N末端修飾的胰島素衍生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含額外的一個或多個二硫鍵的新型N末端修飾的胰島素衍生物、包含其的藥物組合物及其制備方法。
【專利說明】N末端修飾的胰島素衍生物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及包含一個或多個額外的二硫鍵的新型N末端修飾的胰島素及其制備 方法。
[0002] 發(fā)明背景 糖尿病是代謝病，在這種病中，利用葡萄糖的能力部分或完全喪失。該病癥可以例如通 過施用胰島素來治療。
[0003] 到目前為止，口服途徑是最廣泛使用的藥物施用途徑。然而，由于一些障礙如在胃 腸（GI)道和腸粘膜中的酶促降解、藥物流出泵、從腸粘膜吸收不足和變化、以及在肝中的 首過代謝，胰島素的施用常常局限于腸胃外途徑，而不是優(yōu)選的口服施用。
[0004] 人胰島素由兩個多肽鏈組成，即A和B鏈，其分別包含21個和30個氨基酸殘基。 A和B鏈通過兩個二硫鍵相互連接。多種蛋白酶的作用使人胰島素在胃腸道的內(nèi)腔中迅速 降解，限制了其吸收進(jìn)入循環(huán)。當(dāng)與天然胰島素相比，親水的并且對蛋白水解性降解穩(wěn)定的 胰島素類似物在動物模型中表現(xiàn)出更高的生物利用度。
[0005] 將二硫鍵引入蛋白是改善蛋白穩(wěn)定性一種天然方式。也有許多成功地將二硫鍵工 程改造進(jìn)蛋白并伴隨穩(wěn)定性增加的實例。至今，沒有胰島素中工程改造的二硫鍵的報道。
[0006]WO2008/145721涉及某些肽，所述肽已經(jīng)被N末端修飾以保護(hù)所述肽免于氨肽酶 和二肽基肽酶的降解。WO2010/033220描述了與聚合物和任選一個或多個具有最高達(dá)10 個碳原子的部分偶聯(lián)的肽綴合物。
[0007] 治療性肽的藥物組合物需要具有數(shù)年的保存限期以適合于常規(guī)使用。然而，由于 對化學(xué)和物理降解的敏感性，肽組合物本質(zhì)上是不穩(wěn)定的。
[0008]WO08/145728、WO2010/060667 和WO2011/086093 公開了用于口服施用的脂質(zhì) 藥物組合物的實例。
[0009] 藥物組合物經(jīng)常含有濃度最高達(dá)200ppm的醛和酮。醛和酮可以與胰島素反應(yīng)， 因此引起組合物中胰島素的大量的化學(xué)降解。作為結(jié)果，胰島素組合物的保存限期可能低 于3個月。藥物開發(fā)需要至少2年的保存限期。
[0010] 已知，出于穩(wěn)定性目的，含水藥物組合物可以包含化合物諸如乙二胺。例如，WO 2006/125763描述了包含乙二胺作為緩沖劑的含水藥物多肽組合物。
[0011] 然而，仍然尋求在不將乙二胺或其它穩(wěn)定化合物加入組合物的情況下使藥物組合 物、特別是無水脂質(zhì)組合物中的胰島素穩(wěn)定的方法。
[0012] 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及由肽部分、N末端修飾基團(tuán)和白蛋白結(jié)合部分組成的N末端修飾的胰島素， 其中所述肽部分具有不存在于人胰島素中的至少一個二硫鍵。
[0013] 在一個方面，本發(fā)明涉及由肽部分、N末端修飾基團(tuán)和白蛋白結(jié)合部分組成的N末 端修飾的胰島素，其中所述肽部分具有兩個或更多個半胱氨酸取代，且保留了人胰島素的 三個二硫鍵。
[0014] 在一個方面，本發(fā)明涉及包含兩個或更多個半胱氨酸取代的N末端修飾的胰島 素，其中保留了人胰島素的三個二硫鍵，其中以這樣的方式選擇半胱氨酸取代的位點，所述 方式使得引入的半胱氨酸殘基位于折疊的N末端修飾的胰島素的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存 在于人胰島素中的一個或多個額外的二硫鍵的形成，并且其中所述N末端修飾的胰島素具 有具有相同肽部分、相同N末端修飾基團(tuán)和相同白蛋白結(jié)合部分、但不具有不存在于人胰 島素中的任何二硫鍵的胰島素肽的胰島素受體親和力的至少5%。在一個方面，N末端修飾 的胰島素具有具有相同肽部分、存在于人胰島素中的二硫鍵和相同白蛋白結(jié)合部分、但不 具有N末端修飾基團(tuán)的胰島素肽的胰島素受體親和力的至少5%。
[0015] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素包含修飾基團(tuán)，所述修飾基團(tuán)為一個 或兩個有機(jī)取代基，其各自具有低于200g/mol的分子量（MW)，且其綴合于親本胰島素 (parentinsulin)的N末端。
[0016] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的N末端修飾的胰島素的藥物組合物。
[0017] 發(fā)明描述 本發(fā)明涉及新型N末端修飾的胰島素，在本文中也命名為N末端保護(hù)的胰島素，其中將 一個或多個二硫鍵工程改造進(jìn)胰島素。本發(fā)明的新型N末端修飾的胰島素特別適合用于在 口服制劑中使用。因此，本發(fā)明的一方面也考慮了包含新型N末端修飾的胰島素（其中將 一個或多個二硫鍵工程改造進(jìn)胰島素）的口服藥物組合物。
[0018] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素由肽部分、N末端修飾基團(tuán)和白蛋白結(jié) 合部分組成。
[0019] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有兩個或更多個半胱氨酸取代，并 且保留了人胰島素的三個二硫鍵。
[0020] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有側(cè)鏈。在一個方面，側(cè)鏈連接于賴 氨酸殘基的ε氨基。在一個方面，側(cè)鏈連接于B-鏈中賴氨酸殘基的ε氨基。
