輕鏈橋連的雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了用于臨床治療的具有免疫激活性質(zhì)的新形式單體雙特異性融合蛋白。雙特異性融合蛋白包括對(duì)感興趣的第一靶標(biāo)具有特異性的第一靶向結(jié)構(gòu)域；衍生自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的恒定區(qū)的橋連結(jié)構(gòu)域，該免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和對(duì)感興趣的第二靶標(biāo)具有特異性的第二靶向結(jié)構(gòu)域。雙特異性融合蛋白還可以包括融合到橋連結(jié)構(gòu)域的N-端或C-端的接頭。第一靶向結(jié)構(gòu)域融合到橋連結(jié)構(gòu)域并且第二靶向結(jié)構(gòu)域融合到橋連結(jié)構(gòu)域或接頭上。接頭可以包括GGGGS序列。感興趣的第一靶標(biāo)可以是CD20、Her2/neu或EpCAM，并且第二靶向結(jié)構(gòu)域是T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域。
【專利說明】輕鏈橋連的雙特異性抗體
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年12月27日提交的臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/580，491的優(yōu)先權(quán)，其公開通過引用全文納入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及雙特異性或多重特異性生物分子，諸如雙特異性抗體的制備方法及其產(chǎn)物。
[0004]發(fā)明背景
[0005]結(jié)合具有不同功能的生物分子可能產(chǎn)生具有需要或改良性質(zhì)的新分子。例如，在多特異性抗體，包括雙特異性抗體和雙特異性腫瘤祀向T-淋巴細(xì)胞銜接子(engager)中的最新進(jìn)展已經(jīng)證明與單克隆抗腫瘤治療相比，具有免疫激活性質(zhì)的多重特異性分子經(jīng)常在腫瘤治療中遞送增強(qiáng)的功效。
[0006]例如，雙特異性抗體(BsAb)可以由來自不同抗體的兩種不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，可變區(qū))的片段組成。兩種不同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合兩種不同類型的抗原。這些分子可以在臨床治療中有所應(yīng)用，諸如腫瘤免疫治療。對(duì)于這類應(yīng)用，BsAbs可以被設(shè)計(jì)成同時(shí)結(jié)合細(xì)胞毒性細(xì)胞(使用受體如0)3 (Kurby immunology (Kurby免疫學(xué)).San Francisco:ff.H.Freeman.1SBN1-492-0211-4))和靶標(biāo)如癌細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞上的抗原)。
[0007]雙特異性和多重特異性蛋白的構(gòu)建包括多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域的融合。然而，這樣的融合可能由于融合伙伴不同的生物和/或生理性質(zhì)而造成融合伙伴之間的不相容。另外，生理限制，包括腎過濾或循環(huán)途徑的滲透性，也可能挑戰(zhàn)醫(yī)學(xué)上可用的多重特異性腫瘤靶向分子的設(shè)計(jì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的實(shí)施方式涉及用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用如臨床治療的具有免疫激活性質(zhì)的新形式雙特異性或多重特異性融合蛋白。這些蛋白包括通過橋連結(jié)構(gòu)域連接的兩個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域(靶向結(jié)構(gòu)域)，橋連結(jié)構(gòu)域可以包括一個(gè)或兩個(gè)任選的接頭。橋連結(jié)構(gòu)域可以衍生自抗體的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，使得融合蛋白中的不同伙伴是相容的并且可以保留需要的生物性質(zhì)?？梢杂米鳂虻拿庖咔虻鞍捉Y(jié)構(gòu)域可包括輕鏈恒定區(qū)或重鏈恒定區(qū)。這樣的融合蛋白可以被稱為輕鏈橋連的抗體或重鏈橋連的抗體。
[0009]例如，本發(fā)明的實(shí)施方式所述的雙特異性融合蛋白可以包括抗腫瘤生物標(biāo)記，諸如CD20(Hybridoma.19832 ;17)、Her2/neu(Am J Clin Pathol 2003 120(suppl I) ;S53)或EpCAM(J.1mmunol.1992 148⑵；590)，作為細(xì)胞靶向或生物分子靶向結(jié)構(gòu)域的單鏈連接的Fv片段(ScFv)，作為橋的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，任選的接頭(其可以省去)，和作為T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域的抗-CD3 ScFv0這樣的輕鏈橋連的雙特異性免疫激活劑同時(shí)顯示出對(duì)腫瘤表達(dá)的細(xì)胞靶標(biāo)和T-淋巴細(xì)胞的結(jié)合特異性。結(jié)合兩個(gè)靶標(biāo)特異性地誘導(dǎo)對(duì)腫瘤靶標(biāo)的T-淋巴細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。
