與跨細(xì)胞擴散同時發(fā)生，且這兩種途徑均被所采用的滲透促進策略影響。因為汗腺和毛囊僅占身體表面積的約1%，所以經(jīng)附件擴散常被忽略。[0103]圖2X5示意圖圖示了原始細(xì)胞和對其核的多種代表性修飾，以及為優(yōu)化用于特定應(yīng)用所作的SLB。自底部左側(cè)開始，原始細(xì)胞由受支撐的脂質(zhì)雙層包封的納米多孔二氧化硅核組成。該核具有高表面積、可控的顆粒直徑、可調(diào)的孔徑、可修飾的表面化學(xué)，并且可被工程化以促進高容量裝載不同類型的負(fù)載物(即納米顆粒、蛋白質(zhì)毒素、治療性核酸、藥物)。該受支撐的脂質(zhì)雙層提供流體表面，可使用異雙功能交聯(lián)子將多種分子(即肽、聚乙二醇-PEG)綴合至該表面以影響特定的結(jié)合、內(nèi)化和滲透。[0104]圖3X5。初步結(jié)果說明原始細(xì)胞可與SC相互作用，穿透SC并擴散穿過皮膚，以及這些相互作用的透皮動力學(xué)被SLB組合物和制劑影響。a.)ICP-MS結(jié)果顯示在經(jīng)DOPC/Chol/PEG處理的皮膚樣品(η=3)的容器(receptacle)中SiO2的總量(μg)，其中SC是完整的或除去的。b.)示意圖圖示了使用熒光團的核功能化以及各步后必須作出的必須特征。c.)與DSPC/膽固醇制劑相比，在24小時后，容器中DOPC/膽固醇配制的原始細(xì)胞顯示接近2X量的Si02。然而，與非PEG化的制劑相比，經(jīng)PEG配制的相同原始細(xì)胞顯示顯著降低的動力學(xué)。[0105]圖1X6。示意圖描述了我們計劃開發(fā)用于將抗病毒劑靶向遞送至潛在宿主細(xì)胞和已感染細(xì)胞的原始細(xì)胞。MSNP核以藍色顯示，而SLB以黃色顯示。[0106]圖2X6。非靶向的、PEG化的原始細(xì)胞的初步體內(nèi)特征。(A)經(jīng)原始細(xì)胞或鹽水注射的Balb/c小鼠的時間依賴性重量。(B)經(jīng)DyLight633標(biāo)記的原始細(xì)胞或100μL鹽水(對照)注射并經(jīng)IVISLuminaII成像的Balb/c小鼠。在所有實驗中，原始細(xì)胞經(jīng)10重量％PEG-2000修飾并被注射至尾靜脈中。[0107]圖1X7。原始細(xì)胞的體內(nèi)一般生物分布和毒性。(A)靜脈注射后即刻顆粒的系統(tǒng)性循環(huán)和(B)注射后48小時對肝和骨的定位。(C)一周三次給予原始細(xì)胞無肉眼可見的毒性癥狀，包括以整個動物體重計的毒性癥狀。(D)觀察到顆粒熒光在經(jīng)原始細(xì)胞注射的小鼠(D1、D3、D4-總共30mg，歷時4周)肝臟蓄積而對肝臟解剖無作用。[0108]圖2X7。肝臟厚切片中顆粒分布的3D渲染。發(fā)現(xiàn)顆粒隨時間在肝臟確定的但目前未經(jīng)確認(rèn)的區(qū)域蓄積。在劑量達到每只小鼠30mg，歷時4周時，未觀測到肉眼可見或組織學(xué)毒性。比例尺=20μm。[0109]圖1X8、2X8、3X8.如實施例8的實驗所測定的通過全層和斷層皮膚的原始細(xì)胞擴散。[0110]圖4X8。如實施例8的實驗所測定的供體帽樣品的ICP質(zhì)譜。[0111]圖5X8。如實施例8的實驗所測定的核功能化。[0112]圖6X8、7X8、8X8、9X8。如實施例8的實驗所測定的用于測定容器流體中SiO2濃度的突光光譜。[0113]圖10X8。陽性對照顯示當(dāng)利用如實施例8的實驗所測定的皮膚自發(fā)熒光時，可將皮膚中熒光標(biāo)記的顆粒成像。[0114]圖1X9。給予多種原始細(xì)胞制劑(500yl，16mg/ml，于0.5XPBS中)，各制劑η=4。從各實驗獲得的I塊皮膚(SI)經(jīng)0.5ΧPBS處理。如實施例9的實驗所測定的，使用SI24小時容器流體的1:2稀釋液在濃度范圍為0.16mg/ml-1.953125E-5mg/ml內(nèi)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0115]圖2X9。如實施例9的實驗所測定，結(jié)合熒光光譜的線性回歸分析。[0116]圖3X9。如實施例9的實驗所測定，SLB制劑可極大地影響透皮擴散。[0117]圖4X9。如實施例9的實驗所測定，向DOPC/膽固醇和DSPC/膽固醇制劑中加入PEG顯著地降低透皮擴散。[0118]圖5X9、6X9。如實施例9的實驗所測定，作為時間的函數(shù)，校正平均熒光強度的個體增加。[0119]圖7X9、8X9和9X9。如實施例9的實驗所測定，解釋了制劑對動力學(xué)的作用。[0120]發(fā)明詳述[0121]以下術(shù)語將在整個說明書中使用以描述本發(fā)明。在術(shù)語未明確定義的情況中，應(yīng)當(dāng)以與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的使用一致的方式理解術(shù)語。[0122]在提供數(shù)值范圍的情況中，應(yīng)當(dāng)理解為在所述范圍的上限和下限之間的每一居間值(至該下限的最小整數(shù)的十分之一，除非文中另有明確規(guī)定)，且在該聲明范圍內(nèi)的任何其他聲明的數(shù)值或者居間值涵蓋于本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在較小范圍內(nèi)，也涵蓋于本發(fā)明內(nèi)，適用該聲明的范圍內(nèi)任何特別排除的端值。當(dāng)聲明的范圍包括一個或兩個端值時，排除這些被包括在內(nèi)的一個或兩個端值的范圍也包含在發(fā)明中。在取代基可能未一個或多個馬庫什基團的情況中，應(yīng)當(dāng)理解僅使用那些形成穩(wěn)定鍵的取代基。[0123]除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中也可使用與本文所述的那些方法和材料類似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧?，但這里描述了優(yōu)選方法和材料。[0124]必須指出，用于本文和所附權(quán)利要求的單數(shù)形式的“一個”(“a”、“an”和“the”)包括復(fù)數(shù)的指代物，除非上下文明確另有指示。[0125]此外，以下術(shù)語具有如下定義。[0126]說明書通篇所使用的術(shù)語“患者”或“受試者”描述的是動物，通常是哺乳動物，尤其包括家養(yǎng)動物并優(yōu)選是人，其被提供了使用本發(fā)明的化合物或組合物進行的治療，包括預(yù)防性治療(預(yù)防)。對于特定動物如人類患者的特定感染、病癥或疾病狀態(tài)的治療而言，術(shù)語患者指的是該特定的動物。在大多數(shù)情況中，本發(fā)明的患者或受試者是一種性別或兩種性別的人類患者。[0127]本文所用的術(shù)語“有效的”，除非另有所指，否則描述的是在其用途范圍內(nèi)使用時產(chǎn)生或影響預(yù)期結(jié)果(無論該結(jié)果與感染和/或疾病狀態(tài)或本領(lǐng)另有描述的狀態(tài)的預(yù)防和/或治療是否相關(guān))的化合物或組分的量。術(shù)語有效的包括本申請另有描述或使用的所有其它有效量或有效濃度術(shù)語(包括術(shù)語“治療有效的”)。[0128]本文所用的術(shù)語“化合物”描述的是本文所公開的任何具體化合物或生物活性劑，包括任何和所有立體異構(gòu)體(包括非對映異構(gòu)體)、單獨的光學(xué)異構(gòu)體(對映異構(gòu)體)或外消旋混合物、藥學(xué)上可接受的鹽和前藥形式。本文的術(shù)語化合物指的是穩(wěn)定化合物。在其使用范圍內(nèi)，術(shù)語化合物可指本文另有描述的單個化合物或化合物的混合物。[0129]術(shù)語“生物活性劑”指的是可配制用于本發(fā)明實施方案中的任何生物學(xué)活性化合物或藥物。示例性生物活性劑包括用于治療癌癥或繼發(fā)于癌癥的疾病狀態(tài)或病癥的本發(fā)明的化合物，且可包括抗病毒劑，尤其是抗HIV、抗HBV和/或抗HCV劑(尤其在將治療肝細(xì)胞癌的情況中)以及其它本文另有描述的化合物或藥劑。[0130]術(shù)語“治療”同義地指任何向有疾病風(fēng)險或罹患疾病的患者提供益處(包括通過減輕、抑制、遏抑或消除至少一種癥狀、延緩所述疾病進展、預(yù)防、延緩或抑制所述疾病發(fā)作的可能性等改善病癥)的行為。關(guān)于病毒感染，這些術(shù)語也適用于病毒感染并且在一些特別有利的實施方案中，優(yōu)選地包括根除或消除作為所述感染致病因子的病毒。[0131]如本文所用的，治療涵蓋預(yù)防性和治療性治療，主要為癌癥的治療，但也有其它疾病狀態(tài)包括病毒感染，尤其包括HBV和/或HCV的治療。例如可在疾病發(fā)生前向哺乳動物預(yù)防性地給予本發(fā)明的化合物以減低該疾病的可能性。預(yù)防性給予有效地減低或降低哺乳動物中后續(xù)疾病發(fā)生的可能性或降低后續(xù)發(fā)生疾病(尤其包括癌癥的轉(zhuǎn)移)的嚴(yán)重性(抑制)?；蛘撸缈上蛞杨净技膊〉牟溉閯游镏委熜缘亟o予本發(fā)明的化合物。在一項治療性給予的實施方案中，給予本發(fā)明化合物有效地消除該疾病并產(chǎn)生緩解或基本上消除癌癥轉(zhuǎn)移的可能性。給予本發(fā)明的化合物有效地降低該疾病的嚴(yán)重性或延長罹患該疾病的哺乳動物的壽命(如在癌癥病例中)，或者抑制或甚至消除該疾病的致病因子(如在乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)感染的病例中)。[0132]如本文所用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指適于給予受試者包括人類患者以實現(xiàn)本文所述的治療而考慮到該疾病的嚴(yán)重性和治療的需要無過度的有害的副作用的化合物或組合物。[0133]如本文所用的，術(shù)語“抑制”指的是潛在作用的部分或完全消除，而抑制劑為具有抑制能力的化合物/組合物。[0134]當(dāng)用于上下文時，術(shù)語“預(yù)防”應(yīng)意指“減低可能性”或作為給予或同時給予本發(fā)明的一種化合物或組合物(單獨或與其它藥劑組合)的結(jié)果，預(yù)防避免發(fā)生疾病、病癥或疾病狀態(tài)。應(yīng)當(dāng)注意預(yù)防很少100%有效，因此術(shù)語預(yù)防和減低可能性用于表示在給定的患者或受試者群體中，給予本發(fā)明的化合物將減低特定病癥或疾病狀態(tài)(具體地，疾病狀態(tài)的惡化如癌癥的生長或轉(zhuǎn)移)或其它公認(rèn)的疾病進展指示物發(fā)生的可能性或抑制特定病癥或疾病狀態(tài)(具體地，疾病狀態(tài)的惡化如癌癥的生長或轉(zhuǎn)移)或其它公認(rèn)的疾病進展指示物發(fā)生。[0135]術(shù)語“原始細(xì)胞”用于描述由包括二氧化硅、聚苯乙烯、鋁、鈦、鋯或一般的金屬氧化物、有機金屬酸鹽(organometalIates)、有機娃酸鹽或它們的混合物的材料制成的多孔納米顆粒。[0136]本發(fā)明的原始細(xì)胞所用的多孔納米顆粒包括中孔二氧化硅納米顆粒和核-殼納米顆粒。[0137]所述多孔納米顆粒還可以是生物可降解的聚合物納米顆粒，其包括一種或多種選自以下的組合物:脂族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(己內(nèi)酯)(PCL)、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)、藻酸鹽和其它多糖、膠原和其化學(xué)衍生物、白蛋白(一種親水性蛋白)、玉米蛋白(一種醇溶蛋白，親水性蛋白)和共聚物及它們的混合物。[0138]多孔球狀二氧化硅納米顆粒用于優(yōu)選的原始細(xì)胞并被受支撐的脂質(zhì)或聚合物雙層或多層包裹。本發(fā)明的多種實施方案提供了納米結(jié)構(gòu)以及構(gòu)建和使用所述納米結(jié)構(gòu)的方法和提供本發(fā)明原始細(xì)胞的方法。很多最基本形式的原始細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的。各種大小的多孔二氧化娃顆粒(大小范圍(直徑)從小于5nm至200nm或500nm或更大)是本領(lǐng)域可容易得到的或可使用本領(lǐng)域已知的方法容易地制備(見實施例部分)，或者可從SkySpringNanomaterials,Inc.,Houston,Texas,USA或從DiscoveryScientific,Inc.,Vancouver,BritishColumbia購得?？墒褂肅arroll等人,Langmuir,25,13540-13544(2009)的操作容易地制備多形二氧化硅納米顆粒?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法學(xué)容易地制備原始細(xì)胞。本發(fā)明的實施例部分提供了獲得用于本發(fā)明的原始細(xì)胞的一些方法學(xué)?？扇菀椎刂苽浔景l(fā)明的原始細(xì)胞，包括含有與二氧化硅納米顆粒的表面融合的脂質(zhì)的原始細(xì)胞。參見，例如Liu等人，Chem.Comm.，5100-5102(2009)，Liu等人，J.Amer.Chem.Soc.，131，1354-1355(2009)，Liu等人，J.Amer.Chem.Soc.，131，7567-7569(2009)Lu等人，Nature,398，223-226(1999)，根據(jù)Ashley等人，NatureMaterials,2011,May；10(5):389-97,Lu等人，Nature,398，223-226(1999)，Caroll等人，Langmuir,25，13540-13544(2009)，和以下實驗部分另有呈現(xiàn)的方法制備用于本發(fā)明的優(yōu)選原始細(xì)胞。[0139]術(shù)語“納米顆?！焙汀岸嗫准{米顆粒”在本文中可互換使用且這些顆?？梢越Y(jié)晶相、無定形相、半結(jié)晶相、半無定形相或它們的混合物存在。[0140]納米顆粒可具有多種形狀和橫斷層面圖形，其可能部分地取決于產(chǎn)生所述顆粒所使用的方法。在一項實施方案中，納米顆?？删哂幸韵滦螤?球狀、桿狀、管狀、薄片狀、纖維狀、平板狀、線狀、立方體狀、須狀(whisker)。納米顆?？砂ň哂袃煞N或多種上述形狀的顆粒。在一項實施方案中，顆粒的橫斷層面圖形可以是以下形狀的一種或多種:環(huán)形、橢圓形、三角形、矩形或多邊形。在一項實施方案中，納米顆?？苫旧嫌煞乔驙铑w粒組成。例如，這些顆粒可具有橢球形，其可能所有三個主軸具有不同長度，或者可以是旋轉(zhuǎn)的扁圓或扁長(prelate)橢球形。或者，非球狀納米顆粒可以是分層形式，其中分層指的是顆粒一個軸的最大長度基本上小于其它兩軸各自的最大長度。非球狀顆粒還可具有金字塔墩或錐墩形狀，或者伸長的桿狀。在一項實施方案中，所述納米顆?？梢允遣灰?guī)則形狀的。在一項實施方案中，多數(shù)納米顆粒可主要由球狀納米顆粒組成。[0141]本文所用的描述多顆粒(例如，多孔納米顆粒)的短語“有效平均粒徑”意指其中至少50%的顆粒具有特定大小。因此，“直徑的有效粒徑小于約2，OOOnm”意指其中至少50%顆粒的直徑小于約2，OOOnm0在一些實施方案中，納米顆粒具有的有效平均粒徑為小于約2,OOOnm(即2μm)、小于約I,900nm、小于約I,800nm、小于約I,700nm、小于約I,600nm、小于約I,500nm、小于約I,400nm、小于約I,300nm、小于約I,200nm、小于約I,lOOnm、小于約1，OOOnm、小于約900nm、小于約800nm、小于約700nm、小于約600nm、小于約500nm、小于約400nm、小于約300nm、小于約250nm、小于約200nm、小于約150nm、小于約lOOnm、小于約75nm或小于約50nm，通過光散射方法、顯微鏡法或其它適當(dāng)?shù)姆椒y量?！癉5(l”指的是多顆粒中50%的顆粒落在其下的粒徑。類似地，“D9(l”是多顆粒中90%的顆粒落在其下的粒徑。[0142]在一些實施方案中，所述多孔納米顆粒包含選自以下的一種或多種組分:二氧化硅、生物可生物降解的聚合物、溶膠、金屬和金屬氧化物。[0143]在本發(fā)明的一項實施方案中，所述納米結(jié)構(gòu)包括核-殼結(jié)構(gòu)，其包含由脂質(zhì)殼優(yōu)選雙層，但可能是單層或多層包裹的多孔顆粒核(參見Liu等人，JACS,2009，Id)。所述多孔顆粒核可包括，例如由被脂質(zhì)雙層包裹的上述有機或無機材料制成的多孔納米顆粒。在本發(fā)明中，這些脂質(zhì)雙層包裹的納米結(jié)構(gòu)被稱為“原始細(xì)胞”或“功能性原始細(xì)胞”，因為它們具有受支撐的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的實施方案中，原始細(xì)胞的多孔顆粒核可裝載多種所需的物種(“負(fù)載物”)，包括小分子(例如，本文另有描述的抗癌劑)、大分子(例如，包括大分子如RNA，包括小干擾RNA或siRNA或小發(fā)夾RNA或shRNA或多肽(其中可包括多肽毒素，如蓖麻毒素A鏈或其它毒性多肽，如白喉毒素A鏈DTx))或報告子多肽(例如，其中，綠色熒光蛋白)或半導(dǎo)體量子點、或金屬納米顆粒、或金屬氧化物納米顆粒或其組合。在本發(fā)明的一些優(yōu)選方面，所述原始細(xì)胞裝載有超螺旋質(zhì)粒DNA，其可用于遞送一種或多種治療性和/或診斷性肽或小發(fā)夾RNA/shRNA或小干擾RNA/siRNA(其可用于抑制蛋白質(zhì)(例如，生長因子受體或其它對細(xì)胞尤其是癌細(xì)胞的生長負(fù)責(zé)或有助于細(xì)胞尤其是癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)生長停滯和癌細(xì)胞凋亡的受體(其中包括表皮生長因子/EGFR、血管內(nèi)皮生長因子受體/VEGFR-2或血小板衍生生長因子受體/PDGFR-α))的表達)。[0144]在一些實施方案中，所述負(fù)載物組分可包括但不限于，化學(xué)小分子(尤其是抗癌劑和抗病毒劑，包括抗HIV、抗HBV和/或抗HCV劑)、核酸(DNA和RNA，包括siRNA和shRNA和質(zhì)粒(其在遞送至細(xì)胞后表達一種或多種多肽或RNA分子))以用于特定用途，例如本文另有描述的治療性應(yīng)用或診斷性應(yīng)用。[0145]在實施方案中，所述原始細(xì)胞的脂質(zhì)雙層可提供生物相容性并可被修飾以具有靶向物種，包括例如靶向肽(包括抗體、適體和PEG(聚乙二醇))以例如使得所述原始細(xì)胞更加穩(wěn)定和/或靶向遞送至生物活性細(xì)胞中。[0146]取決于應(yīng)用，本發(fā)明的原始細(xì)胞粒徑分布可以是單分散的或多分散的。所述二氧化硅核可以是非常單分散的(即直徑變化不超過約5%例如200nm直徑不超過±10nm的原始細(xì)胞的均勻大小群體，尤其是如果它們是使用溶液技術(shù)制備的)或非常多分散的(即多分散群體可與平均或中位直徑變化巨大，例如達±200nm或更多，如果它們是通過氣溶膠制備的)。參見附圖1。多分散群體可根據(jù)大小分成單分散群體。所有這些均適用于原始細(xì)胞形成。在本發(fā)明中，優(yōu)選的原始細(xì)胞的直徑優(yōu)選不超過約500nm，直徑優(yōu)選不超過約200nm以能夠遞送至患者或受試者并產(chǎn)生預(yù)期的治療性作用。[0147]在一些實施方案中，本發(fā)明的原始細(xì)胞大小范圍通常為直徑大于約8-10nm至約5μm,優(yōu)選直徑約20nm至3μm,約IOnm至約500nm,更優(yōu)選約20至200nm(包括約150nm,其可以是平均直徑或中位直徑)。如上文所討論，基于原始細(xì)胞群體的平均直徑或中位直徑，所述原始細(xì)胞群體可被視為單分散或多分散的。大小對于本發(fā)明的治療性和診斷性方面非常重要，因為直徑小于約8nm的顆粒會通過腎臟排泄，而大于約200nm的那些顆?？杀桓闻K和脾臟截留。因此，本發(fā)明的一項實施方案聚焦于用于在患者或受試者中藥物遞送和診斷的較小的原始細(xì)胞。[0148]在一些實施方案中，本發(fā)明的原始細(xì)胞的特征在于包含中孔中孔(介孔，mesopore),優(yōu)選存在于納米結(jié)構(gòu)材料中的孔?？砂l(fā)現(xiàn)這些孔(至少一個，但經(jīng)常是很多個)與所述納米顆粒的表面相交(通過具有所述納米顆粒表面上顯現(xiàn)的孔的一端或兩端)或者在納米結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，其中一個或多個中孔與所述納米顆粒的表面中孔互相連接。較小的互連孔常存在于所述表面中孔的內(nèi)部。所述中孔孔徑的總體直徑范圍可為0.03-50nm。優(yōu)選中孔孔徑范圍為2-30nm;它們可以是單一大小的或雙峰的或分級的-它們可以是有序的或無序的(基本上隨機排列的或蠕蟲狀的(worm-like))。見附圖2。[0149]中孔(IUPAC定義直徑為2_50nm)是由模板劑包括表面活性劑、嵌段共聚物、分子、大分子、乳劑、乳膠微球或納米顆?！澳Ｖ啤倍?。此外，方法也可得到微孔(IUPAC定義直徑小于2nm)—直向下到約0.03nm,例如如果未使用氣溶膠方法中的模板部分。它們也可被擴大成大孔，即直徑為50nm。[0150]納米顆粒材料的孔表面化學(xué)可以是非常多樣的-所有有機硅烷得到的陽離子性、陰離子性、親水性、疏水性、反應(yīng)基團-孔表面化學(xué)，尤其是電荷和疏水性(hydrohobicity)，影響裝載容量。參見附圖3。吸引性靜電相互作用或疏水性相互作用控制/增加裝載容量并控制釋放速率。更高的表面積可通過這些吸引性相互作用達到藥物/負(fù)載物的更高裝載。見下文。[0151]在一些實施方案中，通過N2BET方法測量，納米顆粒的表面積范圍為約100m2/g至>約1200!112/^。通常，孔徑越大，表面積越小。見圖2A。理論上，如果不除去模板劑或如果孔徑小于0.5nm,表面積可減少至基本為0，因此由于動力學(xué)作用在77K通過N2吸附無法測量。然而，在這種情況下，它們可通過CO2或水吸附測量，但可能被視為無孔的。這將適用于如果生物分子直接包封在未使用模板制備的二氧化硅核中的情況，在這種情況中，顆粒(內(nèi)部負(fù)載物)將通過在遞送至細(xì)胞后二氧化硅基質(zhì)的溶解來釋放。[0152]通常，本發(fā)明的原始細(xì)胞裝載有負(fù)載物，容量達超過100重量％:定義為(負(fù)載物重量/原始細(xì)胞重量)x100。負(fù)載物的最適裝載量常為約0.01至30%，但這取決于摻合入原始細(xì)胞作為負(fù)載物的藥物或藥物組合。這通常以μΜ/101(ι顆粒的表示，其中取值范圍為2000-100μΜ/1010顆粒。本發(fā)明優(yōu)選的原始細(xì)胞顯示在pH約5.5時釋放負(fù)載物，該pH為內(nèi)體的pH，但在生理pH7或更高(7.4)時穩(wěn)定。[0153]用于裝載的內(nèi)部空間的表面積為孔體積，其最適值范圍為約1.1至0.5立方厘米/克(cc/g)。注意，在本發(fā)明一項實施方案的原始細(xì)胞中，所述表面積主要為與所述納米顆粒的外部幾何表面積相對的內(nèi)部表面積。[0154]本發(fā)明的一項實施方案的多孔顆粒上支撐的脂質(zhì)雙層具有較低的融化轉(zhuǎn)變溫度，即較非多孔載體上支撐的脂質(zhì)雙層或脂質(zhì)體中的脂質(zhì)雙層更具流動性。這在低肽密度實現(xiàn)靶配體的高親和性結(jié)合中有時是重要的，因為雙層的流動性允許側(cè)向擴散和靶細(xì)胞表面受體的肽募集。一項實施方案提供了成簇肽，其促進與互補性靶點結(jié)合。[0155]在本發(fā)明中，脂質(zhì)雙層在組成上可有顯著差異。一般而言，任何可用于脂質(zhì)體的脂質(zhì)或聚合物也可用于原始細(xì)胞。優(yōu)選脂質(zhì)本文另有描述。用于本發(fā)明原始細(xì)胞中的特別優(yōu)選的脂質(zhì)雙層包含重量比為5%DOPE,5%PEG、30%膽固醇、60%DOPC或DPPC(以重量計)的脂質(zhì)混合物(本文另有描述)。[0156]通過ζ電勢測量的中孔二氧化硅NP核的電荷經(jīng)胺硅烷、2-(氨基乙基)丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)或其它有機硅烷修飾可從-50至+50mV單調(diào)地變化。這種電荷修飾依次改變了所述原始細(xì)胞的負(fù)載物內(nèi)藥物的裝載。通常，在受支撐的脂質(zhì)雙層融合后，ζ電勢降低至-1OmV至+5mV,其對于最大化在血液中的循環(huán)時間和避免非特異性相互作用是重要的。[0157]取決于表面活性劑模板如何除去，例如在高溫(500°C)焙燒vs在酸性乙醇中萃取，以及取決于摻入二氧化硅框架中的AEPTMS的量，二氧化硅的溶解速率可差異巨大。這依次控制了內(nèi)部負(fù)載物的釋放速率。這種現(xiàn)象的發(fā)生是因為與孔的內(nèi)表面緊密結(jié)合的分子緩慢地擴散到顆粒核外，因此，顆粒核的溶解部分地控制釋放速率。[0158]本發(fā)明的一項實施方案的原始細(xì)胞的其它特征是它們在pH為7時穩(wěn)定，即它們不會泄漏負(fù)載物，但在pH為5.5(該pH為內(nèi)體的pH)時，脂質(zhì)或聚合物包衣會變得不穩(wěn)定開始釋放負(fù)載物。這種PH觸發(fā)的釋放對于維持原始細(xì)胞的穩(wěn)定直至其通過胞吞作用被內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)的點(在此點若干PH觸發(fā)的事件引起釋放至內(nèi)體，并隨后至胞質(zhì)溶膠)是重要的。原始細(xì)胞核顆粒和表面也可經(jīng)修飾以提供在特定、延長時期內(nèi)負(fù)載物的非特異性釋放，以及可被重新配制以在其它生物物理變化(如局部發(fā)炎區(qū)域中活性氧簇和其它因子的存在增加)后釋放負(fù)載物。定量實驗證據(jù)顯示被靶向的原始細(xì)胞僅引起弱免疫應(yīng)答，因為它們不支持更高親和性IgG(—個有利的結(jié)果)所需的T細(xì)胞幫助。[0159]本發(fā)明的原始細(xì)胞顯示至少一個或多個特征(取決于實施方案)使得它們區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的原始細(xì)胞:[0160]I)與現(xiàn)有技術(shù)相反，本發(fā)明的實施方案指定平均大小(直徑)小于約20nm的納米顆粒-該大小被工程化以促進通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進行的有效細(xì)胞攝取并最小化非靶細(xì)胞和器官的結(jié)合和攝取；[0161]2)本發(fā)明的實施方案可指定單分散和/或多分散大小均可控制生物分布；[0162]3)本發(fā)明的實施方案涉及誘導(dǎo)受體介導(dǎo)的胞吞作用的靶向納米顆粒；[0163]4)本發(fā)明的實施方案通過融合肽或內(nèi)體裂解肽的包裹誘導(dǎo)負(fù)載物分散至細(xì)胞質(zhì)中；[0164]5)本發(fā)明的實施方案提供pH觸發(fā)負(fù)載物釋放的顆粒；[0165]6)本發(fā)明的實施方案顯示受控的時間依賴性負(fù)載物釋放(通過熱誘導(dǎo)的二氧化娃納米顆?；|(zhì)的交聯(lián)程度)；[0166]7)本發(fā)明的一項實施方案可顯不時間依賴性pH觸發(fā)釋放；[0167]8)本發(fā)明的一項實施方案可包含并提供復(fù)合物多種負(fù)載物的細(xì)胞遞送；[0168]9)本發(fā)明的一項實施方案顯示靶癌細(xì)胞的殺死；[0169]10)本發(fā)明的一項實施方案顯示靶癌細(xì)胞的診斷；[0170]11)本發(fā)明的一項實施方案顯示癌細(xì)胞的選擇進入；[0171]12)本發(fā)明的一項實施方案顯示從脫靶細(xì)胞的選擇排除(選擇性)；[0172]13)本發(fā)明的一項實施方案顯示受支撐的脂質(zhì)雙層增強的流動性；[0173]14)本發(fā)明的實施方案顯示對靶細(xì)胞的亞納摩爾和受控的結(jié)合親和性；[0174]15)本發(fā)明的一項實施方案顯示與低于現(xiàn)有技術(shù)中濃度的靶向配體密度的亞納摩爾結(jié)合親和性；[0175]16)本發(fā)明的一項實施方案可進一步將現(xiàn)有技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)中不可得的更精細(xì)的細(xì)節(jié)水平區(qū)分。[0176]術(shù)語“脂質(zhì)”用于描述用于在本發(fā)明中所使用的納米顆粒的表面上形成脂質(zhì)雙層的組分。[0177]多種實施方案提供了從支撐一個或多個脂質(zhì)雙層的納米顆粒構(gòu)建而來的納米結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的實施方案中，所述納米結(jié)構(gòu)優(yōu)選包括，例如，包含被脂質(zhì)雙層殼包裹的多孔顆粒核的核-殼結(jié)構(gòu)。所述納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)選上文所述的多孔二氧化硅納米結(jié)構(gòu)，支撐脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)。[0178]在本發(fā)明的實施方案中，所述原始細(xì)胞的脂質(zhì)雙層可提供生物相容性并可經(jīng)修飾具有靶向物種(包括，例如靶向肽、融合肽、抗體、適體和PEG(聚乙二醇))從而使得例如所述原始細(xì)胞更穩(wěn)定和/或靶向遞送至生物活性細(xì)胞，尤其是癌細(xì)胞中。當(dāng)包含于脂質(zhì)雙層中時，PEG的分子量可變化巨大(盡管PEG范圍為約10至約100單位乙二醇，但可使用約15至約50單位、約15至約20單位、約15至約25單位、約16至約18單位等)且通常通過胺基與磷脂綴合的PEG組分包括約1%至約20%、優(yōu)選約5%至約15%、約10%重量的包含于脂質(zhì)雙層中的脂質(zhì)。[0179]脂質(zhì)體遞送中使用的眾多脂質(zhì)可用于在納米顆粒上形成脂質(zhì)雙層以提供本發(fā)明的原始細(xì)胞。實際上，任何用于形成脂質(zhì)體或多聚體(polymersome)的脂質(zhì)或聚合物可用于脂質(zhì)雙層中，所述脂質(zhì)雙層包裹納米顆粒已形成本發(fā)明一項實施方案的原始細(xì)胞。用于本發(fā)明的優(yōu)選脂質(zhì)包括，例如1，2_二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(D0PC)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC),1,2-二油?；?sn-甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS),1,2-二油酰基_3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:lPEG-2000PE)、l，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油?；鵢2-[12-[(7_硝基-2-1,3-苯并噁二唑~4~基)胺基]月桂?；鵠-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚酰基_2_{12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)胺基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPO、膽固醇和其混合物/組合。膽固醇，技術(shù)上不是脂質(zhì)，但考慮到膽固醇可以是本發(fā)明原始細(xì)胞的脂質(zhì)雙層的重要組分，膽固醇可作為脂質(zhì)存在用于本發(fā)明的一項實施方案的目的。膽固醇經(jīng)常摻合至原始細(xì)胞的脂質(zhì)雙層中從而增強所述雙層的結(jié)構(gòu)完整性。所有這些脂質(zhì)均可容易地從AvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,Alabama,USA)購得。DOPE和DPPE特別用通過脂質(zhì)上的胺基綴合肽、多肽(包括抗體)、RNA和DNA。[0180]在一些實施方案中，所述多孔納米顆粒還可是生物可降解的聚合物納米顆粒，其包括一種或多種選自以下的組合物:脂族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(己內(nèi)酯)(PCL)、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)、藻酸鹽和其它多糖、膠原和其化學(xué)衍生物、白蛋白(一種親水性蛋白)、玉米蛋白(一種醇溶蛋白，親水性蛋白)和共聚物及它們的混合物[0181]在其它實施方案中，所述多孔納米顆粒各自包含具有基本上無二氧化硅的核表面的核，和與該核表面連接的殼，其中所述核包含選自以下的過渡金屬化合物:氧化物、碳化物、硫化物、氮化物、磷化物、硼化物、鹵化物、硒化物、碲化物、氧化鉭、氧化鐵或其組合。[0182]本發(fā)明所用的二氧化硅納米顆?？梢允?，例如，中孔二氧化硅納米顆粒和核-殼納米顆粒。所述納米顆?？蓳胶衔辗肿?，例如吸收染料。在適當(dāng)?shù)臈l件下，所述納米顆粒發(fā)射源自化學(xué)發(fā)光的電磁輻射?？砂渌煊皠┮员阌贛R1、CT、PET和/或超聲成像中的造影。[0183]中孔二氧化硅納米顆粒的大小可以是例如約5nm至約500nm，包括其間的所有整數(shù)和范圍。以顆粒的最長軸測量大小。在多項實施方案中，所述顆粒大小為約IOnm至約500nm和約IOnm至約lOOnm。所述中孔二氧化娃納米顆粒具有多孔結(jié)構(gòu)。這些孔的直徑可為約I至約20nm，包括其間的所有整數(shù)和范圍。在一項實施方案中，這些孔的直徑為約I至約10nm。在一項實施方案中，約90%的孔的直徑為約I至約20nm。在另一項實施方案中，約95%的孔的直徑為約I至約20nm。[0184]可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法合成所述中孔納米顆粒。在一項實施方案中，所述納米顆粒通過溶膠-凝膠方法學(xué)合成，其中一種或多種二氧化硅前體和一種或多種與吸附分子綴合(即共價結(jié)合)的二氧化硅前體在膠束形式的模板存在下水解。所述模板可使用表面活性劑例如溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)形成。據(jù)預(yù)期可使用任何可形成膠束的表面活性劑。[0185]核-殼納米顆粒包含核和殼。所述核包含二氧化硅和吸附分子。所述吸附分子經(jīng)由所述分子與二氧化硅網(wǎng)絡(luò)之間的一個或多個共價鍵并入所述二氧化硅網(wǎng)絡(luò)中。所述殼包含二氧化硅。[0186]在一項實施方案中，使用已知的溶膠-凝膠化學(xué)法，例如通過一種或多種二氧化硅前體的水解獨立地合成所述核。所述二氧化硅前體以二氧化硅前體和與吸附分子綴合(例如，通過共價鍵連接)的二氧化硅前體(本文稱為“綴合的二氧化硅前體”)的混合物存在。水解可在堿(堿性)條件下進行以形成二氧化硅核/或二氧化硅殼。例如，水解可通過向包含一種或多種二氧化硅前體和一種或多種綴合的二氧化硅前體的混合物中加入氫氧化銨進行。[0187]二氧化硅前體是在水解條件下可形成二氧化硅的化合物。二氧化硅前體的實例包括但不限于，有機硅烷，例如四乙氧基硅烷(TEOS)、四甲氧基硅烷(TMOS)等。[0188]用于形成所述綴合二氧化硅前體的二氧化硅前體具有能夠與所述一種或多種吸附分子反應(yīng)形成一個或多個共價鍵的一個或多個官能團。這類二氧化硅前體的實例包括但不限于，異氰酸丙基三乙氧基硅烷(ICPTS)、氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)、巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)等。[0189]在一項實施方案中，用于形成核的有機硅烷(可綴合的二氧化硅前體)具有通式R4nSiXn，其中X為可水解的基團，如乙氧基、甲氧基、或2-甲氧基-乙氧基；R為具有I至12個碳原子的單價有機基團，其可任選含有，但不限于，功能性有機基團，如巰基、環(huán)氧、丙烯?；?、甲基丙烯酰基或氨基；且η為O至4的整數(shù)。所述可綴合的二氧化硅前體與吸附分子綴合并隨后與二氧化硅前體(例如TEOS和TM0S)共縮合形成核。用于形成二氧化硅殼的硅烷具有η等于4。也已知功能性單_、雙-和三-烷氧基硅烷用于共反應(yīng)性官能團或羥基功能性表面(包括玻璃表面)，參見Kirk-Othmer,EncyclopediaofChemicalTechnology,Vol.20,3rdEd.,J.Wiley,N.Y.；還參見E.Pluedemann,SilaneCouplingAgents,PlenumPress,N.Y.1982。有機硅烷可引起凝膠，因此采用醇或其它已知的穩(wěn)定劑可能是理想的?？稍诿绹鴮＠暾?0/306，614和10/536，569中找到使用改良的Stoeber方法合成核-殼納米顆粒的方法，這類方法的公開內(nèi)容在此引入作為參考。[0190]“含胺硅烷”包括但不限于，經(jīng)硅原子功能化的伯胺、仲胺或叔胺，且可以是單胺或多胺，如二胺。優(yōu)選地，所述含胺硅烷為N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)。含胺硅烷的非限制性實施例還包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)，以及氨基功能性三烷氧基硅烷。還可使用質(zhì)子化仲胺、質(zhì)子化叔烷基胺、質(zhì)子化脒、質(zhì)子化胍、質(zhì)子化吡啶、質(zhì)子化嘧啶、質(zhì)子化吡嗪、質(zhì)子化嘌呤、質(zhì)子化咪唑、質(zhì)子化吡咯、季烷基胺或其組合。