C1-抑制劑在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)繼發(fā)性水腫中的應(yīng)用的制作方法【專利摘要】在最一般的方面中，本發(fā)明的主題是預(yù)防和/或治療繼發(fā)性水腫的方法。特別地，本發(fā)明涉及C1-抑制劑，其用于預(yù)防受試者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)繼發(fā)性水腫形成和/或減小其大小的方法，其中所述受試者具有或已經(jīng)具有至少一種選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷的疾病。優(yōu)選CNS的繼發(fā)性水腫是繼發(fā)性腦水腫。本發(fā)明的另一個主題是治療與血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加相關(guān)的疾病的方法。且第三個主題是血漿衍生的C1-抑制劑，其用于預(yù)防、減輕或治療腦缺血-再灌注損傷方法?！緦＠f明】Cl-抑制劑在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)繼發(fā)性水腫中的應(yīng)用[0001]在最一般的方面中，本發(fā)明的主題是預(yù)防和/或治療繼發(fā)性水腫。特別地，本發(fā)明涉及Cl-抑制劑，其用于預(yù)防受試者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)繼發(fā)性水腫形成和/或減小其大小的方法，其中所述受試者具有或已經(jīng)具有至少一種選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷的疾病。優(yōu)選CNS的繼發(fā)性水腫是繼發(fā)性腦水腫。本發(fā)明的另一個主題是治療與血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加相關(guān)的疾病。且第三個主題是血漿衍生的Cl-抑制劑，其用于預(yù)防、減輕或治療腦缺血-再灌注損傷方法。[0002]在本說明書中，引述了許多文獻(xiàn)。將這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容包括制造商的手冊完整地引入本文參考。[0003]腦缺血和隨后因再灌注導(dǎo)致的損傷(腦缺血-再灌注損傷)的病理學(xué)是復(fù)雜的且涉及眾多不同的分子和細(xì)胞途經(jīng)。其中持續(xù)性缺血的一個特征在于血腦屏障的結(jié)構(gòu)裂解，由此導(dǎo)致形成腦水腫。過度水腫還可能簡單地通過機械壓力損害健康腦區(qū)域，并且是中風(fēng)患者中神經(jīng)癥狀惡化的常見原因。迄今為止，缺乏基于抗擊急性缺血性發(fā)作的藥理學(xué)的令人信服的策略。[0004]將腦水腫定義為因腦實質(zhì)內(nèi)流體局限性或彌漫性異常蓄積導(dǎo)致的腦容量增加。一般而言，將腦水腫分成4種不同類型:血管源性水腫、細(xì)胞毒性水腫、腦積水水腫(或間質(zhì)水腫)和滲透性水腫(或墮積性水腫)。盡管存在不同形式的水腫的這種分類，但是在大部分臨床情況中，存在不同類型的水腫的組合，這取決于該病的時程。在腦血流受到干擾后的水腫形成和腦出血方面，細(xì)胞毒性和/或血管源性腦水腫似乎起主要作用。此外，考慮到腦水腫形成中涉及的介體，可以舉出許多介體(例如緩激肽)，它們具有許多不是對于腦水腫形成的作用的特性(Nag等人(2009)ActaNeuropathol.;118:197-217)。[0005]在腦水腫中，最初腦容量的改變由腦脊髓液和血容量的減少代償，由此原發(fā)性腦水腫主要是細(xì)胞毒性水腫。在大的半球損害中，進(jìn)行性膨脹超過了這些代償機制且顱內(nèi)壓增加(即繼發(fā)性或惡性腦水腫形成)導(dǎo)致腦組織疝形成，從而造成死亡。因此，血管源性惡性腦水腫持續(xù)是不同類型腦病理性情況例如大腦梗死、出血、外傷、感染和腫瘤后死亡率的主要原因。對腦水腫缺乏有效療法仍然是持續(xù)關(guān)注和研究的動力。[0006]在缺血性發(fā)作方面，繼發(fā)性腦水腫是缺血性發(fā)作過程中繼發(fā)性梗死生長和隨后神經(jīng)癥狀惡化的常見原因(Ayata和Ropper(2002)JClinNeurosc1.；9:113-124；Bardutzky和Schwab(2007)Stroke;38:3084-3094)。在缺血性發(fā)作中，惡性大腦中動脈(MCA)梗死是用于描述具有顯著性空間占有作用和腦組織疝形成的完全MCA區(qū)域梗死的術(shù)語。據(jù)估計惡性MCA梗死的發(fā)生率為全部中風(fēng)的I%以下。使用保守形式的醫(yī)療方法的死亡率約為80%，且昏迷狀態(tài)在發(fā)作的2-5天內(nèi)腦死亡中終止。死亡通常因缺血性腦組織進(jìn)行性膨脹、腦組織轉(zhuǎn)移、顱內(nèi)壓局灶性增加和缺血向鄰近血管區(qū)域擴展而發(fā)生。這種類型的中風(fēng)的幸存患者因生活質(zhì)量差而殘疾。迄今為止，沒有藥物證實可持續(xù)地減輕腦缺血癥中的腦水腫，且通常作為救生步驟的最終的治療方法是減壓的偏側(cè)顱骨切除術(shù)。此外，顯然不了解缺血性發(fā)作中的水腫形成和連續(xù)的神經(jīng)元變性的基礎(chǔ)分子機制。[0007]激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)通過凝血因子XII(FXII,Hageman因子)啟動且在調(diào)節(jié)血管通透性和水腫形成中起重要作用(Leeb-Lundberg等人(2005)Pharmacol.Rev.；571:27-77)。近來還在中風(fēng)患者中證實了KKS活化(Wagner等人(2002)J.Neurol.Sc1.；202:75-76)。激肽類(例如緩激肽、胰激肽)構(gòu)成了KKS的終產(chǎn)物。激肽類是高度活性促炎肽激素，其在不同類型的組織損傷(包括腦缺血)過程中由激肽釋放酶類從其前體激肽原類中釋放。激肽類的細(xì)胞效應(yīng)由兩種不同的緩激肽受體BlR和B2R介導(dǎo)?；罨@些受體觸發(fā)靶器官中的炎癥性過程，例如釋放促炎細(xì)胞因子或吸引免疫細(xì)胞以及血管通透性增加。[0008]近來，阻斷B1R、但不阻斷B2R減輕了小鼠局灶性腦缺血(Austinat等人(2009)Stroke；40:285-293)和外傷性腦損傷(Raslan等人(2010)J.Cereb.BloodFlowMetab.；30:1477-1486)實驗?zāi)Ｐ椭械难X屏障損害和水腫形成，表明KKS對缺血性發(fā)作和外傷性腦損傷的急性期中腦水腫形成的功能關(guān)聯(lián)性。[0009]在通過抑制FXII預(yù)防KKS活化的研究中，F(xiàn)XII在接觸帶負(fù)電荷的表面時以生理學(xué)方式被活化(表面激活)，研究了急性實驗性中風(fēng)后的神經(jīng)病理學(xué)結(jié)果(Hagedorn等人(2010)Circulat1n；121:1510-1517；Kleinschnitz等人(2006)JEM；203(3):513)。[0010]Cl-酯酶抑制劑(Cl-1NH)是478氨基酸的糖蛋白，其屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，稱作舍平類。其命名來源于最初描述為血液和組織中經(jīng)典補體途徑的唯一已知的生理學(xué)抑制劑。然而，Cl-1NH還是通過阻斷活化的FXII和血漿激肽釋放酶的KKS的主要調(diào)節(jié)劑。除幾種另外的功能(例如FXIa抑制)外，它是唯一已知的Cls和Clr即補體系統(tǒng)的第一種成分的活化的同源性絲氨酸蛋白酶的生理學(xué)抑制劑。[0011]以前的研究已經(jīng)證實Cl-1NH制劑在缺血性發(fā)作自身動物模型(DeSimoni等人(2004)Am.J.Pathol.;164:1857-1863;Gesuete等人(2009)Ann.Neurol.；66:332-342)以及外傷性腦損傷動物模型(Longhi等人(2009)Crit.CareMed.；37:659-665)和外傷性脊髓損傷動物模型(Tei等人(2008)Neurol.Res.；30:761-767)中的有益作用，但基礎(chǔ)分子機制在很大程度上是未知的。此外，這些研究集中于急性神經(jīng)病理學(xué)結(jié)果，而未公開對(繼發(fā)性)腦水腫的作用，即預(yù)防其形成和/或減小其大小。此外，deSimoni等人(2004;Am.J.Pathol.；164:1857-1863)公開了在再灌注開始給予時，血漿衍生的Cl-抑制劑(15U/小鼠)恰好在缺血/再灌注損傷鼠模型中有效，而在再灌注開始后30分鐘給予時效力完全。[0012]因此，顯而易見，對治療或預(yù)防腦內(nèi)血管阻塞后出現(xiàn)的繼發(fā)性腦水腫的藥物仍然存在需求。所以，本發(fā)明的一個目的在于滿足這種需求。[0013]因此，本發(fā)明中的技術(shù)問題在于提供成功地靶向繼發(fā)性腦水腫的可選和/或改進(jìn)的方式和方法，它構(gòu)成了研發(fā)用于治療和/或預(yù)防繼發(fā)性腦水腫的多種令人滿意的藥物的基礎(chǔ)或能夠研發(fā)這些藥物。[0014]通過提供以權(quán)利要求為特征的實施方案解決了這一技術(shù)問題。[0015]令人意外地，申請人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過給予Cl-抑制劑可以預(yù)防或減輕在最初損傷后發(fā)生的繼發(fā)性腦水腫。這種最初的損傷或原發(fā)性疾病可以是腦內(nèi)的血管阻塞，例如缺血性發(fā)作,或腦內(nèi)出血,例如出血性中風(fēng)。