穩(wěn)定的胰高血糖素納米乳液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了含有胰高血糖素、油相和水相的水包油型納米乳液，其中胰高血糖素物理和化學穩(wěn)定以及該納米乳液適用于通過手動注射給藥或通過泵給藥，以治療低血糖癥。
【專利說明】穩(wěn)定的胰高血糖素納米乳液
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請請求2011年12月29日提交的美國臨時專利申請第61/581，610號的優(yōu)先 權(quán)，通過參考方式將其全部內(nèi)容并入本文中以用于所有目的。 發(fā)明領域
[0003] 本公開涉及穩(wěn)定的胰高血糖素納米乳液
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 胰高血糖素是由胰腺分泌的激素，其為由29個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為 3, 48?a。可獲得具有合適純度的能使其用作藥物的合成的和重組的胰高血糖素。胰高血 糖素不能口服吸收，因此通過注射給藥。
[0006] 醫(yī)學上，胰高血糖素用于治療低血糖癥（由低于正常的血糖濃度所表征）。低血糖 癥常見于1型糖尿病患者和胰島素使用者。輕度的低血糖癥導致焦慮、發(fā)汗、震顫、心悸、惡 心以及臉色蒼白。低血糖癥嚴重時，大腦缺少其需要的用于能量的葡萄糖，從而導致驚厥、 昏迷甚至死亡。嚴重的低血糖是危及生命的緊急情況，其需要立即的醫(yī)療干預，目前對嚴重 低血糖的治療標準是注射胰高血糖素。
[0007] 注射之后，胰高血糖素刺激肝臟將儲存的糖原轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖被釋放入血 液中。注射后5-20分鐘胰高血糖素開始起效。胰高血糖素在血液中的半衰期是3-6分鐘， 與胰島素類似。
[0008] 胰高血糖素的等電點為7. 1，因此在生理學pH(pH4-8)條件下其不溶于水，且在pH 中性水溶液中沉淀。在pH 3或更低的水溶液中，它開始時是可溶的，但在一小時內(nèi)聚集形 成凝膠。膠凝的胰高血糖素主要由β-折疊纖絲（β-sheet fibrils)組成，β-折疊纖絲由 肽的疏水性以及形成電勢的鏈間及鏈內(nèi)氫鍵所誘導（Chou, P.Y.et al. 1975. Biochemistry 14(11) :2536-2541)。聚集的胰高血糖素并不適于注射，因為凝膠會堵塞皮下注射器針頭， 而且如果靜脈內(nèi)給藥的話，會堵塞血管。為了減慢聚集過程，通常采用酸性（PH2-4)制劑以 在短時間內(nèi)將胰高血糖素保持在相對無聚集的狀態(tài)。這樣的酸性制劑必須在制備后立即注 射，因為胰高血糖素會聚集（用于注射的GlucaGen? Hypokit的產(chǎn)品說明書[胰高血糖 素 [rDNA 源])。
[0009] 除了物理不穩(wěn)定以外，胰高血糖素還會發(fā)生多種類型的化學降解。在水溶液中，它 迅速地降解，形成多種降解產(chǎn)物。已報道了至少16種胰高血糖素的降解產(chǎn)物，主要的降解 途徑為在9位、15位和21位的天冬氨酸裂解以及在3位、20位和24位的谷氨酰胺脫酰胺化 (Kirsch, L. E. , et al. 2000. International Journal of Pharmaceutics, 203:1 15-125)。 胰高血糖素的化學降解是快速和復雜的。例如，在需要將胰高血糖素溶解并防止其聚集的 酸性溶液（pH 2-4)中，37°C時，約5-70%的胰高血糖素在24小時內(nèi)分解為多種降解產(chǎn)物 (美國專利公開第2011/0097386號）。在水性環(huán)境中防止胰高血糖素降解是非常困難的， 目前還沒有開發(fā)出有效的方法來減慢胰高血糖素在水性環(huán)境中的天冬氨酸裂解和谷氨酰 胺脫酰胺化。這樣的不穩(wěn)定性限制了目前可用的胰高血糖素制劑在醫(yī)學上的應用。