[0191]在本發(fā)明的原始細(xì)胞的一些實施方案中，所述脂質(zhì)雙層由一種或多種選自磷脂酰膽堿(PC)和膽固醇的脂質(zhì)組成。[0192]在一些實施方案中，所述脂質(zhì)雙層由一種或多種選自以下的磷脂酰膽堿(PC)組成:1，2-二肉豆蘧?；?Sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC),1,2-二油?；鵢3_三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)，卵PC，以及包含約50%至約70%、或約51%至約69%、或約52%至約68%、或約53%至約67%、或約54%至約66%、或約55%至約65%、或約56%至約64%、或約57%至約63%、或約58%至約62%、或約59%至約61%、或約60%的一種或多種不飽和磷脂酰膽堿的脂質(zhì)混合物，具有碳長度為14并無不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)[16:0]、I,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)[18:0]、1，2-二油酰基_sn_甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)[18:1(Λ9-順式)]、POPC[16:0-18:1]、和DOTAP[18:1]。[0193]在其它實施方案中:[0194](a)所述脂質(zhì)雙層由(I)卵PC和⑵一種或多種選自以下的磷脂酰膽堿(PC)組成:1，2-二肉豆蘧?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC),1,2-二油?；鵢3_三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)、包含約50%至約70%、或約51%至約69%、或約52%至約68%、或約53%至約67%、或約54%至約66%、或約55%至約65%、或約56%至約64%、或約57%至約63%、或約58%至約62%、或約59%至約61%、或約60%的一種或多種不飽和磷脂酰膽堿的脂質(zhì)混合物，具有碳長度為14并無不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)[16:0]、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)[18:0]、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)[18:1(八9-順式)]、卩0卩(:[16:0-18:1]、和DOTAP[18:1];且其中[0195](b)混合物中卵PC的摩爾濃度為約10%至約50%或約11%至約49%，或約12%至約48%，或約13%至約47%，或約14%至約46%，或約15%至約45%，或約16%至約44%，或約17%至約43%，或約18%至約42%，或約19%至約41%，或約20%至約40%，或約21%至約39%，或約22%至約38%，或約23%至約37%，或約24%至約36%，或約25%至約35%，或約26%至約34%，或約27%至約33%，或約28%至約32%，或約29%至約31%，或約30%。[0196]在一些實施方案中，所述脂質(zhì)雙層由一種或多種選自以下的組合物組成:磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰二乙醇胺、磷脂酰肌醇(phosphatidylinosite)、鞘脂和乙氧基化留醇，或它們的混合物。在這類實施方案的示例性實施例中，所述磷脂可以是卵磷脂；所述磷脂酰肌醇可衍生自大豆、油菜、棉籽、卵和其混合物；所述鞘脂可以是神經(jīng)酰胺、腦苷酯、鞘氨醇和鞘磷脂，和其混合物；所述乙氧基化留醇可以是植物留醇、PEG-(聚乙二醇)-5-大豆留醇和PEG-(聚乙二醇)-5-菜籽留醇。在一些實施方案中，所述植物留醇包含以下組合物的至少兩種的混合物:谷留醇(sistosterol)、菜油留醇和豆甾醇。[0197]在其它示例性實施方案中，所述脂質(zhì)雙層由選自以下的一種或多種磷脂?；M成:磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇和溶血磷脂酰肌醇。[0198]在其它示例性實施方案中，所述脂質(zhì)雙層由選自單?；姿岣视王セ蚨；姿岣视王サ牧字M成。[0199]在其它示例性實施方案中，所述脂質(zhì)雙層由選自以下的一種或多種磷酸肌醇(phosphoinositides)組成:磷脂酰肌醇_3_磷酸酯(PI_3_P)、磷脂酰肌醇_4_磷酸酯(P1-4-P)、磷脂酰肌醇-5-磷酸酯(P1-5-P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸酯(PI_3，4-P2)、磷脂酰肌醇-3，5-二磷酸酯(P1-3，5-P2)、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸酯(PI_4，5-P2)、磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸酯(P1-3，4，5-P3)、溶血磷脂酰肌醇-3-磷酸酯(LP1-3-P)、溶血磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(LP1-4-P)、溶血磷脂酰肌醇-5-磷酸酯(LP1-5-P)、溶血磷脂酰肌醇_3，4-二磷酸酯(LP1-3，4-P2)、溶血磷脂酰肌醇-3，5-二磷酸酯(LP1-3，5-P2)，溶血磷脂酰肌醇_4，5-二磷酸酯(LP1-4，5-P2)和溶血磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸酯(LP1-3,4，5-P3)和磷脂酰肌醇(PI)以及溶血磷脂酰肌醇(LPI)。[0200]在其它示例性實施方案中，所述脂質(zhì)雙層由選自以下的一種或多種磷脂組成:PEG-聚(乙二醇)衍生的二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG-DSPE)、聚(乙二醇)衍生的神經(jīng)酰胺(PEG-CER)、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、卵磷脂酰膽堿(EPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、monosialogangolioside、鞘磷脂(spingomyelin)(SPM)、二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC)、二肉豆蘧?；字Ｄ憠A(DMPC)和二肉豆蘧?；字８视?DMPG)。[0201]在本發(fā)明的原始細(xì)胞的一項示例性實施方案中:[0202](a)所述一種或多種藥學(xué)活性劑包括至少一種抗癌劑；[0203](b)在缺乏活性氧簇的條件下，少于約10%至約20%的抗癌劑自所述多孔納米顆粒釋放；和[0204](C)在由于與活性氧簇接觸導(dǎo)致脂質(zhì)雙層破裂后，所述多孔納米顆粒釋放抗癌劑的量大約等于脂質(zhì)雙層經(jīng)5%(重量/體積)TritonX-100溶解釋放的抗癌劑的量的約60%至約80%、或約61%至約79%、或約62%至約78%、或約63%至約77%、或約64%至約77%、或約65%至約76%、或約66%至約75%、或約67%至約74%、或約68%至約73%、或約69%至約72%、或約70%至約71%、或約70%。[0205]本發(fā)明的原始細(xì)胞的一項示例性實施方案包括大量帶負(fù)電荷的、納米多孔的、納米顆粒二氧化硅核，所述二氧化硅核:[0206](a)經(jīng)選自以下的含胺硅烷修飾:(1)伯胺、仲胺、叔胺，其各自經(jīng)硅原子功能化；(2)單胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS);(4)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS);(5)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基硅烷；和(7)質(zhì)子化仲胺、質(zhì)子化叔烷基胺、質(zhì)子化脒、質(zhì)子化胍、質(zhì)子化吡啶、質(zhì)子化嘧啶、質(zhì)子化吡嗪、質(zhì)子化嘌呤、質(zhì)子化咪唑、質(zhì)子化吡咯、季烷基胺或其組合；[0207](b)裝載有SiRNA或蓖麻毒素A鏈；和[0208](c)被包含選自以下的脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層包封和支撐包含選自以下的脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層:[0209]I,2-二油?；?sn-甘油_3_磷酸膽堿(DOPC)、I,2_二棕櫚?；鵢sn_甘油_3_磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；鵢sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂基]_sn_甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)、1-棕櫚酰基-2-{12-[(7-硝基_2_1，3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂基}-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，且其中所述脂質(zhì)雙層包括陽離子質(zhì)子和一種或多種兩性離子磷脂。[0210]本發(fā)明的原始細(xì)胞可包括多種藥學(xué)活性成分。[0211]術(shù)語“報告子”用于描述摻入至本發(fā)明實施方案的磷脂雙層或原始細(xì)胞的負(fù)載物中并提供可被測量信號的成像劑或部分。該部分可提供熒光信號或者可以是允許放射檢測的放射性同位素。用于原始細(xì)胞中的示例性熒光標(biāo)記(優(yōu)選地經(jīng)綴合或吸附至脂質(zhì)雙層或二氧化硅核，盡管這些標(biāo)記也可被摻入至經(jīng)原始細(xì)胞遞送至細(xì)胞的負(fù)載物元件如DNA、RNA、多肽和小分子中)，包括Hoechst33342(350/461)、4',6-二脒基_2_苯基吲哚(DAPI,356/451)、AlexaFluorv405羧酸、琥珀酰亞胺酯(401/421)、CellTracker?VioletBMQC(415/516),CellTracker?GreenCMFDA(492/517)、鈣黃綠素(495/515)、膜聯(lián)蛋白V的AlexaFluor?488綴合物(495/519)、AlexaFluor*488山羊抗小鼠IgG(H+L)(495/519)、Click-1T?AHAAlexaFluor*488蛋白質(zhì)合成HCS分析(495/519)、LIVEOEAD?可固定綠色死細(xì)胞染色試劑盒(495/519)、SYlOX綠色核酸染色(504/523)、MitoSOX?紅色線粒體超氧化物指示劑(510/580)。AlexaFluor?532羧酸、琥珀酰亞胺酯(532/554)、pHrodo?琥珀酰亞胺酯(558/576)、CellTracker?RedCMTPX(577/602)、TexasRed*1，2-二(十六?；?-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(TexasRed?DHPE,583/608),AlexaFluor?647酰肼(649/666)、AlexaFluor*647羧酸、琥珀酰亞胺酯(650/668)、Ulysis?AlexaFluor?647核酸標(biāo)記試劑盒(650/670)和膜聯(lián)蛋白V(650/665)的AlexaFluor?647綴合物。還可摻入增強熒光信號或使熒光衰減變慢的部分(moities)，其包括S1wFadenGold抗衰減試劑(含和不含DAPl)和Image-1T?FX信號增強劑。所有這些均為本領(lǐng)域已知的。其它的報告子包括可被質(zhì)粒(如組蛋白封裝的超螺旋DNA質(zhì)粒)表達的多肽報告子并包括多肽報告子如綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白。本發(fā)明的報告子主要用于診斷性應(yīng)用(包括診斷患者中癌癥(癌組織)的存在或進展和患者或受試者中治療的進展)中。[0212]術(shù)語“組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA”用于描述本發(fā)明原始細(xì)胞(其利用已經(jīng)“超螺旋化”(即，使用引起質(zhì)粒在自身上折疊的過飽和鹽溶液或其它離子溶液在自身上進行折疊并“超螺旋”以變得更緊湊以有效地封裝至原始細(xì)胞中)的優(yōu)選的質(zhì)粒DNA)的優(yōu)選組分。實際上，所述質(zhì)粒可以是表達任意數(shù)目的多肽或編碼RNA(包括小發(fā)夾RNA/shRNA或小干擾RNA/siRNA)的任何質(zhì)粒，如本文另有描述。一旦超螺旋化(使用濃縮鹽或其它陰離子溶液)，所述超螺旋質(zhì)粒RNA然后與組蛋白復(fù)合以產(chǎn)生組蛋白封裝的“復(fù)合的”超螺旋質(zhì)粒DNA。[0213]本文“封裝的’DNA指的是裝載至原始細(xì)胞中(或吸附至孔中或直接限制于納米二氧化硅核自身內(nèi))的DNA。為使DNA空間上最小化，DNA經(jīng)常被封裝，其可以若干方式實現(xiàn)，從調(diào)整周圍介質(zhì)的電荷到形成DNA和例如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或其它納米顆粒(通常，但不排他為陽離子型)的小復(fù)合物。封裝DNA通常經(jīng)由脂質(zhì)復(fù)合物(即將DNA和陽離子型脂質(zhì)混合物復(fù)合)來實現(xiàn)。此外，DNA還被陽離子型蛋白質(zhì)(包括除組蛋白外的蛋白質(zhì))以及金納米顆粒(例如，NanoFlares-工程化DNA和金屬復(fù)合物,其中該納米顆粒的核為金)封裝。[0214]任意數(shù)目的組蛋白，以及其它將DNA封裝至較小體積的手段如標(biāo)準(zhǔn)陽離子型納米顆粒、脂質(zhì)或蛋白質(zhì)，可用于封裝超螺旋質(zhì)粒DNA“組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA”,但在涉及治療人類患者的治療方面，優(yōu)選使用人類組蛋白。在本發(fā)明的一些方面，本領(lǐng)域已知或可根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)容易地實施，盡管可使用其它相似比例的其它組蛋白，但人類組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4以優(yōu)選比例1:2:2:2:2的組合。DNA也可以是雙鏈線性DNA而不是質(zhì)粒DNA，其也可以任選地為超螺旋和/或經(jīng)組蛋白或其它封裝組分封裝的。[0215]可用于本發(fā)明該方面的其它組蛋白包括，例如H1F、H1F0、HlFNT,H1F00、HlFXH1H1HIST1H1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HIST1H1T;H2AF、H2AFB1、H2AFB2、H2AFB3、H2AFJ、H2AFV、H2AFX、H2AFY、H2AFY2、H2AFZ、H2A1、HIST1H2AA、HIST1H2AB、HIST1H2AC、HIST1H2AD、HIST1H2AE、HIST1H2AG、HIST1H2A1、HIST1H2AJ,HIST1H2AK、HIST1H2AL、HIST1H2AM、H2A2、HIST2H2AA3、HIST2H2AC、H2BF、H2BFM、HSBFS,HSBFWT、H2B1、HIST1H2BA、HISTIHSBB,HIST1HSBC、HISTIHSBD,HIST1H2BE、HIST1H2BF、HIST1H2BG、HIST1H2BH、HIST1H2B1、HIST1H2BJ,HIST1H2BK、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BN、HIST1H2B0、H2B2、HIST2H2BE、H3A1、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H31、HIST1H3J、H3A2、HIST2H3C、H3A3、HIST3H3、H41、HIST1H4A、HIST1H4B、HIST1H4C、HIST1H4D、HIST1H4E、HIST1H4F、HIST1H4G、HIST1H4H、HIST1H41、HIST1H4J、HIST1H4K、HIST1H4L、H44和HIST4H4。[0216]術(shù)語“核定位序列”指的是摻入或者交聯(lián)至組蛋白的肽序列，其中所述組蛋白包含組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA。在一些實施方案中，本發(fā)明的原始細(xì)胞可進一步包含經(jīng)核定位序列(注意組蛋白可與該核定位序列交聯(lián)或質(zhì)粒本身可經(jīng)修飾以表達核定位序列)修飾(交聯(lián))的質(zhì)粒(常為組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA)，所述核定位序列增強了組蛋白封裝的質(zhì)粒穿透細(xì)胞核并將其內(nèi)容物放置于那里(以促進表達和最終細(xì)胞死亡)的能力。這些肽序列有助于將組蛋白封裝的質(zhì)粒DNA和結(jié)合的組蛋白搬運至靶細(xì)胞的細(xì)胞核中，隨后質(zhì)粒將表達所需的肽和/或核苷酸以遞送治療性和/或診斷性分子(多肽和/或核苷酸)至靶細(xì)胞的細(xì)胞核中。本領(lǐng)域公知，任意數(shù)目的交聯(lián)劑可用于將核定位序列共價連接至組蛋白(常位于賴氨酸基團或在懸掛(pendant)暴露于多肽的氨基酸的側(cè)鏈中具有親核性或親電性基團的其它基團)，其可用于將組蛋白封裝的質(zhì)粒引入細(xì)胞核中?；蛘撸磉_核定位序列的核苷酸序列可定位于靠近表達組蛋白的核苷酸序列的質(zhì)粒中，從而發(fā)生綴合至核定位序列的組蛋白的表達，促進質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的細(xì)胞核中。[0217]蛋白質(zhì)通過核被膜進入細(xì)胞核。核被膜由同心膜、外層膜和內(nèi)層膜組成。這些是通往細(xì)胞核的入口。被膜由孔或大細(xì)胞核復(fù)合物組成。經(jīng)NLS翻譯的蛋白質(zhì)將與輸入蛋白(akakaryopherin)強烈地結(jié)合，同時該復(fù)合物將移動通過核孔。任意數(shù)目的核定位序列可用于將組蛋白封裝的質(zhì)粒DNA引入至細(xì)胞核中。優(yōu)選的核定位序列包括H2N-GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOHSEQ1.DNO:9、RRMKffKK(SEQIDNO:10)、PKKKRKV(SEQIDNO:11)和KR[PAATKKAGQA]KKKK(SEQIDNO:12)、核質(zhì)蛋白的NLS、包含兩個堿性氨基酸簇、被具有約10個氨基酸的間隔區(qū)分隔的原型二分裂信號(prototypicalbipartitesignal)。數(shù)目眾多的其它核定位序列是本領(lǐng)域公知的。參見,例如LaCasse等人，NuclearlocalizationsignalsoverlapDNA-orRNA-bindingdomainsinnucleicacid-bindingproteins.Nuc1.AcidsRes.,23,1647-16561995)；ffeis,K.1mportinsandexportins:howtogetinandoutofthenucleus[publishederratumappearsinTrendsBiochemSci1998Jul；23(7):235].TIBS,23，185-9(1998)；和MuratCokoI,RajNair&BurkhardRost,“Findingnuclearlocalizationsignals，，，atthewebsiteubic.bioc.Columbia,edu/papers/2000nls/paper.html#tab2。[0218]術(shù)語“癌癥”用于描述具有失去正常控制的獨特特征的腫瘤細(xì)胞(新生物)的增殖，其導(dǎo)致不受調(diào)控的生長、缺少分化、局部組織侵襲和/或轉(zhuǎn)移。如本文所用，新生物包括但不限于，受試者或宿主組織中細(xì)胞形態(tài)學(xué)不規(guī)則以及與相同類型組織的正常增生相比，受試者組織中細(xì)胞的病理性增生。此外，新生物包括侵襲性或非侵襲性的良性腫瘤和惡性腫瘤(例如，結(jié)腸腫瘤)。惡性新生物與良性新生物區(qū)別在于前者顯示較大程度的發(fā)育異常，或細(xì)胞分化和定向的損失，并且具有侵襲和轉(zhuǎn)移的性質(zhì)。在本文中術(shù)語癌癥還包括耐藥癌癥，包括多重耐藥癌癥。新生物或瘤變(本發(fā)明的靶細(xì)胞可自其中衍生得到)的實例包括但不限于，癌(例如，鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、肝細(xì)胞癌和腎細(xì)胞癌)，特別是膀胱癌、骨癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌(結(jié)腸直腸癌)、食管癌、頭部癌癥、腎癌、肝癌(肝細(xì)胞癌)、肺癌、鼻咽癌、頸部癌癥、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病，如急性髓細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)、急性T細(xì)胞成淋巴細(xì)胞性白血病、成人T細(xì)胞白血病、嗜堿細(xì)胞性白血病、嗜酸細(xì)胞性白血病、粒細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞性白血病、白細(xì)胞減少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、巨核細(xì)胞性白血病、小原粒型白血病、單核細(xì)胞性白血病、中性粒細(xì)胞性白血病和干細(xì)胞白血病；良性和惡性淋巴瘤，特別是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B細(xì)胞淋巴瘤；良性和惡性黑色素瘤；骨髓增生性疾?。蝗饬?特別是尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神經(jīng)上皮樣瘤和滑膜肉瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(例如,膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、松果體細(xì)胞腫瘤、腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經(jīng)纖維瘤和神經(jīng)鞘瘤)；生殖系腫瘤(例如，腸癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、肺癌(例如，小細(xì)胞肺癌、混合型小細(xì)胞和非小細(xì)胞癌、胸膜間皮瘤，包括轉(zhuǎn)移性胸膜間皮瘤小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星形細(xì)胞瘤、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤)；混合型瘤變，特別是癌肉瘤和霍奇金?。灰约盎旌掀鹪吹哪[瘤，如Wilm腫瘤和畸胎癌。應(yīng)當(dāng)注意其中一些腫瘤包括肝細(xì)胞癌和宮頸癌顯示在癌細(xì)胞上特異性地展現(xiàn)升高水平的MET受體，并且是本發(fā)明實施方案的組合物和療法(其包括與原始細(xì)胞復(fù)合的MET結(jié)合肽)的主要靶點。[0219]術(shù)語“同服”和“共同給予”同義地用于描述給予與至少一種其它藥劑(常為至少一種其它抗癌劑(如本文另有描述))組合的至少一種本發(fā)明的原始細(xì)胞組合物，本文明確的公開了在同一時間或大約在同一時間被視為有效量的量和濃度。盡管優(yōu)選同時給予共同給予的組合物/藥劑，但可在多個時間給予藥劑從而使得兩種(或兩種以上)組合物/藥劑的有效濃度在患者中同時出現(xiàn)至少一段時間?；蛘撸诒景l(fā)明的一些方面中，可能可以使共同給予的組合物/藥劑在不同的時間在患者中展現(xiàn)其抑制作用，且最終結(jié)果為癌癥(尤其包括肝細(xì)胞癌或細(xì)胞性癌)的抑制和治療以及其它疾病狀態(tài)、病癥或并發(fā)癥的減少或抑制。當(dāng)然，當(dāng)不只是疾病狀態(tài)、感染或其它病癥存在時，本發(fā)明的化合物可根據(jù)需要與其它藥劑組合以治療該其它感染或疾病或病癥。[0220]術(shù)語“抗癌劑”用于描述可與一種或多種包含本發(fā)明的原始細(xì)胞的組合物組合配制的化合物，并用于治療任意類型的癌癥，其中尤其是肝細(xì)胞癌或?qū)m頸癌?？膳c本發(fā)明的化合物一起配制的抗癌化合物包括，例如，可用于本發(fā)明的例示性抗癌劑包括依維莫司、曲貝替定、白蛋白結(jié)合型紫杉醇(abraxane)、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林(enzastaurin)、凡德他尼(vandetanib)、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調(diào)節(jié)劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗(oregovomab)、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗(zanolimumab)、edotecarin、粉防己喊、盧I:匕替康、替米矛[I芬、obIimersen、ticiIimumab、易普利單抗、棉酚、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,BIO140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRlKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744,Sdx102、他侖帕奈(talampanel)、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體、5’-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib、ro0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二鈉鹽七水合物、喜樹堿、PEG-標(biāo)記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺酰基哌啶(piperadine)甲基)_吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6，Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x,其中x=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;ΤΑΚ-165、ΗΚΙ-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、ΕΚΒ-569、ΡΚΙ-166、GW-572016、洛那法尼(1nafarnib)、BMS-214662、替吡法尼(tipifarnib);氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二?；桨芬涣u肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛(wèi)、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光輝霉素、長春堿、長春瑞濱、托泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內(nèi)皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、頂862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內(nèi)酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米(bortezimib)、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬(Pipendoxifene)、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬(Acolbifene)、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-0-(2-羥基乙基)-雷帕霉素、替西羅莫司、AP-23573、RADOOUABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀(darbepoetin)、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的干擾素a_2a、干擾素a_2a、PEG化的干擾素a-2b，干擾素a_2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬酰胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、環(huán)孢菌素、柔紅霉素脂質(zhì)體、Edwina-門冬酰胺酶、銀89、卡索匹坦(casopitant)、奈妥匹坦(netupitant)、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦(aprepitant)、苯海拉明、輕嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細(xì)胞生成素、阿法依泊汀(epoetinalfa)、阿法達貝泊汀(darbepoetinalfa)和其混合物。[0221]在整個說明書中，術(shù)語“抗肝細(xì)胞癌劑”用于描述可用于抑制、治療或降低肝細(xì)胞癌可能性或該癌癥的轉(zhuǎn)移的抗癌劑。本發(fā)明中可使用的抗癌劑包括，例如，多吉美(索拉菲尼)、舒尼替尼、貝伐珠單抗、特羅凱(厄洛替尼)、泰立沙(拉帕替尼)和其混合物。此外，本發(fā)明還可使用其它抗癌劑，其中這類藥劑可抑制癌癥(尤其是肝細(xì)胞癌)的轉(zhuǎn)移。[0222]術(shù)語“抗病毒劑”用于描述生物活性劑/藥物，其抑制病毒(包括突變株如耐藥病毒株)的生長和/或加工(elaboration)。優(yōu)選的抗病毒劑包括抗HIV劑、抗HBV劑和抗HCV劑。在本發(fā)明的一些方面，尤其是治療肝細(xì)胞癌是治療目的的方面，考慮到經(jīng)常發(fā)現(xiàn)乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)是與肝細(xì)胞癌相關(guān)的主要或次要感染或疾病狀態(tài)，抗丙肝劑或抗乙肝劑的納入可與其它傳統(tǒng)抗癌劑組合以影響治療。本發(fā)明可使用的抗HBV劑，作為原始細(xì)胞中的負(fù)載物組分或作為包括原始細(xì)胞群的藥物組合物中的額外的活性劑，包括如下藥劑:賀維力(阿德福韋二匹伏酯)、拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋、恩曲他濱、克來夫定、valtoricitabine、amdoxovir、帕拉德福韋(pradefovir)、racivir、BAM205、硝唑尼特、UT231_B、Bay41_4109、EHT899、日達仙(胸腺肽α-1)和其混合物。用于本發(fā)明的典型的抗HCV劑包括如下藥劑:波普瑞韋(boceprevir)、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100,NM283、VX-950(替拉瑞韋)、SCH50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS9190、GS9256、GS9451、GS5885、GS6620、GS9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GN1-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI201335,BI207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PS1-938、PS1-7977、PS1-7851、SCY-635、利巴韋林、PEG化干擾素、PHX1766,SP-30和其混合物。[0223]術(shù)語“抗HIV劑”指的是抑制HIV病毒(I和/或II)或其突變株的生長和/或加工的化合物。用于本發(fā)明的可作為負(fù)載物包含于本發(fā)明原始細(xì)胞的例示性抗HIV劑包括，例如，其中包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、其它非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(即，那些不是本發(fā)明代表的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑，其例示性化合物可包括，例如3TC(拉米夫定)、AZT(齊多夫定)、(-)-FTC、ddl(地達諾新)、ddC(扎西他濱)、阿巴卡韋(ABC)、替諾福韋(PMPA)、D-D4FC(Reverset)、D4T(司他夫定)、Racivir、L-FddC,L-FD4C、NVP(奈韋拉平)、DLV(地拉韋定)、EFV(依法韋侖)、SQVM(甲磺酸沙奎那韋)、RTV(利托那韋)、IDV(茚地那韋)、SQV(沙奎那韋)、NFV(那非那韋)、APV(安潑那韋)、LPV(洛匹那韋)、其中融合抑制劑如T20、fuseon和其混合物。[0224]術(shù)語“靶向活性物種”用于描述與本發(fā)明的原始細(xì)胞(其與所靶向細(xì)胞的表面上的部分結(jié)合從而使得該原始細(xì)胞可選擇性地與該靶細(xì)胞的表面結(jié)合并將其內(nèi)容物放置于細(xì)胞中)的表面復(fù)合或優(yōu)選地共價鍵接的化合物或部分。在與靶細(xì)胞結(jié)合的物種中，用于本發(fā)明的靶向活性物種優(yōu)選為本文另有描述的靶向肽、包含抗體或抗體片段的多肽、適體或碳水化合物。[0225]術(shù)語“靶向肽”用于描述一種優(yōu)選的靶向活性物種，具有特定序列的肽，其與癌細(xì)胞中的受體或其它多肽結(jié)合并允許本發(fā)明的原始細(xì)胞靶向表達與該靶向肽結(jié)合的肽(為受體或其它功能性多肽)的特定細(xì)胞。在本發(fā)明中，例示性靶向肽包括，例如，SP94游離肽(H2N-SFSIILTPILPL-C00H，SEQIDNO:6)、經(jīng)C端半胱氨酸修飾用于與交聯(lián)劑綴合的SP94肽(H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(SEQID.NO:13)或8mer多聚精氨酸(H2N-RRRRRRRR-C00H,SEQIDNO:14))、經(jīng)修飾的SP94肽(H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH,SEQIDNO:8)或MET結(jié)合肽，如本文另有描述。其它靶向肽是本領(lǐng)域已知的。靶向肽可通過使用本文另有描述的交聯(lián)劑與脂質(zhì)雙層復(fù)合或優(yōu)選地共價連接。[0226]術(shù)語“MET結(jié)合肽”或“MET受體結(jié)合肽”用于五(5)中7-mer肽，已顯示其將MET受體結(jié)合到癌細(xì)胞表面，結(jié)合效率增強。根據(jù)本發(fā)明，鑒定了若干具有可變氨基酸序列的小肽，所述序列以可變水平的特異性和可變能力結(jié)合MET受體(a.La.肝細(xì)胞生長因子受體，由基因c-MET表達)以活化MET受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。使用噬菌體展示生物淘選鑒定7-mer肽，所得序列的實例證明與MET受體以及隨后與表達高水平MET受體的細(xì)胞如癌細(xì)胞(例如肝細(xì)胞、卵巢和宮頸)的結(jié)合增強，其顯示如下。生物淘選方法中若干種最常觀測到的序列的結(jié)合數(shù)據(jù)也再本發(fā)明的實施例部分呈現(xiàn)。具體地，這些肽可用作細(xì)胞特異性療法的靶向配體。然而，具有活化受體通路能力的肽本身或與其它治療組合可具有額外的治療值。已發(fā)現(xiàn)很多肽不僅結(jié)合肝細(xì)胞癌(其為最初預(yù)期的靶點)還結(jié)合多種其它癌，包括卵巢癌和宮頸癌。據(jù)信這些肽可廣范圍地應(yīng)用于靶向或治療多種癌癥和其它與MET和相關(guān)受體表達有關(guān)的生理學(xué)問題。[0227]以下五種7-mer肽序列顯示大量與MET受體結(jié)合并具體地用作用于本發(fā)明原始細(xì)胞上的靶向肽。