[0021] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有兩個或更多個半胱氨酸取代，保 留的人胰島素的三個二硫鍵以及連接于諸如B-鏈中的賴氨酸殘基的ε氨基的側(cè)鏈。
[0022] 在本發(fā)明的一個方面，以這樣的方式選擇半胱氨酸取代的位點，所述方式使得引 入的半胱氨酸殘基位于折疊的N末端修飾的胰島素的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于人胰島 素中的一個或多個額外的二硫鍵的形成。
[0023]本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素在包含醛和/或酮 諸如微量醛和/或酮的藥物組合物中是穩(wěn)定的，同時當(dāng)與親本胰島素即沒有N末端修飾的 類似胰島素相比時，所述胰島素保留生物和藥理性質(zhì)。
[0024] 本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素是物理穩(wěn)定的并且 不易于產(chǎn)生原纖化，同時當(dāng)與親本胰島素即沒有N末端修飾的類似胰島素相比時，所述胰 島素保留生物和藥理性質(zhì)。
[0025] 在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素用于含水制劑中，以用于皮 下注射胰島素治療。
[0026] 在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素可用作超長效胰島素，其或 者在含水制劑中以注射治療或以口服治療。
[0027] 在一個方面，除了賦予對醛和/或酮的化學(xué)穩(wěn)定性之外，本發(fā)明的N末端修飾的胰 島素的N末端修飾可以改變胰島素受體親和力。例如，如下文所述，在生理pH下使N末端 中性或帶負(fù)電荷的N末端修飾可以為胰島素受體賦予更低親和力。
[0028] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及提供本發(fā)明的N末端修飾的胰島素，諸如本發(fā)明的?；?的N末端修飾的胰島素，當(dāng)口服施用時，其具有令人滿意的生物利用度。與以相似劑量給 予的沒有N末端修飾的相似胰島素（親本胰島素）的生物利用度相比，本發(fā)明的優(yōu)選的N 末端修飾的胰島素的生物利用度是相似的。在一個方面，生物利用度比以相似劑量給予的 具有額外的一個或多個二硫鍵但沒有N末端修飾的相似酰化胰島素的生物利用度高至少 10%，在一個方面生物利用度高至少20%，在一個方面生物利用度高至少25%，在一個方 面生物利用度高至少30%，在一個方面生物利用度高至少35%，在一個方面生物利用度高 至少40 %，在一個方面生物利用度高至少45 %，在一個方面生物利用度高至少50 %，在一 個方面生物利用度高至少55%，在一個方面生物利用度高至少60%，在一個方面生物利用 度高至少65%，在一個方面生物利用度高至少70%，在一個方面生物利用度高至少80%， 在一個方面生物利用度高至少90%，在一個方面生物利用度高至少100%，在一個方面生 物利用度比親本胰島素的高多于100%。
[0029] 當(dāng)本文中使用時，術(shù)語"親本胰島素"應(yīng)當(dāng)是指沒有N末端修飾的類似胰島素。例 如，如果N末端修飾的胰島素是?；腘末端修飾的胰島素，那么親本胰島素是具有相同肽 部分和相同白蛋白結(jié)合部分、但沒有N末端修飾的酰化胰島素，或者例如，如果N末端修飾 的胰島素是酰化的蛋白酶穩(wěn)定的N末端修飾的胰島素，那么親本胰島素是具有相同肽部分 和相同白蛋白結(jié)合部分、但沒有N末端修飾的?；牡鞍酌阜€(wěn)定的胰島素。
[0030] 在一個方面，生物利用度比以相似劑量給予的沒有不存在于人胰島素中的任何二 硫鍵的相似?；襈末端修飾的胰島素的生物利用度高至少10%，在一個方面生物利用度 高至少20%，在一個方面生物利用度高至少25%，在一個方面生物利用度高至少30%，在一個 方面生物利用度高至少35%，在一個方面生物利用度高至少40%，在一個方面生物利用度高 至少45%，在一個方面生物利用度高至少50%，在一個方面生物利用度高至少55%，在一個方 面生物利用度高至少60%，在一個方面生物利用度高至少65%，在一個方面生物利用度高至 少70%，在一個方面生物利用度高至少80%，在一個方面生物利用度高至少90%，在一個方面 生物利用度高至少100%，在一個方面，生物利用度比沒有不存在于人胰島素中的任何二硫 鍵的相似?；襈末端修飾的胰島素的生物利用度高多于100%。
[0031] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及提供本發(fā)明的N末端修飾的胰島素，當(dāng)口服施用時，其 相對于作為靜脈內(nèi)ακ)施用而施用時具有令人滿意的生物利用度。相對于當(dāng)N末端修飾 的胰島素為靜脈內(nèi)施用時的生物利用度，本發(fā)明的優(yōu)選化合物的生物利用度（相對于靜脈 內(nèi)施用）是至少〇. 3%，在一個方面是至少0. 5%，在一個方面是至少1%，在一個方面是至 少1. 5%，在一個方面是至少2%，在一個方面是至少2. 5%，在一個方面是至少3%，在一個 方面是至少3. 5%，在一個方面是至少4%，在一個方面是至少5%，在一個方面是至少6%， 在一個方面是至少7%，在一個方面是至少8%，在一個方面是至少9%，在一個方面是至少 10%。