[0010]除了上述的抗腫瘤ScFv示例以外，也可使用其他細(xì)胞-靶向結(jié)構(gòu)域。這類其他分子可以具有對(duì)其他細(xì)胞靶標(biāo)的特異性結(jié)合能力。除了 T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域以外，其他細(xì)胞靶向結(jié)構(gòu)域的示例可以包括具有所需特異性的ScFv或毒素多肽、酶、激素、細(xì)胞因子、信號(hào)分子。此外，本發(fā)明的實(shí)施方式所述的融合蛋白可以在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)。另外，ScFv的取向可以是輕鏈可變區(qū)連接到重鏈可變區(qū)上，或反之。這樣的雙特異性分子的應(yīng)用包括藥物應(yīng)用，諸如載特定生物標(biāo)記細(xì)胞的消耗治療，諸如腫瘤治療。另外，這樣的分子可以在診斷應(yīng)用中使用。
[0011]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及雙特異性融合蛋白。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所述的雙特異性融合蛋白可以包括對(duì)感興趣的第一靶標(biāo)具有特異性的第一靶向結(jié)構(gòu)域；衍生自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的恒定區(qū)的橋連結(jié)構(gòu)域，該免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和對(duì)感興趣的第二靶標(biāo)具有特異性的第二靶向結(jié)構(gòu)域。靶向結(jié)構(gòu)域可以對(duì)靶標(biāo)生物分子或細(xì)胞有特異性。
[0012]按照本發(fā)明的一些實(shí)施方式，雙特異性融合蛋白還可以包括與橋連結(jié)構(gòu)域的N-端或C-端融合的接頭。第一靶向結(jié)構(gòu)域融合到橋連結(jié)構(gòu)域或接頭上而第二靶向結(jié)構(gòu)域融合到橋連結(jié)構(gòu)域或接頭上。接頭可以包括GGGGS序列。感興趣的第一靶標(biāo)可以是⑶20、Her2/neu、EpCAM等,并且第二祀向結(jié)構(gòu)域可以是T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域,諸如抗-⑶3。
[0013]按照本發(fā)明的一些實(shí)施方式，雙特異性融合蛋白可以省去上述的接頭結(jié)構(gòu)域，例如，其中對(duì)感興趣的第一靶標(biāo)具有特異性的第一靶向結(jié)構(gòu)域和對(duì)感興趣的第二靶標(biāo)具有特異性的第二靶向結(jié)構(gòu)域各直接融合到橋連結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)末端。
[0014]按照本發(fā)明的一些實(shí)施方式，雙特異性融合蛋白可以包括間插在第一靶向結(jié)構(gòu)域和橋連結(jié)構(gòu)域之間，以及橋連結(jié)構(gòu)域和第二靶向結(jié)構(gòu)域之間的一個(gè)或多個(gè)上述的接頭。即，第一靶向結(jié)構(gòu)域和第二靶向結(jié)構(gòu)域都與接頭單獨(dú)融合，這些接頭與橋連結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)末端融合。
[0015]在任意的上述實(shí)施方式中，第一靶向結(jié)構(gòu)域可以包括對(duì)感興趣的第一靶標(biāo)具有特異性的第一 ScFv，并且第二靶向結(jié)構(gòu)域可以包括對(duì)感興趣的第二靶標(biāo)具有特異性的第二ScFv0
[0016]在任意的上述實(shí)施方式中，第一 ScFv和第二 ScFv各自可以包括人免疫球蛋白序列。在上述實(shí)施方式中，第一 ScFv可以包括對(duì)第一抗原具有結(jié)合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，并且第二 ScFv可以包括對(duì)第二抗原具有結(jié)合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH。
[0017]在任意上述實(shí)施方式中，接頭可以包括一個(gè)或多個(gè)GGGGS(G4S)序列。例如，接頭可以包括I個(gè)G4S序列、2個(gè)G4S序列(重復(fù))、3個(gè)G4S序列等。另外，接頭可以包括與G4S序列結(jié)合的其他氨基酸序列。例如，這類其他氨基酸序列可以包括鉸鏈序列(例如，CPPCP)。
[0018]從下面的詳述和所附權(quán)利要求書很容易了解本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)。
[0019]附圖簡要說明
[0020]圖1A和圖1B顯示了說明本發(fā)明的實(shí)施方式所述的各種雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑的構(gòu)建體的示意圖。