[0228]ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)SEQIDNO:1[0229]TATFffFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)SEQIDNO:2[0230]TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)SEQIDNO:3[0231]IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)SEQIDNO:4[0232]WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)SEQIDNO:5[0233]這些肽可各自單獨使用或與上述其它MET肽組合使用或與其它可有助于將本發(fā)明的原始細(xì)胞與癌細(xì)胞(其中，包括肝細(xì)胞癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞)結(jié)合的靶向肽組合使用。這些結(jié)合肽也可單獨作為MET結(jié)合肽用于藥物化合物中以治療癌癥和抑制肝細(xì)胞生長因子結(jié)合。[0234]術(shù)語“融合肽”和“內(nèi)體裂解肽”同義地用于描述任選地并優(yōu)選地交聯(lián)至本發(fā)明的原始細(xì)胞脂質(zhì)雙層表面上的肽。融合肽被摻合至原始細(xì)胞上以促進或有助于從內(nèi)體逃逸并促進原始細(xì)胞引入至靶細(xì)胞中以影響預(yù)期結(jié)果(如本文另有描述的治療性和/或診斷性結(jié)果)。在本領(lǐng)域已知的融合肽中，用于本發(fā)明原始細(xì)胞中的代表性的和優(yōu)選的融合肽包括H5WYG肽、H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(SEQID.NO:13)或8mer聚精氨酸(H2N-RRRRRRRR-C00H,SEQIDNO:14)。[0235]術(shù)語“交聯(lián)劑”用于描述具有可變長度包含兩個不同官能團的雙功能化合物，其可用于將多種本發(fā)明的組分彼此共價連接。本發(fā)明的交聯(lián)劑可包含兩個親電基團(以與寡核苷酸的肽上的親核基團反應(yīng))、一個親電基團和一個親核基團或兩個親核基團。取決于待連接的組分和所需要的相對柔性，所述交聯(lián)劑的長度可變。交聯(lián)劑可用于將靶向和/或融合肽錨定于磷脂雙層上，用于將核定位序列連接至組蛋白以封裝超螺旋質(zhì)粒DNA，且在一些情況中，用于交聯(lián)原始細(xì)胞的脂質(zhì)雙層中的脂質(zhì)。存在數(shù)量眾多的可用于本發(fā)明的交聯(lián)劑，很多可購得或在文獻中可得。其中，用于本發(fā)明的優(yōu)選交聯(lián)劑包括，例如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)，Ν-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼(BMPH),NHS-(PEG)n-馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺基-[(N-馬來酰亞胺基丙酰胺基)_二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)和6-[3'-(2-吡啶基二硫代)_丙酰胺基]己酸琥珀酰亞胺酯(LC-SPDP)。[0236]如上文所詳述,本發(fā)明的多孔納米顆粒核可包括具有至少一個維度(dimension)的多孔納米顆粒，例如，寬度或直徑為約3000nm或更小、約1000nm或更小、約500nm或更小、約200nm或更小。優(yōu)選地，所述納米顆粒核為球形，優(yōu)選直徑為約500nm或更小，更優(yōu)選為約S-1Onm至約200nm。在實施方案中，所述多孔顆粒核具有多種橫斷層形狀，包括環(huán)形、矩形、正方形或其它形狀。在一些實施方案中，所述多孔顆粒核可具有平均孔徑范圍為約2nm至約30nm的核，盡管所述平均孔徑和其它性質(zhì)(例如，所述多孔顆粒核的孔隙率)不限于本發(fā)明教導(dǎo)的多種實施方案。[0237]通常，本發(fā)明的原始細(xì)胞是生物相容的。藥物和其它負(fù)載物組分經(jīng)常通過吸附和/或所述顆粒核的孔的毛細(xì)填充至大約最終原始細(xì)胞(含所有組分)的50%重量。在本發(fā)明的一些實施方案中，所裝載的負(fù)載物可自顆粒核(中孔)的多孔表面釋放，其中釋放特點可由例如孔徑、多孔顆粒核的表面化學(xué)、系統(tǒng)的PH值和/或本文概述的多孔顆粒核與周圍脂質(zhì)雙層間的相互作用決定或調(diào)整。[0238]在本發(fā)明中，用于制備原始細(xì)胞的多孔納米顆粒核可變得親水或進行性地更加疏水，如本文另有描述，且可進一步經(jīng)處理以提供更加親水的表面。例如，中孔二氧化硅顆?？蛇M一步經(jīng)氫氧化銨和過氧化氫處理以提供更高的親水性。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，脂質(zhì)雙層被融合至多孔顆粒核上以形成原始細(xì)胞。本發(fā)明的原始細(xì)胞可包括多種重量比的多種脂質(zhì)，優(yōu)選包含1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、I,2-二棕櫚?；?sn_甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS),1,2-二油酰基_3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化-(l’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油_3_磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]_sn_甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)、1-棕櫚酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。[0239]用于制備本發(fā)明的原始細(xì)胞的脂質(zhì)雙層可例如通過以下方法制備:使用本領(lǐng)域已知或如本文另有描述的標(biāo)準(zhǔn)方案，將水合脂質(zhì)薄膜通過孔徑為例如約IOOnm的過濾器擠出。然后可將濾過的脂質(zhì)雙層膜與多孔顆粒核例如通過吸量管混合融合。在一些實施方案中，過量的脂質(zhì)雙層或脂質(zhì)雙層薄膜可用于形成原始細(xì)胞以改善該原始細(xì)胞的膠體穩(wěn)定性。[0240]在一些診斷性實施方案中，為了診斷性目的，多種染料或熒光(報告子)分子可包含于原始細(xì)胞負(fù)載物(如由質(zhì)粒DNA表達的)中或依附于所述多孔顆粒核和/或脂質(zhì)雙層。例如，所述多孔顆粒核可以是二氧化硅核或脂質(zhì)雙層，并且可以是經(jīng)FITC(綠色熒光)共價標(biāo)記的，而脂質(zhì)雙層或顆粒核可以是經(jīng)FITCTexasred(紅色熒光)共價標(biāo)記的。然后，可通過例如共聚焦熒光觀測所述多孔顆粒核、脂質(zhì)雙層和所形成的原始細(xì)胞以用于診斷性應(yīng)用中。此外，如本文所討論的，質(zhì)粒DNA可作為負(fù)載物用于本發(fā)明的原始細(xì)胞中從而該質(zhì)粒可表達一種或多種可用于診斷性應(yīng)用中的熒光蛋白如綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白。[0241]在多項實施方案中，原始細(xì)胞用于協(xié)同系統(tǒng)中，其中所述脂質(zhì)雙層融合或脂質(zhì)體融合(即，在多孔顆粒核上)裝載并密封有多種負(fù)載物組分和顆粒核的孔，從而形成經(jīng)裝載的原始細(xì)胞用于負(fù)載物遞送穿過脂質(zhì)雙層的細(xì)胞膜，或者如果適用，通過多孔納米顆粒的溶出。在一些實施方案中，除融合單個脂質(zhì)(例如磷脂)雙層外，多個具有相反電荷的雙層可被接連融合至多孔顆粒核上以進一步影響負(fù)載物的裝載和/或密封以及最終原始細(xì)胞的釋放特征。[0242]負(fù)載物遞送可包括融合和協(xié)同裝載機制。例如，負(fù)載物可通過多孔顆粒上的脂質(zhì)體融合協(xié)同地裝載、包封或密封。所述負(fù)載物可包括，例如，小分子藥物(例如，尤其包括抗癌藥物和/或抗病毒藥物如抗HBV或抗HCV藥物)、肽、蛋白質(zhì)、抗體、DNA(尤其是質(zhì)粒DNA，包括優(yōu)選的組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA)、RNA(包括shRNA和siRNA(其也可由作為負(fù)載物摻入原始細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA表達))、熒光染料(包括熒光染料肽，其可由摻入原始細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA表達)。[0243]在本發(fā)明的實施方案中，負(fù)載物可被裝載至多孔顆粒核的孔(中孔)中以形成經(jīng)裝載的原始細(xì)胞。在多項實施方案中，任何開發(fā)用于基于脂質(zhì)體的藥物遞送的常規(guī)技術(shù)，例如使用PEG化的靶向遞送，可被轉(zhuǎn)移并應(yīng)用于本發(fā)明的原始細(xì)胞。[0244]如上文所討論的，靜電學(xué)和孔徑可在負(fù)載物裝載中發(fā)揮作用。例如，多孔二氧化娃納米顆粒可搬運負(fù)電荷，而孔徑在約2nm至約IOnm或IOnm以上是可調(diào)的。負(fù)電荷納米顆?？删哂形秸姾煞肿拥淖匀悔厔?，而正電荷納米顆粒具有吸附負(fù)電荷分子的自然趨勢。在多項實施方案中，其它性質(zhì)如表面潤濕性(如，疏水性)也可影響具有不同疏水性的負(fù)載物的裝載。[0245]在多項實施方案中，負(fù)載物裝載可以是通過調(diào)整脂質(zhì)組合物進行的協(xié)同的脂質(zhì)輔助的裝載。例如，如果負(fù)載物組分是負(fù)電荷分子，則負(fù)載物裝載至負(fù)電荷二氧化硅可通過脂質(zhì)輔助的裝載實現(xiàn)。在一些實施方案中，例如，當(dāng)脂質(zhì)雙層融合至二氧化硅表面顯示融合和協(xié)同裝載機制時，帶負(fù)電荷的物種可作為負(fù)載物被裝載至負(fù)電荷二氧化硅顆粒的孔中。以該方式，帶負(fù)電荷的中孔顆粒上的非負(fù)電荷(即，正電荷或中性)脂質(zhì)雙層或脂質(zhì)體的融合可用于裝載具有負(fù)電荷負(fù)載物組分的顆粒核。所述負(fù)電荷負(fù)載物組分可在經(jīng)裝載的原始細(xì)胞(與溶液中帶電荷的負(fù)載物組分相比，其具有超過約100倍的濃度)中濃縮。在其它實施方案中，通過改變中孔顆粒和脂質(zhì)雙層的電荷，正電荷負(fù)載物組分可被容易地裝載至原始細(xì)胞中。[0246]—旦產(chǎn)生，在給予后，所述經(jīng)裝載的原始細(xì)胞可具有細(xì)胞攝取以將負(fù)載物遞送至所需位點。例如，可向患者或受試者給予負(fù)載物裝載的原始細(xì)胞并且包含靶向肽的原始細(xì)胞可與靶細(xì)胞結(jié)合并被靶細(xì)胞(例如，受試者或患者中的癌細(xì)胞)內(nèi)化或攝取。由于靶細(xì)胞中負(fù)載物裝載的原始細(xì)胞的內(nèi)化，然后負(fù)載物組分可被遞送至靶細(xì)胞中。在一些實施方案中，所述負(fù)載物為小分子，其可被直接遞送至靶細(xì)胞中用于治療。在其它實施方案中，負(fù)電荷DNA或RNA(包括shRNA或siRNA)，尤其包括DNA質(zhì)粒(其優(yōu)選配制為組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA，優(yōu)選地經(jīng)核定位序列修飾)可被靶細(xì)胞直接遞送或內(nèi)化。因此，DNA或RNA可首先被裝載至原始細(xì)胞中，然后通過所述經(jīng)裝載的原始細(xì)胞的內(nèi)化遞送至靶細(xì)胞中。[0247]如所討論的，被裝載至原始細(xì)胞并被原始細(xì)胞遞送至靶細(xì)胞中的負(fù)載物包括小分子或藥物(尤其是抗癌劑或抗HBV劑和/或抗HCV劑)、生物活性大分子(生物活性多肽，如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈或RNA分子,如shRNA和/或siRNA,如本文另有描述)或組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA(其可表達治療性或診斷性肽或治療性RNA分子如shRNA或siRNA，其中所述組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA任選地并優(yōu)選地經(jīng)核定位序列(其可定位并濃縮所遞送的質(zhì)粒DNA至靶細(xì)胞的細(xì)胞核中)修飾)。如此，經(jīng)裝載原始細(xì)胞可將它們的負(fù)載物遞送至靶細(xì)胞以用于治療或診斷。[0248]在本發(fā)明的多項實施方案中，原始細(xì)胞和/或經(jīng)裝載的原始細(xì)胞可提供靶向遞送方法學(xué)以選擇性地將所述原始細(xì)胞或負(fù)載物組分遞送至靶細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)中。例如，脂質(zhì)雙層的表面可經(jīng)相應(yīng)于靶細(xì)胞的靶向活性物種修飾。所述靶向活性物種可以是本文另有描述的靶向肽、包含抗體或抗體片段的多肽、適體、碳水化合物或其它與靶細(xì)胞結(jié)合的部分。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，所述靶向活性物種是本文另有描述的靶向肽。在一些實施方案中，優(yōu)選的肽靶向物種包括本文另有描述的MET結(jié)合肽。[0249]例如，通過在經(jīng)裝載的原始細(xì)胞的表面上提供靶向活性物種(優(yōu)選靶向肽)，所述原始細(xì)胞選擇性地與本發(fā)明的祀細(xì)胞結(jié)合。在一項實施方案中,通過將祀向癌細(xì)胞(包括肝癌細(xì)胞)的本文另有描述的示例性靶向肽SP94或類似物或MET結(jié)合肽綴合至脂質(zhì)雙層，由于所述示例性SP94或MET結(jié)合肽對所述癌(包括肝癌)細(xì)胞的特異性祀向，大量的負(fù)載物裝載的原始細(xì)胞可被該特異性癌細(xì)胞識別并內(nèi)化。在大多數(shù)情況中，如果所述原始細(xì)胞與所述靶向肽綴合，則所述原始細(xì)胞選擇性地與所述癌細(xì)胞結(jié)合并且不與非癌性細(xì)胞發(fā)生明顯的結(jié)合。[0250]一旦被所述靶細(xì)胞結(jié)合并攝取，所述經(jīng)裝載的原始細(xì)胞可從多孔顆粒釋放負(fù)載物組分并將所釋放的負(fù)載物組分轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞中。例如，被多孔顆粒核上的脂質(zhì)體融合的雙層密封在原始細(xì)胞內(nèi)的負(fù)載物組分可從所述脂質(zhì)雙層的孔中釋放，轉(zhuǎn)運穿過所述脂質(zhì)雙層的原始細(xì)胞膜并遞送至靶細(xì)胞內(nèi)。在本發(fā)明的實施方案中，原始細(xì)胞中負(fù)載物組分的釋放特點與僅使用本領(lǐng)域已知的脂質(zhì)體時的釋放特點相比更可控。負(fù)載物的釋放可通過例如多孔核和脂質(zhì)雙層的相互作用和/或其它參數(shù)如系統(tǒng)的PH值來測定。例如，負(fù)載物的釋放可通過脂質(zhì)雙層、通過多孔二氧化硅的溶解實現(xiàn)；同時負(fù)載物從原始細(xì)胞中的釋放可以是PH依賴的。[0251]在一些實施方案中，負(fù)載物的pH值常小于7，優(yōu)選為約4.5至約6.0，但可以是約pH14或小于pH14。較低的pH與高pH相比傾向于更顯著地促進負(fù)載物組分的釋放。較低的PH是有利的，因為大多數(shù)細(xì)胞中的內(nèi)體隔室處于低pH(約5.5)，但細(xì)胞的負(fù)載物遞送速率可被負(fù)載物的pH影響。取決于負(fù)載物和負(fù)載物從原始細(xì)胞中釋放所處的pH，負(fù)載物的釋放可以是相對短的(約數(shù)小時至一天)或持續(xù)數(shù)天至約20-30天或更長。因此，本發(fā)明可適應(yīng)于從原始細(xì)胞本身的即釋和/或緩釋應(yīng)用。[0252]在一些實施方案中，表面活性劑的納入可使得脂質(zhì)雙層快速的破裂，將負(fù)載物組分轉(zhuǎn)運穿過原始細(xì)胞以及靶細(xì)胞的脂質(zhì)雙層。在一些實施方案中，表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)的應(yīng)用/釋放可使所述原始細(xì)胞的磷脂雙層破裂，從而促進負(fù)載物快速地從原始細(xì)胞中釋放至靶細(xì)胞中。除表面活性劑外，其它材料也可被納入以使所述雙層快速破裂。一個實例是金或磁性納米顆粒，其可使用光和熱以產(chǎn)生熱量從而使所述雙層破裂。此外，可調(diào)節(jié)所述雙層以在離散的生物物理現(xiàn)象如在響應(yīng)活性氧簇產(chǎn)生增加的炎癥過程中破裂。在一些實施方案中，所述脂質(zhì)雙層的破裂可依次誘導(dǎo)負(fù)載物組分從原始細(xì)胞的顆粒核的孔中即刻釋放和完全釋放。以該方式，與本領(lǐng)域的其它遞送系統(tǒng)相比，原始細(xì)胞平臺可提供日益多樣的遞送系統(tǒng)。例如，當(dāng)與僅使用納米顆粒的遞送系統(tǒng)相比時，本文所公開的原始細(xì)胞平臺可提供簡單的系統(tǒng)并可利用脂質(zhì)體或脂質(zhì)雙層的低毒性和免疫原性以及其被PEG化或被綴合以延長循環(huán)時間和影響靶向作用的能力。在另一實例中，當(dāng)與僅使用脂質(zhì)體的遞送系統(tǒng)相比，所述原始細(xì)胞平臺可提供更穩(wěn)定的系統(tǒng)并利用中孔核以控制裝載和/或釋放特點并提供增加的負(fù)載物容量。[0253]此外，多孔顆粒核上的脂質(zhì)雙層和其融合可被微調(diào)以控制裝載、釋放和靶向特點并且可包含融合肽和相關(guān)的肽以促進原始細(xì)胞的遞送，達到更大的治療性和/或診斷性作用。而且，所述原始細(xì)胞的脂質(zhì)雙層可為配體展示和多價靶向提供流體界面，由于流體脂質(zhì)界面上配體重組的容量，其允許相對低表面配體密度的特異性靶向。此外，本文所公開的原始細(xì)胞可容易地進入靶細(xì)胞而無多孔顆粒支撐的空脂質(zhì)體不能被所述細(xì)胞內(nèi)化。[0254]本發(fā)明的藥物組合物包含如本文另有描述與藥學(xué)上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合配制以產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果(例如，治療性結(jié)果和/或診斷性分析，包括治療監(jiān)測)的有效群體的原始細(xì)胞。取決于所需要獲得的結(jié)果，所述組合物群體內(nèi)的原始細(xì)胞可以是相同的或不同的。本發(fā)明的藥物組合物還可包含額外的生物活性劑或藥物，如抗癌劑或抗病毒劑，例如抗HIV劑、抗HBV劑或抗HCV劑。[0255]通常，根據(jù)受試者的體格大小和病癥，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的藥物規(guī)范，確定所述化合物的給予劑量和途徑。所采用的劑量水平可變化巨大，且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。通常，采用毫克(mg)至克(g)的量。可通過多種途徑，例如口服、經(jīng)皮、圍神經(jīng)或胃腸外(即靜脈)、皮下、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)或肌內(nèi)注射，向受試者給予所述組合物，其中包括口腔、直腸和經(jīng)皮給予。本發(fā)明的方法治療的受試者包括人、伴侶動物、實驗動物等。本發(fā)明涵蓋即釋和/或緩/控釋組合物，包括同時包含即釋和緩釋制劑的組合物。當(dāng)不同群體的原始細(xì)胞用于藥物組合物中時或當(dāng)一種或多種額外的生物活性劑與一種或多種群體的本文另有描述的原始細(xì)胞組合使用時，尤其如此。[0256]包含本發(fā)明化合物的制劑可以是液體、固體、半固體或凍干粉末形式，如例如，溶液、混懸液、乳劑、緩釋制劑、片劑、膠囊、散劑、栓劑、乳膏劑、軟膏劑、洗劑、氣霧劑、貼劑等，優(yōu)選適于容易給予精確計量的單位劑量形式。[0257]本發(fā)明的藥物組合物通常包括常規(guī)藥物載體或賦形劑且可能額外地包括其它藥用劑、載體、佐劑、添加劑等。優(yōu)選地，所述組合物為約0.1重量％至約85重量％、約0.5重量％至約75重量％為本發(fā)明的一種或多種化合物，其余基本上由適宜的藥物賦形劑組成。[0258]用于胃腸外給予(例如，靜脈、肌內(nèi)或鞘內(nèi))的可注射組合物通常包含于適宜1.V.溶液如滅菌生理鹽水溶液中的化合物。所述組合物還可作為混懸劑在水性乳劑中配制。[0259]液體組合物可通過將原始細(xì)胞群(約0.5重量％至約20重量％或更多)和任選的藥用佐劑溶解或分散于載體例如鹽水、水性葡萄糖、甘油或乙醇中以形成溶液或混懸劑。為用于口服液體制劑，可以溶液、混懸劑、乳劑或糖漿劑制備所述組合物，以液體形式或適于在水或生理鹽水中水合的干燥形式提供。[0260]為了口服給予，這類賦形劑包括藥用級別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂等。如果需要，所述組合物也可包含少量的非毒性輔助物質(zhì)如潤濕劑、乳化劑或緩沖劑。[0261]當(dāng)所述組合物以固體制劑的形式用于口服給予時，所述制劑可以是片劑、顆粒劑、散劑、膠囊等。在片劑制劑中，所述組合物通常與添加劑例如賦形劑(如糖類或纖維素制劑)、粘合劑如淀粉糊或甲基纖維素、填充劑、崩解劑和其它藥物制劑制備中通常使用的添加劑一起配制。[0262]制備這類劑型的方法是已知的或者對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的；例如，參見Remington’sPharmaceuticalSciences(17thEd.,MackPub.C0.,1985)。所給予的組合物將包含在生物學(xué)系統(tǒng)(包括本發(fā)明的患者或受試者)中用于治療性用途的藥學(xué)上有效量的所選擇的化合物。[0263]治療有需要的患者或受試者的特定疾病狀態(tài)或感染(尤其包括癌癥和/或HBV、HCV或HIV感染)的方法包括給予有效量的本發(fā)明的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療性原始細(xì)胞和任選至少一種額外的生物活性(例如，抗病毒)劑。[0264]本發(fā)明的診斷性方法包括向有需要的患者(懷疑患有癌癥的患者)給予有效量的診斷性原始細(xì)胞群(例如，包含靶物種，如靶向肽(其與癌細(xì)胞和報告子組分選擇性結(jié)合，從而若所述癌細(xì)胞存在，則標(biāo)識原始細(xì)胞與癌細(xì)胞的結(jié)合)的原始細(xì)胞)，于是使得由所述報告子組分(部分)證明的原始細(xì)胞與癌細(xì)胞的結(jié)合能夠診斷患者中癌癥的存在。[0265]本發(fā)明替代性的診斷性方法可用于監(jiān)測患者中癌癥或其它疾病狀態(tài)的治療，所述方法包括在治療前向患者或受試者給予有效群體的診斷性原始細(xì)胞(例如，包含祀物種，如靶向肽(其與癌細(xì)胞和報告子組分選擇性結(jié)合，從而若所述癌細(xì)胞存在，則標(biāo)識原始細(xì)胞與癌細(xì)胞的結(jié)合)的原始細(xì)胞)，測定所述患者中診斷性原始細(xì)胞與祀細(xì)胞的結(jié)合水平，并且在治療過程中和/或治療后，測定所述患者中診斷性原始細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合水平，于是治療開始前和治療過程中和/或治療后患者中結(jié)合的差異將證明患者中治療的有效性，包括患者是否完成治療或疾病狀態(tài)是否被抑制或消除(包括癌癥的緩解)。[0266]以下非限制性實施例是本發(fā)明和其有利特性的解釋，并不以任何方式限制本發(fā)明公開的內(nèi)容或權(quán)利要求。在實施例以及本申請的任意處，除非另外指出，所有份數(shù)和百分?jǐn)?shù)均以重量計。[0267]實施例1[0268]配體靶向原始細(xì)胞[0269]如以下實施例所提供的，經(jīng)由脂質(zhì)體與納米多孔二氧化硅顆粒融合形成的多孔納米顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(原始細(xì)胞)是一種新型的納米載體，其解決了與癌癥治療和診斷的靶向遞送相關(guān)的多種挑戰(zhàn)。與脂質(zhì)體相似，原始細(xì)胞是生物相容的、生物可降解的和非免疫原性的，但與類似大小的脂質(zhì)體遞送劑相比，其納米多孔二氧化硅核賦予了極大增加的負(fù)載物容量和延長的雙層穩(wěn)定性。而且，可調(diào)節(jié)該核的孔隙率和表面化學(xué)以促進多種治療劑如藥物、核酸和蛋白質(zhì)毒素的包封?？赏ㄟ^孔徑和二氧化硅的總體壓縮程度來控制負(fù)載物的釋放速率，使得原始細(xì)胞用于需要爆發(fā)性釋放或控釋特點的應(yīng)用中。最終，該原始細(xì)胞的受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)可經(jīng)配體修飾以促進選擇性遞送和經(jīng)PEG修飾以延長循環(huán)時間。在實施例中，【發(fā)明者】報告了使用肽靶向的原始細(xì)胞實現(xiàn)編碼小發(fā)夾RNA(shRNA)的質(zhì)粒的高度特異性遞送，其通過沉默細(xì)胞周期蛋白BI誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長停滯和細(xì)胞凋亡。如以下實施例部分所述，【發(fā)明者】已通過使用雙重表面活性劑方法制備了具有足夠大孔的合成的二氧化硅納米顆粒以適應(yīng)組蛋白封裝的質(zhì)粒。當(dāng)用于與膨脹劑(1，3，5-三甲基苯)合用時，非離子型表面活性劑(Pluronic?F-127)用作大孔模板，而碳氟化合物表面活性劑(FC-4)促進二氧化硅核的生長。所得的顆粒直徑范圍為IOOnm至300nm并包含具有20nm孔和17.3nm孔入口的有序網(wǎng)絡(luò)。超螺旋質(zhì)粒DNA經(jīng)組蛋白封裝，并且所得復(fù)合物(直徑約15nm)在裝載至二氧化硅核之前經(jīng)核定位序列(NLS)修飾。在37°C暴露于模擬體液后，月旨質(zhì)體與納米多孔核的融合促進了包封DNA的長期滯留(>1個月)。使用噬菌體展示，【發(fā)明者】鑒別出對肝細(xì)胞生長因子受體(c-Met)(已知其被多種類型的肝細(xì)胞癌(HCC)過表達)具有納摩爾親和性的靶向肽。裝載有DNA-組蛋白-NLS并經(jīng)"240份副本(每一靶向肽和融合肽促進原始細(xì)胞和包封DNA的內(nèi)體逃逸)修飾的原始細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)染分裂和未分裂的HCC。此外，靶原始細(xì)胞有效地誘導(dǎo)HCC的GJM停滯和細(xì)胞凋亡(LC，，=25nM)而不影響非癌性細(xì)胞(包括肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞(PBMC、B細(xì)胞和T細(xì)胞))的活力。[0270]方法[0271]如前所述1,2(也參見Ashley等人,NatureMaterials,2011,May；10(5):389-97)使用在油包水乳劑液滴1內(nèi)的氣溶膠輔助的蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝(EISA)或溶劑萃取驅(qū)動的自組裝從一種或多種水溶性二氧化硅前體和一種或多種兩親性表面活性劑制備形成原始細(xì)胞的核的納米多孔二氧化硅顆粒。溶劑蒸發(fā)或萃取濃縮了一種或多種表面活性劑中的氣溶膠或乳劑液滴，其指導(dǎo)周期的有序結(jié)構(gòu)(在其周圍二氧化硅組裝并濃縮)的形成。通過熱煅燒除去表面活性劑，得到具有界限清楚、均勻的孔徑和拓?fù)鋵W(xué)的多孔納米顆粒。經(jīng)由氣溶膠輔助的EISA形成的顆粒(“單式”顆粒)具有平均直徑為大約120nm(在基于尺寸排阻的分離后)，Brunauer-Emmer-Teller(BET)表面積超過1200m2/g,孔體積分?jǐn)?shù)為約50%,且單式孔直徑為2.5nm。在乳劑液滴內(nèi)形成的顆粒(‘多形’顆粒)具有平均直徑為~150nm(在基于尺寸排阻的分離后)，BET表面積>600m2/g，孔體積分?jǐn)?shù)為~65%，且多模式孔形態(tài)學(xué)由被6-12nm孔互連的大的(20_30nm)、表面可及的孔組成。(分別)與氣溶膠或乳劑加工有關(guān)的液-汽或液-液界面張力強制形成具有最小表面糙度的球形。此外，氮吸附等溫線的分析證明兩種類型的顆粒均具有完全可及的三維孔網(wǎng)。[0272]所述納米多孔二氧化硅核的高孔體積、表面積和可及性賦予了高負(fù)載物容量并使得能夠快速裝載多種類型的治療性和診斷性藥劑。單式納米多孔核對低分子量的化療劑具有聞容量，而多形核具有包封siRNA、蛋白質(zhì)毒素和其它聞分子量負(fù)載物(例如，質(zhì)粒DNA)所需的大的、表面可及的孔。通過二氧化硅核的濃縮程度可精確地控制負(fù)載物的釋放速率。將各種量的AEPTMS、含胺硅烷摻入至用于形成納米多孔二氧化硅核的溶膠中降低了可達到的濃縮水平并促進了所述核在中性pH、高離子強度(即，細(xì)胞溶質(zhì))條件下更加快速的溶解。不含AEPTMS的顆粒在模擬體液中歷時2周時間溶解，而含30mol%AEPTMS的顆粒在24小時內(nèi)溶解。因此，原始細(xì)胞可適應(yīng)于需要連續(xù)或爆發(fā)性釋放特點的應(yīng)用。[0273]將AEPTMS摻入至用于形成納米多孔二氧化硅顆粒的前體溶膠中促進了在細(xì)胞溶質(zhì)條件下的顆粒溶解并促進包封負(fù)載物與經(jīng)簡單擴散達到的釋放速度相比更加快速的釋放。然而，經(jīng)AEPTMS修飾的顆粒還降低了對弱堿性化療藥物(例如，多柔比星)的容量。因此，為了最大化容量和細(xì)胞內(nèi)釋放，我們描述了ζ電勢、負(fù)載物(例如，藥物(多柔比星/DOX)/化療)容量、二氧化硅溶解速率和負(fù)載物釋放速率作為AEPTMS濃度的函數(shù)。如之前所證明的，未經(jīng)修飾的單式顆粒(ζ=-104.5±5.6)對負(fù)載物具有高容量(在DOX的情況中，每IOltl顆粒~1.8mM)但在24小時(即，HCC的典型的倍增時間)內(nèi)僅釋放其20%的包封負(fù)載物(藥物)。相反的，經(jīng)30重量％AEPTMS修飾的單式顆粒(ζ=88.9±5.5)在6小時內(nèi)釋放其所有的包封負(fù)載物(藥物)，但具有降低的藥物(DOX)容量(每IOltl顆粒~0.15mM)。含15重量％AEPTMS的多形顆粒(ζ=-21.3±5.I)保留了其對藥物(DOX)的高容量(每IOltl顆粒~1.1mM)并且當(dāng)暴露于模擬體液時在24小時內(nèi)釋放其幾乎所有的包封負(fù)載物(藥物)；因此這些顆粒被選用于涉及負(fù)載物遞送的所有實驗。應(yīng)當(dāng)著重注意，盡管單式二氧化硅顆粒的ζ電勢作為AEPTMS濃度的函數(shù)增加，但經(jīng)AEPTMS修飾的顆粒的孔體積分?jǐn)?shù)(對于含30重量％AEPTMS的顆粒，~45%)與未經(jīng)修飾的顆粒(~50%)基本上沒有差異。因此，我們將經(jīng)AEPTMS修飾的單式顆粒的負(fù)載物容量降低歸因于靜電排斥而不是孔體積降低。多形顆粒被納入作為對照以證明孔徑對負(fù)載物容量和負(fù)載物釋放動力學(xué)的影響。[0274]通用試劑[0275]無水乙醇、鹽酸(37%)、原硅酸四乙酯(TE0S，98%)、3_氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，^98%)、3-[2-(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS,工業(yè)級)、2_氰基乙基三乙氧基硅烷(CETES，≥97.0%)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB,≥99%)、Brif-56、十二烷基硫酸鈉(sds,^98.5%),Triton?x-1oo、十六烷(≥99%)、鹽酸多柔比星(≥98%)、5_氟尿嘧啶(≥99%)、順式二胺二氯鉬(II)(順鉬，>99.9%)、從白喉桿菌獲得的白喉毒素、從多孔木霉獲得的環(huán)孢菌素A(CsA,>95%),N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC，≥99%)、人表皮生長因子、L-α-磷脂酰乙醇胺、胸苷(≥99%)、次黃嘌呤(≥99%)、牛纖連蛋白、牛膠原I型、明膠、大豆胰蛋白酶抑制劑(≥98%)、2_巰基乙醇(≥99.0%)、DL-二硫蘇糖醇(≥99.5%)、二甲亞砜(≥99.9%)、ρΗ5檸檬酸緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA，99.995%)、4_(2_羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(HEPES,^99.5%)、磷酸氫二胺(^99.99%)和Sepharose?CL-4B購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。ABIL*EM90(鯨蠟基PEG/PPG-10/1二甲硅油)購自EvonikIndustries(Essen,Germany)。超純、EM級甲醒(16%，無甲醇)購自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)。He"rnanexII購自(Milllheim,Germany)。[0276]脂質(zhì)[0277]I,2-二油?；?sn-甘油_3_磷酸膽堿(DOPC)、I,2_二棕櫚酰基_sn_甘油_3_磷酸膽堿(DPPC),1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC),1,2-二油?；鵢3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油_3_磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油?；鵢2-[12-[(7_硝基-2-1,3-苯并噁唑_4_基)氨基]月桂?；鵠-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:0NBDPC)、1-棕櫚?；?2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁唑-4-基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPC)和膽固醇購自AvantiPolarLipids、Inc.(Alabaster,AL)。[0278]細(xì)胞系和生長基質(zhì)[0279]人H印3B(HB-8064)、人肝細(xì)胞(CRL-11233)、人外周血單核(CRL-9855)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(CRL-2873)、T淋巴細(xì)胞(CRL-8293)、B淋巴細(xì)胞(CCL-156)、Eagle最低必需培養(yǎng)基(EMEM)、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM),RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、和IX胰蛋白酶-EDTA溶液(含0.53mMEDTA的0.25%胰蛋白酶)購自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC;Manassas,Virginia)。BEGMBullet試劑盒購自LonzaGroupLimited(Clonetics;WalkersviIIe,MD)。無酌.紅的DMEM購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。[0280]熒光染料和顯微鏡試劑[0281]Hoechst33342(350/461)、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAP1、356/451)、AlexaFluor?405羧酸、琥珀酰亞胺酯(401/421)、CellTracker?VioletBMQC(415/516)、CellTracker?GreenCMFDA(492/517)、鈣黃綠素(495/515)、膜聯(lián)蛋白V的AlexaFluor?488綴合物(495/519)、AlexaFluor?488山羊抗小鼠IgG(H+L)(495/519)、Click-1T*AHAAlexaFluor?488蛋白質(zhì)合成HCSA分析(495/519)、LIVE43EAD?可固定綠色死細(xì)胞染色試劑盒(495/519)、SYTOX?綠色核酸染色(504/523)、MitoSOX?紅色線粒體超氧化物指示劑(510/580)、AlexaFIUOT?532羧酸、琥珀酰亞胺酯(532/554)、碘化丙啶(535/617)、pHrodo?琥珀酰亞胺酯(558/576)、CellTracker?RedCMTPX(577/602)、TexasRed?1，2_二(十六?