[0016]因此，一般地，本發(fā)明涉及Cl-抑制劑，其用于預(yù)防受試者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)繼發(fā)性水腫形成和/或減小其大小的方法，其中所述受試者具有或已經(jīng)具有至少一種選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷的疾病。特別地，所述出血性中風(fēng)是腦出血或蛛網(wǎng)膜下出血。[0017]在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)繼發(fā)性水腫是繼發(fā)性腦水腫或繼發(fā)性脊髓水腫。[0018]本發(fā)明的另一個方面是用于穩(wěn)定受試者血腦屏障或血脊髓屏障的Cl-抑制劑，其中所述受試者具有或已經(jīng)具有至少一種疾病，其選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷、脊髓損傷、糖尿病、多發(fā)性硬化、CNS細(xì)菌感染如腦膜炎、感染腦的病毒感染如HIV、和腦瘤、特別是轉(zhuǎn)移性腦瘤。[0019]因此，請求保護用于治療與受試者血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加相關(guān)的疾病的Cl-抑制劑，其中所述疾病選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷、脊髓損傷、糖尿病、多發(fā)性硬化、CNS細(xì)菌感染如腦膜炎、感染腦的病毒感染如HIV、和腦瘤、特別是轉(zhuǎn)移性腦瘤。[0020]此外，請求保護Cl-抑制劑，其用于預(yù)防或減輕與受試者血腦屏障或血脊髓屏障通透性的方法，其中這種通透性增加與疾病相關(guān)，所述疾病選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷、脊髓損傷、糖尿病、多發(fā)性硬化、CNS細(xì)菌感染、優(yōu)選腦膜炎、感染腦的病毒感染、優(yōu)選HIV、和腦瘤、優(yōu)選轉(zhuǎn)移性腦瘤。[0021]本發(fā)明的第三個方面是血漿衍生的Cl-抑制劑，其用于預(yù)防、減輕或治療受試者腦缺血-再灌注損傷的方法，其中在再灌注開始后30分鐘或以上給予所述抑制劑。[0022]在一些實施方案中，在使用血漿衍生的Cl-抑制劑治療腦缺血-再灌注損傷方面，所述腦缺血-再灌注損傷在選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)和圍產(chǎn)期中風(fēng)的疾病之后發(fā)生。[0023]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“Cl-抑制劑”、“Cl酯酶抑制劑”和“C1-1NH”是指作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)或其片段，發(fā)揮抑制與補體系統(tǒng)相關(guān)的蛋白酶、優(yōu)選蛋白酶Clr和Cls以及MASP-1和MASP-2、與激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)相關(guān)的蛋白酶、優(yōu)選血漿激肽釋放酶和因子Xlla、與凝固系統(tǒng)相關(guān)的蛋白酶、優(yōu)選因子XIa的作用。此外，Cl-1NH可以用作減少選擇蛋白-介導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的抗炎分子。本文所用的Cl-1NH可以是天然的絲氨酸蛋白酶抑制劑或其活性片段，或它可以包含重組肽、合成肽、肽模擬物或提供類似功能特性-例如抑制蛋白酶Clr和Cls和/或MASP-1和MASP-2和/或因子XIIa和/或因子XIa的肽片段。有關(guān)進(jìn)一步有關(guān)Cl-抑制劑的結(jié)構(gòu)和功能的公開內(nèi)容，參見美國專利US4,915，945;美國專利US5,939，389;美國專利US6,248，365;美國專利US7,053，176;和W02007/073186，將這些文獻(xiàn)完整地引入本文參考。[0024]因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述抑制劑是血漿衍生的或重組的Cl-抑制劑。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抑制劑與天然存在的人蛋白質(zhì)或其變體相同。Cl-1NH應(yīng)包含所有天然存在的等位基因，其具有與Cl-抑制劑相同的功能。在最優(yōu)選的實施方案中，所述抑制劑是人Cl酯酶抑制劑。[0025]在另一個優(yōu)選的實施方案中，修飾本發(fā)明的Cl-抑制劑以改善生物利用度和/或半衰期，改善效力和/或減少潛在的副作用。這種修飾可以通過重組或其他步驟進(jìn)行。這種修飾的實例可以是所述Cl-抑制劑的糖基化或白蛋白融合。有關(guān)蛋白質(zhì)糖基化和白蛋白融合的進(jìn)一步公開內(nèi)容，參見W001/79271，將該文獻(xiàn)完整地引入本文參考。[0026]在不同的實施方案中，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法生產(chǎn)Cl-抑制劑。例如，可以通過從幾個供體中采集血漿制備血漿衍生的C1-1NH。血漿供體應(yīng)是如本領(lǐng)域中所定義的健康的血漿供體。優(yōu)選地，采集若干個(1000或以上)健康供體的血漿并且任選地進(jìn)一步加工。制備用于治療目的的Cl-抑制劑的典型方法公開在美國專利US4，915，945中，將該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整地引入本文參考?；蛘?，在一些實施方案中，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)從天然組織來源中采集和濃縮C1-1NH。包含Cl-抑制劑的商購產(chǎn)品是，例如血漿衍生的Cinryze*(viroPharma)、重組RueQnpstRhucin?(均為Pharming)和血楽；衍生的Berinert?(cslBehring)。顯示Berinert?用于治療遺傳性血管水腫和先天性缺乏。重組Cl-1NH可以通過已知方法制備。[0027]術(shù)語“中樞神經(jīng)系統(tǒng)水腫”或“CNS水腫”是指水在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外隙過度蓄積。術(shù)語“腦部水腫”或“腦水腫”是指在腦細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外隙過度蓄積。甚至不了解CNS急性或原發(fā)性水腫、優(yōu)選原發(fā)性腦水腫形成的病理生理學(xué)且特別是短暫延遲的(即中風(fēng)發(fā)作后的數(shù)小時或數(shù)天)CNS惡性或繼發(fā)性水腫、優(yōu)選繼發(fā)性腦水腫發(fā)生及其涉及的(分子)病理機制，且其看起來相當(dāng)復(fù)雜。在腦血流受阻和腦出血后的水腫形成方面，血管源性和/或細(xì)胞毒性腦水腫看起來起主要作用。[0028]原發(fā)性CNS水腫、優(yōu)選原發(fā)性腦水腫是在最初損傷期間或損傷后短暫或即刻(即數(shù)分鐘內(nèi))發(fā)生的水腫。它主要是因受損腦細(xì)胞的異常吸水導(dǎo)致的細(xì)胞毒性水腫。[0029]相反，繼發(fā)性CNS水腫、優(yōu)選繼發(fā)性腦水腫隨后即在損傷后數(shù)小時乃至數(shù)天發(fā)生，且主要是血管源性水腫。例如，在外傷性腦損傷(TBI)中，惡性腦水腫是罕見的(〈10%)，但通常是致命性(~100%)并發(fā)癥。它根據(jù)為對醫(yī)療處置頑固性的損傷后數(shù)小時內(nèi)顱內(nèi)壓快速(ICP)增加診斷。[0030]因此，本文所用的術(shù)語“繼發(fā)性腦水腫”或“繼發(fā)性腦部水腫”或“惡性腦水腫”或“惡性腦部水腫”是指任何延遲的損傷后腦腫脹，即在最初損傷后數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)發(fā)生晚期腫脹。特別地，本發(fā)明的繼發(fā)性腦水腫基本上是血管源性水腫。在這類水腫中，由于血腦屏障破壞，所以通常排除血管內(nèi)蛋白質(zhì)和流體透入大腦實質(zhì)細(xì)胞外隙。一旦血漿成分通過血腦屏障，則水腫擴散且這可能是十分快速和廣泛的。[0031]本文所用的術(shù)語“繼發(fā)性脊髓水腫”是指脊髓的任何延遲的損傷后腫脹，即在最初損傷后數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)發(fā)生晚期腫脹。特別地，本發(fā)明的繼發(fā)性脊髓水腫基本上是血管源性水腫。在這類水腫中，通常排除血管內(nèi)蛋白質(zhì)和流體透入大腦實質(zhì)細(xì)胞外隙。一旦血漿成分通過血脊髓屏障，則水腫擴散且這可能是十分快速和廣泛的。[0032]優(yōu)選繼發(fā)性水腫在導(dǎo)致至少一種疾病的最初損傷后1-10天、更優(yōu)選2-5天發(fā)生，所述疾病涉及繼發(fā)性腦水腫。在一些實施方案中，繼發(fā)性水腫在最初損傷后2、3、4或5天或在它們之間的各任意時間發(fā)生。[0033]術(shù)語“預(yù)防繼發(fā)性水腫形成”是指Cl-抑制劑的使用方法，其中繼發(fā)性水腫形成完全或部分得以預(yù)防。完全預(yù)防繼發(fā)性水腫形成是指繼發(fā)性水腫完全不會發(fā)生，條件是在形成前預(yù)先給予Cl-抑制劑。部分預(yù)防繼發(fā)性水腫形成是指在方案中減小繼發(fā)性水腫的大小，其中在繼發(fā)性水腫已經(jīng)開始出現(xiàn)前給予Cl-抑制劑且隨后出現(xiàn)的水腫大小小于未治療患者的水腫大小。