[0021 ] 圖2A和圖2B顯示了本發(fā)明的實(shí)施方式所述來自真核和原核表達(dá)系統(tǒng)的輕鏈橋連雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑的表達(dá)和純化。圖2B顯示了考馬斯亮藍(lán)染色(組圖A)和由BL-21 (DE3)pLysS表達(dá)的可溶蛋白上針對(duì)帶His-標(biāo)簽的LCBTA的Western印跡(組圖B)。兩個(gè)組圖中的泳道I和3是IPTG誘導(dǎo)前的提取物。兩個(gè)組圖中的泳道2和4是用IPTG誘導(dǎo)的提取物。泳道I和2表示Ka LCBTA-1的EpCAM靶向。泳道3和4表示Ka LCBTA-1的Her2/neu革巴向。
[0022]圖3A顯示選擇的腫瘤靶向單克隆抗體和輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑的尺寸排阻-高效液相色譜(SEC-HPLC)分析。圖3B顯示SEC-HPLC分析輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑的均勻性和它們的抗原結(jié)合活性以及產(chǎn)率的改善。
[0023]圖4A和4B顯示了本發(fā)明的實(shí)施方式所述的結(jié)合⑶20+拉吉(Raji)淋巴瘤細(xì)胞、Her2/neu+BT474乳腺癌細(xì)胞、EpCAM+HT29結(jié)直腸癌細(xì)胞(圖4A)和Jurkat淋巴瘤細(xì)胞的CD3(圖4B)的不同腫瘤靶向輕鏈橋連的雙特異性抗體的示例。
[0024]圖5顯示了本發(fā)明的實(shí)施方式所述的幾個(gè)雙特異性抗體的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴激活劑的瞬時(shí)表達(dá)的比較。
[0025]圖6證明了 La LCBTA和Ka LCBTA的體外血清穩(wěn)定性分析。
[0026]圖7顯示在單克隆抗體和本發(fā)明的實(shí)施方式所述腫瘤靶向雙特異性抗體(同時(shí)靶向EpCAM和Her2)的刺激之后外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞因子分泌概況的示例。
[0027]圖8A顯示了本發(fā)明的實(shí)施方式所述Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑對(duì)⑶20+B-淋巴瘤(拉吉)的細(xì)胞毒性。圖SB顯示了本發(fā)明的實(shí)施方式所述Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑對(duì)Her2/neu7EpCAM+結(jié)直腸癌(HT29)的細(xì)胞毒性。圖8C顯示了本發(fā)明的實(shí)施方式所述Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑對(duì)Herf/neu+/EpCAM+胰腺癌(Capan-1)的細(xì)胞毒性。
[0028]圖9A顯示由本發(fā)明的實(shí)施方式所述靶向⑶20的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑根除腫瘤的移植研究。圖9B顯示由本發(fā)明的實(shí)施方式所述靶向Her2/neU的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑根除腫瘤的移植研究。圖9C顯示由本發(fā)明的實(shí)施方式所述靶向EpCAM的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑根除腫瘤的移植研究。
[0029]發(fā)明詳述
[0030]本發(fā)明的實(shí)施方式涉及用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用如臨床治療的具有免疫激活性質(zhì)的新形式雙特異性或多重特異性融合蛋白。本發(fā)明的實(shí)施方式所述的單體雙特異性或多重特異性免疫激活分子可以指輕鏈橋連的雙特異性免疫激活劑(LCBTA)，或更具體地指免疫球蛋白橋連的雙特異性或多重特異性生物分子。本發(fā)明的實(shí)施方式所述的生物分子可以是雙特異性的或多重特異性的。然而，為清楚起見，下面的說明書將這些分子稱為“雙特異性”分子。應(yīng)理解這樣提及“雙特異性”旨在包括“雙特異性”和“多重特異性”。
[0031]本發(fā)明的實(shí)施方式所述的雙特異性分子可以包括連接兩個(gè)靶向結(jié)構(gòu)域的橋連結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的實(shí)施方式所述的橋連結(jié)構(gòu)域可以包括蛋白或肽，并且這兩個(gè)靶向結(jié)構(gòu)域可以分別連接橋連結(jié)構(gòu)域的N-端和C-端。本發(fā)明的實(shí)施方式所述的這兩個(gè)靶向結(jié)構(gòu)域可以衍生自抗體的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，可變區(qū))。這兩個(gè)靶向結(jié)構(gòu)域之一可以是T-淋巴細(xì)胞-激活結(jié)構(gòu)域，而另一個(gè)靶向結(jié)構(gòu)域可以對(duì)靶標(biāo)分子或細(xì)胞，諸如腫瘤細(xì)胞、腫瘤抗原、病毒、細(xì)菌等有特異性。
[0032] 本發(fā)明的雙特異性分子的示例可以包括下式⑴和(VI)中所示的那些，其中TgD是靶向結(jié)構(gòu)域，BD是橋連結(jié)構(gòu)域，TAD是T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域，并且LNK是接頭:
[0033]TgD -BD-TAD式(I)