[0032] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及提供本發(fā)明的N末端修飾的胰島素，當(dāng)口服施用時，其 相對于當(dāng)作為s.c.(皮下）施用而施用時具有令人滿意的生物利用度。相對于當(dāng)N末端修 飾的胰島素為皮下施用時的生物利用度，本發(fā)明的優(yōu)選化合物的生物利用度（相對于皮下 施用）是至少0. 3%，在一個方面是至少0. 5%，在一個方面是至少1%，在一個方面是至少 I. 5%，在一個方面是至少2%，在一個方面是至少2. 5%，在一個方面是至少3%，在一個方 面是至少3. 5%，在一個方面是至少4%，在一個方面是至少5%，在一個方面是至少6%， 在一個方面是至少7%，在一個方面是至少8%，在一個方面是至少9%，在一個方面是至少 10%。
[0033]本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及提供本發(fā)明的N末端修飾的胰島素，當(dāng)皮下施用時，其 相對于當(dāng)作為靜脈內(nèi)施用而施用時具有令人滿意的生物利用度。相對于當(dāng)N末端修飾的胰 島素為靜脈內(nèi)施用時的生物利用度，本發(fā)明的優(yōu)選化合物的生物利用度（相對于靜脈內(nèi)施 用）是至少10%，在一個方面是至少15%，在一個方面是至少20%，在一個方面是至少25%， 在一個方面是至少30%，在一個方面是至少35%，在一個方面是至少40%，在一個方面是至少 45%，在一個方面是至少50%，在一個方面是至少55%，在一個方面是至少60%，在一個方面是 至少70 %，在一個方面是至少80 %，在一個方面是至少90 %。
[0034]用于測量胰島素生物利用度的標(biāo)準(zhǔn)試驗對于本領(lǐng)域中技術(shù)人員是已知的，并且尤 其包括測量相同物種中口服和靜脈內(nèi)（i.v.)施用的、討論中的胰島素的濃度的曲線下的 相對面積（AUC)。血液（血漿）樣品中胰島素濃度的定量可以使用例如抗體測定（ELISA) 或通過質(zhì)譜來完成。
[0035] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及提供具有令人滿意的效力的本發(fā)明的N末端修飾的胰 島素。與人胰島素的效力相比，本發(fā)明的優(yōu)選的N末端修飾的胰島素的效力可以是人胰島 素的效力的至少5%，在一個方面是至少10%，在一個方面是至少20%，在一個方面是至少 30 %，在一個方面是至少40 %，在一個方面是至少50 %，在一個方面是至少75 %，和在一個 方面是至少100%。
[0036] 表觀體內(nèi)效力可以通過比較討論的胰島素與以相似劑量給予的比較胰島素的血 糖對時間曲線來測量。測量體內(nèi)效力的其它方法在在實施例中給出。
[0037]用于測量胰島素體外效力的標(biāo)準(zhǔn)試驗是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，尤其包括下面的 試驗：（1)胰島素放射受體試驗，其中將胰島素的相對效力定義為替代特異性結(jié)合于例如 細(xì)胞膜，例如大鼠肝質(zhì)膜部分上存在的胰島素受體的50%的 125I-胰島素所需的胰島素和 胰島素類似物/衍生物的比例；(2)脂肪生成試驗，例如用大鼠脂肪細(xì)胞進(jìn)行，其中將相對 的胰島素效力定義為實現(xiàn)[3-?]葡萄糖向有機(jī)可提取的材料（即脂質(zhì)）的最大轉(zhuǎn)化的50% 所需的胰島素和胰島素類似物/衍生物的比例；(3)在分離的脂肪細(xì)胞中的葡萄糖氧化試 驗，其中將胰島素類似物/衍生物的相對效力定義為實現(xiàn)葡萄糖-1_[ 14C]向[14CO2]的最 大轉(zhuǎn)化的50 %的胰島素和胰島素類似物/衍生物的比例；(4)胰島素放射免疫測定法，其 可以通過測量胰島素或胰島素類似物/衍生物與125I-胰島素競爭結(jié)合至特異性抗胰島素 抗體的效果而測定胰島素類似物/衍生物的免疫原性；以及（5)其它試驗，其測量胰島素 或胰島素類似物或衍生物與抗體在動物血漿樣品中的結(jié)合，諸如具有特異性胰島素抗體的 ELISA試驗。
[0038]本發(fā)明的N末端修飾的胰島素可以具有延長的時間作用特征，即在高血糖例如糖 尿病患者中提供比人胰島素持續(xù)更長的胰島素作用。換言之，與人胰島素相比，具有延長的 時間作用特征的胰島素具有延長的葡萄糖水平的降低。在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾 的胰島素在單次施用胰島素分子后提供持續(xù)約8小時至約2周的胰島素作用。在一個方面， 胰島素作用持續(xù)約24小時至約2周。在一個方面，所述作用持續(xù)約24小時至約1周。在 進(jìn)一步的方面，所述作用持續(xù)約1周至約2周。在又進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約1周。在 又進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約2周。在一個方面，所述作用持續(xù)約1天至約7天。在一個 方面，所述作用持續(xù)約1天至約3天。在一個方面，所述作用持續(xù)約1天至約2天。在一個 方面，所述作用持續(xù)約2天至約3天。在進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約7天至約14天。在 又進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約7天。在又進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約14天。在一個方 面，所述作用持續(xù)約2天至約7天。在一個方面，所述作用持續(xù)約3天至約7天。在又進(jìn)一 步方面，所述作用持續(xù)約3天。在又進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約4天。在又進(jìn)一步方面， 所述作用持續(xù)約5天。在又進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約6天。在又進(jìn)一步方面，所述作用 持續(xù)約7天。