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，繼發(fā)性水腫的大小即繼發(fā)性水腫的體積與未治療繼發(fā)性水腫的大小相比被預(yù)防了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%,80%,90%(或它們之間的任意百分比)。[0034]本文所用的術(shù)語“減輕”包括減少個體或動物中繼發(fā)性水腫的可能性，降低任何癥狀的嚴(yán)重性和/或減少處于發(fā)生最初損傷后發(fā)生繼發(fā)性水腫風(fēng)險中的群體中患者的比例。因此，“減輕”是指減輕、降低、減少、限制、改善或改進(jìn)繼發(fā)性水腫病情。減小繼發(fā)性水腫的大小可以包括，例如防止繼發(fā)性水腫發(fā)生；降低繼發(fā)性水腫風(fēng)險、在其發(fā)展時或其一旦已發(fā)展降低繼發(fā)性水腫的嚴(yán)重性；限制繼發(fā)性水腫損害；減少繼發(fā)性水腫擴散，例如限制最初損傷后發(fā)生的水腫的體積；或改善與繼發(fā)性水腫相關(guān)的腦或脊髓中的病情。[0035]術(shù)語“減小繼發(fā)性水腫的大小”是指Cl-抑制劑的使用方法，其中繼發(fā)性水腫的大小減小，無論繼發(fā)性水腫是否是在給藥當(dāng)時開始。因此，減小繼發(fā)性水腫的大小是指:減小方案中繼發(fā)性水腫的體積，其中給予Cl-抑制劑以減小已經(jīng)存在的繼發(fā)性水腫的大小，所述繼發(fā)性水腫在給藥后發(fā)生；和減小方案中繼發(fā)性水腫的體積，其中給予Cl-1NH以減小已經(jīng)出現(xiàn)、但仍然生長的繼發(fā)性水腫的大小。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，減小繼發(fā)性水腫的大小是指繼發(fā)性水腫的大小與未治療的繼發(fā)性水腫即不存在治療的大小或體積相比減小了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(或它們之間任意的百分比)。[0036]因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，繼發(fā)性水腫的大小與未治療的繼發(fā)性水腫的體積相比減小了至少10%、優(yōu)選至少20%、更優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%。[0037]在本發(fā)明的一些實施方案中，所述治療受試者的繼發(fā)性水腫是預(yù)防性的和/或治療性的。本發(fā)明Cl抑制劑的應(yīng)用可以以預(yù)防和/或治療目的使用，以預(yù)防繼發(fā)性水腫形成和/或減小繼發(fā)性水腫大小。[0038]涉及繼發(fā)性水腫的疾病由最初的損傷誘發(fā)，本文所用的最初的損傷可以稱作術(shù)語“最初損傷”，即最初損傷導(dǎo)致至少一種與繼發(fā)性水腫相關(guān)的疾病。本發(fā)明的最初損傷的實例是腦缺血。優(yōu)選這種最初的損傷可以是血管阻塞，例如缺血性發(fā)作或出血，例如出血性中風(fēng)。更優(yōu)選所述最初的損傷是腦內(nèi)血管阻塞或腦內(nèi)出血。[0039]與繼發(fā)性水腫相關(guān)的至少一種疾病選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷?；蛘?，可以對具有如感染或腦瘤這樣的疾病的受試者給予C1-1NH。[0040]本發(fā)明中所用的術(shù)語“中風(fēng)”是本領(lǐng)域眾所周知的，且有時也稱作腦血管意外(CVA)或腦梗死。中風(fēng)在醫(yī)學(xué)上是對腦的供血下降而導(dǎo)致腦功能缺失而定義的醫(yī)學(xué)病癥，特別是歸因于缺血。所述供血下降可以因例如血栓形成或栓塞導(dǎo)致。此外，中風(fēng)可以因出血過程導(dǎo)致。因此，一般將中風(fēng)分成兩個主要類型，即i)缺血性發(fā)作和ii)出血性中風(fēng)。缺血歸因于血液循環(huán)中斷且出血歸因于血管破裂或異常血管結(jié)構(gòu)，兩種情況最終均導(dǎo)致腦組織損害。約87%的中風(fēng)因缺血導(dǎo)致，其余的由出血導(dǎo)致。一些出血發(fā)生在缺血區(qū)域內(nèi)部(〃出血轉(zhuǎn)化〃)。尚不了解有多少出血實際上作為缺血性發(fā)作開始。[0041]根據(jù)本發(fā)明，所述中風(fēng)由此優(yōu)選為缺血性發(fā)作或出血性中風(fēng)。[0042]在缺血性發(fā)作中，對部分腦的供血減少，導(dǎo)致該區(qū)域中的腦組織功能障礙和壞死。主要存在3個致病原因:血栓形成(由局部形成血塊阻塞血管)、栓塞(同前歸因于來自體內(nèi)另外區(qū)域的血塊/栓塞物)和全身性灌注不足(供血普遍減少,例如在休克中)。根據(jù)本發(fā)明，血栓形成可以優(yōu)選在動脈、靜脈、小動脈、小靜脈和毛細(xì)血管中發(fā)生，而栓塞可以優(yōu)選在動脈、小動脈和毛細(xì)血管中發(fā)生。[0043]出血性中風(fēng)即顱內(nèi)出血是血液蓄積在顱穹窿內(nèi)的任何區(qū)域。軸內(nèi)出血(腦內(nèi)部血液)與軸外出血(顱骨內(nèi)部、但腦外部的血液)之間存在差別。[0044]在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述出血性中風(fēng)是腦出血或蛛網(wǎng)膜下出血。[0045]腦出血或腦內(nèi)出血是發(fā)生在腦組織自身內(nèi)部的顱內(nèi)出血的亞型。腦出血可以因慢性高血壓或腦外傷導(dǎo)致，或它可以是藥物誘發(fā)的，例如因抗血小板治療(例如乙酰水楊酸)或抗凝治療(例如維生素K拮抗劑，如苯丙香豆素)誘發(fā)，或它可以在出血性中風(fēng)中自主發(fā)生。非創(chuàng)傷性腦內(nèi)出血是自發(fā)出血進(jìn)入腦組織。腦出血是軸內(nèi)出血；即它可以發(fā)生在腦組織內(nèi)而非其外部。存在兩種類型的軸內(nèi)出血:腦實質(zhì)出血和腦室內(nèi)出血(腦室系統(tǒng)內(nèi)的血液)。顱內(nèi)出血的另一種類型是軸外出血，例如硬膜上血腫、硬膜下血腫和蛛網(wǎng)膜下血腫，它們均出現(xiàn)在顱骨內(nèi)、但在腦組織外。[0046]蛛網(wǎng)膜下出血出血進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔-腦周圍蛛網(wǎng)膜與軟腦脊膜之間的區(qū)域。這種情況自發(fā)方式，通常歸因于破裂的腦動脈瘤或可能因頭部損傷導(dǎo)致。[0047]本發(fā)明中所用的圍產(chǎn)期中風(fēng)是導(dǎo)致胎兒或新生兒期間腦中損傷的腦血管局灶性病。圍產(chǎn)期是指從妊娠中期(胎兒生命)直至出生和生命的第一個月的時間期限。因此，圍產(chǎn)期中風(fēng)是指從妊娠28周開始直到出生后28天的任意階段嬰兒發(fā)生的中風(fēng)。在一些情況中，它導(dǎo)致兒童期癲癇。[0048]本發(fā)明的外傷性腦損傷(TBI)也稱作顱內(nèi)損傷在外力創(chuàng)傷性損傷腦時發(fā)生。TBI可以基于嚴(yán)重性、機制(閉合性頭部外傷或穿通性頭部外傷)或其他特征(例如發(fā)生在特別位置或廣泛區(qū)域內(nèi))分類，且可以導(dǎo)致眾多身體、認(rèn)知、社會、情感和行為效應(yīng)，且結(jié)果可以從完全恢復(fù)到永久性殘疾或死亡。將外傷性腦損傷定義為因外部機械力導(dǎo)致的腦損害，例如快速加速或減速、撞擊、沖擊波或拋射物穿透。大腦功能暫時或永久地受損，且結(jié)構(gòu)損害可能使用當(dāng)前技術(shù)檢測到，也可能不能檢測到。[0049]本文所用的術(shù)語“脊髓損傷”(SCI)是因創(chuàng)傷而不是疾病導(dǎo)致的對脊髓的任何損傷。根據(jù)脊髓和神經(jīng)根受損區(qū)域的不同，癥狀可以從疼痛到麻痹至失禁廣泛地改變。將脊髓損傷描述為不同水平的"不完全"，可以從對患者無影響到意味著總體功能缺失的"完全〃損傷。脊髓損傷存在許多原因，但典型地與由例如機動車輛事故、跌落、體育運動損傷和暴力導(dǎo)致的大創(chuàng)傷相關(guān)。[0050]糖尿病(diabetesmellitus)、通常稱作糖尿病(diabetes)是一組代謝性疾病，其中人具有高血糖，這歸因于身體無法產(chǎn)生足夠的胰島素或因為細(xì)胞對產(chǎn)生的胰島素?zé)o應(yīng)答。在血腦屏障方面的顯著改變發(fā)生，其影響屏障效應(yīng)和運輸功能。[0051]多發(fā)性硬化(MS，稱作彌漫性硬化或彌漫性腦脊髓炎)是炎性疾病，其中腦和脊髓軸突周圍的脂肪髓鞘受損，導(dǎo)致脫髓鞘和瘢痕形成以及廣譜征兆和癥狀。MS是CNS感染，其中淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤入CNS。[0052]腦膜炎是覆蓋腦和脊髓的保護膜(共同稱作腦脊膜)的炎癥。這種炎癥可能因感染病毒、細(xì)菌或其他微生物導(dǎo)致，但因一些藥物導(dǎo)致的較不常見。腦膜炎可能因炎癥接近腦和脊髓而威脅生命。[0053]人免疫缺陷病毒(HIV)是慢病毒屬(Ientivirus)(逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的一員)，其導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，即人體中免疫系統(tǒng)進(jìn)行性衰竭導(dǎo)致威脅生命的機會致病菌感染和癌癥繁殖的病癥。HI病毒在感染后迅速穿透血腦屏障。[0054]腦瘤是顱內(nèi)的實體瘤，即腦或中樞脊髓內(nèi)的腫瘤(定義為細(xì)胞異常生長)。[0055]在本發(fā)明的一些實施方案中，具有最初損傷的受試者是非先天性缺乏Cl-抑制劑的受試者，即對具有Cl酯酶抑制劑先天性缺乏的受試者不給予Cl-抑制劑。[0056]在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，Cl-抑制劑用于預(yù)防人體中繼發(fā)性水腫形成和/或減小其大小，即本發(fā)明優(yōu)選的受試者是人。