；?_sn_甘油_3_磷酸乙醇胺(TexasRed?DHPE,583/608)、AlexaFluor647酰肼(649/666)、AlexaFluor?647羧酸、琥珀酰亞胺酯(650/668)、Ulysis?AlexaFluor?647核酸標(biāo)記試劑盒(650/670)和膜聯(lián)蛋白V的AlexaFluor?647綴合物(650/665)、ShwFadeglGold抗衰減試劑(含和不含DAPI)和Image-1T?FX信號增強劑、IXDulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS)、牛血清白蛋白第五組分溶液(BSA，7.5%)和轉(zhuǎn)鐵蛋白購自InvitrogenLifeSciences(Carlsbad,CA)。紅色突光蛋白(RFP,557/585)、CaspGLOff?熒光素活性半胱天冬酶-3染色試劑盒(485/535)和CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶-8染色試劑盒(540/570)購自BioVision,Inc.(MountainView,CA)。水溶性CdSe/ZnS量子點、CZWD640(640/660)購自NN-Labs(Fayetteville,AR)。[0282]交聯(lián)劑[0283]1-乙基_3_[3_二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4_[N_馬來酸亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-甲酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)、Ν-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼(BMPH)、琥珀酰亞胺基-[(N-馬來酰亞胺基丙酰胺基)_二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)、6-[3'-(2-批啶基二硫代)_丙酰胺基]己酸琥珀酰亞胺酯(LC-STOP)和巰基添加試劑盒(SulfhydrylAdditionKit)購自PierceProteinResearchProducts(ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)。[0284]其它二氧化硅納米顆粒[0285]亞5nm娃納米顆粒購自MeloriumTechnologies,Inc.(Rochester,NY)。10_20nm氧化娃納米顆粒購自SkySpringNanomaterials,Inc.(Houston,TX)。30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、lOOnm、150nm、200nm和10μm二氧化娃顆粒購自DiscoveryScientific,Inc.(Vancouver,BritishColumbia)。[0286]合成的siRNA和肽[0287]沉默子選擇siRNA(對于EGFR、VEGFR-2和PDGFR-a，siRNAID分別為s565、s7824和sl0234)購自Ambion,Inc.(Austin,TX)。具有5’氨基改良劑C12的雙鏈DNA寡核苷酸(5，-AAACATGTGGATTACCCATGTC-3’)購自IntegratedDNATechnologies(IDT;Coralville，IA)?！坝坞x的”SP94肽(H2N-SISIILTPILPL-C00H,SEQIDN0:6)、經(jīng)C端半胱氨酸改良用于綴合的SP94肽(H2N-SiSlII/IPILP1.GGC-C00H,SEQIDNO:7)和用于圖2d募集實驗的SP94肽(H2N-SFSI1LTP1LPLEEEGGC-C00H,SEQIDNO:8)由NewEnglandPeptide(Gardner,MA)合成。H5WYG肽(H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGggc-cooh)和核定位序列(H2N-NQSSNFC；PMK(；(；NF(；(；RSS(；PV<；(；(；(；QYFAKPRNQ(；(；YGGC-C00H)由BiopeptideC0.,Inc.(SanDiego,CA)合成。這些肽的粗體部分是原始序列；其它添加的氨基酸殘基是用于綴合或標(biāo)記目的。所有抗體(CHALV-1、抗Rablla、抗LAMP-1、抗EGFR、抗VEGFR-2、抗PDGFR-α)購自Abeam,Inc.(Cambridge,MA)。[0288]細(xì)胞培養(yǎng)條件[0289]H印3B、肝細(xì)胞、PBMC、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞自ATCC獲得，并根據(jù)制造商說明書生長。簡而言之，ifep3B維持于含有10%FBS的EMEM中。肝細(xì)胞生長于涂布有BSA、纖連蛋白和牛膠原I型的燒瓶中；所使用的培養(yǎng)基為含有5ng/mL表皮生長因子、70ng/mL磷脂酰乙醇胺和10%FBS的BEGM(慶大霉素、兩性霉素和腎上腺素被從BEGMBullet試劑盒中棄除)。HUVEC生長于含有20%FBS的DMEM中；明膠涂布的燒瓶用于促進附著。PBMC、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞維持于懸浮燒瓶(GreinerBio-One；Monroe,NC)中。PBMC生長于補充有0.02mM胸苷、0.1mM次黃嘌呤、0.05mM2_巰基乙醇和10%FBS的MDM中。T和B淋巴細(xì)胞分別生長于含有20%FBS的MDM和含有20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞維持在37°C，于潮濕氣氛(含有5%CO2的空氣)中。粘附細(xì)胞以亞培養(yǎng)比例1:3使用0.05%胰蛋白酶傳代，而非粘附細(xì)胞以密度為2xl05細(xì)胞/mL接種并維持在1-5χ106細(xì)胞/mL。[0290]納米多孔二氧化硅顆粒的合成和特征描述[0291]單式二氧化硅納米顆粒的合成[0292]Lu等人2描述了用于制備具有單式孔隙率的納米多孔二氧化硅顆粒的氣溶膠輔助的蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝方法。簡而言之，使用改良的商業(yè)噴霧器(Model9302A;TSI，Inc.；StPaul1MN)將含有二氧化硅前體(TEOS)、結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的表面活性劑(CTAB，最初濃度遠低于連接膠束濃度,或CMC)以及溶解于水和乙醇溶液的均質(zhì)溶膠霧化。氮氣用作載氣，而且所有加熱區(qū)維持在400°C以蒸發(fā)溶劑并提高有效表面活性劑濃度。真空的壓將為20psi。在維持于80°C的Durapore膜過濾器(Millipore;BiIlerica,MA)上收集顆粒。典型的反應(yīng)混合物含有55.9mL去離子H20、43mL200-proof乙醇、1.1OmL1.0NHCl,4.0gCTAB和10.32gTEOS0為制備在細(xì)胞內(nèi)(中性pH，相對高鹽濃度)條件下更快速溶解的納米多孔二氧化硅顆粒，將多種量的TEOS和AEPTMS、含胺硅烷摻合至前體溶膠中，并使用濃HCl將系統(tǒng)的pH調(diào)節(jié)至2.0。例如，為制備含有15重量％AEPTMS的顆粒，使用9.36gTEOS和1.33gAEPTMS。[0293]多形二氧化硅顆粒的合成[0294]Carroll等人1描述了用于合成具有多式孔隙率的納米多孔二氧化硅核的乳液處理法。簡而言之，將1.82gCTAB(可溶于水性相中)加入至20g去離子水中，在40°C攪拌直至溶解，并允許冷卻至25°C。將0.57g1.0NHCl、5.2gTEOS和0.22gNaCl加入至CTAB溶液，并攪拌所得溶膠I小時。制備由含3重量％AbilEM90(—種非離子型乳化劑，可溶于油相中)的十六烷組成的油相。將前體溶膠與油相(溶膠:油體積比為1:3)在1000ml圓底燒瓶中混合，劇烈攪拌2分鐘以促進油包水乳劑的形成，加至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-205；BuchiLaboratoryEquipment!Switzerland),并放置于80°C水浴30分鐘。然后在120mbar減壓下煮沸混合物(35rpm,持續(xù)3小時)以除去溶劑。在3000rpm離心(ModelCentraMP4R；InternationalEquipmentCompany；Chattanooga,TN)顆粒20分鐘，并傾出上清液。最終，所述顆粒在500°C煅燒5小時以除去表面活性劑和其它過量的有機物質(zhì)。如Cairoll等人所述，溶劑萃取將水相富集于CTAB(>CMC)中，且在二氧化硅顆粒濃縮(在水相中)后，所得膠束模制6-12nm孔。此外，兩種表面活性劑(CTAB和AbilEM90)在水油界面的吸附協(xié)同地降低了界面張力，導(dǎo)致模制大的、表面可及孔的20-30nm微乳劑液滴的自發(fā)形成。[0295]二氧化硅納米顆粒的特征描述[0296]使用ZetasizerNano(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)進行納米多孔二氧化硅顆粒的動態(tài)光散射。通過將48μL二氧化硅顆粒(25mg/mL)稀釋于2.4ml的IXD-PBS中制備樣品。將溶液轉(zhuǎn)移至ImL聚苯乙烯試管(Sarstedt；Niimbrecht,Germany)用于分析。使用ASAP2020表面積和孔隙率分析儀(MicromeriticsInstrumentCorporation；Norcross,GA)進行氮吸附。使用ZetasizerNano(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)測量ζ電勢。在一項典型的實驗中，將二氧化硅顆粒、脂質(zhì)體或原始細(xì)胞以1:50稀釋于模擬體液(ρΗ7.4)或檸檬酸緩沖液(ρΗ5.0)(兩種緩沖液均經(jīng)調(diào)節(jié)以包含150mMNaCl)中，并轉(zhuǎn)移至Iml折疊毛細(xì)孔(foldedcapillarycell)(Malvern；Worcestershire,UnitedKingdom)用于分析。見DLS和氮吸附數(shù)據(jù)的附圖1和二氧化娃納米顆粒、脂質(zhì)體和原始細(xì)胞的ζ電勢值的附圖12。[0297]原始細(xì)胞的合成、裝載和表面功能化[0298]脂質(zhì)體與納米多孔二氧化硅顆粒的融合[0299]Liu等人25_27描述了用于合成原始細(xì)胞的操作并將簡單地提及。脂質(zhì)訂購自AvantiPolarLipids,將其預(yù)溶解于氯仿中并在_20°C保存。在氮氣流下干燥2.5mg脂質(zhì)并放置于真空烘箱(Model1450M,VffRInternational,WestChester,PA)中過夜以除去殘余溶劑，然后立即進行原始細(xì)胞合成。濃度為2.5mg/mL的脂質(zhì)在0.5XD-PBS中再水合并使用Min1-Extruderset(AvantiPolarLipids,Inc.；Alabaster,AL)將脂質(zhì)通過IOOnm過濾器至少10次。將DPPC和DSPC溶解于預(yù)熱至其各自轉(zhuǎn)變溫度(41°C和55°C)的0.5XD-PBS中，并在擠出過程中維持在60°C。所得脂質(zhì)(直徑~120nm)在4°C保存不超過一周。在室溫將納米多孔二氧化硅核溶解于0.5XD-PBS(25mg/mL)中并暴露于過量的脂質(zhì)體(1:2-1:4體積比的脂質(zhì):二氧化硅)中30-90分鐘。在4°C將原始細(xì)胞在過量脂質(zhì)存在下保存達3個月。為除去過量的脂質(zhì)，將原始細(xì)胞在10，OOOrpm離心5分鐘，洗滌兩次并在0.5XD-PBS中再懸浮。[0300]受支撐的脂質(zhì)雙層組合物的優(yōu)化[0301]優(yōu)化SLB組合物以最小化非特異性結(jié)合和毒性以控制細(xì)胞；使用的多種脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)參見附圖4。用于所有表面結(jié)合、內(nèi)化和遞送實驗的原始細(xì)胞具有由DOPC(或DPPC)和5重量％DOPE(或DPPE)、30重量％膽固醇、和5重量％18:1(或16:0)PEG-2000PE組成的SLB。如果有必要，可將熒光脂質(zhì)(18:1-12:0NBD-PC、16:0-12:0NBD-PC、或TexasRed*DHPE)以1-5重量％摻入至SLB中。在再水合和擠出前將脂質(zhì)一起凍干；例如合并和干燥75μL的DOPC(25mg/mL)、5μL的DOPE(25mg/mL)、10μL的膽固醇(75mg/mL)、5μL的18:1PEG-2000PE(25mg/mL)和5μL的18:1-12:ONBD-PC(5mg/mL)以形成由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇、5重量％PEG-2000和I重量％NBD-PC組成的脂質(zhì)體。[0302]經(jīng)多種類型的靶向配體修飾的受支撐的脂質(zhì)雙層[0303]通過將多種密度的多種類型的靶向配體與SLB綴合以優(yōu)化原始細(xì)胞對HCC的特異性親和性。經(jīng)由異雙功能交聯(lián)劑NHS-(PEG)n-馬來酰亞胺(其對巰基和胺部分具有反應(yīng)性并具有PEG間隔臂，其長度可改變以優(yōu)化特異性親和性)，將SP94和H5WYG肽(與C端半胱氨酸殘基合成)與PE的頭基中存在的伯胺綴合。在大多數(shù)研究中使用SM(PEG)24(間隔臂=9.52nm)。使用巰基添加試劑盒(根據(jù)制造商說明書)將轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗EGFR和CHALV-1中存在的胺部分轉(zhuǎn)化成游離的巰基。使用SM(PEG)2Jf功能化的轉(zhuǎn)鐵蛋白和抗體與SLB中的PE綴合。通過反應(yīng)立體化學(xué)和孵育時間控制配體密度。例如在室溫使用10倍摩爾過量的SP94孵育原始細(xì)胞2小時以得到0.015重量％的肽密度(~6肽/原始細(xì)胞)，而在4°C使用5000倍摩爾過量的SP94過夜孵育原始細(xì)胞以得到5.00重量％的肽密度(~2048肽/原始細(xì)胞)通過Tricine-SDS-PAGE(SP94和H5WYG肽)或Laemml1-SDS-PAGE(轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗EGFR和CHALV-1)28測定平均配體密度。簡而言之，在使用LC-SH)P(間隔臂=1.57nm)，一種與伯胺和巰基反應(yīng)并經(jīng)可經(jīng)由還原消除的異雙功能交聯(lián)劑條件下，使用多種配體密度修飾原始細(xì)胞。將原始細(xì)胞暴露于IOmM二硫蘇糖醇(DTT)30分鐘并在10，OOOrpm離心5分鐘；所得含有游離配體的上清液的濃度經(jīng)由SDS-PAGE通過使用ImageJImage處理和分析軟件(NationalInstitutesofHealth；Bethesda,MD)比較各樣品的條帶強度來測定。20%明膠(含6%雙丙烯酰胺和6M尿素)用于分析SP94和H5WYG肽的密度。10%明膠用于分析抗體(抗EGFR和CHALV-1)的密度，而15%明膠用于分析轉(zhuǎn)鐵蛋白的密度。[0304]熒光標(biāo)記的納米多孔核的制備[0305]通過向900μL含20%APTES的0.5ΧD-PBS中添加100μL顆粒(25mg/mL)熒光標(biāo)記納米多孔核；在室溫在APTES中過夜孵育顆粒并離心(10，OOOrpm,5分鐘)以除去未反應(yīng)的APTES，并再懸浮于ImL0.5XD-PBS中。添加胺反應(yīng)性熒光團(fIuorophore)(例如AlexaFluor*647甲酸琥珀酰亞胺酯；lmg/mL于DMSO中)(每mL顆粒5μL染料)，并將所述顆粒在室溫保持2小時，然后離心除去未反應(yīng)的染料。在4°C將熒光標(biāo)記的顆粒保存于0.5XD-PBS中。[0306]使用化療藥物裝載單式核和脂質(zhì)體[0307]在脂質(zhì)體融合前，在室溫將經(jīng)修飾含有15重量％AEPTMS(25mg/mL)的單式納米多孔核浸泡于多柔比星(5mM)或多柔比星、順鉬和5-氟尿嘧啶(每種藥物各5mM)的混合物中I小時。經(jīng)顆粒在10，OOOrpm離心5分鐘除去過量藥物。使用在先描述的磷酸銨梯度法29，使用DOX裝載120nm脂質(zhì)體。簡而言之，脂質(zhì)薄膜經(jīng)300mM(NH4)2HPO4再水合，并且所述脂質(zhì)體溶液通過IOOnm膜擠出至少10次。脂質(zhì)體經(jīng)等張性緩沖溶液(140mMNaCl,IOmMHEPES、pH7.4)經(jīng)由滲析(Float-A-LyzerG2滲析單兀、3.5_5kDaMWCO；SpectrumLaboratories,Inc.；RanchoDominguez,CA)平衡，并在4°C經(jīng)鹽酸多柔比星(1:3藥物:月旨質(zhì)摩爾比)過夜孵育。如在先所述3°，31使用5-FU或順鉬裝載脂質(zhì)體。[0308]使用多組分混合物、siRNA和白喉毒素A鏈裝載多式核[0309]將經(jīng)修飾含有20重量％AEPTMS(25mg/mL)的多式納米多孔核浸泡于鈣黃綠素(5mM)、AlexaFluor;647標(biāo)記的dsDNA寡核苷酸(100μΜ)、RFP(100μΜ)和CdSe/ZnS量子點(10μΜ)的溶液中4小時；各負(fù)載物的濃度可改變以得到高光譜成像最適的熒光強度。通過將各為Img的鈣黃綠素和NLS溶解于850μLIXD-PBS中使用NLS修飾鈣黃綠素(使用C端半胱氨酸殘基合成)；添加100μLEDC(10mg/mL于去離子水中)和50μLBMPH(10mg/mL于DMSO中),并在室溫孵育該混合物2小時。經(jīng)滲析(Slide-A-Lyzermini滲析單元，2kDaMWCO；ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)除去過量的鈣黃綠素。使用Ulysis?AlexaFluor?647核酸標(biāo)記試劑盒(根據(jù)制造商說明書)標(biāo)記dsDNA寡核苷酸并通過混合50μLdsDNA(2mM于去離子水中)和50μLNLS(ImM于DMSO中)以及10μLSMCC(10mg/mL于DMSO中)經(jīng)NLS修飾；在室溫孵育該混合物2小時,并經(jīng)滲析(Slide-A-Lyzermini滲析單兀，7kDaMWCO；ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)除去過量的NLS。對于附圖13-16中所述的遞送實驗，在4°C將經(jīng)20重量％AEPTMS(25mg/mL)修飾的多式納米多孔核浸泡于SiRNA(IOOyM)或白喉毒素A鏈(100μM)2小時。經(jīng)10，OOOrpm離心5分鐘除去未包封的負(fù)載物，并立即將脂質(zhì)體與負(fù)載物裝載的核融合。[0310]使用組蛋白封裝CBl質(zhì)粒。[0311]圖4描述了用于使CBl質(zhì)粒(pCBl)超螺旋的方法。示意圖描述了使用高飽和鹽溶液使CBl質(zhì)粒(pCBl)(下文和附圖12中所示的CBl質(zhì)粒載體)超螺旋，使用組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4封裝超螺旋的pCBl，并使用通過與組蛋白綴合促進易位通過核孔的核定位序列(NLS)修飾所得的pCBl-組蛋白復(fù)合物的方法。圖4(B)和⑶顯示CBl質(zhì)粒(B)和組蛋白封裝的PCBl(D)的原子力顯微鏡(AFM)圖像。比例尺=lOOnm。(C)和(E)分別對應(yīng)于(B)和(D)中紅線的高度剖面圖。[0312]裝載有組蛋白封裝的pCBl的MC40靶向中孔二氧化硅納米顆粒支撐的脂質(zhì)雙層(原始細(xì)胞)的合成。[0313]如圖5所述，5㈧提供了描述用于產(chǎn)生DNA裝載的、肽靶向的原始細(xì)胞的方法。根據(jù)該方法，通過簡單地將顆粒浸入PCBl-組蛋白復(fù)合物溶液中將組蛋白-封裝的pCBl裝載至形成原始細(xì)胞核的中孔二氧化硅顆粒中。然后將PEG化的脂質(zhì)體與DNA-裝載的核融合以形成受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)(其進一步經(jīng)結(jié)合HCC的靶向肽(MC40)和促進內(nèi)化原始細(xì)胞內(nèi)體逃逸的內(nèi)體裂解肽(H5WYG)修飾)。巰基-胺交聯(lián)子(間隔臂=9.5nm)用于將經(jīng)C-端半胱氨酸殘基修飾的肽綴合至SLB的DOPE部分。圖5(B)顯示可用作原始細(xì)胞核的中孔二氧化硅納米顆粒的透射電子顯微鏡圖像。比例尺=200nm。插入圖=掃描電子顯微鏡(SEM)圖像,其證明15-25nm孔是表面可及的。插入圖比例尺=50nm。5(C)顯示中孔二氧化硅納米顆粒的大小分布，其由動態(tài)光散射(DLS)測定。(5D，左軸)中孔二氧化硅納米顆粒的累積孔體積圖，其使用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型由圖S-4A所示的氮吸附等溫線的吸附支計算得到。(5D，右軸)pCBl-組蛋白復(fù)合物的大小分布，其通過DLS測定。[0314]中孔二氧化硅納米顆粒對組蛋白封裝的pCBl具有高容量，且所得的原始細(xì)胞僅在模擬內(nèi)體環(huán)境的條件下釋放包封的DNA。[0315]如圖6(A)所述，可包封在未經(jīng)修飾的中孔二氧化硅納米顆粒(ζ=-38.5mV)或經(jīng)APTES(—種含胺硅烷)修飾的中孔二氧化硅納米顆粒(ζ=+11.5mV)內(nèi)的pCBl或組蛋白封裝的pCBl(“復(fù)合物”)的濃度。06(B)顯示當(dāng)IxlO6細(xì)胞/mL與1x109MC40-靶向的、pCBl-裝載的原始細(xì)胞一起在37°C孵育24小時時，對ZsGreen(—種由pCBl編碼的綠色熒光蛋白)變得陽性的Hep3B的百分?jǐn)?shù)。X軸指明了原始細(xì)胞核是否經(jīng)AEPTMS修飾和pCBl是否經(jīng)組蛋白預(yù)封裝。在(A)和⑶中納入經(jīng)DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物封裝的PCBl作為對照。圖6(C)和⑶顯示暴露于模擬體液(C)或pH5緩沖液⑶后，組蛋白封裝的PCBl從未經(jīng)修飾的中孔二氧化硅納米顆粒和相應(yīng)原始細(xì)胞的時間依賴性釋放。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000組成，且對于(B)，經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96ο)。[0316]MC40靶向的原始細(xì)胞遞送組蛋白封裝pCBl至HCC的方法[0317]如附圖7中所示的示意圖所述，[I]由于靶向肽向Met(其被多種HCC系過表達)的募集，MC40靶向的原始細(xì)胞高親和性地與Hep3B細(xì)胞結(jié)合。流體DOPCSLB提高肽的活動性，因此使經(jīng)低MC40密度修飾的原始細(xì)胞保持對Hep3B的高特異性親和性(見圖8A)。[2]MC40靶向的原始細(xì)胞經(jīng)受體介導(dǎo)胞吞作用被H印3B內(nèi)化(見圖8B和圖15A)。[3]內(nèi)體條件使SLB[插入天然材料參考]去穩(wěn)定并引起H5WYG內(nèi)體裂解肽質(zhì)子化，這兩種情況使得組蛋白封裝的PCBl在H印3B細(xì)胞質(zhì)中變得分散(見圖15B)。[4]當(dāng)pCBl-組蛋白復(fù)合物經(jīng)核定位序列(NLS)修飾時，其在~24小時內(nèi)在Hep3B細(xì)胞的細(xì)胞核中變得濃縮(見圖16C)，這使得分裂和非分裂癌細(xì)胞能夠有效轉(zhuǎn)染(見圖17)。[0318]MC40靶向的原始細(xì)胞高親和性地與HCC結(jié)合并被H印3B而不是正常的肝細(xì)胞內(nèi)化。[0319]圖8(A)顯示當(dāng)暴露于Hep3B或肝細(xì)胞時，MC40靶向的原始細(xì)胞的表觀解離常數(shù)(Kd);Kd值與特異性親和性負(fù)相關(guān)并且從飽和結(jié)合曲線(見圖S-11)測定。誤差棒表示η=5的95%置信區(qū)間(1.96ο)。圖8(B)和(C)顯示在37°C暴露于1000倍過量MC40靶向原始細(xì)胞I小時的H印3B(B)和肝細(xì)胞(C)的共聚焦熒光顯微鏡圖像。Met經(jīng)AlexaFluor*488標(biāo)記的單克隆抗體(綠色)染色,原始細(xì)胞核經(jīng)AlexaFluor?594(紅色)染色,且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)染色。比例尺=20μπι。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％D0PE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％(A-C)或0.500重量％(A)的MC40靶向肽修飾。[0320]MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞在皮摩爾濃度誘導(dǎo)HCC的細(xì)胞凋亡但對正常肝細(xì)胞的活力具有最小的影響。[0321]圖9(A)和(B)顯示在37°CHep3B持續(xù)暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞后，細(xì)胞周期蛋白BImRNA和細(xì)胞周期蛋白BI蛋白質(zhì)表達的劑量(A)和時間(B)依賴性降低。將細(xì)胞在(A)中暴露于多種pCBl濃度48小時和在(B)中暴露于5pMpCBl多種時間周期。納入肝細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白BI和H印3B中ZsGreen的表達作為對照。分別采用實時PCR和免疫熒光測定細(xì)胞周期蛋白BImRNA和蛋白質(zhì)濃度。圖9(C)顯示在37°C持續(xù)暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞([pCBl]=5pM)多種時間周期后，停留在G2/M期的Hep3B的百分?jǐn)?shù)。G2/M期的肝細(xì)胞和S期的H印3B的百分?jǐn)?shù)納入用于比較。在細(xì)胞周期分析前，細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342染色。圖9(D)顯示在37°C持續(xù)暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞([PCBl]=5pM)多種時間周期后，凋亡的H印3B的百分?jǐn)?shù)。對凋亡標(biāo)記物呈陽性的肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)納入作為對照。對AlexaFluor?647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V呈陽性的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的早期，而對膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶均呈陽性的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的晚期。通過添加單-和雙陽性細(xì)胞的數(shù)目測定凋亡細(xì)胞的總數(shù)。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0322]MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞較相應(yīng)的脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplex)2500倍更有效地誘導(dǎo)HCC的選擇性凋亡。[0323]圖10⑷顯示DOPC原始細(xì)胞、經(jīng)10重量％PEG-2000(18:1)修飾的DOPC原始細(xì)胞、由PCBl以及DOTAP和D0PE(1:1重量/重量)的混合物組成的脂質(zhì)復(fù)合物，和經(jīng)10重量％PEG-2000修飾的D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物的ζ電勢。所有ζ電勢測量在0.5ΧPBS(ρΗ7.4)中進行。圖10(Β，左軸)顯示在37°C持續(xù)暴露于經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞或脂質(zhì)復(fù)合物遞送的5pMpCBl48小時后，凋亡的!fep3B和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。圖10(B，右軸)顯示在37°C在48小時內(nèi)誘導(dǎo)90%lxl06Hep3B細(xì)胞凋亡所需的MC40靶向的、pCBI裝載的原始細(xì)胞或脂質(zhì)復(fù)合物的數(shù)目。對于(B)，細(xì)胞經(jīng)AlexaFluor*647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠染色；單-和雙-陽性細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡的。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(當(dāng)標(biāo)明時)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)10重量％的PEG-2000(當(dāng)標(biāo)明時)、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。在所有實驗中，pCBl經(jīng)NLS修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0324]MC40靶向的原始細(xì)胞選擇性地將高濃度的紫杉醇、Bcl-2-特異性siRNA和pCBl遞送至HCC而不影響肝細(xì)胞的活力。[0325]圖11㈧顯示使Bcl-2表達沉默的紫杉醇、siRNA的濃度，和可包封于IO12原始細(xì)胞、脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物的CBl質(zhì)粒的濃度。圖1lA中的紅棒表示當(dāng)紫杉醇和pCBl均裝載于原始細(xì)胞內(nèi)時，紫杉醇和PCBl濃度如何變化。藍棒表示當(dāng)紫杉醇、siRNA和pCBl均裝載于原始細(xì)胞或當(dāng)siRNA和pCBl裝載于脂質(zhì)復(fù)合物內(nèi)時，紫杉醇、siRNA和pCBl濃度如何變化。圖1l(B)提供了共聚焦熒光顯微鏡圖像顯示在經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞遞送至H印3B后，OregonGreer^488標(biāo)記的紫杉醇(綠色)、AlexaFluor?594標(biāo)記的siRNA(紅色)和Cy5標(biāo)記的pDNA(白色)的細(xì)胞內(nèi)分布。細(xì)胞在37°C與1000倍過量的MC40靶向的原始細(xì)胞一起孵育24小時，然后經(jīng)Hoechst33342(藍色)固定和染色。比例尺=10μπι。圖11(C)顯示了在37°C暴露于IOnM紫杉醇和/或5pMpCB148小時后，停留G2/M期的H印3B、SNU-398和肝細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。將分?jǐn)?shù)對匕/M中對數(shù)生長細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)化。圖1l(D)顯示了在37°C暴露于IOnM紫杉醇、250pMBcl-2-特異性siRNA和/或5pMpCBl48小時后，對AlexaFluor?647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白和碘化丙錠(PI)變得陽性的H印3B、SNU_398和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在(C)和(D)中，‘pCBl，指的是使用DOTAP和D0PE(1:1重量/重量)的化合物封裝并非特異性地遞送至細(xì)胞的pCBl。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。脂質(zhì)體由DSPC和5重量％DMPE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(16:0)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。脂質(zhì)復(fù)合物由DOTAP:DOPE(1:1重量/重量)混合物組成，且經(jīng)10重量％PEG-2000,0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0326]CBl質(zhì)粒的載體地圖[0327]如圖12所示，CBl質(zhì)粒(pCBl)由RNA1-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen載體(ClontechLaboratories,Inc.；MountainView,CA)和pNEB193載體(NewEnglandBioLabs,Inc.；Ipswich,MA)構(gòu)建。pCBl編碼細(xì)胞周期蛋白BI特異性小發(fā)夾RNA(shRNA)[Yuan等人,Oncogene(2006)25,1753-1762]和Zoanthussp.綠色突光蛋白(ZsGreen)。組成型shRNA表達由RNApolII1-依賴的人U6啟動子(Pu6)驅(qū)動，而組成型ZsGreen表達由巨細(xì)胞病毒(Pcmvie)的立即早期啟動子驅(qū)動。ori和AmpK元件使得E.coli中的質(zhì)粒能夠傳播。編碼細(xì)胞周期蛋白BI特異性的shRNA的有義和反義鏈的DNA序列被下劃線標(biāo)出并且側(cè)面有用于將dsDNA寡核苷酸引入pSIREN載體的限制性酶切位點(紅色為BamHI，藍色為EcoRI)。[0328]組蛋白封裝pCBl的特征描述[0329]圖13(A)顯示了暴露于升高濃度的組蛋白011、！^、！128、！13和!14的摩爾比為1:2:2:2:2)的pCBl的電泳遷移率變動分析。給出泳道3_6的pCBl:組蛋白的摩爾比。泳道I包含DNA梯帶，而泳道2包含未添加組蛋白的pCBl。圖13(B)顯示了組蛋白封裝的pCBl(l:50pCBl:組蛋白摩爾比)的TEM圖像。比例尺=50nm。[0330]未裝載和pCBl裝載的中孔二氧化硅納米顆粒的氮吸附分析。[0331]圖14(A)裝載組蛋白封裝的pCBl前后中孔二氧化硅納米顆粒的氮吸附等溫線。圖14⑶顯示了裝載組蛋白封裝的pCBl前后中孔二氧化硅納米顆粒的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面積。誤差棒表不η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0332]DOPC原始細(xì)胞的中子小角散射(SANS)。[0333]圖15顯示了DOPC原始細(xì)胞的SANS數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)擬合通過使用具有等厚共形殼的多分散多孔二氧化硅球體模型獲得，并且顯示所述二氧化硅顆粒表面跨越多個孔開口的36-Α雙層的存在。雙層厚度為0、20和60A的模擬SANS數(shù)據(jù)被納入用于比較。測量的雙層厚度36人與其它在平面支撐的脂質(zhì)雙層上進行的中子研究(33-38Α)[參見Ferrari,M.Cancernanotechnology:Opportunitiesandchallenges.NatureReviewsCancer5，161-171(2005)]一致，且在這些對比條件下，主要表示從所述脂質(zhì)雙層的富氫烴核的散射。實驗數(shù)據(jù)也表明存在299.2A孔，其通過將0.0315A4(即，實驗數(shù)據(jù)中峰的q值，其由孔散射引起)除以2測得。使用100%D2OPBS緩沖液中的5%(體積/體積)原始細(xì)胞懸浮液在LQDbeamlineatLANSCE(LosAlamosNationalLaboratories)上獲得SANS數(shù)據(jù)。使用NCNRSANS數(shù)據(jù)分析包(NIST)擬合數(shù)據(jù)。[0334]原始細(xì)胞保護包封的DNA免遭核酸酶降解。[0335]圖16顯示DNA酶I處理的pCBl(泳道3)、組蛋白封裝的pCBl(泳道5),DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封裝的pCBl(泳道7)、裝載于具有陽離子核的原始細(xì)胞中的PCBl(泳道9)和裝載于具有陰離子核的原始細(xì)胞中的組蛋白封裝的pCBl(泳道11)的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。裸PCBl(泳道2)、從組蛋白釋放的pCBl(泳道4)、從D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物釋放的PCBl(泳道6)、從具有陽離子核的原始細(xì)胞釋放的pCBl(泳道8)和從具有陰離子核的原始細(xì)胞釋放的組蛋白封裝的PCBl(泳道10)被納入用于比較。