[0039] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素在單次施用胰島素分子后提供持續(xù)約 8小時至約24小時的胰島素作用。在一個方面，胰島素作用持續(xù)約10小時至約24小時。 在一個方面，所述作用持續(xù)約12小時至約24小時。在進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約16小時 至約24小時。在又進(jìn)一步方面，所述作用持續(xù)約20小時至約24小時。在又進(jìn)一步方面， 所述作用持續(xù)約24小時。
[0040] 在一個方面，胰島素作用持續(xù)約24小時至約96小時。在一個方面，胰島素作用持 續(xù)約24小時至約48小時。在一個方面，胰島素作用持續(xù)約24小時至約36小時。在一個 方面，胰島素作用持續(xù)約1小時至約96小時。在一個方面，胰島素作用持續(xù)約1小時至約 48小時。在一個方面，胰島素作用持續(xù)約1小時至約36小時。
[0041] 作用持續(xù)時間（時間-作用曲線）可以通過抑制血糖的時間，或通過測量相關(guān)藥 代動力學(xué)特性，例如或MRT(平均停留時間）來測量。
[0042] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及提供本發(fā)明的N末端修飾的胰島素，其在口服施用后相 對于人胰島素具有令人滿意的延長作用。與人胰島素相比，本發(fā)明的優(yōu)選的N末端修飾的 胰島素的作用持續(xù)時間長至少10%。與人胰島素的持續(xù)時間相比，在一個方面，所述持續(xù)時 間長至少20%，在一個方面長至少25%，在一個方面長至少30%，在一個方面長至少35%，在一 個方面長至少40%，在一個方面長至少45%，在一個方面長至少50%，在一個方面長至少55%， 在一個方面長至少60%，在一個方面長至少65%，在一個方面長至少70%，在一個方面長至少 80%，在一個方面長至少90%，在一個方面長至少100%，在一個方面長多于100%。
[0043] 在一個方面，與每日一次的胰島素諸如LysB29(Nε-十四燒?；ヾesB30人胰島 素或A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰島素相比，本發(fā)明的優(yōu)選的N末端修飾的胰島素的作用 持續(xù)時間長至少10%。與每日一次胰島素諸如LysB29(Ne-十四烷酰基）desB30人胰島素 或A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰島素的相比，在一個方面，所述持續(xù)時間長至少20%，在一 個方面長至少25%，在一個方面長至少30%，在一個方面長至少35%，在一個方面長至少40%， 在一個方面長至少45%，在一個方面長至少50%，在一個方面長至少55%，在一個方面長至少 60%，在一個方面長至少65%，在一個方面長至少70%，在一個方面長至少80%，在一個方面長 至少90%，在一個方面長至少100%，在一個方面長多于100%。
[0044] 在一個方面，與每日一次胰島素諸如LysB29(Nε-十四燒?；ヾesB30人胰島素 或A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰島素相比，本發(fā)明的優(yōu)選的N末端修飾的胰島素的作用持 續(xù)時間長至少1〇〇%。與每日一次胰島素諸如LysB29(Nε-十四烷?；ヾesB30人胰島素或 A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰島素相比，在一個方面，所述持續(xù)時間長至少200%，在一個方 面長至少250%，在一個方面長至少300%，在一個方面長至少350%，在一個方面長至少400%， 在一個方面長至少450%，在一個方面長至少500%，在一個方面長至少550%，在一個方面長 至少600%，在一個方面長至少650%，在一個方面長至少700%，在一個方面長至少800%，在一 個方面長至少900%，在一個方面長至少1000%，在一個方面長多于1000%。
[0045]在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素針對蛋白水解性降解，即針對胃腸 (GI)道中或身體其它部位的快速降解，是穩(wěn)定的。在一個方面，相對于沒有一個或多個額外 的二硫鍵的N末端修飾的胰島素，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素針對蛋白水解性降解是穩(wěn) 定的。在一個方面，相對于以相似劑量給予的具有一個或多個額外二硫鍵但沒有N末端修 飾的相似?；葝u素，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素針對蛋白水解性降解是穩(wěn)定的。
[0046]針對蛋白水解性降解穩(wěn)定的N末端修飾的胰島素在本文被理解為本發(fā)明的N末端 修飾的胰島素，相對于人胰島素，其經(jīng)受由一種或多種蛋白酶的更慢的降解。在一個實施方 案中，相對于人胰島素，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素經(jīng)受由一種或多種蛋白酶的更慢的 降解。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素針對由一種或多種 酶的降解是穩(wěn)定的，該酶選自：胃蛋白酶（諸如例如，同種型胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白 酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶（諸如例如，同種型糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋 白酶C)，胰蛋白酶，胰島素-降解酶（IDE)，彈性蛋白酶（諸如例如，同種型胰腺彈性蛋白酶 I和/或II)，羧肽酶（例如，同種型羧肽酶A，羧肽酶A2和/或羧肽酶B)，氨肽酶，組織蛋 白酶D及源自大鼠、豬或人的腸提取物中存在的其它酶。