而根據(jù)本發(fā)明，還可以對是動物的受試者給予Cl-抑制劑，優(yōu)選家畜，更優(yōu)狗、貓或馬。[0057]在一些實施方案中，制備用于治療CNS繼發(fā)性水腫或腦缺血-再灌注損傷和/或治療血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加的藥物組合物，其包含C1-1NH。包含Cl-1NH的藥物組合物的配制方法是本領(lǐng)域公知的。例如，如果提供粉末或凍干形式的C1-1NH(例如通過冷凍干燥)且期望水性藥物，則可以通過混合藥物制劑的水性成分溶解粉末并且使用適合的技術(shù)例如渦旋或適度攪拌進(jìn)行攪拌。在其他實施方案中，提供凍干形式的C1-1NH，并且使其與水性藥用成分(例如另外的活性成分或無活性成分，例如填充劑、穩(wěn)定劑、溶劑或載體)合并，然后給藥。[0058]在一些實施方案中，藥物組合物可以包含至少一種添加劑，例如填料、填充劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑或賦形劑。標(biāo)準(zhǔn)藥物制劑技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(例如，參見2005Physicians，DeskReference^,ThomsonHealthcare:Montvale,NJ,2004；Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，Gennado等人,Eds.Lippincottffilliams&ffilkins!Philadelphia,PA,2000)。適合的藥用添加劑包括，例如甘露糖醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。在一些實施方案中，藥物組合物還可以包含PH緩沖試劑和濕潤劑或乳化劑。在另外的實施方案中，組合物可以包含防腐劑或穩(wěn)定劑。[0059]藥物組合物的制劑可以根據(jù)預(yù)期的給藥途徑和其他參數(shù)的不同而改變(例如，參見Rowe等人，HandbookofPharmaceuticalExcipients,第4版，APhAPublicat1ns,2003)。在一些實施方案中，藥物組合物可以是凍干的餅狀物或粉末。例如，可以使用無菌注射用水(USP)重構(gòu)凍干的組合物以用于通過靜脈內(nèi)注射給藥。在其他實施方案中，組合物可以是無菌無熱原溶液。在另外的實施方案中，以粉末形式在丸劑或片劑中遞送組合物。[0060]所述藥物組合物可以包含Cl-1NH作為唯一活性化合物或可以以與至少另一種化合物、組合物或生物材料組合的方式遞送。這種化合物的實例包括維生素、抗生素或預(yù)期除去或抑制腦中血塊形成的化合物(例如組織型纖溶酶原激活物、乙酰水楊酸、氯吡格雷或雙嘧達(dá)莫)。[0061]還公開了用于治療CNS繼發(fā)性水腫和治療腦缺血-再灌注損傷或治療血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加的藥盒。在一些實施方案中，所述藥盒包含(a)Cl-1NH、(b)用于治療CNS繼發(fā)性水腫或腦缺血-再灌注損傷或用于治療治療血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加的使用說明書和任選的(C)至少另一種治療活性化合物或藥物。Cl-1NH成分可以是液體或固體形式(例如凍干后)。如果是液體形式，則Cl-1NH可以包含添加劑，例如穩(wěn)定劑和/或防腐劑，例如脯氨酸、甘氨酸或蔗糖或其他增強貯存期限的添加劑。[0062]在一些實施方案中，所述藥盒可以包含另外的化合物，例如治療活性化合物或藥物，將它們在Cl-1NH之前、與之同時或在其之后給予。這種化合物的實例包括維生素、抗生素、抗病毒藥等。在其他實施方案中，預(yù)期除去或抑制腦中血塊形成的化合物(例如組織型纖溶酶原激活物、乙酰水楊酸、氯吡格雷或雙嘧達(dá)莫)可以包括在所述藥盒中。[0063]在不同的實施方案中，藥盒的使用說明書包括使用藥盒成分治療CNS繼發(fā)性水腫或腦缺血-再灌注損傷或用于治療血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加的指導(dǎo)說明。該說明還可以包含有關(guān)如何制備(例如稀釋或重構(gòu)，在冷凍干燥的蛋白質(zhì)的情況下)Cl-抑制劑的信息。該說明還可以包括有關(guān)給藥劑量和頻率的指導(dǎo)原則。[0064]可以通過任意適合的給藥方式對個體遞送Cl-抑制劑制劑。不同的遞送系統(tǒng)是公知的且可以用于通過任意便利的途經(jīng)給予所述組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過全身給予Cl-抑制劑制劑。對于全身應(yīng)用，為了經(jīng)胃腸外或腸(例如口服、陰道或直腸)遞送，根據(jù)常規(guī)方法配制治療蛋白。胃腸外給藥可以包括、但不限于靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、硬膜下、通過鞘內(nèi)注射或通過直接注入腦、肺內(nèi)、透皮或鼻內(nèi)給藥。最優(yōu)選的給藥途徑是靜脈內(nèi)給藥。可以通過輸注或通過快速濃注連續(xù)給予所述制劑。一些制劑包括緩釋系統(tǒng)。[0065]在有關(guān)治療繼發(fā)性水腫的一些實施方案中，在最初損傷已經(jīng)開始后5、10、20、30、40或50分鐘或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72、96、120或240小時(或它們之間的任意時間時)給予C1-1NH。在一個優(yōu)選的實施方案中，給予在最初損傷后最遲10天、優(yōu)選最遲5天、更優(yōu)選最遲3天、更優(yōu)選最遲I天、更優(yōu)選最遲12小時、更優(yōu)選最遲6小時、更優(yōu)選最遲3小時、更優(yōu)選最遲I小時、更優(yōu)選最遲30分鐘和甚至更優(yōu)選在最初損傷后直接(或在它們之間的任意時間時)進(jìn)行。[0066]在人Cl酯酶抑制劑長的半衰期和/或預(yù)防性治療方面，優(yōu)選的給藥應(yīng)在最初損傷發(fā)生后盡可能快地進(jìn)行。[0067]在其他優(yōu)選的實施方案中，使用Cl-1NH治療可以從因最初損傷導(dǎo)致的阻塞后再灌注開始后即刻或至多10天開始。優(yōu)選地，這種治療在再灌注開始后盡可能快地進(jìn)行。在一些實施方案中，治療從最初損傷后再灌注開始后5、10、20、30、40或50分鐘或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72、96、120或240小時(或它們之間的任意時間時)進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實施方案中，給藥在最初損傷后再灌注開始后最遲10天、優(yōu)選最遲5天、更優(yōu)選最遲3天、更優(yōu)選最遲I天、更優(yōu)選最遲12小時、更優(yōu)選最遲6小時、更優(yōu)選最遲3小時、更優(yōu)選最遲I小時、更優(yōu)選最遲30分鐘和甚至更優(yōu)選在最初損傷后再灌注開始后直接進(jìn)行。[0068]在有關(guān)使用血漿衍生的Cl-抑制劑治療腦缺血-再灌注損傷的一些實施方案中，治療可以從再灌注開始后30分鐘一至多10天開始。在優(yōu)選的實施方案中，治療在再灌注開始后30、40或50分鐘或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72、96、120或240小時(或它們之間的任意時間時)進(jìn)行。在其他實施方案中，給藥從再灌注開始后不遲于10天、優(yōu)選不遲于5天、更優(yōu)選不遲于3天、更優(yōu)選不遲于I天、更優(yōu)選不遲于12小時、更優(yōu)選不遲于6小時、更優(yōu)選不遲于3小時、更優(yōu)選不遲于I小時、更優(yōu)選不遲于45分鐘和甚至更優(yōu)選不遲于30分鐘(或它們之間的任意時間時)進(jìn)行。優(yōu)選地，這種治療在再灌注開始后30分鐘一10天、更優(yōu)選在再灌注開始后30分鐘一5天、更優(yōu)選30分鐘一3天和更優(yōu)選30分鐘一I天(或它們之間的任意時間時)進(jìn)行。[0069]對患者給藥可以以單劑量或重復(fù)給藥和任意各種生理學(xué)可接受的鹽形式和/或使用可接受的藥用載體和/或添加劑作為藥物組合物的組成部分進(jìn)行。因此，在一些實施方案中，以如下劑量給予Cl-抑制劑:(i)單劑量作為注射或輸注；或(ii)以多劑量形式，優(yōu)選2劑量，它們各自為注射或輸注形式；或(iii)作為長期輸注或施用。長期輸注/施用在一定時間期限內(nèi)給予，優(yōu)選30分鐘-2周、更優(yōu)選30分鐘-1周、更優(yōu)選30分鐘-6天、更優(yōu)選30分鐘-5天、更優(yōu)選30分鐘-4天、更優(yōu)選30分鐘-3天、更優(yōu)選30分鐘-2天、更優(yōu)選30分鐘-1天、更優(yōu)選30分鐘-12小時、更優(yōu)選30分鐘-6小時(或它們之間的任意時間期限)的期限內(nèi)。[0070]在一個優(yōu)選的實施方案中，對患者給藥可以以雙倍劑量，即最初損傷后和在再灌注開始前I次和在最初損傷后再灌注開始后I次進(jìn)行。[0071]可以以治療有效量對患者給予包含Cl-1NH的組合物。一般而言，治療有效量可以因受試者年齡、一般情況和性別以及受試者中醫(yī)學(xué)病癥的嚴(yán)重性的不同而改變。該劑量可以由臨床醫(yī)師決定且如果必要，可以調(diào)整以適合于所觀察到的治療效果。在一些實施方案中，Cl-1NH的劑量可以約為lU/kg-5000U/kg體重。在不同的實施方案中，Cl-1NH的劑量為1、5、7.5、10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或4500U/kg體重(或它們之間的任意值)。