[0034]TAD -BD- TgD式(II)
[0035]TgD - LNK -BD- TAD 式(III)
[0036]TAD -BD- LNK - TgD 式(IV)
[0037]TgD - LNK -BD- LNK - TAD 式(V)
[0038]TAD - LNK -BD- LNK - TgD 式(VI)
[0039]一些示例可以包括靶向結(jié)構(gòu)域和橋連結(jié)構(gòu)域之間的接頭。一些示例可以包括T-淋巴細(xì)胞-激活結(jié)構(gòu)域和橋連結(jié)構(gòu)域之間的接頭。一些示例可以包括靶向結(jié)構(gòu)域和橋連結(jié)構(gòu)域之間的接頭和T-淋巴細(xì)胞-激活結(jié)構(gòu)域和橋連結(jié)構(gòu)域之間的另一個(gè)接頭。
[0040]按照本發(fā)明的實(shí)施方式，靶向結(jié)構(gòu)域(TD)(例如，腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域、抗原靶向結(jié)構(gòu)域、生物分子靶向結(jié)構(gòu)域等)可以衍生自抗體的可變區(qū)。抗體衍生的靶向結(jié)構(gòu)域可以包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其可以兩種構(gòu)型(取向)存在:(1)輕鏈可變區(qū)在N-端而重鏈可變區(qū)在C-端，或(2)重鏈可變區(qū)在N-端而輕鏈可變區(qū)在C-端。
[0041]在靶向結(jié)構(gòu)域(例如，腫瘤靶向結(jié)構(gòu)域)中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以與接頭連接，其可以包括任意合適的接頭，諸如短肽片段。例如，本發(fā)明的實(shí)施方式所述的接頭可以包括短肽，其通常包括小氨基酸殘基或親水氨基酸殘基(例如，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等)。這樣的肽的一個(gè)示例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S)。其他示例可以在序列中包含這些氨基酸的變換，諸如GGGSG、GGSGG, GSGGG或SGGGG。其他示例可以包括含有G或S以外的氨基酸殘基的肽，諸如GGTGS、GTSPGG, GNGGGS等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解許多常用的肽接頭可以用于本發(fā)明的實(shí)施方式中。
[0042]按照本發(fā)明的實(shí)施方式，這樣的短肽接頭可以包括重復(fù)單元以增加接頭長度。例如，一些接頭可以包括2個(gè)G4S-重復(fù)的接頭、3個(gè)G4S-重復(fù)的接頭、或4個(gè)G4S-重復(fù)的接頭。此外，一些“重復(fù)-樣”接頭可以包括不同肽序列的混合物，諸如G4S-GGSGG-G4S-SGGGG。
[0043]按照本發(fā)明的實(shí)施方式，橋連接頭可以包括肽片段，優(yōu)選衍生自抗體的片段。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，橋連結(jié)構(gòu)域可以衍生自重鏈、輕鏈，具體地重鏈或輕鏈中的恒定區(qū)。例如，本發(fā)明的實(shí)施方式所述的橋可以衍生自輕鏈，諸如kappa(K)鏈、lambda-2 ( λ -2)鏈、或lambda-5 ( λ-5)鏈(或替代輕鏈)。在一些實(shí)施方式中，橋可以包括衍生自輕鏈的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，諸如kappa O )鏈、lambda-2(A _2)鏈,或lambda-5 ( λ -5)鏈的恒定區(qū)。相似地，橋連結(jié)構(gòu)域可以衍生自重鏈或重鏈的區(qū)域(例如，恒定區(qū))。本文使用的術(shù)語“衍生自”是指橋連結(jié)構(gòu)域與輕鏈或重鏈的結(jié)構(gòu)域(例如，恒定區(qū))的全長序列具有基本的同源性(例如，≥50%，優(yōu)選≥70%，更優(yōu)選≥80%，最優(yōu)選≥90% )。
[0044]另外，按照本發(fā)明的實(shí)施方式，橋連結(jié)構(gòu)域可以是模擬輕鏈恒定區(qū)的K鏈、λ鏈、或λ-5 (或替代輕鏈)的突變體，或K鏈、λ鏈、或λ-5替代輕鏈的衍生物。本文使用的“突變體”是指保守性突變體或非保守性突變體。如本文所述，本發(fā)明的實(shí)施方式所述的突變體保留了用作橋連結(jié)構(gòu)域的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解保守性突變體包括用相似的氨基酸取代氨基酸并且通常會(huì)具有保持的生物活性或結(jié)構(gòu)。保守性突變體可以包括1-50個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選1-30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選1-20個(gè)氨基酸，并且最優(yōu)選1-10個(gè)氨基酸。非保守性突變體可能具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，例如1-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選1-30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選1-20個(gè)氨基酸，并且最優(yōu)選1-10個(gè)氨基酸的刪除、取代或插入。