泳道I包含DNA梯帶。樣品與DNA酶I(每50ngDNAI單位)在室溫一起孵育30分鐘，并使用I%SDS刺激PCBl釋放。[0336]圖17顯示中孔二氧化硅納米顆粒(“未經(jīng)修飾的核”)、在室溫浸泡于20%(體積/體積)APTES中12小時的中孔二氧化硅納米顆粒(“APTES修飾的核”)、CBl質(zhì)粒(、081”)、組蛋白封裝的？081(“pCBl-組蛋白復(fù)合物U^DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封裝的pCBl(“D0TAP/D0PE脂質(zhì)復(fù)合物”)的ZetaU)電勢值。(電勢測量在0.5XPBS(pH7.4)中進行。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0337]用于測定圖6和S-16(A)-⑶中對ZsGreen表達呈陽性的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的代表性前向散射-側(cè)向散射(FSC-SSC)圖和FL-1直方圖。[0338]圖18顯示門控㈧或非門控(C)排出細(xì)胞殘骸的ZsGreen陰性細(xì)胞的FSC-SSC圖(Α和C)和相應(yīng)的FL-1直方圖(分別為B和D)。FL-1通道的平均熒光強度(MFI)值在(B)和⑶中給出。(E)-(H)門控(E)或非門控(G)排出細(xì)胞殘骸的ZsGreen陽性細(xì)胞的FSC-SSC圖(Ε和G)和相應(yīng)的FL-1直方圖(分別為F和H)。(F)和(H)上的門對應(yīng)于具有MFI(282的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，即100ΧZsGreen陰性細(xì)胞的MFI(見D圖)。[0339]MC40靶向肽的鑒別[0340]圖19提供了描述用于從Ph.D.?-7卩遼菌體展不文庫(NewEnglandBioLabs,Inc.；Ipswich,MA)選擇MC40祀向肽的方法的示意圖。lxlOnpfu/mL的肽在室溫與IOOnM融合至人IgGFe域的重組人Met(rhMet)—起孵育I小時。蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G包被的磁性顆粒用于親和捕捉Met-噬菌體復(fù)合物并隨后用TBS(含有150mMNaCl的50mMTris-HCl，pH7.4)洗滌10次以除去未結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬菌體克隆經(jīng)低pH緩沖液(含lmg/mLBSA的0.2M甘氨酸，pH2.2)洗脫，并且洗脫液經(jīng)宿主細(xì)菌(E.coliER2738)感染而擴增。根據(jù)示意圖，使用逐漸苛刻的條件=Met濃度從IOOnM降至50nM再降至ΙΟηΜ，孵育時間從I小時減少至30分鐘再減少至15分鐘，且添加至洗滌緩沖液的吐溫-20JAO0Z0(體積/體積)增加至0.1%再增加至0.5%，進行5輪親和性選擇。通過蛋白質(zhì)A涂布的磁性顆粒和蛋白質(zhì)G涂布的磁性顆粒間的交替多輪選擇避免對蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G的肽特異性。[0341]在5輪選擇后，從50株單獨的克隆重新獲得DNA并使用與Ph.D.?-7試劑盒一起提供的_96gIII引物測序。對MET受體具有最大結(jié)合活性的序列如下所示:[0342]ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)SEQIDNO:1[0343]TATFffFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)SEQIDNO:2[0344]TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)SEQIDNO:3[0345]IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)SEQIDNO:4[0346]WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)SEQIDNO:5[0347]MC40靶向肽的特征描述[0348]圖20(A)顯示第5輪選擇后的肽序列比對；優(yōu)勢序列ASVHFPP與此前鑒定的Met特異性12體YLFSVHWPPLKASEQIDNO:15的粗體部分相似。將顯示靶不相關(guān)的HAIYPRH肽(~10%)(SEQIDNO:16)的噬菌體克隆從序列比對中略去。圖20(B)和(C)顯示親和選擇的噬菌體克隆與rhMet結(jié)合的程度經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測定。⑶中所述的ELISA示意圖描述于材料與方法部分。ELISA結(jié)果如(C)所示。圖20(D)顯示除去未與Met結(jié)合的肽后的序列比對。從該比對測定圖20中所述的共有序列。圖20(E)和(F)顯示暴露于(I)抗Met和不相關(guān)噬菌體克隆(TPDWLFP,SEQIDNO:17)的AlexaFluor?488標(biāo)記的單克隆抗體和抗M13噬菌體的AlexaFluor?546標(biāo)記的單克隆抗體(藍點)或(2)抗Met和MC40克隆的AlexaFluor?488標(biāo)記的單克隆抗體和抗M13噬菌體的AlexaFhkH."546標(biāo)記的單克隆抗體(橙點)的Ifep3B(E)和肝細(xì)胞(F)的流式細(xì)胞儀散點圖。未處理細(xì)胞(紅點)用于設(shè)置FL-1(AlexaFluor?488熒光)和FL-2(AlexaFluor?546熒光)通道的電壓參數(shù)。[0349]暴露于H印3B的MC40靶向的原始細(xì)胞的樣品結(jié)合曲線。[0350]為測定圖8A中的解離常數(shù)，lxl06Hep3B或肝細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞松馳素D預(yù)處理以抑制胞吞并在37°C與多種濃度的AlexaFklOl:647標(biāo)記的、MC40靶向的原始細(xì)胞一起孵育I小時。流式細(xì)胞儀用于測定所得細(xì)胞群的平均熒光強度，其對原始細(xì)胞濃度作圖以獲得總結(jié)合曲線。在飽和濃度的未標(biāo)記的肝細(xì)胞生長因子的存在下，通過將細(xì)胞與AlexaHuor?647標(biāo)記的、MC40靶向的原始細(xì)胞一起孵育來測定非特異性結(jié)合。通過從總結(jié)合曲線減去非特異性結(jié)合曲線獲得特異性結(jié)合曲線；從特異性結(jié)合曲線計算Kd值。在圖21所述的實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％D0PE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％(~6肽/顆粒)的MC40靶向肽修飾；相應(yīng)的Kd值為1050±142pM。所有誤差棒表示η=5的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0351]MC40靶向的原始細(xì)胞經(jīng)受體介導(dǎo)的胞吞作用內(nèi)化，并且在不存在H5WYG肽的情況下定向至溶酶體。[0352]圖22⑷顯示在37°C在I小時內(nèi)被Hep3B或肝細(xì)胞各自內(nèi)化的MC40靶向原始細(xì)胞的平均數(shù)。IxlO6細(xì)胞在不存在(-)或存在(+)飽和濃度(100yg/mL)的人肝細(xì)胞生長因子(HGF)的情況下與多種濃度的原始細(xì)胞一起孵育，而流式細(xì)胞儀用于測定與各細(xì)胞有關(guān)的顆粒的平均數(shù)，如Ashley等人，NatureMaterials,2011,May；10(5):389-97所述。原始細(xì)胞經(jīng)NBD和pHrodo?標(biāo)記以從那些內(nèi)化至酸性細(xì)胞內(nèi)隔室的顆粒區(qū)別表面結(jié)合顆粒(分別地)。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96ο)。(B)原始細(xì)胞和(l)Rab5、(2)Rab7、(3)溶酶體相關(guān)的膜蛋白I(LAMP-1)、或(4)Rablla之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)(r值)。Hep3B細(xì)胞在37°C與1000倍過量的AlexaFluor?594標(biāo)記的原始細(xì)胞一起孵育I小時，然后固定，透化，并與AlexaFluor"488標(biāo)記的抗Rab5、Rab7、LAMP-1或Rablla抗體一起孵育。SlideBook軟件用于測定r值，其以η=3x50細(xì)胞的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。微分干涉對比(DIC)圖像用于定義H印3Β的邊界從而當(dāng)計算r值時可忽視細(xì)胞邊界外的像素。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0353]當(dāng)經(jīng)NLS修飾并經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞遞送時，組蛋白封裝的pCBl在HCC細(xì)胞核中以時間依賴性的方式濃縮。[0354]圖23(A)_(C)描述了在37°C暴露于1000倍過量的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞15分鐘(A)、12小時⑶、或24小時(C)的!fep3B細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡圖像。對于(B)，在~2小時后，原始細(xì)胞的內(nèi)體逃逸和pCBl的胞質(zhì)分散是明顯的；然而直至12-16小時，ZsGreen表達仍然不可檢測。在24小時，Cy5標(biāo)記的pCBl仍然分布于整個細(xì)胞；然而在(C)中胞質(zhì)染色不可見，因為Cy5通道的增益被減小以避免位于細(xì)胞核內(nèi)的像素飽和。二氧化硅核經(jīng)AlexaFluor?594(紅色)標(biāo)記，pCBl經(jīng)Cy5(白色)標(biāo)記，且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)復(fù)染。比例尺=20μm。圖23(D)顯示對于Cy5標(biāo)記的pCBl和Hoechst33342標(biāo)記的H印3B細(xì)胞核，皮爾森相關(guān)系數(shù)(r值)對時間的作圖。SlideBook軟件用于測定r值，其以η=3x50細(xì)胞的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。微分干涉對比(DIC)圖像用于定義H印3Β的邊界從而當(dāng)計算r值時可忽視細(xì)胞邊界外的像素。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0355]當(dāng)經(jīng)NLS修飾并經(jīng)MC40靶向的原始細(xì)胞遞送時，組蛋白封裝的pCBl選擇性地轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的HCC細(xì)胞，接近100%有效性。[0356]圖24⑷、(C)和(E)顯示了在37°C暴露于1000倍過量的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞24小時的H印3B細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡圖像。在(A)中Hep3B細(xì)胞正在分裂而在(C)和(E)中~95%匯合；在所有圖像中，pCBl經(jīng)組蛋白預(yù)封裝，且在(E)中該pCBl-組蛋白復(fù)合物進一步經(jīng)NLS修飾。二氧化娃核經(jīng)AlexaFluor"594(紅色)標(biāo)記,pCBl經(jīng)Cy5(白色)標(biāo)記，且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)復(fù)染。比例尺=20μπι。圖24(B)、(D)和(F)顯示在37°C持續(xù)暴露于1x109MC40革巴向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞(“PC”)24小時后，ZsGreen表達呈陽性的lxl06!fep3B和肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在(B)中細(xì)胞正在分裂而在(D)和(F)中~95%匯合；x軸表示無論CBl質(zhì)粒(“pCBl”)和pCBl-組蛋白復(fù)合物(“復(fù)合物”)是否經(jīng)NLS修飾，。單獨pCBl，以及經(jīng)DOTAP和DOPE1:1(重量/重量)混合物封裝的PCBl用作對照。細(xì)胞被暴露于20mg/mL的麥胚凝集素(WGA)以阻斷NLS修飾的pCBl通過核孔復(fù)合物易位。誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96(0。圖24(G)-⑴分別為圖(A)、(C)和(E)中所采用細(xì)胞的細(xì)胞周期直方圖。給出了各直方圖GcZG1期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在所有實驗中，原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0357]圖25顯示了在37°C暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞I小時或72小時的H印3B細(xì)胞(A)和肝細(xì)胞(B)的共聚焦熒光顯微鏡圖像；在所有實驗中PCBl濃度維持在5pMo(B)中的箭頭指示有絲分裂細(xì)胞。細(xì)胞周期蛋白BI經(jīng)AlexaFluor*594標(biāo)記的單克隆抗體(紅色)標(biāo)記，而細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)染色。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有比例尺=20μm。[0358]圖26顯示了在37°C暴露于MC40靶向的、pCBl裝載的原始細(xì)胞I小時或72小時的H印3B細(xì)胞(A)和肝細(xì)胞(B)的共聚焦熒光顯微鏡圖像；在所有實驗中PCBl濃度維持在5pM。細(xì)胞分別經(jīng)AlexaFluorκ647標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(白色)和碘化丙錠(紅色)染色以分析早期和晚期凋亡，而且細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342(藍色)復(fù)染。原始細(xì)胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經(jīng)0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有比例尺=20μm。[0359]含有兩性離子脂質(zhì)組成的SLB的原始細(xì)胞誘導(dǎo)非特異性細(xì)胞毒性。[0360]如附圖27所述，在37°C持續(xù)暴露于IxIO9APTES修飾的中孔二氧化硅納米顆粒、含APTES修飾核的DOPC原始細(xì)胞、裝載有編碼亂序shRNA序列的質(zhì)粒(“亂序pCBl”)的DOPC原始細(xì)胞或裝載有亂序pCBl的D0TAP/D0PE(1:1重量/重量)脂質(zhì)復(fù)合物48小時后，lxl06Hep3B變得細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù)。使用正-和負(fù)-電荷聚苯乙烯納米顆粒(分別為“胺-PS”和“羧基-PS”)作為陽性對照，而使用暴露于IOmM抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)或Ipmol游離pCBl的!fep3B作為陰性對照。所有誤差棒表示η=3的95%置信區(qū)間(1.96σ)。[0361]本文所公開的所有參考文獻在其相關(guān)處引入作為參考[0362]實施例1的參考文獻[0363]ICarroll,N.J.,Pylypenko,S.,Atanassov,P.B.&Petsev,D.N.MicroparticleswithBimodalNanoporosityDerivedbyMicroemulsionTemplating.Langmuir,do1:10.1021/la900988j(2009).[0364]2Lu,Y.F.etal.Aerosol-assistedself-assemblyofmesostructuredsphericalnanoparticles.Nature398,223-226(1999).[0365]3Iler,R.K.TheChemistryofSilica:Solubility,Polymerization,ColloidandSurfaceProperties,andBiochemistry.(JohnWileyandSons,1979).[0366]4DoshijD.A.etal.NeutronReflectivityStudyofLipidMembranesAssembledonOrderedNanocompositeandNanoporousSilicaThinFilms.Langmuir21，2865-2870，do1:10.1021/la0471240(2005).[0367]5Bernhard，M.1.etal.GuineaPigLine10HepatocarcinomaModel:CharacterizationofMonoclonalAntibodyandinVivoEffectofUnconjugatedAntibodyandAntibodyConjugatedtoDiphtheriaToxinAChain.CancerResearch43,4420-4428(1983).[0368]6LojA.，LinjC.T.&WujH.C.Hepatocellularcarcinomacell-specificpeptideligandfortargeteddrugdelivery.MolecularCancerTherapeutics7，579-589，do1:10.1158/1535-7163.mct-07-2359(2008).[0369]7SciotjR.etal.Transferrinreceptorexpressioninhumanhepatocellularcarcinoma:animmunohistochemicalstudyof34cases.Histopathology12，53-63(1988).[0370]8KannangaijR.，SahinjF.&TorbensonjM.S.EGFRisphosphorylatedatTy845inhepatocellularcarcinoma.ModPathol19，1456-1461(2006).[0371]9BehrjJ.P.TheProtonSponge:aTricktoEnterCellstheVirusesDidNotExploit.CHIMIAInternationalJournalforChemistry51，34-36(1997).[0372]10Jiang,W.,KimBettyjY.S.,RutkajJ.T.&ChanWarrenjC.W.Nanoparticle-mediatedcellularresponseissize-dependent.NatNano3，145-150(2008).[0373]11ZimmermannjR.etal.Chargingandstructureofzwitterionicsupportedbilayerlipidmembranesstudiedbystreamingcurrentmeasurements,fluorescencemicroscopy,andattenuatedtotalreflectionFouriertransforminfraredspectroscopy.Biointerphases4，1-6(2009).[0374]12AshiharajE.，KawatajE.&MaekawajT.FutureProspectofRNAInterferenceforCancerTherapies.CurrentDrugTargets11，345-360(2010).[0375]13PawitanjJ.A.ThepossibleuseofRNAinterferenceindiagnosisandtreatmentofvariousdiseases.1nternationalJournalofClinicalPractice63，1378-1385(2009).[0376]14ElbashirjS.M.etal.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature411，494-498(2001).[0377]15Davis,M.E.etal.EvidenceofRNAiinhumansfromsystemicallyadministeredsiRNAviatargetednanoparticles.Natureadvanceonlinepublication(2010).[0378]16OhjY._K.&Park,T.G.siRNAdeliverysystemsforcancertreatment.AdvancedDrugDeliveryReviews61，850-862(2009).[0379]17Sou,K.，Endo，T.，Takeoka，S.&Tsuchida，E.Poly(ethyleneglycol)-ModificationofthePhospholipidVesiclesbyUsingtheSpontaneousIncorporationofPoly(ethyleneglycol)-LipidintotheVesicles.BioconjugateChemistry11,372-379,do1:10.1021/bc990135y(2000).[0380]18Klein,E.etal.“HFP，，F(xiàn)luorinatedCationicLipidsforEnhancedLipoplexStabilityandGeneDelivery.BioconjugateChemistry21，360-371，do1:10.1021/bc900469z(2010).[0381]19Minguez，B.，Tovar,V.，Chiang，D.，Villanueva，A.&Llovet，J.M.Pathogenesisofhepatocellularcarcinomaandmoleculartherapies.CurrentOpinioninGastroenterology25，186-194110.1097/M0G.1090bl013e32832962a32832961(2009).[0382]20Li,S.-D.，Chen,Y._C.，HackettjM.J.&Huang,LTumor-targetedDeliveryofsiRNAbySelf-assembledNanoparticles.MolTher16，163-169，do1:http://www.nature,com/mt/journal/vl6/nl/suppinfo/6300323sl.html(2007).[0383]21LandenjC.N.etal.TherapeuticEphA2GeneTargetingInvivoUsingNeutralLiposomalSmallInterferingRNADelivery.CancerResearch65，6910-6918(2005).[0384]22HonjojT.，NishizukajY.，Hayaishij0.&Katoj1.DiphtheriaToxin-dependentAdenosineDiphosphateRibosylationofAminoacylTransferaseIIandInhibitionofProteinSynthesis.JournalofBiologicalChemistry243，3553-3555(1968).[0385]23UchidajT.，KimjJ.H.，YamaizumijM.，Miyake,Y.&OkadajY.ReconstitutionoflipidvesiclesassociatedwithHVJ(Sendaivirus)spikes.Purificationands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對照相比，所有制劑的通量均增加，DMSO制劑展現(xiàn)最高的伊馬替尼通量(0.225μg/cm2hr)。[0410]因此，透皮原始細(xì)胞可由多孔納米顆粒組成，所述多孔納米顆粒(a)裝載有一種或多種藥學(xué)活性劑如伊馬替尼和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種角質(zhì)層滲透促進劑，例如單飽和ω-9脂肪酸(油酸、反油酸、二十烯酸、二十碳三烯酸(Meadacid)、芥酸和神經(jīng)酸，優(yōu)選油酸)、醇、二醇(最優(yōu)選聚乙二醇(PEG))、R8肽和膜軟化劑如膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鏈表面活性劑(例如，去氧膽酸鈉)。原始細(xì)胞可具有平均為約50nm至約300nm,優(yōu)選約65nm至約75nm的直徑。[0411]實施例2的參考文獻[0412]1."FASS.se."Mobil,fass.se.Web.26Jan.2010.[0413]2.Benson,Η.2005.TransdemalDrugDelivery:PenetrationEnhancementTechniques.CurrentDrugDelivery.2:23-33.[0414]3.KearjC.，Yang,J.，Godwin,D.，andFelton,L.2008.1nvestigationintotheMechanismbyWhichCyclodextrinsInfluenceTransdermalDrugDelivery.DrugdevelopmentandIndustrialPharmacy.34:692-697.[0415]4.BanyjB.W.2001.NovelmechanismsanddevicestoenablesuccessfUltransdennaldrug[0416]delivery.EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences.14101-114[0417]5.MaghrabyjG.，Barry,W.，andWilliams,A.2008.Liposomesandskin:Fromdrugdeliveryto[0418]modelmembranes.EuropeanJournalofPharmaceuticalScience.34203-222.[0419]6.Singh,B.，Singh,J.andSingh,B.N.2005.Effectsofionizationandpenetrationenhancersonthetransdermaldeliveryof5-fluorouraciIthroughexcisedhumanstratumcorneum.1nternationalJournalofPharmaceutics.298:98-107.[0420]7.DouroumisjD.,andFahrjA.2007.Stablecarbamazepinecolloidalsystemsusingthecosolventtechnique.EuropeanJournalofPharmaceuticalScience.30:367-374.[0421]8.Ni，N.，Sanghvi,T.，andYalkowskyjS.2002.Solubilizationandprefomulationofcarbendazim.1nternationalJournalofPharmaceutics.24499-104.[0422]9.RubinojT.J.andYalkowskyjH.S.1987.CosolvencyandCosolventPolarity.Pharmaceutical[0423]Research.4220-230.[0424]10."PharmacologyofDMS0."DimethylSulfoxide(DMSO)-Dr.StanleyJacob.Web.30Mar.[0425]2010.[0426]11.NotmanjR.，Otter,K.W.，NorojG.M.，BrielsjJ.W.，andAnwar,J.2007.ThePermeability[0427]EnhancingMechanismofDSMOinCeramideBilayersSimulatedbyMolecularDynamics.[0428]BiophysicalJournal.93:2056-2068.[0429]實施例3[0430]siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[0431]結(jié)果[0432]siRNA裝載的原始細(xì)胞的特征描述。二氧化娃納米顆粒如Carroll等人35所述制備，并具有>600m2/g的BET表面積、~65%的孔體積分?jǐn)?shù)和由通過6-12nm孔互連的大的(20-30nm)、表面可及的孔組成的多式孔形態(tài)學(xué)(見圖2BX3-CX3)。如方法部分所述在裝載siRNA(或蓖麻毒素A鏈)前按大小分離二氧化硅納米顆粒(見圖2AX3)。圖3AX3顯示使用一系列策略構(gòu)建的原始細(xì)胞或脂質(zhì)復(fù)合物的siRNA裝載容量。由兩性離子磷脂、DOPC組成的脂質(zhì)復(fù)合物每101°顆粒包封~IOnMSiRNA0由陽離子脂質(zhì)、DOTAP組成的脂質(zhì)復(fù)合物的構(gòu)建，使得siRNA負(fù)載物增加5倍，推測由于負(fù)電荷核苷酸和正電荷脂質(zhì)組分之間的吸引性靜電相互作用。包含負(fù)電荷二氧化硅核和兩性離子脂質(zhì)雙層的原始細(xì)胞具有大約與陽離子脂質(zhì)復(fù)合物相同的容量。經(jīng)含胺硅烷AEPTMS修飾的二氧化硅核，使ζ電勢從_32mV增加至+12mV并得到每101°顆粒~IμM的siRNA容量。使用DOTAP脂質(zhì)體協(xié)同地將siRNA裝載至負(fù)電荷核中使得原始細(xì)胞具有類似的容量，比基于顆粒的治療應(yīng)用中常用地兩性離子脂質(zhì)體的容量高大于100倍。圖3BX3和3CX3中顯示了在分散于替代生物學(xué)流體中的DOPC和DOTAP脂質(zhì)體以及含經(jīng)AEPTMS修飾的核的DOPC原始細(xì)胞的穩(wěn)定性。在中性和溫和的酸性PH條件下DOPC脂質(zhì)復(fù)合物快速釋放它們包封的siRNA，使得在4_12小時內(nèi)完全失去核苷酸內(nèi)容物。盡管在中性PH條件下DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物比DOPC脂質(zhì)復(fù)合物更穩(wěn)定，但在72小時周期內(nèi)丟失它們siRNA內(nèi)容物的大約50%。與上述兩種脂質(zhì)復(fù)合物顯著相反，當(dāng)暴露于模擬體液72小時時，含經(jīng)AEPTMS修飾的核的DOPC原始細(xì)胞保留了它們包封的RNA的95%。在溫和的酸性條件(其反映了內(nèi)體/溶酶體通路的條件)下，siRNA裝載的、AEPTMS修飾的核和受支撐的脂質(zhì)雙層的PE和PC頭基之間降低的經(jīng)典和偶極相互作用引起膜去穩(wěn)定并將該核暴露于酸性介質(zhì)。在膜去穩(wěn)定后，負(fù)載物擴散和核溶解的合并速率導(dǎo)致該釋放特點，見圖3CX3。因此，關(guān)于siRNA裝載容量、顆粒穩(wěn)定性和釋放特征，與相應(yīng)的脂質(zhì)復(fù)合物相比，原始細(xì)胞表現(xiàn)出極大的改善。[0433]siRNA裝載的原始細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性:我們最近證明了與靶向肽(SP94)(其結(jié)合肝細(xì)胞癌(HCC)但不控制肝細(xì)胞)綴合的原始細(xì)胞遞送多種化療劑和選擇性誘導(dǎo)表達相關(guān)表面標(biāo)記物的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。此處我們顯著地展開描述裝載有大分子負(fù)載物(包括siRNA和蛋白質(zhì)毒素)的靶向原始細(xì)胞。我們制備了由AEPTMS修飾的二氧化硅核和D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000(55:5:30:10質(zhì)量比)支撐的脂質(zhì)雙層組成、與SP94綴合以選擇性結(jié)合HCC并與內(nèi)體裂解肽綴合以促進內(nèi)體/溶酶體釋放的原始細(xì)胞。原始細(xì)胞裝載有靶向細(xì)胞周期蛋白超家族成員(包括細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白E、密切牽涉于整個細(xì)胞周期和活力的蛋白質(zhì))的siRNA的等摩爾混合物。[0434]圖4X3顯示通過使用AEPTMS修飾的核構(gòu)建的、siRNA-裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞，HCC細(xì)胞系H印B中基因沉默的濃度和時間依賴性。A圖證明了在48小時內(nèi)，原始細(xì)胞的濃度增加，以及從而siRNA濃度的增加誘導(dǎo)各靶基因中蛋白質(zhì)水平的劑量依賴性降低。對于細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白D1、和細(xì)胞周期蛋白E，抑制蛋白質(zhì)表達90%的siRNA的濃度(IC9tl)分別為125pM、92pM、149pM和370pM。B組顯示在添加125pM裝載于靶原始細(xì)胞的siRNA后，蛋白質(zhì)水平如何降低。截至72小時，各靶蛋白水平受抑制超過90%，抑制程度(細(xì)胞周期蛋白E略低于其它周期蛋白)反映了IC9tl值的區(qū)另ij。圖4CX3顯示使用多種類型的SP94靶向的顆?？蓪崿F(xiàn)基因沉默的選擇性。在與H印3B孵育48小時后，裝載有125pMsiRNA的DOPC原始細(xì)胞幾乎誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白A2蛋白質(zhì)的完全抑制，但對未轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞無影響。相反，裝載有125pMsiRNA的DOPC脂質(zhì)復(fù)合物對各細(xì)胞系中的細(xì)胞周期蛋白蛋白質(zhì)水平幾乎無影響。裝載有125pMsiRNA的SP94靶向的DOPC脂質(zhì)復(fù)合物誘導(dǎo)Hep3B中細(xì)胞周期蛋白A2~60%抑制，但也降低肝細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白A2水平，該作用可能由它們的正電荷(ζ=+22mV)引起。抑制細(xì)胞周期蛋白A2表達90%所需的SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞、DOPC脂質(zhì)復(fù)合物和DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物的數(shù)目顯示于C圖的右軸上。需要的DOPC原始細(xì)胞比類似的DOPC脂質(zhì)復(fù)合物少IO4倍而需要的DOPC原始細(xì)胞比DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物少300倍。因此，關(guān)于活性和特異性，靶向原始細(xì)胞相比于基于脂質(zhì)的納米顆粒提供顯著的優(yōu)勢。[0435]圖5X3顯示了解釋原始細(xì)胞分布的時間依賴性和暴露于siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞的細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白A2、B1、Dl和E的表達的共聚焦熒光顯微鏡圖像。如A圖中所證明的，向Hep3B添加原始細(xì)胞I小時后，各蛋白質(zhì)的表達仍處于對照水平，且二氧化娃核存在于點狀模式(punctuatepattern),表面內(nèi)體定位。截至48小時,二氧化娃核均勻地遍布于H印3B細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且各靶向蛋白質(zhì)的表達被抑制至本底水平。作為對比，未轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞的相同處理既未導(dǎo)致原始細(xì)胞的細(xì)胞蓄積也未抑制蛋白質(zhì)表達(見B圖)。[0436]圖6X3證明了siRNA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)HCC細(xì)胞毒性的能力。原始細(xì)胞裝載有125pM的siRNA混合物并添加至!fep3B或?qū)φ崭渭?xì)胞中。