Cl-1NH給藥的典型治療范圍還公開在美國專利US5，939，389中，將該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整地引入?yún)⒖?。?yōu)選以1-1000單位/kg體重、更優(yōu)選5-500單位/kg體重、更優(yōu)選10-200單位/kg體重的劑量且最優(yōu)選20-100單位/kg體重的劑量給予Cl-抑制劑。[0072]所給予的藥物組合物可以包含Cl-1NH作為唯一活性化合物或可以將其與至少另一種化合物、組合物或生物材料組合遞送。這種化合物的實例包括維生素、抗生素或預(yù)期除去或抑制腦中血塊形成的化合物(例如組織型纖溶酶原激活物、乙酰水楊酸、氯吡格雷或雙嘧達(dá)莫)。[0073]在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了預(yù)防受試者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)繼發(fā)性水腫形成和/或減小其大小的方法，其中所述受試者具有或已經(jīng)具有至少一種疾病，其選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷。優(yōu)選所述CNS繼發(fā)性水腫是繼發(fā)性腦水腫或繼發(fā)性脊髓水腫。[0074]附圖顯示:[0075]圖1:C1-1NH降低了小鼠急性缺血性發(fā)作后的死亡率并且改善了其功能性結(jié)果。(a)Cl-1NH-治療小鼠(分別為7.5U或15.0U)和對照組中直到tMCAO后第7天的死亡率(η=10/組);**ρ=0.0087,*p=0.0215,與對照組小鼠比較的時序檢驗(log-ranktest)。(b)tMCAO后第5天時的長期功能性結(jié)果(Bederson評分)(η=3-9/組)；**ρ〈0.01，克-瓦二氏檢驗(Kruskal-Wallistest),然后是Dunn多重比較檢驗。[0076]圖2=Cl-1NH顯示缺血性發(fā)作中顯著的血腦屏障穩(wěn)定和消水腫效應(yīng)。(a)上部圖:有代表性的相應(yīng)對照組小鼠(Ctrl)的冠狀腦切片和在血管示蹤劑伊文思藍(lán)注射后tMCAO后第I天(最初損傷后24h)時使用7.5UCl-1NH或15.0UCl-1NH在最初損傷后Ih治療的小鼠。在Cl-1NH治療后血管滲漏明顯減少。注意伊文思藍(lán)外滲物甚至在接受Cl-1NH的小鼠中還存在梗死的區(qū)域(基底神經(jīng)節(jié)，紅色箭頭)中甚至幾乎不存在。下部圖:通過tMCAO后24h治療和未治療小鼠的缺血性半球中的面積法確定的伊文思藍(lán)外滲物體積(n=7-10/組)；*ρ〈0.05，單因素方差分析(1-wayAN0VA),與未治療的對照組小鼠比較的Bonferroni事后檢驗(post-hoctest)o(b)根據(jù)對照組小鼠(Ctrl)和在tMCAO后第I天(最初損傷后24h)時使用7.5UCl-1NH或15.0UCl-1NH在最初損傷后Ih治療的小鼠的缺血性半球中腦含水量確定的水腫形成(η=5/組)；***ρ〈0.0001，單因素方差分析，與未治療的對照組小鼠比較的Bonferroni事后檢驗。(c)假擬操作的小鼠、對照組(Ctrl)和tMCAO后24h使用7.5UCl-1NH或15.0UCl-1NH在最初損傷后Ih治療的小鼠皮質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)中內(nèi)皮縮血管肽-1的相對基因表達(dá)(n=6-14/組)。注意15.0UCl-1NH防止了兩個腦區(qū)域中內(nèi)皮縮血管肽-1的誘導(dǎo)；*#ρ〈0.0001，.ρ〈0.0001,兩因素方差分析(2iayAN0VA),與假擬操作的小鼠比較的Bonfeironi事后檢驗(分別為皮質(zhì)(*)或基底神經(jīng)節(jié)O)。(d)對照組小鼠或分別接受?.5UCl-1NH或15.0UCl-1NH的小鼠(最初損傷后Ih治療)在tMCAO后第I天(最初損傷后24h)時缺血性發(fā)作基底神經(jīng)節(jié)中閉鎖蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析(η=4/組)，*ρ〈0.05,單因素方差分析，與未治療的小鼠比較的Bonferroni事后檢驗。[0077]圖3=Cl-1NH治療減少了大鼠中中風(fēng)時的腦水腫形成。使大鼠經(jīng)受90分鐘tMCAO并且在再灌注后即刻用20U/kgCl-1NH治療。在第I天時(最初損傷后24h)通過來自TTC-染色的腦切片進(jìn)行面積法計算腦水腫的程度(n=15/組)；***ρ〈0.0001，與媒介物治療的對照組比較的雙尾學(xué)生t_檢驗(two-tailedStudent‘st-test)。[0078]圖4=Cl-1NH治療減少了中風(fēng)后的腦內(nèi)血栓形成。(a)上部圖:纖維蛋白(原)在對照組小鼠(Ctrl)和使用7.5UCl-1NH或15.0UCl-1NH治療的小鼠的梗死⑴和對側(cè)(c)皮質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)中的蓄積，正如在tMCAO后24h通過免疫印跡確定的。顯示了每個組的2個有代表性的免疫印跡。下部圖:上述小鼠組和腦區(qū)域中血栓形成的光密度測定法定量(η=3-5/組);***ρ〈0.0001，##ρ〈0.01，兩因素方差分析，與對照組比較的Bonferroni事后檢驗(分別為皮質(zhì)(*)或基底神經(jīng)節(jié)O)。(b)上部圖:來自對照組小鼠(Ctrl)和在tMCAO后第I天時使用15.0UCl-1NH治療的小鼠的梗死基底神經(jīng)節(jié)的有代表性的H&E染色。血栓形成血管在對照組小鼠中豐富(箭頭)，而在接受15.0UCl-1NH(箭頭)的小鼠中微血管開放性顯著增加，這一結(jié)果通過計算血栓形成指數(shù)得以證實(η=5/組)(下部圖)；*ρ〈0.05，單因素方差分析，與對照組比較的Bonferroni事后檢驗?？潭葪l:100μπι。[0079]圖5:延遲的Cl-1NH治療減少了腦內(nèi)血栓形成。上部圖:纖維蛋白(原)在對照組小鼠(Ctrl)和中風(fēng)后6h使用7.5UCl-1NH或15.0UCl-1NH治療的小鼠的梗死皮質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)中的蓄積，正如在tMCAO后24h通過免疫印跡確定的。下部圖:上述小鼠組和腦區(qū)域中血栓形成的光密度測定法定量(η=4/組);*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，.ρ〈0.0001，兩因素方差分析，與對照組比較的Bonfeironi事后檢驗(分別為皮質(zhì)(*)或基底神經(jīng)節(jié)O)。[0080]圖6=Cl-1NH在施用于tMCAO后延遲環(huán)境中時仍然有效。(a)上述小鼠組中tMCAO后第I天(最初損傷后24h)時的神經(jīng)學(xué)Bederson評分(上部圖)和握力試驗評分(下部圖)(n=8-16/組)。最初損傷后6h接受15.0UCl-1NH的小鼠的行為明顯優(yōu)于對照組或接受較低劑量(7.5U)C1-1NH的小鼠；*p〈0.05，克-瓦二氏檢驗，然后是Dunn多重比較檢驗。[0081]實施例示例本發(fā)明，而絕不限制本發(fā)明。[0082]缺血模型.在本研究中包括C57B1/6小鼠和⑶大鼠，根據(jù)使用實驗動物的制度性指導(dǎo)原則進(jìn)行且方案得到政府當(dāng)局批準(zhǔn)(RegierungvonUnterfranken,ffiirzburg,Germany；RegierungsprasidiumGiessen,Germany)。通過短暫性大腦中動脈閉塞(tMCAO)、使用管腔內(nèi)絲線技術(shù)誘發(fā)局灶性腦缺血癥60分鐘(6-8周或20周齡C57B1/6小鼠)或90分鐘(7-9周齡CD大鼠)(Longa,E.Z.,Weinstein,P.R.,Carlson,S.,&Cummins,R.,Reversiblemiddlecerebralarteryocclus1nwithoutcraniectomyinrats.Strokel989；20(I):84-91；Kleinschnitz等人Stroke2011)?？刂苿游锏年P(guān)鍵生理參數(shù)，它們可能影響中風(fēng)后果(例如腦血流量)。全部中風(fēng)實驗均根據(jù)目前建立的ARRIVE指導(dǎo)原則進(jìn)行(http://www.nc3rs.cxtr/ARRIVE)。將動物由不參與數(shù)據(jù)采集和分析的獨立的人隨機分給操作人員。我們進(jìn)行手術(shù)并且評價全部讀出參數(shù)，而對實驗組是不了解的。詳細(xì)的研究設(shè)計(包括排除標(biāo)準(zhǔn))如下所示。[0083]小鼠腦缺血的誘導(dǎo).如所述的(Kleinschnitz等人，JExpMed2006；PloSΒ?Ο12010)，在6-8-周或20周齡小鼠中通過60分鐘短暫性大腦中動脈閉塞(tMCAO)誘發(fā)局灶性腦缺血癥。用在70%N20/30%O2混合物中2.5%的異氟烷(Abbott,Wiesbaden,Germany)麻醉小鼠。通過使用反饋控制加熱裝置在手術(shù)的自始至終將核心體溫維持在37°C。在頸部中線皮膚切開后，連接近端頸總動脈和頸外動脈并且插入標(biāo)準(zhǔn)化娃橡膠-涂敷的6.0尼龍單絲(6021；DoccolCorp.,Redlands,CA,USA)，且通過右頸內(nèi)動脈推進(jìn)以封閉右側(cè)MCA起點。管腔內(nèi)縫合線原位進(jìn)行60分鐘。然后重新麻醉動物并且抽出封閉用單絲以便能夠再灌注。[0084]小鼠中功能結(jié)果的評價.