[0045]按照本發(fā)明的一些實(shí)施方式，橋(或橋連結(jié)構(gòu)域)可以與靶向結(jié)構(gòu)域和T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域直接連接。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，可以在橋和靶向結(jié)構(gòu)域或T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域之間提供接頭。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，可以在橋和靶向結(jié)構(gòu)域之間提供一個(gè)接頭，并且在橋和T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域之間提供第二個(gè)接頭。
[0046]橋連結(jié)構(gòu)域和靶向結(jié)構(gòu)域或T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域之間的接頭可與上述的那些結(jié)構(gòu)域內(nèi)接頭相似。例如，橋連結(jié)構(gòu)域和靶向結(jié)構(gòu)域或T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域之間的接頭可以包括G4S接頭或G4S-重復(fù)接頭(其可以是雙重復(fù)、三重復(fù)等)。另外，如上述，接頭可以包括其他氨基酸序列。
[0047]按照本發(fā)明的實(shí)施方式，T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域可以用或不用間插結(jié)構(gòu)域與橋連結(jié)構(gòu)域的一個(gè)末端相連用于T-淋巴細(xì)胞激活。各種T-淋巴細(xì)胞激活分子為本領(lǐng)域已知，包括抗-CD3抗體(單克隆或多克隆)，或此類抗體的CD3-結(jié)合片段或配體或?qū)?-1BB分子的抗體。例如，按照本發(fā)明的實(shí)施方式，T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域可以包括針對(duì)CD3的單克隆抗體的可變區(qū)。在這樣的實(shí)施方式中，可以在兩個(gè)取向上使用可變區(qū)的重鏈和輕鏈:(I)輕鏈可變區(qū)位于N-端并且重鏈可變區(qū)位于C-端，或(2)重鏈可變區(qū)位于N-端并且輕鏈可變區(qū)位于C-端。
[0048]與靶向結(jié)構(gòu)域的描述相似，接頭可連接T-淋巴細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。例如，這樣的接頭可以包括任意合適的氨基酸序列，諸如G4S或雙、三或四G4S-重復(fù)的接頭。另外，接頭可以包括其他氨基酸序列。
[0049]本發(fā)明的雙特異性分子可以用于靶向細(xì)胞或分子，同時(shí)激活T-淋巴細(xì)胞應(yīng)答。用下面的工作實(shí)施例來說明這些分子的一些生物用途。
[0050] 免疫球蛋白輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細(xì)胞激活劑的產(chǎn)生
[0051]在第一組示例中，抗-CD20、抗-Her2/neu或抗-EpCAM ScFv (可變區(qū)的單鏈片段)用作細(xì)胞靶向結(jié)構(gòu)域(CtD)，并且選擇抗-⑶3 ScFv作為T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域(TAD)。所選的CtD和TAD通過橋連接，例如其可能包括衍生自抗體輕鏈或重鏈的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。這類橋的示例可以包括選自人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些。這類選自人免疫球蛋白恒定區(qū)的免疫球蛋白鏈橋的具體示例可能包括，但不限于以下所示的SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQID N0.3 和 SEQ ID N0.4:
[0052]?SEQIDN0.1:VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0053]-人免疫球蛋白κ恒定區(qū)
[0054]?SEQIDN0.2:GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEK TV APTECS
[0055]-人免疫球蛋白λ2恒定區(qū)
[0056]?SEQIDN0.3:VTHVFGSGTQLTVLSQPKATPSVTLFPPS SE ELQANKATLVCL Met NDFYPGILTVTffKADGTPIT QG VEMetTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWRSRRSYSCQVMetHEGSTVEKTVAPTECS
[0057]-人免疫球蛋白λ5恒定區(qū)
[0058]?SEQIDN0.4:TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSC
[0059]-人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)I(CHl)