通過膜聯(lián)蛋白V結(jié)合增加鑒定處于細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞，而處于細(xì)胞凋亡晚期的細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶染色均為陽性。在添加原始細(xì)胞后早在12小時就觀測到凋亡H印3B數(shù)目選擇性增加(A圖)，并且截至72小時超過90%細(xì)胞的兩種細(xì)胞凋亡標(biāo)記物均呈陽性。相反，在未轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞中未觀測到細(xì)胞毒性，通過圖6B和6C顯示的代表性顯微鏡圖像確認(rèn)該觀測。B圖證明在48小時內(nèi)整個種群的Hep3B對表面結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V和細(xì)胞核結(jié)合的碘化丙啶呈陽性，而C圖顯示對照肝細(xì)胞凋亡的兩種標(biāo)記物仍為陰性。[0437]毒素裝載的原始細(xì)胞的特征描述。由于大的(20_30nm)、表面可及核的存在，多式二氧化娃納米顆?？扇菀椎匮b載有各種蛋白質(zhì)毒素，包括白喉毒素、霍亂毒素和蓖麻毒素。此外，經(jīng)低密度(0.015重量％或~6肽/原始細(xì)胞)SP94修飾的DOPC原始細(xì)胞所展現(xiàn)的高度差別特異性使得選擇性遞送尤其是細(xì)胞毒性劑至癌細(xì)胞成為可能。蓖麻毒素發(fā)現(xiàn)于蓖麻油植物(Ricinuscommunis)的種子中，并由包含被二硫鍵結(jié)合在一起的A和B亞單元的異二聚體組成。B亞單元經(jīng)由受體介導(dǎo)的胞吞作用介導(dǎo)毒素進入細(xì)胞，而A亞單元通過裂解28SrRNA中的特異性糖苷鍵抑制蛋白質(zhì)合成。38催化活性的蓖麻毒素A鏈(RTA)已被用作腫瘤特異性免疫毒素的亞單元以抑制多種模型系統(tǒng)中癌細(xì)胞的生長。39’40[0438]圖7X3顯示了裝載有RTA的DOPC原始細(xì)胞和脂質(zhì)細(xì)胞的容量和釋放特征。如A圖所證明，<1ηΜ的蛋白質(zhì)可被裝載于IOkiDOPC脂質(zhì)體中。相反，含未修飾的二氧化硅核的DOPC原始細(xì)胞包封接近100多倍的RTA，且用AEPTMS修飾所述核使得該容量進一步增加了一個數(shù)量級。B和C圖中顯示了RTA裝載的DOPC原始細(xì)胞和脂質(zhì)體的pH依賴性穩(wěn)定性。當(dāng)在中性PH在模擬體液中孵育達72小時時，DOPC原始細(xì)胞釋放它們包封負(fù)載物的~5%，而在溫和的酸性(即，內(nèi)體)條件下RTA從該顆粒穩(wěn)定地釋放。相反，在中性和酸性條件下，DOPC脂質(zhì)體均快速失去它們的RTA內(nèi)容物。[0439]RTA裝載的原始細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。如圖8X3所示，包封于SP94靶向的原始細(xì)胞內(nèi)的RTA引起H印3B細(xì)胞中初生蛋白質(zhì)合成的濃度(A圖)和時間(B圖)依賴性降低。在添加RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞后48小時，在RTA濃度為~5pM處達到蛋白質(zhì)合成的半最大抑制，且在30pMRTA處觀測到完全抑制(A圖)。當(dāng)向!fep3B中添加RTA濃度為25pM的RTA裝載的原始細(xì)胞時，RTA裝載的原始細(xì)胞在~24小時內(nèi)引起蛋白質(zhì)合成降低50%，并且在60小時內(nèi)完全抑制。圖C所顯示的結(jié)果證明了當(dāng)加入至H印3B時，RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞有效地抑制初生蛋白合成，但對相同條件下的對照肝細(xì)胞幾乎無影響。相反，當(dāng)加入至細(xì)胞使得RTA的終濃度為25pM時，SP94靶向的DOPC脂質(zhì)體不能抑制H印3B或肝細(xì)胞中的初生蛋白合成。此外，如C圖右軸所示，需要IO4倍更多的RTA裝載的脂質(zhì)體(~60pMRTA)以抑制!fep3B細(xì)胞中90%的蛋白質(zhì)生物合成。[0440]如圖9X3所示,使用AlexaFluor488標(biāo)記的甲硫氨酸衍生物和AlexaFluor647標(biāo)記的二氧化硅核(分別地)定量初生蛋白合成和細(xì)胞內(nèi)原生細(xì)胞分布。在向Hep3B添加RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞后I小時，蛋白質(zhì)合成是旺盛的，且原始細(xì)胞位于細(xì)胞質(zhì)小泡內(nèi)(A圖)。在48小時孵育后，原始細(xì)胞分散遍布于細(xì)胞質(zhì)并且蛋白質(zhì)合成被顯著抑制。如B圖所示，向未轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞添加類似的原始細(xì)胞既未導(dǎo)致原始細(xì)胞的細(xì)胞蓄積也未抑制初生蛋白合成。[0441]圖10X3中顯示RTA裝載的原始細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)HCC細(xì)胞而非對照肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力。根據(jù)半胱天冬酶-9和/或半胱天冬酶-3的激活測量到，早在8小時，RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞就誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，截至20-28小時50%的細(xì)胞呈陽性。截至49小時看到完全細(xì)胞死亡。相等的原始細(xì)胞濃度未降低肝細(xì)胞活力低于對照水平，即使孵育7天后。圖B和C中顯示了原始細(xì)胞分布和細(xì)胞凋亡的顯微鏡圖像。在向Hep3B添加RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞后48小時，原始細(xì)胞分布于細(xì)胞質(zhì)中且細(xì)胞對半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3激活呈陽性(B圖)。如C圖所示，在相同的實驗條件下，對照肝細(xì)胞對半胱天冬酶染色和顆粒蓄積仍為陰性。[0442]討論[0443]大分子療法(包括核酸和毒素)正被廣泛研究用于治療很多由基因表達的異常模式介導(dǎo)的疾病，由于遞送系統(tǒng)的顯著缺陷，其全部潛能仍未揭示。17’18本文，我們提供的證據(jù)表明原始細(xì)胞展現(xiàn)了使得有效封裝和特異性細(xì)胞遞送siRNA和蛋白質(zhì)毒素成為可能的特性。[0444]由于若干原因，未修飾的核酸，包括siRNA,不能被全身性給予。它們對血衆(zhòng)核酸酶高度敏感并且由于有效的腎過濾具有非常短的循環(huán)半衰期。3此外，由于核酸的凈負(fù)電荷和大尺寸，核酸不易于被細(xì)胞攝取。41為繞開這些問題，將siRNA與多種聚合物綴合或包封于納米顆粒如脂質(zhì)體中。摻入中性脂質(zhì)體或與陽離子脂質(zhì)綴合提高了穩(wěn)定性和循環(huán)半衰期，并且在陽離子復(fù)合物的情況中，增強了向細(xì)胞的靜電介導(dǎo)的遞送。42，43中性產(chǎn)品，包括殼聚糖(chitosan)44和環(huán)糊精(cyclodextran)45已被用于與siRNA形成生物活性的復(fù)合物。與聚合物，如聚乙烯亞胺的綴合已顯示通過有助于防止降解可增強siRNA的治療有效性并增強遞送。46[0445]全身性給予siRNA的治療用于需要遞送至特定器官或細(xì)胞亞類以增強有效性并降低非特異性毒性。在抗癌療法中尤其如此，其中有必要保護正常細(xì)胞免遭細(xì)胞毒性siRNA的作用。如果靶向細(xì)胞存在于機體的多個位置，并發(fā)癥也會出現(xiàn)，如血液學(xué)腫瘤或轉(zhuǎn)移性疾病的情況，其中新生細(xì)胞廣泛播散。為解決該問題，已將識別靶向細(xì)胞表面上差別表達的抗原的分子直接與siRNA或包封所述核苷酸的顆粒綴合。[0446]受體配體，如葉酸鹽/酯47、膽固醇48和轉(zhuǎn)鐵蛋白13成功地用于指導(dǎo)SiRNA復(fù)合物與過表達各自細(xì)胞受體的細(xì)胞結(jié)合。[0447]識別靶細(xì)胞上適當(dāng)分子的抗體也用于指導(dǎo)包含SiRNA的顆粒選擇性與特異性種類的細(xì)胞結(jié)合。49此外，已將通過多重篩選操作選擇以與所需細(xì)胞表位結(jié)合的肽或核酸適體，直接與siRNA或多個種類的含siRNA顆粒綴合以增強特異性細(xì)胞相互作用。50[0448]盡管在核酸和蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)的一些方面有顯著的進展，包括它們化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾以免遭降解或與靶向試劑的綴合，但仍存在許多缺陷。[0449]盡管利用陽離子脂質(zhì)或聚合物以靜電地復(fù)合、濃縮并遞送核酸的許多試劑是市購可得的，但大多數(shù)這些制劑導(dǎo)致真核細(xì)胞的非特異性轉(zhuǎn)染。此外，已發(fā)現(xiàn)陽離子脂質(zhì)/核酸復(fù)合物(脂質(zhì)復(fù)合物)是細(xì)胞毒性的，并且在血清存在下，其轉(zhuǎn)染有效性和膠體穩(wěn)定性是有限的。反之，兩性離子脂質(zhì)不能有效地壓縮核酸，即使在二價陽離子存在下。所有這些納米顆粒遞送系統(tǒng)還面臨有限的負(fù)載物容量。[0450]如我們的實驗結(jié)果所示，相比于已有的遞送策略，原始細(xì)胞提供顯著的優(yōu)勢。我們此前已描述了其作為小分子治療劑的靶向納米載體的效用，并證明了其負(fù)載物容量、穩(wěn)定性和細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性遠優(yōu)于傳統(tǒng)脂質(zhì)體。由于大分子的大尺寸、電荷特性和細(xì)胞內(nèi)負(fù)載物釋放的電勢問題，基于納米顆粒的大分子遞送存在更大的挑戰(zhàn)。本文我們已表明原始細(xì)胞也再這些應(yīng)用中提供了獨特優(yōu)勢。通過將多式多孔二氧化硅納米顆粒浸泡于所需的一種或多種負(fù)載物的溶液中，多式多孔二氧化硅納米顆?？扇菀椎匮b載有核酸、毒素和大分子混合物。DOPC脂質(zhì)體與負(fù)載物裝載的核的融合導(dǎo)致穩(wěn)定的受支撐的脂質(zhì)雙層(SLB)的形成，所述SLB在中性pH下保留負(fù)載物，降低了非特異性結(jié)合，改善了膠體穩(wěn)定性，并緩和了與陽離子脂質(zhì)體和脂質(zhì)復(fù)合物有關(guān)的細(xì)胞毒性(詳情參見參考文獻34)。與流動但穩(wěn)定的SLB綴合的靶向肽與細(xì)胞表面受體多價地相互作用，誘導(dǎo)受體介導(dǎo)的胞吞作用。在酸化的內(nèi)體環(huán)境中，SLB去穩(wěn)定化連同滲透膨脹和內(nèi)體破裂(由內(nèi)體裂解肽的質(zhì)子海綿體效應(yīng)引起)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)二氧化硅核的分散。[0451]合并擴散和二氧化硅和溶解使得受控的、持續(xù)的負(fù)載物釋放>12小時。原始細(xì)胞合并的容量、穩(wěn)定性和靶向和內(nèi)化效率導(dǎo)致對H印3B格外低得IC9tl值，且實際上對正常肝細(xì)胞無副作用。[0452]含有150nm核的原始細(xì)胞每顆粒(每L)包封~6xl07siRNA分子或IxlO7蓖麻毒素A鏈(RTA)分子并在暴露于模擬體液72小時后保留幾乎其負(fù)載物的100%。作為對t匕，脂質(zhì)和聚合物納米顆粒具有低10-1000倍的大分子負(fù)載物容量，并且在中性pH實質(zhì)上更不穩(wěn)定。51’52此外，相比于中孔二氧化硅顆粒，原始細(xì)胞具有更高的核酸負(fù)載物容量。SIMP,由Tanaka等人研發(fā)的用于遞送siRNA裝載的納米脂質(zhì)體至卵巢癌,包封大約與原始細(xì)胞相同量的RNA(每顆粒2pgvs.每顆粒1.3pg)，盡管他們的平均直徑大10倍(1.6μπιvs.150nm)53。[0453]聚乙烯亞胺包被的中孔二氧化硅納米顆粒，由Xia等人研發(fā)，每10μg顆粒復(fù)合~IμgSiRNAdO重量％)33;作為對比，10μg原始細(xì)胞可裝載有~6.5μgSiRNA(65重量％)。容量和穩(wěn)定性的增強使得siRNA裝載的原始細(xì)胞沉默靶基因和在比文獻中報道的值低10-10，OOO倍的濃度誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡成為可能。51’52’54_58siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞在siRNA濃度范圍為90pM至370pM(IC9(l)時沉默90%的細(xì)胞周期蛋白A2、B1、Dl和E的表達，并且在siRNA濃度為125pM殺死>90%的HCC(LC9tl)。作為對比，靶向脂質(zhì)體具有IC9tl和LC9tl值為5-500nM，取決于顆粒的類型和實驗進行的條件。54_56’58_6°siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞的療效也超過了聚合物包裹的中孔納米顆粒的療效。若干組已使用包封于聚陽離子聚合物內(nèi)的中孔二氧化硅納米顆粒以復(fù)合siRNA;該顆粒在納米顆粒:siRNA(重量/重量)比為10-20時導(dǎo)致報告子和內(nèi)源性基因表達30-60%敲低。33’61由于我們將siRNA裝載在經(jīng)AEPTMS修飾的二氧化硅納米顆粒的納米孔內(nèi)，原始細(xì)胞的容量顯著的較高，導(dǎo)致在原始細(xì)胞:細(xì)胞比例為~8時，完全沉默稀薄啊周期蛋白A2、B1、D1和E的表達。結(jié)論，我們的發(fā)現(xiàn)表明原始細(xì)胞可用作多種大分子包括核酸和毒素的通用的靶向納米載體。納米多孔核也可裝載有其它不同的負(fù)載物類型，包括治療診斷學(xué)和個體化用藥的新興領(lǐng)域所需的成像和診斷劑。[0454]材料和方法[0455]材料。抗細(xì)胞周期蛋白A2抗體(小鼠mAb)、細(xì)胞周期蛋白BI(小鼠mAb)、細(xì)胞周其月蛋白Dl(小鼠mAb)、和細(xì)胞周期蛋白E(小鼠mAb)購自Abeam,Inc.(Cambridge,MA)。沉默子選擇siRNA(siRNAIDs對于細(xì)胞周期蛋白A2、B1、Dl和E的siRNAID分別為s2513、s2515,s229和s2526)由LifeTechnologiesCorporation(Carlsbad,CA)購自AppliedBiosystems?。人H印3B(HB-8064)、人肝細(xì)胞(CRL-11233)、Eagle最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM)、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和IX胰蛋白酶-EDTA溶液(含0.53mMEDTA的0.25%胰蛋白酶)購自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC；Manassas,Virginia)。1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(D0PE)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)和膽固醇購自AvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,AL)。CaspGLOW?熒光素活性半胱天冬酶-9染色試劑盒(485/535)和CaspGLOff?紅色活性半胱天冬酶-3染色試劑盒(540/570)購自BioVision,Inc.(MountainView,CA)。[0456]ΛHfIivEM90(鯨蠟基PEG/PPG-10/1二甲硅油)購自EvonikIndustries(Essen,Germany)。[0457]Hoechst33342(350/461)、AlexaFluor"488抗體標(biāo)記試劑盒(495/519)、膜聯(lián)蛋白V的AlexaFluor?488綴合物(495/519)、Ciick-?Τ*AHAAlexaFluor?488蛋白質(zhì)合成HCS分析(495/519)、碘化丙啶(535/617)、AlexaFluor?647甲酸琥珀酰亞胺酯(650/668)、SlQwFa4e?>Gold抗褪色劑、Image-1l"FX信號增強劑、IXDulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS)和牛白蛋白成分V溶液(BSA，7.5%)購自InvitrogenLifeSciences(Carlsbad,CA)。BEGMBullet試劑盒購自LonzaGroupLimited(Clonetics；Walkersville,MD)。AlHlCOlI^Ultra-4離心過濾器裝置(IOkDaMffCO)購自Millipore(Billerica，MA)。所有妝由NewEnglandPeptide(Gardner,MA)合成。玻拍酉先亞胺基-[(N-馬來酰亞胺基丙酰胺基)-二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)購自PierceProteinResearchProducts(ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)。超純、EM級甲醒(16%,無甲醇)購自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)。無水乙醇、鹽酸(37%)、原娃酸四乙酯(TE0S，98%)、3-[2-(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS，工業(yè)級)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB，>99%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，≥98.5%),Triton*X-1OO,十六烷(≥99%)、叔丁醇(≥99.5%)、2_巰基乙醇(≥99.0%)、DL-二硫蘇糖醇(≥99.5%)、二甲亞砜(≥99.9%)、pH5檸檬酸緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA,99.995%)、人表皮生長因子、L-α-磷脂酰乙醇胺、牛纖連蛋白、牛膠原I型、大豆胰蛋白酶抑制劑(≥98%)、無酚紅DMEM、從蓖麻獲得的去糖基化A鏈和Sephadex?G-200購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。[0458]細(xì)胞培養(yǎng)條件。！fep3B和肝細(xì)胞獲自ATCC，并根據(jù)制造商說明書生長。簡而言之，Hep3B維持于含有10%FBS的EMEM中。肝細(xì)胞生長于涂布有BSA、纖連蛋白和牛膠原I型的燒瓶中；所使用的培養(yǎng)基為含有5ng/mL表皮生長因子、70ng/mL磷脂酰乙醇胺和10%FBS的BEGM(慶大霉素、兩性霉素和腎上腺素被從BEGMBullet試劑盒中棄除)。在37°C將細(xì)胞維持于潮濕氣氛(補充有5%CO2的空氣)中并用0.05%胰蛋白酶在亞培養(yǎng)比1:3下傳代。[0459]多式二氧化硅納米顆粒的合成。Cairoll等人35描述了用于合成具有多式孔隙率的納米多孔二氧化硅顆粒的乳液處理技術(shù)。簡而言之，將1.82gCTAB(可溶于水相中)加入至20g去離子水中，在40°C攪拌直至溶解，并允許冷卻至25°C。將0.57g1.0NHCl、5.2gTEOS和0.22gNaCl加入至CTAB溶液，并攪拌所得溶膠I小時。制備由含3重量％ABIL?EM90(可溶于油相的非離子型乳化劑)的十六烷組成的油相。前體溶膠與油相(1:3體積比的溶膠:油)在1000mL圓底燒瓶中混合，劇烈攪拌2分鐘以促進油包水乳劑的形成，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-205；BuchiLaboratoryEquipment!Switzerland)并放置于80°C水浴中持續(xù)30分鐘。然后在120mbar減壓下煮沸混合物(35rpm，持續(xù)3小時)以除去溶劑。然后在3000rpm離心(ModelCentraMP4R；InternationalEquipmentCompany；Chattanooga,TN)顆粒20分鐘，并傾出上清液。最后，在500°C將顆粒煅燒5小時以除去表面活性劑和過量的有機物質(zhì)。[0460]為使得未修飾顆粒更加親水，它們在80°C經(jīng)(i)4%(體積/體積)氫氧化銨和4%(體積/體積)過氧化氫和(ii)0.4MHCl和4%(體積/體積)過氧化氫處理15分鐘。然后顆粒經(jīng)水洗滌數(shù)次并再懸浮于0.5XD-PBS中，終濃度為25mg/mL。通過向ImL含20%APTES的無水乙醇中添加25mg煅燒過的顆粒(25mg/mL)，納米多孔核經(jīng)含胺硅烷AEPTMS修飾；在室溫在AEPTMS中過夜孵育所述顆粒，離心(5，OOOrpm,I分鐘)以除去未反應(yīng)的AEPTMS，并再懸浮于ImL0.5XD-PBS中。通過向ImL顆粒中添加5μL胺反應(yīng)性突光團(fIuorophore)(AlexaFluor*647甲酸琥珀酰亞胺酯；lmg/mL于DMSO中)(每mL顆粒IμL染料)，熒光標(biāo)記AEPTMS修飾的顆粒；將所述顆粒在室溫保持2小時，然后離心除去未反應(yīng)的染料。將熒光標(biāo)記顆粒保存于4°C0.5XD-PBS中。在負(fù)載物裝載和脂質(zhì)體融合前，經(jīng)由尺寸排阻色譜或差速離心除去直徑大于~200nm的顆粒。[0461]二氧化娃納米顆粒的特征描述。使用ZetasizerNano(Malvern；Worcestershire,UnitedKingdom)進行納米多孔二氧化娃顆粒以及負(fù)載物裝載的原始細(xì)胞和脂質(zhì)體的動態(tài)光散射。通過將48μL二氧化硅顆粒(25mg/mL)稀釋于2.4ml0.5XD-PBS中制備樣品。將溶液轉(zhuǎn)移至ImL聚苯乙烯試管(Sarstedt；Niimbrecht,Germany)用于分析。使用ASAP2020表面積和孔隙率分析儀(MicromeriticsInstrumentCorporation；Norcross,GA)進行氮吸附。使用ZetasizerNano(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)測量ζ電勢。將二氧化硅顆粒以1:50稀釋于0.5ΧD-PBS中并轉(zhuǎn)移至Iml折疊式毛細(xì)管樣品池(foldedcapillarycells)(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)用于分析。[0462]脂質(zhì)體與納米多孔二氧化硅顆粒的融合。此前已描述過用于合成原始細(xì)胞的操作％36’62’63_enref_33并將僅作簡要提及。脂質(zhì)訂購自AvantiPolarLipids，將其預(yù)溶解于氯仿中并在_20°C保存。在氮氣流下干燥2.5mg脂質(zhì)并放置于真空烘箱(Model1450M,VffRInternational,WestChester,PA)中過夜以除去殘余溶劑,然后立即進行原始細(xì)胞合成。濃度為2.5mg/mL的脂質(zhì)在0.5XD-PBS中再水合并使用Min1-Extruderset(AvantiPolarLipids,Inc.;Alabaster,AL)將脂質(zhì)通過IOOnm過濾器至少10次。所得脂質(zhì)(直徑~120nm)在4°C保存不超過一周。在室溫,納米多孔二氧化娃核(25mg/mL)經(jīng)2_4倍體積過量的脂質(zhì)體孵育30-90分鐘。在4°C將原始細(xì)胞在過量脂質(zhì)存在下保存達I個月。為除去過量的脂質(zhì)，將原始細(xì)胞在5，OOOrpm離心I分鐘，洗滌兩次并在0.5XD-PBS中再懸浮。[0463]在再水合和擠出前將脂質(zhì)一起凍干；例如合并和干燥75μL的D0PC(25mg/mL)、5μL的DOPE(25mg/mL)UOμL的膽固醇(75mg/mL)、10μL的18:1PEG-2000PE(25mg/mL)以形成由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇和10重量％PEG-2000NBD-PC組成的脂質(zhì)體。[0464]質(zhì)量比為55:5:30:10的DOPC:D0PE:膽固醇:18:1PEG-2000PE用于合成‘D0PC原始細(xì)胞’，而質(zhì)量比為55:5:30:10^DOTAP:DOPE:膽固醇:18:1PEG-2000PE用于合成iDOTAP原始細(xì)胞’。[0465]肽與受支撐的脂質(zhì)雙層的綴合。使用異雙功能交聯(lián)劑SM(PEG)24(其對巰基和胺部分具有反應(yīng)性并具有9.52nmPEG間隔臂)，將SP94和H5WYG肽(與C端半胱氨酸殘基合成)與PE的頭基中存在的伯胺綴合。首先，原始細(xì)胞在室溫經(jīng)10倍摩爾過量的SM(PEG)24孵育2小時并離心(I分鐘，5，OOOrpm)以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑。然后活化的原始細(xì)胞在室溫經(jīng)5倍摩爾過量的SP94孵育原始細(xì)胞2小時以得到0.015重量％的肽密度(~6肽/原始細(xì)胞)，而在室溫經(jīng)500倍摩爾過量的H5WYG孵育4小時以得到0.500重量％的肽密度(~240肽/原始細(xì)胞)。[0466]洗滌原始細(xì)胞以除去游離態(tài)，并使用Tricine-SDS-PAGE測定平均肽密度，如前所述。34[0467]siRNA和蓖麻毒素A鏈裝載的原始細(xì)胞的合成。將未修飾的或經(jīng)AEPTMS修飾的核(25mg/mL)在4°C浸泡于siRNA(250μM，于IXD-PBS中)或去糖基化蓖麻毒素A鏈(100μΜ，于IXD-PBS中)2小時。經(jīng)5，OOOrpm離心I分鐘除去未包封的負(fù)載物，并立即將DOPC脂質(zhì)體與上文所述的負(fù)載物裝載的核融合。經(jīng)由我們此前描述的協(xié)同機理使用siRNA裝載未修飾的核。36簡而言之，向75μL二氧化硅納米顆粒(25mg/mL)中添加25μLsiRNA(ImM)。輕輕地渦旋該溶液，并在4°C將其與200μLDOTAP脂質(zhì)體孵育。經(jīng)離心除去過量的脂質(zhì)和未包封的siRNA后立即使用。[0468]siRNA裝載的脂質(zhì)復(fù)合物的合成。為制備siRNA裝載的DOPC脂質(zhì)復(fù)合物，首先將DOPC、DOPE、cholesterol、和18:1PEG-2000PE以55:5:30:10質(zhì)量比混合，在氮氣流下干燥，并放置于真空烘箱中過夜以除去殘余的氯仿。然后將脂質(zhì)膜溶解于叔丁醇中，并與siRNA溶液以1:1混合(稀釋于含0.85%(重量/體積)NaCl和0.25M蔗糖的IOmMTris-HCl(ρΗ7.4)中)使得最終DOPC:siRNA比為10:1(重量/重量)。渦旋該混合物，在丙酮和干冰浴中快速冷凍，并凍干。在使用前，脂質(zhì)復(fù)合物制劑經(jīng)等張蔗糖溶液(含0.85%(重量/體積)NaCl和0.25M蔗糖的IOmMTris-HCl(pH7.4))水合至最終siRNA濃度為100μg/mL;經(jīng)離心驅(qū)動的過濾(IOkDaMWCO)除去未包封的siRNA。[0469]如Wu等人64所述，我們在較小的改良下制備siRNA裝載的DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物。我們使用18:1PEG-2000PE代替PEG化的神經(jīng)酰胺并使用D0TAP:D0PE:膽固醇:PEG_2000PE比為55:5:30:10。此外，我們將凍干的脂質(zhì)復(fù)合物溶解于含0.85%(重量/體積)NaCl和0.25M蔗糖的IOmMTris-HCl(pH7.4)中以使得最終siRNA濃度為100μg/mL，并使用離心過濾裝置(IOkDaMWC0)除去未包封的siRNA。將脂質(zhì)復(fù)合物溶解于0.5XD-PBS中以用于ζ電勢分析。[0470]為使用SP94和H5WYG修飾DOPC和DOTAP，首先將它們與10倍摩爾過量的SM(PEG)24在室溫孵育2小時；在經(jīng)離心驅(qū)動的過濾(IOkDaMWCO)除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑后，將它們與5倍摩爾過量的SP94和1000倍摩爾過量的H5WYG在室溫孵育2小時。使用離心過濾裝置(IOkDaMWCO)除去游離態(tài)。[0471]RTA裝載的脂質(zhì)體的合成。為制備RTA裝載的DOPC脂質(zhì)體，在氮氣流下干燥2.5mg脂質(zhì)(55:5:30:10質(zhì)量比的D0PC:D0PE:膽固醇:18:1PEG-2000PE)并將其放置于真空烘箱(Model1450M,VffRInternational,WestChester,PA)中過夜以除去殘余溶劑。將脂質(zhì)在濃度為2.5mg/mL于0.5XD-PBS中再水合，簡單超聲，并與等體積的RTA(100μM，于0.5ΧD-PBS中)混合。渦旋該混合物，在丙酮和干冰浴中快速冷凍，并凍干。在使用前，所述脂質(zhì)體制劑經(jīng)上文所述的等張蔗糖溶液再水合，劇烈渦旋，并允許其在室溫靜置2-4小時。然后使用Min1-Extruderset(AvantiPolarLipids,Inc.；Alabaster,AL)將脂質(zhì)體通過IOOnm過濾器至少10次，并通過Sephadex"；G-200柱以除去未包封的RTA。RTA裝載的脂質(zhì)體經(jīng)上文所述的SP94和H5WYG修飾。[0472]負(fù)載物容量和釋放速率的測定。通過將IxIOici顆粒在I重量％SDS(溶解于D-PBS)中孵育24小時并離心所述溶液以除去原始細(xì)胞核和其它碎片測定原始細(xì)胞、脂質(zhì)復(fù)合物和脂質(zhì)體的siRNA和蓖麻毒素A鏈(RTA)容量。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較260nm處的吸光度測定上清液中siRNA的濃度。經(jīng)由SDS-PAGE使用ImageJImageProcessingandAnalysissoftware(NationalInstitutesofHealth；Bethesda,MD)通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較條帶強度測定上清液中RTA的濃度。[0473]通過在37°C將IxIOiq顆粒懸浮于ImL模擬體液(含150mM和10%血清的EMEM，PH7.4)或檸檬酸緩沖液(pH5.0)中持續(xù)多個時期測定siRNA和RTA在中性和酸性pH條件下的釋放速率。經(jīng)離心(對于原始細(xì)胞，5，OOOxg，5分鐘；對于脂質(zhì)體，15，OOOxg，30分鐘；MicrofUge*16Centrifuge;Beckman_Coulter；Brea,CA)將顆粒制成丸狀。使用UV可見光譜法和SDS-PAGE測定上清液中siRNA和RTA濃度。將釋放的負(fù)載物的濃度轉(zhuǎn)化成最初包封于101°顆粒內(nèi)的負(fù)載物濃度的百分?jǐn)?shù)。[0474]細(xì)胞周期蛋白A2、B1、D1和E蛋白質(zhì)表達的定量。為測定沉默90%細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白Dl或細(xì)胞周期蛋白E表所需的siRNA的濃度(IC9(I，見圖4AX3)，將lxl06!fep3B細(xì)胞在37°C暴露于多種濃度的裝載于SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞中的siRNA，持續(xù)48小時。將細(xì)胞離心(lOOOrpm，I分鐘)以除去過量的顆粒，用3.7%甲醛固定(室溫，15分鐘)，并用0.2%TritonX-100透化(室溫，15分鐘)；然后將細(xì)胞暴露于抗細(xì)胞周期蛋白A2、抗細(xì)胞周期蛋白B1、抗細(xì)胞周期蛋白Dl或抗細(xì)胞周期蛋白E的1:500稀釋液，使用AlexaFluor*488抗體標(biāo)記試劑盒在37°C標(biāo)記I小時。洗滌細(xì)胞3次并再懸浮于D-PBS中以用于流式細(xì)胞術(shù)分析(FACSCalibur)。GraphPadPrism(GraphPadSoftware,Inc.；LaJolla,CA)用于從log(siRNA濃度)對平均熒光強度的作圖計算IC9tl值；初始蛋白質(zhì)濃度具有暴露于siRNA裝載的原始細(xì)胞5分鐘的抗體標(biāo)記的細(xì)胞的平均熒光強度。[0475]為測定細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白E表達的時間依賴性降低(見圖4BX3)，將siRNA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞與lxl06Hep3B細(xì)胞混合從而使得最終siRNA濃度為125pM;在37°C孵育細(xì)胞和原始細(xì)胞，持續(xù)不同的時期，并經(jīng)上文所述的免疫熒光測定所得的蛋白質(zhì)水平。[0476]為收集圖4CX3(左軸)所述的數(shù)據(jù)，向lxl06!fep3B或肝細(xì)胞中添加充足體積的siRNA裝載的SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞、DOPC脂質(zhì)復(fù)合物或DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物使得最終siRNA濃度為125pM。在37°C孵育樣品48小時，并如上所述定量細(xì)胞周期蛋白A2表達的降低。為測定圖4CX3(右軸)中所繪制的值，將lxl06Hep3B細(xì)胞在37°C暴露于多種濃度(顆粒/mL)的siRNA裝載的SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞、DOPC脂質(zhì)復(fù)合物或DOTAP脂質(zhì)復(fù)合物48小時；使用免疫熒光法定量細(xì)胞周期蛋白A2表達，且從顆粒濃度對細(xì)胞周期蛋白A2濃度的作圖計算使細(xì)胞周期蛋白A2表達降低90%所需的顆粒數(shù)。[0477]將圖5X3中所述的細(xì)胞在37°C暴露于10倍過量含AlexaFluor?647標(biāo)記的核的siRNA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞I小時或48小時。細(xì)胞經(jīng)D-PBS洗滌3次，根據(jù)制造商說明書經(jīng)Hoechst33342標(biāo)記,經(jīng)3.7%甲醒(室溫，15分鐘)固定，經(jīng)0.2%Tritonx-1oo透化(室溫，5分鐘)，并經(jīng)Image-1T?FX信號增強劑阻斷(室溫，30分鐘)。[0478]然后將細(xì)胞在4°C暴露于AlexaFluor*488標(biāo)記的抗細(xì)胞周期蛋白A2、B1、D1或E的抗體(以1:500稀釋于I%BSA中)過夜，在D-PBS中洗滌3次，并用SlmvFad》Gold封閉。[0479]siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的定量。通過將IxlO6細(xì)胞在37°C與125pM的siRNA孵育不同時期，測定暴露于siRNA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞的H印3B和肝細(xì)胞(見圖6AX3)的時間依賴性活力。細(xì)胞經(jīng)離心(lOOOrpm，I分鐘)以除去過量的原始細(xì)胞并經(jīng)AlexaFluor488?標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶染色。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur)測定活力的(雙陰性)和非活力的(單或雙陽性)細(xì)胞的數(shù)目。[0480]將圖6BX3和6CX3所示的細(xì)胞在37°C暴露于10倍過量的siRNA裝載的、SP94靶向的含AlexaFluor?647標(biāo)記的核的原始細(xì)胞I小時或48小時。然后細(xì)胞經(jīng)D-PBS洗滌3次,根據(jù)制造商說明書經(jīng)Hoechst33342、AlexaFluor?488標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶染色，固定(室溫，3.7%甲醛，10分鐘)，并用SlowFaiieGold封閉。[0481]初生蛋白質(zhì)合成的定量。通過將lxl06!fep3B細(xì)胞在37°C與多種濃度的原始細(xì)胞包封的RTA孵育48小時測定RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞的IC9tl值(見圖8AX3)。使用CHck-1T?AHAAlexaFluor?488蛋白質(zhì)合成HCS分析(根據(jù)制造商說明書)檢測初生蛋白質(zhì)合成的降低，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur)定量。