在第I天(最初損傷后24h)和在tMCAO后第5天時，根據(jù)Bederson對神經(jīng)性缺陷評分并且定量(BedersonJB,PittsLH,TsujiM,NishimuraMC,DavisRL,BartkowskiH.Ratmiddlecerebralarteryocclus1n!evaluat1nofthemodelanddevelopmentofaneurologicexaminat1n.Stroke.1986；173:472-476):0,無缺陷山前肢彎曲；2，如1+對側(cè)面擠壓的抗性減?。?，單向轉(zhuǎn)圈；4，縱向旋轉(zhuǎn)；5，不活動。對于握力試驗(MoranPM,HigginsLS,CordellB,MoserPC.Age-relatedlearningdeficitsintransgenicmiceexpressingthe751_aminoacidisoformofhumanbeta-amyloidprecursorprotein.ProcNatlAcadSciUSA.1995；9212:5341-5345),將小鼠置于兩個支持物之間的帶上中間位置并且如下分級:0，跌落；1，用I個或2個前爪緊握帶；2，如I且嘗試攀爬帶；3，用I個或2個前爪+1個或2個后爪緊握帶；4，用前爪和后爪握緊帶+尾部盤繞帶；5，逃逸(至支持物)。[0085]大鼠中腦缺血的誘導(dǎo).使用管腔內(nèi)絲線技術(shù)使7-9周齡大鼠經(jīng)受90分鐘tMCAO(Longa,E.Z.,Weinstein,P.R.,Carlson,S.,&Cummins,R.,Reversiblemiddlecerebralarteryocclus1nwithoutcraniectomyinrats.Strokel989;20(I):84-91)。具體而言，在異氟燒室內(nèi)用5%異氟燒(CPPharma,Burgdorf,Germany)在自主呼吸動物中誘發(fā)麻醉且隨后通過面罩維持2.5%異氟烷。在手術(shù)期間，將動物置于加熱裝置上以確保正常體溫(37°C)。在頸部中線皮膚切開后，分離左頸總動脈和頸外動脈并且連接。在動脈切開術(shù)后，將通過加熱使其尖端鈍端化的標(biāo)準(zhǔn)化硅橡膠-涂敷的4.0尼龍單絲(Ethilon;Johnson&Johnson,St-Stevens-ffoluwe,Belgium)插入頸內(nèi)動脈且向盧頁腦方向推進(jìn)至大腦中動脈起點，直到感覺到適度阻力為止。使封閉用絲線保持原位90分鐘。然后重新麻醉動物并且抽出封閉用單絲以便能夠再灌注。[0086]Cl-1NH治療.誘發(fā)tMCAO(最初損傷)后Ih或6h，小鼠接受單一靜脈內(nèi)注射血漿人C1_INH(Berninert*P,CSLBehringGmbH,Marburg,Germany),劑量為用150μI載體溶液(等滲鹽水)稀釋的7.5單位(U)或15.0U?；陬A(yù)先公開的工作，在腦缺血癥嚙齒動物中選擇相應(yīng)劑量，且15.0U相當(dāng)于得到小鼠中補體溶血活性90%—95%抑制所需的C1-1NH的量(LonghiL等人，CritCareMed2009；StoriniC等人，Neurob1lDis,2005)。在大鼠中，在誘發(fā)tMCAO(誘發(fā)再灌注后即刻)后90分鐘通過靜脈內(nèi)注射20U/kg體重劑量的C1-1NH。對照組小鼠和大鼠接受等體積的等滲鹽水(媒介物)。[0087]中風(fēng)研究設(shè)計.將媒介物治療的小鼠或大鼠或接受Cl-1NH的小鼠或大鼠由不參與數(shù)據(jù)采集和分析的獨立的人隨機分給操作人員。我們進(jìn)行手術(shù)并且評價全部讀出參數(shù)，而對實驗組是不了解的。下列條件從終點分析中排除動物(排除標(biāo)準(zhǔn)):[0088]1.MCAO后24h內(nèi)死亡[0089]2.蛛網(wǎng)膜下出血(SAH)(在腦采樣期間肉眼評價或通過MRI評價)[0090]3.Bederson評分=O(tMCAO后24h,僅小鼠)[0091]中途退出率均勻地分布于各組之間。[0092]血腦屏障滲漏和腦水腫的確定.為了確定血腦屏障滲漏，在誘發(fā)auftMCAO后Ih通過靜脈內(nèi)注射用0.9%NaCl稀釋的100μ12%伊文思藍(lán)示蹤劑(SigmaAldrich,Germany)(Austinat等人,Stroke2011)。24h后，通過賁門給Cl-1NH-治療的小鼠和對照組灌注4%低聚甲醛(PFA)，并且快速取出腦并且使用小鼠腦切片基質(zhì)(HarvardApparatus,Holliston,MA,USA)切成2mm厚度的冠狀切片。用伊文思藍(lán)染色對腦實質(zhì)進(jìn)行平面測量(ImageJsoftware,Nat1nalInstitutesofHealth,USA)以評估血腦屏障損害。[0093]為了評價繼發(fā)性腦水腫程度，在tMCAO后24h處死Cl-1NH-治療的小鼠或?qū)φ战M。取出腦，分離半球，稱重以評價濕重(WW)。此后，將半球在60°C干燥72h，并且測定干重(DW)。使用下列公式計算半球含水量):((Wff-DW)/ffff)xlOO(Austinat等人,Stroke2009)。[0094]在大鼠中，根據(jù)下列等式通過來自TTC-染色腦切片的面積法計算繼發(fā)性腦水腫的程度:[0095]腦水腫的面積(%)=[(AL+AI+AC)xlOO/(ACx2)]-100，[0096]而AL表示TTC-負(fù)值(缺血性)腦組織的總面積，Al表示同側(cè)(中風(fēng)的)半球的活組織總面積，AC表示對側(cè)(健康)半球的總面積。[0097]使用下列方案進(jìn)行計算大鼠中腦水腫所需的TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)染色:在tMCAO后24h處死大鼠。快速取出腦，并且使用保險刀片(VWRInternat1nalGmbH,Darmstadt,Germany)切成6個2-mm厚度的冠狀切片。在37°C用PBS中2%TTC(MerckEurolabGmbH,Darmstadt,Germany)將切片染色15分鐘以顯不梗死(BedersonJB,PittsLH,GermanoSM,NishimuraMC,DavisRL,BartkowskiHM.Evaluat1nof2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorideasastainfordetect1nandquantificat1nofexperimentalcerebralinfarct1ninrats.Stroke.1986；176:1304-1308)。[0098]組織學(xué)和免疫組織化學(xué).將冷凍-包埋的腦切成10-μm厚度切片并且用丙酮固定以便中性粒細(xì)胞染色，或固定在4%PFA的PBS溶液中以便染色小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和閉鎖蛋白。通過用在PBS中的牛血清白蛋白(BSA)預(yù)處理45分鐘封閉表位以防止非特異性結(jié)合。對于侵入的免疫細(xì)胞染色(Austinat等人，2009)，在4°C加入以1:1000稀釋的大鼠抗-小鼠Ly-6B.2異型抗原(中性粒細(xì)胞；MCA771GA,AbDSerotec,Germany)和在包含I%BSA的PBS中以1:100稀釋的大鼠抗-小鼠⑶IIb(小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞；MCA711，AbDSerotec,Germany)過夜。此后，將切片與用包含I%BSA的PBS以1:100稀釋的生物素標(biāo)記的抗大鼠IgG(BA_4001,VectorLaboratories,USA)一起在室溫溫育45分鐘。在用抗生物素蛋白/生物素封閉溶液(抗生物素蛋白/生物素封閉試劑盒，Sp-2001,VectorLaboratories,Inc.,California,USA)處理以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性后，通過鏈霉抗生物素、根據(jù)制造商的說明(VectorstainABCKit,PeroxidaseStandardPK-4000,VectorLaboratories,Inc.,California,USA)使二次抗體與生物素標(biāo)記的過氧化物酶(POD)連接。通過P0D、使用色原體3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(Kem-En-TecDiagnostics,Denmark)使抗原顯現(xiàn)。為了對免疫細(xì)胞定量，選擇在來自Cl-1NH-治療小鼠和對照組的基底神經(jīng)節(jié)(距離前囟點前0.5mm)水平上相同的腦切片(厚度10-μπι)并且從來自4只不同動物的5個隨后的切片中在Nikon顯微鏡Eclipse50i(Nikon,Germany)下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)(距離10μm)(Austinat等人,2009)。[0099]為了進(jìn)行針對閉鎖蛋白的免疫熒光染色，在包含1%BSA的PBS中按照1:100稀釋施用家兔抗-小鼠閉鎖蛋白抗體(ab31721，Abeam,UK)過夜(4°C)。用在1%BSA的PBS溶液中按照1:300稀釋的Cy3-標(biāo)記的山羊抗-家兔二次抗體檢測蛋白質(zhì)。為了染色DNA，以0.4mg/ml的濃度加入突光Hoechst染料(Hoechst33342,Sigma-Aldrich,Germany)30分鐘。在Ax1phot2(Zeiss,Germany)下分析切片。[0100]為了計算血栓形成指數(shù)，在tMCAO后24h將全腦切片。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行H&E染色。為了定量，在安裝CCD照相機(VisitronSystems)的顯微鏡(Ax1phot2,CarlZeissAG)下以盲式方式檢查染色。對于對照組小鼠或分別用7.5UCl-1NH或15.0UCl-1NH治療的小鼠，使用40-倍放大倍數(shù)在每一第10個切片中計數(shù)缺血性基底神經(jīng)節(jié)內(nèi)閉塞的血管數(shù)量。