[0047]在一個實施方案中，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素針對一種或多種酶的降解是穩(wěn) 定的，該酶選自：糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰島素-降解酶（IDE)，彈性蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶 和組織蛋白酶D。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素針對一種或多種酶 的降解是穩(wěn)定的，該酶選自：糜蛋白酶，羧肽酶和IDE。在仍進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的 N末端修飾的胰島素針對一種或多種酶的降解是穩(wěn)定的，該酶選自：糜蛋白酶和IDE。在仍 進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素針對一種或多種酶的降解是穩(wěn)定的， 該酶選自：糜蛋白酶和羧肽酶。
[0048] "蛋白酶（protease) "或"蛋白酶（proteaseenzyme) "是消化酶，其可以使蛋白和 肽降解，并且可以在人體的各種組織中發(fā)現(xiàn)它，諸如例如胃（胃蛋白酶），腸腔（糜蛋白酶， 胰蛋白酶，彈性蛋白酶，羧肽酶等）或胃腸道的粘膜表面（氨肽酶，羧肽酶，腸肽酶，二肽基 肽酶，內(nèi)肽酶等），肝（胰島素降解酶，組織蛋白酶D等），和其它組織中。
[0049]可以測定找作為本發(fā)明的N末端修飾的胰島素對蛋白酶諸如糜蛋白酶、胃蛋白酶 和/或羧基肽酶A或者對酶的混合物諸如組織提取液（來自肝，腎，十二指腸，空腸，回腸， 結(jié)腸，胃等）的蛋白水解穩(wěn)定性的量度。在本發(fā)明的一個實施方案中，相對于人胰島素，1? 增加。在進(jìn)一步的實施方案中，相對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的N末端修飾的胰島 素，1?增加。在仍進(jìn)一步的實施方案中，相對于人胰島素，找增加至少2倍。在仍進(jìn)一步 的實施方案中，相對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的N末端修飾的胰島素，1?增加至少2 倍。在仍進(jìn)一步的實施方案中，相對于人胰島素，找增加至少3倍。在仍進(jìn)一步的實施方 案中，相對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的N末端修飾的胰島素，1?增加至少3倍。在 仍進(jìn)一步的實施方案中，相對于人胰島素，T1A增加至少4倍。在仍進(jìn)一步的實施方案中，相 對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的N末端修飾的胰島素，1?增加至少4倍。在仍進(jìn)一步 的實施方案中，相對于人胰島素，1?增加至少5倍。在仍進(jìn)一步的實施方案中，相對于沒有 一個或多個額外的二硫鍵的N末端修飾的胰島素，1?增加至少5倍。在仍進(jìn)一步的實施方 案中，相對于人胰島素，找增加至少10倍。在仍進(jìn)一步的實施方案中，相對于沒有一個或 多個額外的二硫鍵的N末端修飾的胰島素，1?增加至少10倍。
[0050] 術(shù)語"穩(wěn)定性"在本文中用于包含N末端修飾的胰島素的藥物組合物來描述組合 物的保存期限。當(dāng)是指本發(fā)明的N末端修飾的胰島素時，術(shù)語"穩(wěn)定化的"或"穩(wěn)定的"因 此是指相對于包含沒有N末端修飾的胰島素的組合物或相對于沒有一個或多個額外二硫 鍵的胰島素具有增加化學(xué)穩(wěn)定性、增加物理穩(wěn)定性或增加物理和化學(xué)穩(wěn)定性的組合物。
[0051] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性。在一個方面， 本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有改善的物理穩(wěn)定性。在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾 的胰島素具有改善的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。
[0052] 在一個方面，相對于人胰島素，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有改善的化學(xué)和/ 或物理穩(wěn)定性。在一個方面，相對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的N末端修飾的胰島素， 本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有改善的化學(xué)和/或物理穩(wěn)定性。在一個方面，相對于具 有一個或多個額外二硫鍵但沒有N末端修飾的相似?；葝u素，本發(fā)明的N末端修飾的胰 島素具有改善的化學(xué)和/或物理穩(wěn)定性。