將各樣品的平均熒光強度對log(毒素濃度)作圖，并使用GraphPadPrism測定IC9tl值。[0482]通過將RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞([RTA]=25pM)在37°C與lxl06!fep3B細(xì)胞孵育不同的時期測量初生蛋白質(zhì)合成中的時間依賴性下降(見圖8BX3);如上所述分析初生蛋白質(zhì)合成。[0483]為收集圖8CX3(左軸)所示的數(shù)據(jù)，向lxl06!fep3B或肝細(xì)胞中添加充足體積的RTA裝載的SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞或脂質(zhì)體使得最終RTA濃度為25pM。在37°C孵育樣品48小時，并如上所述定量初生蛋白合成的降低。為測定圖SC(右軸)中所繪制的值，將lxl06Hep3B細(xì)胞在37°C暴露于多種濃度(顆粒/mL)的RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞或脂質(zhì)體48小時；使用CliditsAHAAlexaFkor?488蛋白質(zhì)合成HCS分析定量蛋白質(zhì)生物合成，且從顆粒濃度對初生蛋白濃度的作圖計算使初生蛋白表達降低90%所需的顆粒數(shù)。[0484]將圖9X3中所示的細(xì)胞在37°C暴露于10倍過量含AlexaFluor?647標(biāo)記的核的RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞I小時或48小時。使用C]ick-1T;AHAAlexaFluor?488蛋白質(zhì)合成HCS分析(根據(jù)制造商說明書)標(biāo)記新合成的蛋白質(zhì)。然后根據(jù)制造商說明書使用Hoechst33342將細(xì)胞染色，用3.7%甲醛固定(室溫，10分鐘)，并使用SiowFadegyGoId封閉。[0485]RTA裝載的、SP94靶向的原始細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的定量。通過將lxl06!fep3B和肝細(xì)胞在37°C暴露于RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細(xì)胞([RTA]=25pM)不同時期測定半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3的時間依賴性活化(見圖10AX3)。使用CaspGLOW?熒光素活性半胱天冬酶-9和CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶_3染色試劑盒定量半胱天冬酶活化程度；流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur)用于測定表達高于本底水平(活力Hep3B細(xì)胞)100倍的綠色熒光(FLl)和/或紅色熒光(FL2)的細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞被定義為對半胱天冬酶-9和/或半胱天冬酶-3呈陽性的那些細(xì)胞。[0486]將途10BX3和10CX3所示的細(xì)胞在37°C暴露于10倍過量的RTA裝載的、SP94靶向的含AlexaFluor?647標(biāo)記的核的原始細(xì)胞48小時。使用CaspGLOW?熒光素活性半胱天冬酶-9和CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶_3染色試劑盒(分別)標(biāo)記活性半胱天冬酶_9和活性半胱天冬酶-3。然后細(xì)胞在D-PBS中洗滌3次，并根據(jù)制造商說明書使用Hoechst33342染色，固定(3.7%甲醛，室溫，10分鐘)，并使用ShwFade&Gold封閉。[0487]流式細(xì)胞術(shù)儀器和設(shè)置。對于圖4AX3-4CX3、6DX3、8AX3-8CX3和10AX3，細(xì)胞樣品經(jīng)配備有BDCellQuest?軟件5.2.1版的FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson；FranklinLakes,NJ)分析。使用線性模式的fsc通道和對數(shù)模式的所有其它通道獲得樣品?；谇跋蚬馍⑸溆|發(fā)事件，并將門放置于除外細(xì)胞碎片的前向散射和側(cè)向散射圖上。使用488nm激光源激發(fā)AlexaFluor?488和熒光素，并在FLl通道(530/30過濾器/帶通)中收集發(fā)射強度。使用488nm激光源激發(fā)碘化丙啶和硫代羅丹明(CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶-3染色試劑盒)，并在FL2通道(585/42)中采集發(fā)射強度。使用FlowJo軟件6.4版(TreeStar,Inc.；Ashland,OR)測定平均突光強度。使用SigmaPlotlLO版(SystatSoftware,Inc.；SanJose,CA)生成所有作圖。[0488]共聚焦熒光顯微鏡儀器和設(shè)置。使用ZeissLSM510META(CarlZeissMicroimaging,Inc.；Thornwood,NY)以LSM510軟件的通道模式操作獲得三色和四色圖像；在所有成像中使用63X、1.4-NA油浸物鏡。[0489]典型的激光功率設(shè)置如下:對于405nm二極管激光，30%傳輸；對于488nm氬激光,5%傳輸(60%輸出)；對于543nm氦氖激光，100%傳輸,和對于633nm氦氖激光85%傳輸。對于各通道可調(diào)整增益和偏移量以避免飽和，且通常分別維持在500-700和-0.1。使用0.7-0.9μm光學(xué)薄片獲得具有1024x1024分辨率的8位Z堆棧(8-bitz-stacks)。LSM510軟件用于疊加各通道和用于形成Z堆棧圖像的折疊投影(collapsedprojections)。所有熒光圖像均為折疊投影。[0490]對所有顯微鏡實驗，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長至70-80%匯集，收獲(0.05%胰蛋白酶，10分鐘)，在4000rpm離心2分鐘，并再懸浮于完全生長培養(yǎng)基中。將IxlO4-1xlO6細(xì)胞/mL在37°C接種于涂布有0.01%聚-L-賴氨酸(150_300kDa)的無菌蓋玻片(25_mm，N0.1.5)上并允許其附著4-24小時，然后暴露于原始細(xì)胞。使用Cytopro?離心機,7620型(ffescor,Inc.；Logan,UT)將48小時樣品紡(spun)回至載玻片上。[0491]實施例3的參考文獻[0492]1.PeerDjKarpJMjHongS，F(xiàn)arokhzadOCjMargalitRjLangerR.Nanocarriersasanemergingplatformforcancertherapy.NatNan0.2007；2(12):751-760.[0493]2.PetrosRA，DeSimoneJM.Strategiesinthedesignofnanoparticlesfortherapeuticapplications.NatRevDrugDiscov.2010；9(8):615-627.[0494]3.WangM，ThanouM.Targetingnanoparticlestocancer.PharmacologicalResearch.2010；62(2):90-99.[0495]4.MeisterG，TuschlT.Mechanismsofgenesilencingbydouble-strandedRNA.Nature.2004；431(7006):343-349.[0496]5.RanaTM.1lluminatingthesilence:understandingthestructureandfunctionofsmallRNAs.NatRevMolCellBiol.2007；8(I):23-36.[0497]6.DavidsonBLjMcCrayPB.CurrentprospectsforRNAinterference-basedtherapies.NatRevGenet.2011；12(5):329-340.[0498]7.LaresMR,RossiJJjOuelletDLRNAiandsmallinterferingRNAsinhumandiseasetherapeuticapplications.TrendsinBiotechnology.2010；28(11):570-579.[0499]8.BumcrotDjManoharanMjKotelianskyV，SahDWY.RNAitherapeutics:apotentialnewclassofpharmaceuticaldrugs.NatChemBiol.2006；2(12):711-719.[0500]9.AagaardL，RossiJJ.RNAitherapeutics:Principles，prospectsandchallenges.AdvancedDrugDeliveryReviews.2007；59(2-3):75-86.[0501]10.0zpolatB，SoodAKjLopez-BeresteinG.NanomedicinebasedapproachesforthedeliveryofsiRNAincancer.JournalofInternalMedicine.2010；267(I):44-53.[0502]11.PetroccaF，LiebermanJ.PromiseandChallengeofRNAInterference-BasedTherapyforCancer.JournalofClinicalOncology.February20，20112011；29(6):747-754.[0503]12.deFougerollesA，VornlocherH-PjMaraganoreJ，LiebermanJ.1nterferingwithdisease:aprogressreportonsiRNA—basedtherapeutics.NatRevDrugDiscov.2007；6(6):443-453.[0504]13.DavisME,ZuckermanJE，ChoiCHJjetal.EvidenceofRNAiinhumansfromsystemicallyadministeredsiRNAviatargetednanoparticles.Nature.2010；464(7291):1067-1070.[0505]14.JacksonAL，BurchardJ，LeakeD，etal.Position-specificchemicalmodificationofsiRNAsreduces“off-target，，transcriptsilencing.RNA.July1，20062006；12(7):1197-1205.[0506]I5.JudgeADjSoodVjShawJR，F(xiàn)angD，McClintockKjMacLachIan1.Sequence-dependentstimulationofthemammalianinnateimmuneresp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穩(wěn)定性并減少非特異性相互作用，對HEK293細(xì)胞比對EB2陰性細(xì)胞(親代CH0-K1)具有高IO3倍的親和性。使用共聚焦熒光顯微鏡，我們測得經(jīng)0.015重量％的TGAILHP(SEQIDNO:18)和0.500重量％的R8修飾的MSN-SLB被HEK293迅速地(tl/2=5分鐘)內(nèi)化，而且經(jīng)多種巨胞飲抑制劑預(yù)處理細(xì)胞使攝取降低了60-80%。巨胞飲體的酸化作用(I)使SLB不穩(wěn)定，其觸發(fā)包封的siRNA的釋放并且(2)使R8肽質(zhì)子化，其通過質(zhì)子-海綿機理破壞巨胞飲體的膜，這兩種情況均使得siRNA的細(xì)胞溶質(zhì)分布成為可能。[0563]選擇性結(jié)合和內(nèi)化，隨后的巨胞飲體逃逸使得TGAILHP靶向的、siRNA-裝載的MSN-SLB在siRNA濃度為~5pM時沉默HEK293中90%的NiV-NmRNA成為可能，而不影響親代CHO-Kl細(xì)胞中NiV-N水平。然而，siRNA介導(dǎo)的RNAi是暫時的，并且在治療后5天，NiV-NmRNA水平開始升高。因此，我們設(shè)計了編碼對NiV-N特異性的小發(fā)夾RNA(shRNA)的質(zhì)粒，用組蛋白封裝該質(zhì)粒，并用核定位序列修飾所得的18nm復(fù)合物，然后將其裝載于二氧化硅核內(nèi)。對于組蛋白封裝質(zhì)粒(4.5kbp)，MSN-SLB具有較相應(yīng)的從50:50摩爾比的DOTAP和DOPE形成的脂質(zhì)復(fù)合物高100倍的容量。而且，經(jīng)0.015重量％的TGAILHP(SEQIDNO:18)和0.500重量％的R8修飾的質(zhì)粒裝載的MSN-SLB以顆粒:細(xì)胞比為~1:20(~1750質(zhì)粒/細(xì)胞cell)沉默HEK293中90%的NiV-NmRNA,并誘導(dǎo)長期RNAi；NiV-NmRNA的濃度仍保持在其初始值的〈10%，持續(xù)4周。由于其巨大的負(fù)載物容量，以及其穩(wěn)定性和特異性，MSN-SLB作為能夠預(yù)防病毒復(fù)制和傳播的治療劑的遞送載體顯示了希望。[0564]實施例5[0565]透皮原始細(xì)胞[0566]進行了兩項實驗以測試原始細(xì)胞是否能被工程化以促進SC滲透增強和透皮遞送。在第一項實驗中，目的是測定原始細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)制劑是否可能通過被動擴散穿過角質(zhì)層或通過繞過皮膚而穿過皮膚。為實現(xiàn)該目的，使用了垂直Franz擴散裝置、從腹壁成形術(shù)獲得的全層皮膚和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)。以下部分描述了全部的實驗方法，但簡而言之，使用膠帶剝離方法(tapestrippingmethod)從半數(shù)樣品除去SC,而其余樣品保持完整。使用平均直徑為90nm和孔徑直徑為2.5nm的二氧化硅顆粒，和平均直徑為120nm的脂質(zhì)體以及由55重量％D0PC、30重量％膽固醇和15重量％D0PE-PEG-2000配制成的雙層組合物制備原始細(xì)胞。[0567]表1顯示了所有脂質(zhì)的名稱、簡寫和相關(guān)的物理性質(zhì)。通過填充容器，將皮膚樣品置于其上和將供體帽夾下，修飾的Franz擴散細(xì)胞用于擴散實驗。各組對照(SC完整，SC去除)經(jīng)0.5XPBS處理，而其余樣品經(jīng)8.125mg的原始細(xì)胞處理24小時。然后收集供體帽、皮膚樣品和容器流體中的其余樣品。由于高成本/樣品，僅使用ICP-MS分析了容器流體。圖3aX5顯示了根據(jù)ICP-MS報告，每組(η=3)容器流體中SiO2的總量，證明原始細(xì)胞能夠穿透SC并擴散穿過皮膚。與具有完整SC的皮膚樣品相比，接近4Χ原始細(xì)胞的量能夠擴散穿過SC去除的皮膚樣品，然而，由于各組內(nèi)的高度誤差，這些值統(tǒng)計學(xué)上不顯著，因此這些數(shù)據(jù)僅確認(rèn)了所提議工作的可行性。[0568]下一項實驗有兩個目的，首先，由于ICP-MS的高成本/樣品，為了開發(fā)定量透皮通量的成本有效方法；其次，為了測定原始細(xì)胞的SLB組合物和制劑對透皮動力學(xué)的影響。由于熒光光譜法具有高敏感性、方便使用熒光計和核可被容易地?zé)晒鈽?biāo)記，因此選擇熒光光譜法用于定量通量，圖3bX5為解釋如何使用1°-含胺有機硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，隨后與胺反應(yīng)性熒光團一起孵育通過核的功能化熒光標(biāo)記原始細(xì)胞的核。在所有可見波長下，皮膚本身是高度自發(fā)熒光的，但紅外波長展示了熒光光譜法和共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)所證明的最少量的自發(fā)熒光。因此，選擇AlexaFlour633(激發(fā):632，發(fā)射:647)用于該實驗，并將用于所有后續(xù)實驗中。取決于皮膚自發(fā)熒光的程度，對于容器緩沖液中633標(biāo)記的核，熒光計的敏感性范圍為~195ng/ml-500ng/ml。在該實驗中，使用以下物質(zhì)構(gòu)建含有熒光標(biāo)記的核的原始細(xì)胞:三種堿性SLB組合物和總共六種制劑，所述制劑基于脂質(zhì)轉(zhuǎn)變溫度的差異、飽和度和不飽和度，以及頭基:1.)70重量％D0PC/30重量％膽固醇,2.)55重量％D0PC/30重量％膽固醇/15重量％D0PE-PEG-2000，3.)70重量％DSPC/30重量％膽固醇，4.)55重量％DSPC/30重量％膽固醇/15重量％DSPE-PEG-2000，5.)45重量％D0PC/30重量％膽固醇/25重量％DOPE，和6.)30重量％D0PC/30重量％膽固醇/25重量％DOPE/15重量％DOPE。所有樣品SC保持完整，并且對照經(jīng)0.5XPBS處理，同時各樣品經(jīng)8mg原始細(xì)胞處理24小時。圖3cX5總結(jié)了結(jié)果并解釋SLB組合物和制劑極大地影響了原始細(xì)胞的透皮動力學(xué)。這與文獻一致，該文獻表明具有較低轉(zhuǎn)變溫度的脂質(zhì)較深的擴散進入全層皮膚，而具有較高轉(zhuǎn)變溫度的脂質(zhì)仍局限于角質(zhì)層。初步數(shù)據(jù)共同地證明所提議工作的可行性及其成功的高可能性。此外，已開發(fā)了成本有效的熒光分析法方案定量原始細(xì)胞的透皮動力學(xué)。[0569]方法[0570]原始細(xì)胞合成和特征描述:使用不同的揮發(fā)誘導(dǎo)自組裝(EISA)方法在膠體溶液或經(jīng)霧化合成納米多孔顆粒核。EISA使用兩親性表面活性劑和嵌段共聚物作為與可溶性溶膠-凝膠前體(即酸或堿、H2O或EtOH和一些有機硅烷)結(jié)合的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑以通過簡單溶劑蒸發(fā)促進具有高度有序/均勻孔徑的球形納米尺寸的二氧化硅(SiO2)顆粒的自組裝。56’57—旦完成顆粒合成，則使用溶劑萃取或500°C煅燒除去該結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑?？赏ㄟ^定制濃度和通過選擇結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑控制顆粒大小(30-1000nm)、孔隙率、孔徑(2.5_20nm)、溶解動力學(xué)和表面化學(xué)。此外，使用上文所述的操作可進行合成后功能化(圖3bX5)。通過擠出法形成SLB，在該方法中水性脂質(zhì)溶液多次通過具有均勻孔的多孔聚碳酸酯膜以生成單分散脂質(zhì)體溶液。購買的脂質(zhì)為保存于氯仿中的25mg/ml儲備液，所以在擠出前必須將其萃取和干燥。以不同比例配置，將脂質(zhì)分配于單閃爍瓶中，從而使得最終質(zhì)量為2.5mg。脂質(zhì)組合物和制劑的選擇允許對SLB物理和化學(xué)性質(zhì)的精確控制水平，一個額外水平的控制來自后續(xù)SLB。一旦與該核融合后，則進行修飾(表1)。在真空下除去氯仿，并脂質(zhì)經(jīng)0.5XPBS再水合至終濃度為2.5mg/ml，并擠出，或即刻保存于-20°C〈6個月?！緳?quán)利要求】1.靶向細(xì)胞的多孔原始細(xì)胞，其包含:具有受支撐的脂質(zhì)雙層的納米多孔二氧化硅或金屬氧化物核和至少一種選自以下的其它組分:靶向細(xì)胞的物種；促進原始細(xì)胞內(nèi)體逃逸的融合肽；和包封的DNA，以及包含至少一種選自以下的負(fù)載物組分的其它負(fù)載物:雙鏈線性DNA；質(zhì)粒DNA；藥物；顯像劑；小干擾RNA、小發(fā)夾RNAJiRNA或它們的混合物；其中任選地所述負(fù)載物組分的一種進一步與核定位序列綴合。2.權(quán)利要求1的原始細(xì)胞，其中所述二氧化硅核為球狀且直徑范圍為約IOnm至約250nmo3.權(quán)利要求2的原始細(xì)胞，其中所述二氧化硅核的平均直徑為約150nm。4.權(quán)利要求2或3的原始細(xì)胞，其中所述二氧化硅核的粒徑分布為單分散或多分散的。5.權(quán)利要求2或3的原始細(xì)胞，其中所述二氧化硅核為單分散的。6.權(quán)利要求2或3的原始細(xì)胞，其中所述二氧化硅核為多分散的。7.權(quán)利要求1-6任一項的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層由選自以下的脂質(zhì)組成:1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚?；?sn_甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；?sn_甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；鵢sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]_sn_甘油-3-磷酸膽M(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚?；鵢2_{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和它們的混合物。8.權(quán)利要求1-7任一項的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層包括DOPC和DOPE的組合。9.權(quán)利要求1-7任一項的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層包括D0TAP、D0PG、D0PC或它們的混合物。10.權(quán)利要求1-7任一項的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層包括DOPG和D0PC。11.權(quán)利要求8-10任一項的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層還包括膽固醇。12.權(quán)利要求1-7任一項的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層包括DOPC與約5重量％DOPE、約30重量％膽固醇和約10重量％PEG-2000PE(18:1)的組合。13.權(quán)利要求1-7任一項的原始細(xì)胞，其中脂質(zhì)雙層包括約5重量％DOPE、約5重量％PEG、約30重量％膽固醇、約60重量％DOPC和/或DPPC。14.權(quán)利要求13的原始細(xì)胞，其中所述PEG與所述DOPE綴合。15.權(quán)利要求1-14任一項的原始細(xì)胞，其中所述靶向物種為靶向肽。16.權(quán)利要求15的原始細(xì)胞，其中所述靶向肽為SP94肽。17.權(quán)利要求16的原始細(xì)胞，其中所述靶向肽為SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDN0:8。18.權(quán)利要求15的原始細(xì)胞，其中所述靶向肽為SEQIDNO:KSEQIDN0:2、SEQ1.D.NO:3、SEQ1.D.N0.4或SEQIDNO:5的MET結(jié)合肽。19.權(quán)利要求1-18任一項的原始細(xì)胞，其中所述促融合蛋白為H5WYG肽(SEQIDNO:13)或八體聚精氨酸(SEQIDNO:14)。20.權(quán)利要求19的原始細(xì)胞，其中所述融合肽為SEQIDNO:13。21.權(quán)利要求1-20的原始細(xì)胞，其包含質(zhì)粒DNA，其中所述質(zhì)粒DNA任選經(jīng)修飾以表達核定位序列。22.權(quán)利要求21的原始細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒DNA為超螺旋的或封裝的質(zhì)粒DNA。23.權(quán)利要求22的原始細(xì)胞，其中所述DNA為超螺旋的且封裝的質(zhì)粒DNA。24.權(quán)利要求20-23任一項的原始細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒DNA任選經(jīng)修飾以表達核定位序列。25.權(quán)利要求21-24任一項的原始細(xì)胞，其中所述DNA為組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA,其包括人組蛋白的混合物。26.權(quán)利要求25的原始細(xì)胞，其中所述組蛋白的混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4組成。27.權(quán)利要求25的原始細(xì)胞，其中所述組蛋白混合物為重量比為1:2:2:2:2的H1、H2A、H2B、H3和H4。28.權(quán)利要求1-27任一項的原始細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒DNA能夠表達多肽毒素、小發(fā)夾RNA(shRNA)或小干擾RNA(siRNA)。29.權(quán)利要求28的原始細(xì)胞，其中所述多肽毒素選自蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈。30.權(quán)利要求1或28的原始細(xì)胞，其中所述shRNA或所述siRNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。31.權(quán)利要求1-30任一項的原始細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒DNA能夠表達報告蛋白。32.權(quán)利要求31的原始細(xì)胞，其中所述報告蛋白為綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白。33.權(quán)利要求1-32任一項的原始細(xì)胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12的肽。34.權(quán)利要求1-33任一項的原始細(xì)胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9的肽。35.權(quán)利要求1-34任一項的原始細(xì)胞，其還包含抗癌劑作為藥物。36.權(quán)利要求35的原始細(xì)胞，其中所述抗癌劑為依維莫司、曲貝替定、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、TLK286、AV-299、DN-10U帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886),AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林)、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調(diào)節(jié)劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己堿、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticiIimumab、易普利單抗、棉酹、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,ΒΙΟ140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRiKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、5’-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib;PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-谷氨酸、N-[4-[2_(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二鈉鹽七水合物、喜樹堿、PEG-標(biāo)記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1C11、CHIR-258);3_[5_(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x，其中X=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼(1nafarnib)、BMS-214662、替吡法尼(tipifarnib);氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二?；桨芬涣u肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛(wèi)、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光輝霉素、長春堿、長春瑞濱、托泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內(nèi)皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內(nèi)酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-0-(2-羥基乙基)_雷帕霉素、替西羅莫司、AP-23573、RADOOUABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的干擾素a_2a、干擾素a_2a、PEG化的干擾素a_2b、干擾素a-2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬酰胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、環(huán)孢菌素、柔紅霉素脂質(zhì)體、Edwina-門冬酰胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細(xì)胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀或它們的混合物。37.權(quán)利要求1-36任一項的原始細(xì)胞，其中所述藥物包括抗病毒劑。38.權(quán)利要求37的原始細(xì)胞，其中所述抗病毒劑為抗HIV劑、抗HBV劑或抗HCV劑。39.原始細(xì)胞，其包括具有受支撐的脂質(zhì)雙層的納米多孔二氧化硅核和SEQIDNO:KSEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQID.NO:4或SEQIDNO:5的MET結(jié)合肽。40.權(quán)利要求31的原始細(xì)胞，其中所述MET結(jié)合肽為SEQIDNO:1的肽。41.權(quán)利要求39或40的原始細(xì)胞，其中所述MET結(jié)合肽與所述脂質(zhì)雙層綴合。42.權(quán)利要求39-41任一項的原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞還包括至少一種選自以下的組分:促進原始細(xì)胞內(nèi)體逃逸的融合肽和包封的DNA;質(zhì)粒DNA;雙鏈線性DNA、藥物；顯像劑、小干擾RNA、小發(fā)夾RNA和微RNA，其中所述質(zhì)粒DNA、所述藥物、所述顯像劑和/或所述RNA進一步與核定位序列綴合。43.權(quán)利要求42的原始細(xì)胞，其中所述藥物包括至少一種抗癌劑。44.權(quán)利要求43的原始細(xì)胞，其中所述抗癌劑選自:依維莫司、曲貝替定、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、TLK286、AV-299、DN-10U帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調(diào)節(jié)劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己堿、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticiIimumab、易普利單抗、棉酹、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,BIO140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRlKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、5’-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib;PD0325901、AZD-6244,卡培他濱、L-谷氨酸、N-[4-[2_(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲?；鵠二鈉鹽七水合物、喜樹堿、PEG-標(biāo)記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x，其中X=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二?；桨芬涣u肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛(wèi)、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光輝霉素、長春堿、長春瑞濱、托泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內(nèi)皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、頂862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內(nèi)酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、H)184352、雷帕霉素、40-0-(2-羥基乙基)-雷帕霉素、替西羅莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的干擾素a-2a、干擾素a-2a、PEG化的干擾素a_2b、干擾素a_2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬酰胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、環(huán)孢菌素、柔紅霉素脂質(zhì)體、Edwina-門冬酰胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細(xì)胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀或它們的混合物。45.權(quán)利要求39-45任一項的原始細(xì)胞，其中所述藥物包括至少一種抗病毒劑。46.權(quán)利要求45的原始細(xì)胞，其中所述抗病毒劑為抗HIV劑、抗HBV劑、抗HCV劑或它們的混合物。47.權(quán)利要求39-46任一項的原始細(xì)胞，其中所述DNA能夠表達至少一種報告分子。48.權(quán)利要求39-47的原始細(xì)胞包含質(zhì)粒DNA，其中所述質(zhì)粒DNA任選經(jīng)修飾以表達核定位序列。49.權(quán)利要求48的原始細(xì)胞，其中所述DNA為超螺旋的或封裝的質(zhì)粒DNA。50.權(quán)利要求49的原始細(xì)胞，其中所述DNA為超螺旋的且封裝的質(zhì)粒DNA。51.權(quán)利要求48-51任一項的原始細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒DNA任選經(jīng)修飾以表達核定位序列。52.權(quán)利要求47-51任一項的原始細(xì)胞，其中所述DNA為組蛋白封裝的超螺旋質(zhì)粒DNA,其包括人組蛋白的混合物。53.權(quán)利要求52的原始細(xì)胞，其中所述組蛋白的混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4組成。54.權(quán)利要求53的原始細(xì)胞，其中所述組蛋白混合物為重量比為1:2:2:2:2的H1、H2A、H2B、H3和H4。55.權(quán)利要求48-54任一項的原始細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒DNA能夠表達多肽毒素、小發(fā)夾RNA(shRNA)或小干擾RNA(siRNA)。56.權(quán)利要求55的原始細(xì)胞，其中所述多肽毒素選自蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈。57.權(quán)利要求55的原始細(xì)胞，其中所述shRNA或所述siRNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。58.權(quán)利要求48-57任一項的原始細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒DNA能夠表達報告蛋白。59.權(quán)利要求58的原始細(xì)胞，其中所述報告蛋白為綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白。