[0101]所有組織學(xué)實驗的陰性對照均不包括初級或二次抗體且不產(chǎn)生可檢測到的信號(未顯示)。[0102]PCR研究.如所述的(Austinat等人，Stroke2009),進(jìn)行組織勻化、RNA分離和實時RT-PCR。使用TRIzolreagent?(Invitrogen,Germany)，用MiccraD-8功率勻化器(ART，Germany)制備總RNA并且通過分光光度法定量。然后用TaqMail?逆轉(zhuǎn)錄試劑(AppliedB1systems,Germany)、根據(jù)制造商的說明、使用隨機六聚體逆轉(zhuǎn)錄Iyg總RNA。使用熒光TaqMan?技術(shù)對內(nèi)皮縮血管肽-1(測定ID:Mm00438656_ml，AppliedB1systems,Germany)的相對基因表達(dá)水平進(jìn)行定量。GAPDH(TaqMan?預(yù)先研發(fā)的用于基因表達(dá)的測定試劑，分配編號:4352339E，AppliedB1systems,Germany)用作內(nèi)源性對照以校正樣品RNA的量。使用等量的cDNA在StepOnePlus?實時PCR系統(tǒng)(AppliedB1systems,Germany)中、應(yīng)用TaqMan〃Universal2xPCRMasterMix(AppliedB1systems,Germany)進(jìn)行PCR。將反應(yīng)體系(總體積12.5μI)在50°C溫育2分鐘，在95°C溫育10分鐘，然后進(jìn)行在95°C15s和在60°CI分鐘的40個循環(huán)。包括水對照以確保特異性。每一樣品均一式三份測定，且通過分析擴增圖檢驗數(shù)據(jù)點的完整性。對比Ct方法用于如所述的基因表達(dá)定量(LivakKJ,SchmittgenTD.Analysisofrelativegeneexpress1ndatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method.Methods.2001;25:402-408)。[0103]蛋白質(zhì)印跡.從天然腦中剖離腦皮質(zhì)或基底神經(jīng)節(jié)并且在包含0.1%SDS和4%蛋白酶抑制劑(完全蛋白酶抑制劑混合物，Roche)的RIPA緩沖液(25mMTrispH7.4，150mMNaCl,1%NP-40)中勻化。將樣品聲處理(sonified)10秒。此后，將組織裂解物在4°C以15.0OOXg離心30分鐘，并且將上清液用于BCA蛋白質(zhì)測定和隨后的蛋白質(zhì)印跡分析。在95°C用4xSDS-PAGE加樣緩沖液(終濃度62.5mMTrispH6.8,3%β-巰基乙醇，8%SDS，15%甘油)將總裂解物處理5分鐘。使20μg總蛋白質(zhì)電泳移動并且轉(zhuǎn)至PVDF膜。用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉，50mMTris-HClρΗ7.5,0.05%Tween-20)封閉30分鐘后，將膜與以如下稀釋的初級抗體一起在4°C溫育過夜:抗-纖維蛋白原pAbl:500(AcrisAntibodies),抗-纖維蛋白原PAb1:1000(Abeam,UK),和抗-肌動蛋白mAbl:75.000(Dianova)。在用TBS-T(50mMTris-HClpH7.5,0.05%Tween-20)的洗滌步驟后，將膜與以1:5000稀釋的HRP-綴合的驢抗-家兔IgG(對于纖維蛋白原和纖維蛋白原)(Dianova,Germany)或驢抗-小鼠IgG(對于肌動蛋白)(Dianova,Germany)一起溫育Ih并且最終使用ECLplus(GEHealthcare)展開(Kraft等人，Thrombin-activatablefibrinolysisinhibitor(TAFI)deficientmicearesusceptibletointracerebralthrombosisandischemicstroke.PLoS0ne2010)。[0104]統(tǒng)計學(xué)[0105]將全部結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.d.)，除去描述為散布圖的順序功能結(jié)果等級(包括具有文本中括號內(nèi)給出的25%百分率和75%百分率的中位值)。通過事前檢定力分析(pr1ripoweranalysis)與如下假設(shè)計算檢測有關(guān)梗死體積>0.15的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)大小的實驗次數(shù):α=0.05，β=0.2，平均值，平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差10%。為了進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用GraphPadPrism5.0軟件包(LaJolla,CA,USA)。使用D'Agostino和Pearson綜合正態(tài)性檢驗測試數(shù)據(jù)的高斯分布，然后通過單因素方差分析或在測定兩種因素同時的兩因素方差分析的效應(yīng)的情況中使用P值的事后Bonfeironi調(diào)整進(jìn)行分析。通過克-瓦二氏檢驗與事后Dunn多重比較檢驗比較非參數(shù)功能結(jié)果評分。為了比較存活曲線，使用時序檢驗。通過不成對的雙尾學(xué)生t-檢驗(中風(fēng)大小、腦水腫)或非參數(shù)曼-懷二氏檢驗(功能評分)比較大鼠數(shù)據(jù)。將P-值〈0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。[0106]結(jié)果[0107]測定缺血性發(fā)作后較長時間期限內(nèi)Cl-1NH-治療小鼠和對照組的功能結(jié)果和死亡率(圖la，b)。在60分鐘tMCAO后7天，10只對照組小鼠中的9只(90%)已經(jīng)死亡，這與在先的報告一致(Kleinschnitz等人，PLoSB1l2010)。相反，用7.5UCl-1NH治療的10只小鼠中的7只(70%)和用較高劑量的15.0UCl-1NH治療的10只小鼠中的9只(90%)存活至第7天(分別為ρ〈0.05或ρ〈0.01)(圖la)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，接受15.0UCl-1NH的小鼠在梗死發(fā)展的晚期階段即在tMCAO后的第5天時的Bederson評分方面也明顯優(yōu)于對照組(Bederson評分:分別為中位值2.0[2.0,3.0][對照組]與0.0[0.0,1.0][15.0U]；ρ〈0.01)(圖lb)。[0108]C1-1NH通過使接觸-激肽系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白酶例如因子XIIa或血漿激肽釋放酶失活在調(diào)節(jié)血管通透性和抑制炎癥方面起重要作用(AlvinE.DavisIII,PedroMejia,FengxinLu,MolecularImmunology2008)。因此，解決了缺血性半球中的血腦屏障損害和水腫形成程度。在tMCAO后的第I天時，根據(jù)血管示蹤劑伊文思藍(lán)滲漏入腦實質(zhì)的體積所確定的血腦屏障完整性在中風(fēng)后Ih用15.0UCl-1NH治療的小鼠中得到保護且在注射7.5UCl-1NH后與使用首次用于實驗的對照組治療相比顯著性也較低(平均值51.6±30.6mm3[對照組]分別對比33.1±25.0mm3[7.5U]或13.9±11.4mm3[15.0U]；p〈0.05[對照組對比15.0U])(圖2a)。這一發(fā)現(xiàn)與治療Cl-1NH施用后繼發(fā)性腦水腫形成顯著減少相關(guān)(濕/干重法)(平均值4.3±1.1%[對照組]分別對比2.9±1.0%[7.5U]或0.2±0.9%[15.0U];ρ〈0.0001[對照組對比15.0U])(圖2b)，即也在大鼠中得到證實的結(jié)果(圖3)。重要的是，在腦區(qū)域中幾乎未發(fā)現(xiàn)血腦屏障破壞(基底神經(jīng)節(jié))，其中在Cl-1NH-治療的小鼠中也有規(guī)則地存在梗死(圖2a，箭頭)。這表明在Cl-1NH組觀察到的較小水腫是特定現(xiàn)象且機理相關(guān)，但并非簡單地歸因于這些動物中梗死體積較小。[0109]還分析了Cl-1NH-治療的小鼠和對照組的缺血性腦中的內(nèi)皮縮血管肽-1的表達(dá)。已經(jīng)證實內(nèi)皮縮血管肽-1關(guān)鍵地參與調(diào)節(jié)不同病理生理學(xué)條件下(包括缺血性發(fā)作)的血管完整性和水腫形成(MatsuoY,MiharaSi,NinomiyaM,FujimotoM.ProtectiveeffectofendothelintypeAreceptorantagonistonbrainedemaandinjuryaftertransientmiddlecerebralarteryocclus1ninrats.Stroke.2001；32:2143-2148；BaroneFC,GlobusMY,PriceWJ,WhiteRF,StorerBL,FeuersteinGZ,BustoR,OhlsteinEH.Endothelinlevelsincreaseinratfocalandglobalischemia.JCerebBloodFlowMetab.1994；14:337-342)。tMCAO后24h,在媒介物-治療的小鼠和接受7.5UCl-1NH的小鼠與假擬操作的小鼠相比的皮質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)中內(nèi)皮縮血管肽-1mRNA水平顯著升高(相對基因表達(dá)皮質(zhì):1.0±0.2[假擬]分別對比16.0±6.3[對照組]或15.6±6.8[7.5U],p<0.0001;相對基因表達(dá)基底神經(jīng)節(jié):1.0±0.2[假擬]分別對比4.3±1.2[對照組]或4.2±1.5[7.5U]，p〈0.0001)(圖2c)。