[0053] 本文所用的術(shù)語"物理穩(wěn)定性"是指，胰島素暴露于熱-機(jī)械應(yīng)激和/或與使之不 穩(wěn)定的界面和表面諸如疏水表面和界面的相互作用導(dǎo)致的N末端修飾的胰島素形成胰島 素的無生物活性的和/或不溶性的聚集體的趨勢。因此，物理不穩(wěn)定性涉及相對于人胰島 素的構(gòu)象變化，其包括更有序結(jié)構(gòu)的損失、聚集、原纖化（fibrillation)、沉淀和/或吸附至 表面。已知肽諸如胰島素傾向于例如原纖化導(dǎo)致的不穩(wěn)定。通過在不同溫度不同時間期間 將填充合適的容器（例如，盒或小瓶）的溶液暴露于機(jī)械/物理應(yīng)激（例如攪動）之后例 如目視檢查、比濁法和/或濁度測定法的常規(guī)方法，可以評價包含N末端修飾的胰島素的溶 液的物理穩(wěn)定性。在具有黑背景的尖銳聚焦光中進(jìn)行溶液的目視檢查。通過例如在從〇到 3的等級（顯示無濁度的溶液對應(yīng)于目測評分0,且日光下顯示可見濁度的溶液對應(yīng)于目測 評分3)排序濁度的程度的目測評分而表征溶液的濁度。當(dāng)溶液在日光下顯示可見濁度時， 對于蛋白聚集，溶液被分類為物理不穩(wěn)定的?；蛘撸梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的簡單的 濁度測定評價溶液的濁度。也可以通過使用N末端修飾的胰島素的構(gòu)象狀態(tài)的光譜試劑或 探針評價本發(fā)明的N末端修飾的胰島素的物理穩(wěn)定性。探針優(yōu)選與蛋白的非天然構(gòu)象體優(yōu) 先結(jié)合的小分子。蛋白結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個實例是硫磺素T。硫磺素T是已經(jīng)廣 泛用于淀粉樣原纖維的檢測的熒光染料。在原纖維和還可能其它蛋白構(gòu)型存在的情況下， 當(dāng)結(jié)合于原纖維蛋白形式時，硫磺素T產(chǎn)生在約450nm的新的最大激發(fā)和在約482nm的 增強(qiáng)的發(fā)射。未結(jié)合的硫磺素T在該波長基本上無熒光。例如如實施例109中所述可以測 定本發(fā)明的N末端修飾的胰島素的物理穩(wěn)定性。
[0054] 可以使用其它小分子作為蛋白結(jié)構(gòu)從天然至非天然狀態(tài)的變化的探針。例如，優(yōu) 先結(jié)合于蛋白的暴露的疏水斑塊（patch)的"疏水性斑塊"探針。疏水性斑塊通常埋在天 然狀態(tài)的蛋白的三級結(jié)構(gòu)內(nèi)，但當(dāng)?shù)鞍组_始解折疊或變性時變得暴露。這些小分子的光譜 探針的實例是芳族的疏水性染料，諸如蒽、吖啶、菲咯啉等。其它光譜探針是金屬-氨基酸 復(fù)合物，諸如疏水性氨基酸諸如苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸和纈氨酸等的鈷金 屬復(fù)合物。
[0055] 本文所用的N末端修飾的胰島素的術(shù)語"化學(xué)穩(wěn)定性"是指導(dǎo)致化學(xué)降解產(chǎn)物的 形成的蛋白結(jié)構(gòu)中的化學(xué)共價變化，與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比，該化學(xué)降解產(chǎn)物具有潛在的更 低的生物學(xué)效力和/或潛在的增加的免疫原性特性。根據(jù)天然蛋白的類型和性質(zhì)和蛋白暴 露的環(huán)境，可以形成各種化學(xué)降解產(chǎn)物?；瘜W(xué)降解的消除最可能不能完全避免，在本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的藥物組合物的儲存和使用期間經(jīng)?？吹街饾u增加量的化學(xué)降解產(chǎn)物。大多數(shù) 蛋白傾向于脫酰胺化，在該過程中谷氨酰胺?；蛱於０孵；鶜埢械膫?cè)鏈酰胺基被水 解形成游離的羧酸。其它降解途徑涉及形成高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中兩個或更多的蛋白分 子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫化物相互作用而彼此共價結(jié)合，導(dǎo)致形成共價結(jié)合的二聚 你，"％聚你私多聚H犧f吻]{StabilityofProteinPharmaceuticals,Ahern.T.J. & C, /7(9/?a? Afer7o_rA。氧化可以作為化學(xué)降解的另一種變體被 提及?？梢酝ㄟ^在暴露于不同的環(huán)境條件之后在各個時間點測定化學(xué)降解產(chǎn)物的量評價N末端修飾的胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性（例如經(jīng)常可以通過升高溫度來加速降解產(chǎn)物的形成）。 經(jīng)常通過根據(jù)分子大小、親水性、疏水性和/或電荷使用各種層析技術(shù)（例如，SEC-HPLC和 /或RP-HPLC)分離降解產(chǎn)物來測定各個降解產(chǎn)物各自的量。
[0056] 在一個實施方案中，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有很少或沒有聚集的趨勢。 當(dāng)在硫磺素測定中試驗時，相對于沒有一個或多個額外的二硫鍵的人胰島素和/或N末端 修飾的胰島素的聚集趨勢，聚集趨勢優(yōu)選顯著改善。
[0057] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素具有改善的熱力學(xué)穩(wěn)定性，諸如例如， 折疊穩(wěn)定性，構(gòu)象的穩(wěn)定性和/或更高的熔解溫度。