60.權(quán)利要求39-59任一項的原始細(xì)胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12的肽。61.權(quán)利要求60的原始細(xì)胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9的肽。62.藥物組合物，其包含有效引起治療作用的量的原始細(xì)胞群體和藥學(xué)上可接受的載體/添加劑或賦形劑。63.權(quán)利要求62的組合物，其還包含不被處理為原始細(xì)胞內(nèi)的負(fù)載物的藥物。64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述抗藥物為抗癌劑或抗病毒劑。65.權(quán)利要求64的組合物，其中所述抗病毒劑為抗HIV劑、抗HBV劑、抗HCV劑或它們的混合物。66.權(quán)利要求62-65任一項的組合物為胃腸外劑型。67.權(quán)利要求66的組合物，其中所述劑型為皮內(nèi)劑型、肌肉內(nèi)劑型、骨內(nèi)劑型、腹膜內(nèi)劑型、靜脈內(nèi)劑型、皮下劑型或鞘內(nèi)劑型。68.權(quán)利要求62-65任一項的組合物為局部或透皮劑型。69.SEQIDNO:1、SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQID.N0:4或SEQIDNO:5的MET結(jié)合肽。70.權(quán)利要求69的MET結(jié)合肽為SEQIDNO:1。71.藥物組合物，其包含權(quán)利要求69或70的MET結(jié)合肽。72.藥物組合物，其包含原始細(xì)胞群體，所述原始細(xì)胞群體包含靶向肽從而所述原始細(xì)胞與抗癌劑和抗HBV劑和抗HCV劑或它們的混合物的組合選擇性地結(jié)合肝細(xì)胞癌細(xì)胞。73.權(quán)利要求72的組合物，其中所述靶向肽選自SP94肽、MET結(jié)合肽或它們的混合物。74.權(quán)利要求72的組合物，其中所述抗癌劑為多吉美(索拉菲尼)、舒尼替尼、貝伐珠單抗、特羅凱(厄洛替尼)、泰克泊(拉帕替尼)或它們的混合物。75.權(quán)利要求72至74任一項的組合物，其中所述抗HBV劑為賀維力(阿德福韋二匹伏酯)、拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋、恩曲他濱、克來夫定、valtoricitabine、amdoxovir、帕拉德福韋、racivir、BAM205、硝唑尼特、UT231_B、Bay41-4109、EHT899、日達仙(胸腺肽α-l)或它們的混合物。76.權(quán)利要求72至75任一項的組合物，其中所述抗HCV劑為波普瑞韋、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100,NM283、VX-950(替拉瑞韋)、SCH50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS9190、GS9256、GS9451、GS5885、GS6620、GS9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GN1-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI201335,BI207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PS1-938、PS1-7977、PS1-7851、SCY-635、利巴韋林、PEG化干擾素、PHX1766,SP-30或它們的混合物。77.治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者給予有效量的包含權(quán)利要求1-61任一項的原始細(xì)胞群體的組合物，所述原始細(xì)胞適應(yīng)于遞送抗癌劑至所述患者的癌細(xì)胞。78.治療肝細(xì)胞癌的方法，其包括向所述患者給予有效量的權(quán)利要求72-76任一項的組合物。79.治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者給予有效量的權(quán)利要求1-61任一項的原始細(xì)胞群體，其中所述DNA質(zhì)粒為超螺旋的并且適應(yīng)于表達抗癌多肽和/或RNA，任選與有效量的被配制作為所述原始細(xì)胞內(nèi)的負(fù)載物的其它抗癌劑組合。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述抗癌多肽選自蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈。81.權(quán)利要求79或80的方法，其中所述RNA為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的shRNA或siRNA。82.權(quán)利要求79-81任一項的方法，其中所述siRNA選自s565、s7824或sl0234。83.權(quán)利要求81的方法，其中所述shRNA為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的細(xì)胞周期蛋白BI特異性ShRNA084.權(quán)利要求79-84任一項的方法，其中所述抗癌劑選自:依維莫司、曲貝替定、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258,GSK461364、AZD1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調(diào)節(jié)劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己堿、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利單抗、棉酚、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,BIO140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRlKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體、5’-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib、PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-谷氨酸、^[4-[2-(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1!1-吡咯并[2，3_d]嘧啶_5_基)乙基]苯甲?；鵠二鈉鹽七水合物、喜樹堿、PEG-標(biāo)記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺?；哙ぜ谆?_吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6，Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x,其中x=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二?；桨芬涣u肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛(wèi)、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧唳脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光輝霉素、長春堿、長春瑞濱、托泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內(nèi)皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內(nèi)酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40_0_(2-羥基乙基)-雷帕霉素、替西羅莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的干擾素a-2a、干擾素a-2a、PEG化的干擾素a-2b、干擾素a-2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬酰胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、環(huán)孢菌素、柔紅霉素脂質(zhì)體、Edwina-門冬酰胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細(xì)胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀和它們的混合物。85.權(quán)利要求74-84任一項的方法,其中所述原始細(xì)胞或所述原始細(xì)胞外的組合物還包含抗病毒劑。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述抗病毒劑為抗HBV劑或抗HCV劑。87.治療患者癌癥的方法，其包括向有需要的患者給予有效量的權(quán)利要求62-76任一項的組合物。88.權(quán)利要求87任一項的方法,其中所述癌癥為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌(結(jié)腸直腸癌)、食管癌、頭部癌癥、腎癌、肝癌(肝細(xì)胞癌)、肺癌、鼻咽癌、頸部癌癥、卵巢癌、睪丸癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、惡性黑色素瘤；骨髓增生性疾??；尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神經(jīng)上皮樣瘤、滑膜肉瘤；膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、松果體細(xì)胞腫瘤、腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經(jīng)纖維瘤和神經(jīng)鞘瘤、腸癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、混合型小細(xì)胞和非小細(xì)胞癌、胸膜間皮瘤、胸膜間皮瘤、睪丸癌、甲狀腺癌和星形細(xì)胞瘤。89.在有癌癥風(fēng)險的患者中診斷癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予包含權(quán)利要求1-61任一項的原始細(xì)胞群體的藥物組合物,所述原始細(xì)胞包含適應(yīng)于選擇性結(jié)合癌細(xì)胞并遞送所述原始細(xì)胞至所述細(xì)胞的靶向肽，其中所述原始細(xì)胞包含適應(yīng)于表達報告分子并任選地包含其它報告分子的質(zhì)粒DNA，如果存在癌細(xì)胞，所述原始細(xì)胞與癌細(xì)胞在所述患者中結(jié)合后釋放所述報告分子至所述癌細(xì)胞，并且所述報告分子將誘出可與標(biāo)準(zhǔn)相比的信號以測定所述患者是否患有癌癥，和如果患有癌癥，所述癌癥的程度和/或癌性腫瘤的大小。90.在患者中監(jiān)測癌癥治療的方法，所述方法包括向所述患者給予權(quán)利要求1-61任一項的原始細(xì)胞群體，所述原始細(xì)胞包含適應(yīng)于選擇性結(jié)合癌細(xì)胞并遞送所述原始細(xì)胞至所述細(xì)胞的靶向肽，其中所述原始細(xì)胞包含適應(yīng)于表達報告分子并任選地包含其它報告分子的質(zhì)粒DNA，所述原始細(xì)胞與癌細(xì)胞在所述患者中結(jié)合后將釋放所述報告分子至所述癌細(xì)胞中，并且所述報告分子將在治療開始時和治療過程中的不同間隔誘出可與標(biāo)準(zhǔn)相比的信號以測定所述患者是否對治療應(yīng)答，并且如果應(yīng)答，測定對治療的應(yīng)答程度。91.透皮原始細(xì)胞，其包含以下大量多孔納米顆粒，所述多孔納米顆粒:(a)裝載有一種或多種藥學(xué)活性劑和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，其中所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的角質(zhì)層通透性促進劑:單飽和ω-9脂肪酸、醇、二醇、溶劑、共溶劑、R8肽和膜軟化劑，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約50nm至約300nm。92.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述單飽和ω-9脂肪酸選自油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸、芥酸和神經(jīng)酸，最優(yōu)選油酸，和它們的混合物。93.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述醇選自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及它們的混合物，且所述溶劑和共溶劑選自PEG400和DMSO。94.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述二醇選自乙二醇和聚乙二醇和其混合物。95.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述膜軟化劑可選自膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鏈表面活性劑，以及它們的混合物。96.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述膜軟化劑為去氧膽酸鈉。97.權(quán)利要求92的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約50nm至約300nmo98.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約55nm至約270nmo99.權(quán)利要求92的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約60nm至約240nmo100.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約210nmo101.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約.190nmo102.權(quán)利要求92的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約.160nmo103.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約.130nmo104.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約IOOnm0105.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65mn至約.90nmo106.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑更優(yōu)選地為約65nm至約80nm。107.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約.75nm。108.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約66、.67、68、69、70、71、72、73、74或75nm。109.權(quán)利要求91的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約70nm。110.權(quán)利要求91-109的透皮原始細(xì)胞，其中(a)所述納米顆粒由一種或多種選自以下的組分組成:二氧化硅、可生物降解的聚合物、溶膠、金屬和金屬氧化物；和(b)所述原始細(xì)胞包含至少一種抗癌劑。111.權(quán)利要求91-109的透皮原始細(xì)胞，其中(a)所述納米顆粒由一種或多種選自以下的組分組成:二氧化硅、可生物降解的聚合物、溶膠、金屬和金屬氧化物；和(b)所述原始細(xì)胞包含至少一種選自以下的抗癌劑:依維莫司、曲貝替定、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、TLK.286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK_0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263,FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調(diào)節(jié)劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己堿、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利單抗、棉酹、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110.B10140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdI^KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體、5’-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib,PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲?；鵠二鈉鹽七水合物、喜樹堿、PEG-標(biāo)記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中X=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二?；桨芬涣u肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛(wèi)、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光輝霉素、長春堿、長春瑞濱、托泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內(nèi)皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、頂862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內(nèi)酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、托泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕霉素、40-0-(2-羥基乙基)-雷帕霉素、替西羅莫司、AP-23573、RADOOUABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的干擾素a_2a、干擾素a_2a、PEG化的干擾素a-2b、干擾素a-2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬酰胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、環(huán)孢菌素、柔紅霉素脂質(zhì)體、Edwina-門冬酰胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細(xì)胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀和其混合物。112.透皮原始細(xì)胞，其包含大量多孔納米顆粒，所述多孔納米顆粒為:(a)裝載有藥學(xué)有效量的伊馬替尼的多孔納米顆粒和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層的多孔納米顆粒，其中所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的角質(zhì)層通透性促進劑=PEG400、DMSO和乙醇，以及它們的混合物，且其中所述原始細(xì)胞的平均直徑為約65nm至約66、67、68、69、.70、71、72、73、74或75nm。113.權(quán)利要求112的透皮原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞的伊馬替尼的平均通量為約。0.20至約0.30μg/cm2hr。114.權(quán)利要求113的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層由選自以下的脂質(zhì)組成:1，2_二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、。1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；鵢sn_甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)U,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、。1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂?；鵠-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物。115.治療患有癌癥的受試者的方法,所述方法包括向所述受試者透皮給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求110-114的原始細(xì)胞。116.治療患有一種或多種選自慢性髓細(xì)胞性白血病、胃腸道間質(zhì)瘤和急性淋巴細(xì)胞性白血病嗜酸粒細(xì)胞增多癥(HES)的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者透皮給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求112-114的原始細(xì)胞。117.治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者透皮給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求111的原始細(xì)胞。118.透皮藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求91-109、112、113和114的原始細(xì)胞，和任選地藥學(xué)上可接受的賦形劑。119.透皮藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求110的原始細(xì)胞，和任選地藥學(xué)上可接受的賦形劑。120.透皮藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求111的原始細(xì)胞，和任選地藥學(xué)上可接受的賦形劑。121.原始細(xì)胞，其包含大量經(jīng)含胺的硅烷(AEPTMS)修飾的帶負(fù)電荷的、納米多孔、納米顆粒的二氧化硅核，并且所述二氧化硅核(a)裝載有siRNA或蓖麻毒素A鏈和(b)被脂質(zhì)雙層包封并支撐脂質(zhì)雙層，所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的脂質(zhì):。1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；鵢sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]_sn_甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:0NBDPC)、1-棕櫚酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂酰基}-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，其中所述脂質(zhì)雙層包含陽離子脂質(zhì)和一種或多種兩性離子磷脂。122.權(quán)利要求121的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)選自1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物。123.權(quán)利要求122的原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞具有至少一個以下特征:BET表面積大于約600m2/g、孔體積分?jǐn)?shù)為約60%至約70%、由具有平均直徑為約20nm至約30nm的孔組成的多模式孔形態(tài)學(xué)、通過具有平均直徑為5nm至約15nm的孔互相連接的表面可及的孔。124.權(quán)利要求121或122的原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞每101°納米顆粒二氧化硅核包封約IOnMsiRNA。125.原始細(xì)胞，其包含大量經(jīng)含胺硅烷(AEPTMS)修飾的帶負(fù)電荷的、納米多孔、納米顆粒的二氧化硅核，并且所述二氧化硅核(a)裝載有一種或多種靶向周期蛋白超家族成員的siRNA，所述周期蛋白超家族成員選自細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白E;且(b)其被由選自以下的脂質(zhì)組成的脂質(zhì)雙層包封并支撐由選自以下的脂質(zhì)組成的脂質(zhì)雙層:1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；鵢sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂?；鵠_sn_甘油-3-磷酸膽M(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚?；鵢2_{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。且其中(I)所述脂質(zhì)雙層裝載有SP94和內(nèi)體裂解肽，和(2)所述原始細(xì)胞選擇性地與肝細(xì)胞癌細(xì)胞結(jié)合。126.權(quán)利要求123的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層包含大約55:5:30:10質(zhì)量比的D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000。127.治療患有癌癥的受試者的方法，其包括向所述受試者給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求121-126的原始細(xì)胞。128.權(quán)利要求127的方法，其中所述受試者患有肝癌，并被給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求123-125的原始細(xì)胞。129.藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求121-126的原始細(xì)胞，和任選地藥學(xué)上可接受的賦形劑。130.原始細(xì)胞，其包含大量納米多孔的、納米顆粒二氧化硅核，所述二氧化硅核:(a)裝載有誘導(dǎo)Niv核殼體蛋白(NiV-N)mRNA序列特異性降解的siRNA，和(b)包封于脂質(zhì)雙層并支撐脂質(zhì)雙層，所述脂質(zhì)雙層包含一種或多種選自以下的脂質(zhì):1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；?sn-甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS),1,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP),1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化-(I，-rac-甘油)(DOPG)U,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)U,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂酰基]-sn-甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚?；?2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。131.權(quán)利要求130的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層包含1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇(PEG)、靶向肽、和R8，且所述中孔、納米顆粒二氧化硅核(I)各自平均直徑為約lOOnm，平均表面積大于.1，OOOmVg和平均直徑為約20nm至約25nm的表面可及的孔，并且(2)每101°顆粒裝載約IyMsiRNA或更多。132.權(quán)利要求131的原始細(xì)胞，其中所述靶向肽為與ephrinB2(EB2)結(jié)合的肽。133.權(quán)利要求132的原始細(xì)胞，其中所述靶向肽為TGAILHP(SEQIDNO:18)。134.權(quán)利要求133的原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞包含約0.01至約0.02重量的TGAILHP(SEQIDNO:18)、約10重量％的PEG-2000和約0.500重量％的R8。135.治療已經(jīng)被Nipah病毒(NiV)感染或具有被Nipah病毒(NiV)感染風(fēng)險的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求130-134的原始細(xì)胞。136.藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求130-134的原始細(xì)胞，和任選地藥學(xué)上可接受的賦形劑。137.原始細(xì)胞，其包含大量帶負(fù)電荷的、納米多孔、納米顆粒二氧化硅核，所述二氧化硅核:(a)經(jīng)選自以下的含胺硅烷修飾:(1)伯胺、仲胺、叔胺，其各自經(jīng)硅原子功能化；(2)單胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS);(4)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS);(5)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基硅烷；和(7)質(zhì)子化仲胺、質(zhì)子化叔烷基胺、質(zhì)子化脒、質(zhì)子化胍、質(zhì)子化吡啶、質(zhì)子化嘧啶、質(zhì)子化吡嗪、質(zhì)子化嘌呤、質(zhì)子化咪唑、質(zhì)子化吡咯、季烷基胺或其組合；(b)裝載有siRNA或蓖麻毒素A鏈；和(c)被包含選自以下的脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層包封并支撐包含選自以下的脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層:.1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(D0PC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；鵢sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂基]_sn_甘油-3-磷酸膽堿(18:1-12:ONBDPC)、1-棕櫚酰基-2-(12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂基}-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，且其中所述脂質(zhì)雙層包括陽離子質(zhì)子和一種或多種兩性離子磷脂。138.權(quán)利要求137的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)選自1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1DOTAP)、2_二油?；?sn-甘油-3-磷酸化_(1’-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物。139.權(quán)利要求138的原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞具有至少一個以下特征:BET表面積大于約600m2/g、孔體積分?jǐn)?shù)為約60%至約70%、由具有平均直徑為約20nm至約30nm的孔組成的多模式孔形態(tài)學(xué)、通過具有平均直徑為5nm至約15nm的孔互相連接的表面可及的孔。140.權(quán)利要求138或139的原始細(xì)胞，其中所述原始細(xì)胞每101°納米顆粒二氧化硅核包封約IOnMsiRNA。141.原始細(xì)胞，其包含大量帶負(fù)電荷的、納米多孔、納米顆粒二氧化硅核，所述二氧化硅核:(a)經(jīng)選自以下的含胺硅烷修飾:(I)伯胺、仲胺、叔胺，其各自經(jīng)硅原子功能化；(2)單胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS);(4)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS);(5)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基硅烷；和(7)質(zhì)子化仲胺、質(zhì)子化叔烷基胺、質(zhì)子化脒、質(zhì)子化胍、質(zhì)子化吡啶、質(zhì)子化嘧啶、質(zhì)子化吡嗪、質(zhì)子化嘌呤、質(zhì)子化咪唑、質(zhì)子化吡咯、季烷基胺或其組合；(b)裝載有一種或多種靶向周期蛋白超家族成員的siRNA，所述周期蛋白超家族成員選自細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白E;且(c)其被由選自以下的脂質(zhì)組成的脂質(zhì)雙層包封并支撐由選自以下的脂質(zhì)組成的脂質(zhì)雙層:1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸化-(I’-rac-甘油)(DOPG)、I，2-二油?；鵢sn_甘油_3_磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油?；?2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]月桂?；鵠_sn_甘油-3-磷酸膽M(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚?；鵢2_{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑_4_基)氨基]月桂?；鶀-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。且其中(I)所述脂質(zhì)雙層裝載有SP94和內(nèi)體裂解肽；和(2)所述原始細(xì)胞選擇性地與肝細(xì)胞癌細(xì)胞結(jié)合。142.權(quán)利要求141的原始細(xì)胞，其中所述脂質(zhì)雙層包含大約55:5:30:10質(zhì)量比的D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000。143.治療患有癌癥的受試者的方法，其包括向所述受試者給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求137-142的原始細(xì)胞。144.權(quán)利要求143的方法，其中所述受試者患有肝癌，并被給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求141或142的原始細(xì)胞。145.藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求137-142的原始細(xì)胞，和任選地藥學(xué)上可接受的賦形劑。【文檔編號】A61K31/7088GK104023711SQ201280061866【公開日】2014年9月3日申請日期:2012年10月12日優(yōu)先權(quán)日:2011年10月14日【發(fā)明者】C.E.阿什莉,C.J.布林克爾,E.C.卡恩斯,M.H.菲克拉扎德,L.A.費爾頓,O.內(nèi)格里特,D.P.帕迪利亞,B.S.威爾金森,D.C.威爾金森,C.L.威爾曼申請人:Stc.Unm公司,桑迪亞公司