相反，在用15.0UC1-1NH治療后的腦區(qū)域中未觀察到內(nèi)皮縮血管肽-1轉(zhuǎn)錄物的顯著性誘導(dǎo)(P>0.05)。此外，內(nèi)皮縮血管肽-1表達(dá)在高劑量(15.0U)Cl-1NH治療后的基底神經(jīng)節(jié)中也保持較低(圖2c)，不過，在所有動物中包括均勻地進(jìn)入梗死區(qū)域的基底神經(jīng)節(jié)。[0110]與Cl-1NH在中風(fēng)中的血腦屏障穩(wěn)定效應(yīng)一致，在來自用15.0UC1-1NH治療的小鼠的缺血性基底神經(jīng)節(jié)血管中針對緊密連接蛋白閉鎖蛋白的免疫反應(yīng)性得以保護，但是在對照組小鼠或接受7.5UCl-1NH的小鼠中得到減量調(diào)節(jié)，正如免疫組織化學(xué)所顯示的。為了更具體地對閉鎖蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定量，還進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析(圖2d)。此外，tMCAO后第I天時來自未治療小鼠的缺血性基底神經(jīng)節(jié)中的閉鎖蛋白的量較低(光密度:0.08±0.10)。相反，在用7.5UCl-1NH治療后可分別明顯地檢測到更多的閉鎖蛋白(光密度:0.6±0.3，ρ〈0.05)或15.0U(光密度:0.5±0.2，ρ〈0.05)。[0111]已經(jīng)通過結(jié)合細(xì)胞粘附分子證實了Cl-1NH抑制細(xì)胞從脈管系統(tǒng)遷移至炎癥部位(CaiS，DavisIII,AE,2004,JImmunol)。因此，已經(jīng)通過免疫細(xì)胞化學(xué)法對侵入缺血性腦的免疫細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了定量。在誘導(dǎo)tMCAO后24h，相比中風(fēng)后Ih用15.0UCl-1NH治療的小鼠，明顯多的中性粒細(xì)胞(平均值299.1±138.1[對照組]對比107.2±109.5[15.0υ]，ρ〈0.05)以及巨噬細(xì)胞/小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(平均值676.3±150.4[對照組]對比117.1±64.9[15.0U]，p〈0.0001)進(jìn)入未治療對照組小鼠的缺血性基底神經(jīng)節(jié)。相反，較低劑量的7，5UCl-1NH不能減少局灶性腦缺血后的細(xì)胞運輸(ρ>0.05)。[0112]Cl-1NH還對FXIIa發(fā)揮作用，其為血凝的內(nèi)源性途徑的主要激活物(AlvinE.DavisIII,PedroMejia,FengxinLu,MolecularImmunology2008)。因此，我們分析了Cl-1NH對腦缺血/再灌注損傷后血栓形成活性的影響。實際上，通過蛋白質(zhì)印跡檢測，在缺血性皮質(zhì)中纖維蛋白(原)的量(平均光密度2.8±1.I[對照組]分別對比1.7±0.8[7.5U]或0.03±0.02[15.0U];ρ〈0.0001[對照組對比15.0U])和基底神經(jīng)節(jié)中纖維蛋白(原)的量(平均光密度2.8±1.0[對照組]對比1.2±0.7[7.5U]或0.3±0.2[15.0U];p〈0.001[對照組對比15.0U])在中風(fēng)后第I天時在誘導(dǎo)tMCAO后Ih施用高劑量(15.0U)C1-1NH后顯著減少(圖4a)。因此，在Cl-1NH-治療的小鼠中微血管開放性比首次用于實驗的對照組增加(血栓形成指數(shù):15.8±3.0[對照組]分別對比12.2±2.8[7.5U]或9.8±2.4[15.0U];ρ〈0.05[對照組對比15.0U])(圖4b)。重要的是，當(dāng)在延遲環(huán)境即tMCAO后6h施用Cl-1NH時，在皮質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)中血栓形成活性仍然顯著減少(圖5)。[0113]在嘗試延長外源性施用的Cl-1NH的治療時間窗的過程中，C57B1/6小鼠還在延遲環(huán)境中即再灌注開始后5h(即誘導(dǎo)tMCAO后6h)接受7.5U或15.0UC1-1NH。最值得注意的是，在第I天時，在15.0UCl-1NH組中，神經(jīng)性功能障礙比7.5UCl-1NH組或?qū)φ战M動物仍然顯著減少(Bederson評分:中位值3.0[3.0,4.0][對照組]分別對比3.0[2.0,3.0][7.5U]或3.0[1.0，3.0][15.0U]，ρ〈0.05;握力試驗評分中位值3.0[1.0,4.0][對照組]分別對比4.0[3.0,4.0][7.5U]或4.0[3.0,5.0][15.0U]，ρ〈0.05)(圖6)?！緳?quán)利要求】1.Cl-抑制劑，其用于預(yù)防受試者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)繼發(fā)性水腫形成和/或減小其大小的方法，其中所述受試者具有或已經(jīng)具有至少一種選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷的疾病。2.權(quán)利要求1的抑制劑，其中所述CNS的繼發(fā)性水腫是繼發(fā)性腦水腫或繼發(fā)性脊髓水腫。3.權(quán)利要求1或2的抑制劑，其中所述繼發(fā)性水腫基本上是血管源性水腫。4.權(quán)利要求1-3任一項的抑制劑，其中所述繼發(fā)性水腫在導(dǎo)致權(quán)利要求1的至少一種疾病的最初損傷后1-10天、優(yōu)選2-5天發(fā)生。5.權(quán)利要求4的抑制劑，其中所述最初損傷是血管阻塞或腦內(nèi)出血。6.權(quán)利要求5的抑制劑，其中所述受試者是人。7.權(quán)利要求1-6任一項的抑制劑，其中所述抑制劑是血漿衍生的或重組的Cl-抑制劑。8.權(quán)利要求1-7任一項的抑制劑，其中所述抑制劑與天然存在的人蛋白質(zhì)或其變體相同。9.權(quán)利要求1-8任一項的抑制劑，其中所述抑制劑是人Cl酯酶抑制劑。10.權(quán)利要求1-9任一項的抑制劑，其中所述繼發(fā)性水腫的大小比未治療的繼發(fā)性腦水腫減小了至少10%，優(yōu)選至少20%，更優(yōu)選至少30%。11.權(quán)利要求ι-?ο任一項的抑制劑，其中通過靜脈內(nèi)或皮下給予所述抑制劑。12.權(quán)利要求1-11任一項的抑制劑，其中給予1-1000單位/kg體重、優(yōu)選5-500單位/kg體重的劑量的所述抑制劑。13.權(quán)利要求1-12任一項的抑制劑，其中以如下劑量給予所述抑制劑:(i)作為注射或輸注的單劑量；或(ii)以多劑量形式，優(yōu)選2次劑量，它們各自為注射或輸注的形式；或(iii)作為長期輸注或施用。14.權(quán)利要求1-13任一項的抑制劑，其中在最初損傷后最遲10天、優(yōu)選最遲5天、更優(yōu)選在最初損傷后最遲3天給予所述抑制劑。15.權(quán)利要求1-14任一項的抑制劑，其中在最初損傷后再灌注開始后最遲10天、優(yōu)選最遲5天、更優(yōu)選在最初損傷后再灌注開始后最遲3天給予所述抑制劑。16.權(quán)利要求1-15任一項的抑制劑，其中給予2次、在最初損傷后和再灌注開始前給予I次并且在最初損傷后再灌注開始后第二次給予所述抑制劑。17.Cl-抑制劑，其用于治療與受試者血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加相關(guān)的疾病，其中與血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加相關(guān)的疾病選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷、脊髓損傷、糖尿病、多發(fā)性硬化、CNS細(xì)菌感染、優(yōu)選腦膜炎、感染腦的病毒感染、優(yōu)選HIV、和腦瘤、優(yōu)選轉(zhuǎn)移性腦瘤。18.Cl-抑制劑，其用于預(yù)防或減輕與受試者血腦屏障或血脊髓屏障通透性增加相關(guān)的疾病的方法，其中這種通透性增加與選自以下的疾病相關(guān):中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)、圍產(chǎn)期中風(fēng)、外傷性腦損傷、脊髓損傷、糖尿病、多發(fā)性硬化、CNS細(xì)菌感染、優(yōu)選腦膜炎、感染腦的病毒感染、優(yōu)選HIV、和腦瘤、優(yōu)選轉(zhuǎn)移性腦瘤。19.血漿衍生的Cl-抑制劑，其用于預(yù)防、減輕或治療受試者腦缺血-再灌注損傷的方法，其中在再灌注開始后30分鐘或以上給予所述抑制劑。20.權(quán)利要求19的抑制劑，其中所述抑制劑是人Cl酯酶抑制劑。21.權(quán)利要求19或20的抑制劑，其中通過靜脈內(nèi)或皮下給予所述抑制劑。22.權(quán)利要求19-21任一項的抑制劑，其中給予1-1000單位/kg體重、優(yōu)選5-500單位/kg體重的劑量的所述抑制劑。23.權(quán)利要求19-22任一項的抑制劑，其中在再灌注開始后30分鐘-10天、優(yōu)選30分鐘-5天給予所述抑制劑。24.權(quán)利要求19-23任一項的抑制劑，其中所述腦缺血-再灌注損傷在選自中風(fēng)、缺血性發(fā)作、出血性中風(fēng)和圍產(chǎn)期中風(fēng)的疾病后發(fā)生?！疚臋n編號】A61P7/10GK104080474SQ201280063159【公開日】2014年10月1日申請日期:2012年12月21日優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日【發(fā)明者】C·克萊因施尼茨,M·諾爾特,G·施托爾,G·迪克奈特,S·舒爾特,B·尼斯萬特,I·普拉格斯特申請人:德國杰特貝林生物制品有限公司