[0058] 當(dāng)本文使用時，如果與沒有一個或多個額外的二硫鍵的人胰島素或N末端修飾的 胰島素相比，所述衍生物的變性需要更高的應(yīng)激水平諸如更高的溫度和/或更高濃度的變 性劑，那么N末端修飾的胰島素被稱為具有改善的"熱力學(xué)穩(wěn)定性"。
[0059]可以通過諸如例如Hudson和Andersen,PeptideScience,vol76 (4)，PP. 298-308 (2004)中所述圓二色光譜和NMR評價構(gòu)象的穩(wěn)定性。熔解溫度被理解為胰島素 結(jié)構(gòu)可逆或不可逆地變化的溫度。更高的熔解溫度對應(yīng)更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)?？梢?，例如，通過 圓二色光譜和/或NMR將構(gòu)象穩(wěn)定性評價為溫度的函數(shù)，或通過差示掃描量熱法而測定熔 解溫度。也可以在逐漸增加濃度的變性劑諸如例如鹽酸胍存在的情況下通過CD光譜和或 NMR測定熱力學(xué)穩(wěn)定性?？梢詮倪@種實驗測定以前所述（Kaarsholm,N.C.，等人，1993， 歷32，10773-8)的解折疊的自由能。蛋白變性后，遠(yuǎn)UV范圍（240-218-nm) 內(nèi)的負(fù)CD逐漸減小，與伴隨蛋白解折疊的有序的二級結(jié)構(gòu)的損失一致（Holladay等 人，1977，Jcia, 494，245-254;Melberg和Johnson, 1990， 沒iocAi?.沿·〇Μ_7·5.Jcia, 494，245-254)。在近UV范圍（330-250-nm)內(nèi)的胰島素CD譜 反映了具有來自二硫鍵的貢獻(xiàn)的酪氨酸發(fā)色團(tuán)的環(huán)境（Morris等人，1968，AiocAi?. Biophys. Acta. , 1QQ, --οο?等乂，\WIb, Biochim. Biophys. Acta, 145-155;Strickland&Mercola, 1976，15，3875-3884)。從這些研究 以前計算的胰島素的解折疊的自由能為4.5kcal/mol(Kaarsholm,N.C.,等人，1993， Biochemistry,32, 10773-8)〇
[0060] 在近UV范圍（330-250-nm)內(nèi)的胰島素⑶譜反映了具有來自二硫鍵的貢獻(xiàn)的酪 氨酸發(fā)色團(tuán)的環(huán)境。由于酪氨酸殘基是胰島素二聚體表面的部分，在該區(qū)域（尤是在276nm)的摩爾橢圓率（molarelipticity)的變化反映在胰島素的結(jié)合狀態(tài)上。測量胰島素的 結(jié)合狀態(tài)的另一種方式是通過在本領(lǐng)域已知并且在實施例中描述的非解離條件下應(yīng)用大 小排阻層析法。
[0061] 可以選擇N末端修飾的胰島素的N末端修飾基團(tuán)的電荷，使得與親本胰島素的胰 島素受體親和力相比，N末端修飾的胰島素已經(jīng)保留或改變對于胰島素受體（IR)的親和 力。
[0062] 例如，與沒有N末端修飾的親本胰島素相比，在生理pH下（即pH7. 4)為中性或帶 負(fù)電荷的N末端修飾基團(tuán)可以導(dǎo)致降低的IR親和力。作為另一個實例，與沒有N末端修飾 的親本胰島素相比，在生理PH下帶正電荷的N末端修飾基團(tuán)可以導(dǎo)致保留的或僅僅稍微降 低的IR親和力。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，用于本發(fā)明的N末端修飾基團(tuán)在生理pH下可以是中性或 帶正電荷或帶負(fù)電荷的。
[0064] 在一個方面，本發(fā)明的N末端修飾的胰島素由肽部分、N末端修飾基團(tuán)和白蛋白結(jié) 合部分組成。
[0065]當(dāng)將術(shù)語"在生理pH下帶正電荷"使用為關(guān)于如本文中所述的N末端修飾基團(tuán)時， 是指在包含N末端修飾多肽的溶液中，至少10%的N末端修飾基團(tuán)在生理pH下具有+1的 電荷。在一個方面，在N末端修飾的多肽的溶液中至少30%的N末端修飾基團(tuán)在生理pH下 具有+1的電荷。在進(jìn)一步方面，在N末端修飾的多肽的溶液中至少50%的N末端修飾基 團(tuán)在生理pH下具有+1的電荷。在又進(jìn)一步方面，在N末端修飾的多肽的溶液中至少70% 的N末端修飾基團(tuán)在生理pH下具有+1的電荷。在又進(jìn)一步方面，在N末端修飾的多肽的 溶液中至少90%的N末端修飾基團(tuán)在生理pH下具有+1的電荷。
[0066] 在生理pH下帶正電的N末端修飾基團(tuán)的實例包括但不限于：N,N-二-C1-4烷基諸 如N,N-二甲基和N,N-二乙基、N-脒基（amidinyl)、4-(N,N-二甲基氨基）丁?；?、3-(1-哌 啶基）丙酰基、3 - (N，N-二甲基氨基）丙酰基和 N，N-二甲基-甘氨?；?br> 【權(quán)利要求】
1. N末端修飾的胰島素，其由肽部分、N末端修飾基團(tuán)和白蛋白結(jié)合部分組成，其中所 述肽部分具有至少一個不存在于人胰島素中的二硫鍵。 2. N末端修飾的胰島素，其由肽部分、N末端修飾基團(tuán)和白蛋白結(jié)合部分組成，其中所 述肽部分具有兩個或更多個半胱氨酸取代，且保留了人胰島素的三個二硫鍵。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的N末端修飾的胰島素，其中以這樣的方式選擇半胱氨酸取 代的位點，所述方式使得引入的半胱氨酸殘基位于折疊的N末端修飾的胰島素的三維結(jié)構(gòu) 中，以允許不存在于人胰島素中的一個或多個額外的二硫鍵的形成，并且其中所述N末端 修飾的胰島素具有具有相同肽部分、相同N末端修飾基團(tuán)和相同白蛋白結(jié)合部分、但不具 有不存在于人胰島素中的任何二硫鍵的胰島素肽的胰島素受體親和力的至少5%。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的N末端修飾的胰島素，其中，所述修飾基團(tuán)是一個或 兩個有機(jī)取代基，其各自具有低于200 g/mol的分子量（MW)，且綴合于親本胰島素的N末 端。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的N末端修飾的胰島素，其中修飾基團(tuán)在化學(xué)式V (針 對A鏈N末〗而圖不）中指定為Y'和Z :