[0060]按照本發(fā)明的一些實(shí)施方式，CtD的C-端可以與所選橋(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定區(qū)的橋)的N-端融合。按照本發(fā)明的其他實(shí)施方式，CtD的C-端可以與所選的接頭序列的N-端融合，并且該接頭隨后與所選橋(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定區(qū)的橋)的N-端融合。
[0061]在輕鏈橋的C-端，接頭可以任選地與該橋的C-端融合。按照本發(fā)明的實(shí)施方式，接頭可以包括任意合適的上述肽序列。例如，接頭可以包括一個(gè)或多個(gè)GGGGS序列(G4S)，含有或不含其他序列(例如，鉸鏈序列，CPPCP)。然后該構(gòu)建體可以與TAD連接形成圖1所示的雙特異性分子。
[0062]如上述，本發(fā)明的一些實(shí)施方式可以在橋的N-端具有TAD，含有或不含間插接頭，并且在橋的C-端具有CtD，含有或不含間插接頭。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以用針對(duì)其他靶標(biāo)分子的其他特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域取代CtD。
[0063]圖1所示的LCBTA是二價(jià)(雙特異性)分子，具有針對(duì)細(xì)胞靶標(biāo)的一價(jià)特異性和針對(duì)T-淋巴細(xì)胞上的CD3分子的另一價(jià)特異性。該LCBTA可以在哺乳動(dòng)物、真核或原核細(xì)胞中表達(dá)并純化，例如通過輕鏈特異性親和柱純化至均一(圖2)。SEC-HPLC(尺寸排阻HPLC)分析顯示大多數(shù)的經(jīng)純化雙特異性分子是單體形式(圖3)。然而，ScFv的取向、結(jié)構(gòu)域間接頭的長度、ScFv結(jié)構(gòu)域與橋連結(jié)構(gòu)域的相容性、和/或翻譯的效率可能影響雙特異性分子的翻譯和翻譯后加工，其可能導(dǎo)致多聚體形成的增加和/或改變的生物功能(I和J，圖 3,表 I)。
[0064]表1
[0065]

【權(quán)利要求】
1.一種雙特異性融合蛋白，所述蛋白包含: 對(duì)感興趣的第一靶標(biāo)具有特異性的第一靶向結(jié)構(gòu)域； 衍生自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的恒定區(qū)的橋連結(jié)構(gòu)域；和 對(duì)感興趣的第二靶標(biāo)具有特異性的第二靶向結(jié)構(gòu)域。
2.如權(quán)利要求1所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，還包含融合到所述橋連結(jié)構(gòu)域的N-端或C-端的接頭。
3.如權(quán)利要求1或2所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向結(jié)構(gòu)域融合到所述橋連結(jié)構(gòu)域或所述接頭上并且所述第二靶向結(jié)構(gòu)域融合到所述橋連結(jié)構(gòu)域或所述接頭上。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述橋連結(jié)構(gòu)域是K鏈，λ鏈，λ-5替代輕鏈，或模擬輕鏈恒定區(qū)的所述K鏈、所述λ鏈、所述λ-5替代輕鏈的突變體，或所述K鏈、所述λ鏈、所述λ-5替代輕鏈的衍生物。
6.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述接頭包含GGGGS序列。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第二靶向結(jié)構(gòu)域是T-淋巴細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述感興趣的第一靶標(biāo)是 CD20、Her2/neu 或 EpCAM。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向結(jié)構(gòu)域包含對(duì)所述感興趣的第一靶標(biāo)具有特異性的第一 ScFv，并且所述第二靶向結(jié)構(gòu)域包含對(duì)所述感興趣的第二靶標(biāo)具有特異性的第二 ScFv。
10.如權(quán)利要求9所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv和所述第二ScFv各包含人序列。
11.如權(quán)利要求9或10所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv包含對(duì)第一抗原具有結(jié)合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，并且所述第二 ScFv包含對(duì)第二抗原具有結(jié)合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH。
12.如權(quán)利要求11所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述接頭包含GGGGS序列。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104185642SQ201280064787
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月27日
【發(fā)明者】徐悠深, 許壽山, 張銘一, 駱正凱 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人生物技術(shù)開發(fā)中心, Dcb-美國有限責(zé)任公司