且其中Y'和Z連接至胰島素肽的N末端氨基酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的N末端修飾的胰島素，其中Y'和Z是不同的，且 Y' 是 R-C(=X)-， Z是H， R是H，NH2，直鏈或支鏈的CI-C4烷基，被二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二甲基 銨、二乙基銨或二丙基銨、CO2H或-OCH2CO2H取代的直鏈或支鏈的C2-C4烷基，C5-C6環(huán)烷 基，取代的C5-C6環(huán)烷基，5或6元飽和雜環(huán)基，取代的5或6元飽和雜環(huán)基，且 X是0或S。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的N末端修飾的胰島素，其中Y'和Z是不同的，且 Y' 是 R-C(=X)-， Z是H， R是H，NH2，直鏈或支鏈的C1-C4烷基，被CO2H或-OCH2CO 2H取代的C1-C4烷基，且 X是0。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的N末端修飾的胰島素，其中Y'和Z是相同的且是甲基。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的N末端修飾的胰島素，其中所述N末端修飾基團(tuán)選自： N，N-二甲基、N，N-二乙基、氨基甲?；?、甲酰基、乙?；?、丙?；⒍□；?、戊二?；投u 乙酰基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2-9中任一項的N末端修飾的胰島素，其中半胱氨酸取代的位置是 AlOC 和 B3C。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2-10中任一項的N末端修飾的胰島素，其中除了兩個或更多個半胱 氨酸取代以外，所述肽部分包含選自以下的一個或多個取代的氨基酸：A14E、B16H、B25H、 desB27 和 desB30。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的N末端修飾的胰島素，其中所述肽部分選自：A10C， A14E, B3C, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB27, desB30 人 胰島素；A10C, A14E, B3C, B25H, desB30 人胰島素；A10C, A14E, B3C, desB27, desB30 人胰島素；A10C, A14E, B3C, B16H, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A10C, A14E, B16H, desB27, desB30 人胰島素。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的N末端修飾的胰島素，其中所述白蛋白結(jié)合部分具 有通式 Acy-AAln-AA2m-AA3p-(化學(xué)式 IV)， 其中 n為0或1-3范圍內(nèi)的整數(shù)； m為0或1-10范圍內(nèi)的整數(shù)； P為〇或1-10范圍內(nèi)的整數(shù)； Acy是包含約14個-約20個碳原子的脂肪酸或脂肪二元酸； AAl是中性的線性或環(huán)狀氨基酸殘基； AA2是酸性氨基酸殘基； AA3是中性的含烷撐二醇的氨基酸殘基； AA1、AA2和AA3在所述式中出現(xiàn)的順序可以獨立地互換；AA2可以沿所述式出現(xiàn)數(shù) 次（例如，Acy-AA2-AA32-AA2_) ;AA2可以沿所述式獨立地（=不同的）出現(xiàn)數(shù)次（例如， Acy-AA2-AA32-AA2_) ;Acy、AAl、AA2和/或AA3之間的連接是酰胺（肽）鍵，所述酰胺（肽） 鍵形式上可通過除去Acy、AAl、AA2和AA3各自的氫原子或羥基（水）來獲得；且與肽部分 的連接可以來自化學(xué)式IV?；糠种械腁Al、AA2或AA3殘基的C末端或來自化學(xué)式IV部 分中存在的AA2殘基的一個或多個側(cè)鏈中的一個。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的N末端修飾的胰島素，其選自： 八1〇￥'，-二甲基），六10(：，六14￡，81〇￥°，#°-二甲基），83(：，82511，（168827， B29K 〇VE十八烷二?；?gGlu-2xOEG)，desB30人胰島素 八1〇￥'，-二甲基），六10(：，六14￡，81?，#°-二甲基），83(：，82511，8291(〇￥￡二十 烷二?；?gGlu-2xOEG)，desB30人胰島素。
15. 藥物組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的N末端修飾的胰島素。
【文檔編號】A61K38/28GK104364262SQ201280063236
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月21日
【發(fā)明者】P.馬德森, T.B.克杰德森, T.M.塔格莫塞 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司