[0010] 胰高血糖素用于治療嚴重的低血糖癥。為了避免胰高血糖素的化學不穩(wěn)定性，目 前可用的胰高血糖素藥物產(chǎn)品（例如，諾和諾德的GlucaGen Hypokit (鹽酸胰高血糖素）和 禮來公司的注射用的GluCag〇n(rDNA源））是凍干的，而且以兩部分試劑盒的形式提供。一 部分是裝有包含lmg(l個單位）胰高血糖素和49mg乳糖的干燥的凍干的團塊（"藥餅"） 的小瓶，另一部分是裝有包含12mg/mL甘油、水和鹽酸的稀釋液的注射器。凍干法提供了無 水環(huán)境，其通過防止天冬氨酸裂解、谷氨酰胺脫酰胺化和任何依賴于水的降解途徑，從而使 胰高血糖素保持穩(wěn)定。使用胰高血糖素試劑盒時，首先將稀釋液從注射器中注射入裝有藥 餅的小瓶中，接著輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解胰高血糖素。然后將重組的胰高血糖素溶液吸回至相同 的注射器內(nèi)，這樣就準備好用于注射了。此溶液的pH值約為2. 0-3. 5。重組的胰高血糖素 溶液不穩(wěn)定，制造商建議在重組后立即使用，并丟棄任何未使用的部分。因此，每一個胰高 血糖素試劑盒只能旨在一次性且即時使用。
[0011] 兩部分的胰高血糖素試劑盒的正確使用需要復雜的多步驟程序，這包括觀察試劑 盒的組件、去除蓋封、將稀釋液注射入小瓶內(nèi)、重組胰高血糖素藥餅、抽吸出胰高血糖素溶 液以及給予重組的溶液。如此麻煩的程序即便對于正常人而言也是難以實施的。對于那些 因低血糖癥而無行為能力的患者來說，這樣的操作任務可能是極度困難或者是不可行的。 在及時給予胰高血糖素救援療法方面的延誤可能導致死亡。可悲的是，6-10%的1型糖尿 病患者死亡是由于低血糖癥（Cryer, Ρ· E. 2008. Diabetes57 (12) : 3169-3176)。因此，穩(wěn)定的 即注型液體胰高血糖素制劑對于緊急情況的低血糖癥救治是高度急需的，并具有挽救生命 的潛力。
[0012] 胰島素泵在胰島素依賴糖尿病患者中已經(jīng)廣泛使用了超過十年時間。這些泵向 患者提供了連續(xù)流動的胰島素。餐后，使用者可以手動提高胰島素流速以暫時性地抵消餐 后血糖激增，然后調(diào)回至慢速基本維持流速。這些泵可以直接貼附在腹部表面，將胰島素 直接遞送至皮下插入的小針（例如來自Insulet Corp.的Omnipod)，或在極為貼近身體 處佩戴在外面，通過皮下植入的針頭經(jīng)細管遞送胰島素（例如OneTouch? Ping(Animas Corp.)，Revel?(Medtronic, Inc.)，以及其它產(chǎn)品）。皮下針可以在原位保持長達一周的時 間。
[0013] 環(huán)境條件制約了泵的使用，其要求胰島素和任何其它通過這樣的泵輸送的液體必 須在體溫或接近體溫的條件下（30-37°C )穩(wěn)定至少3-7天。新近開發(fā)的所謂人造胰腺裝 置整合了具有連續(xù)讀取患者血糖水平的能力的傳感器（所謂的連續(xù)的血糖監(jiān)測或"CGM"）， 并使用此信息將胰島素泵的輸出實時調(diào)節(jié)至必要水平。然而，當已經(jīng)泵送了過多的胰島素 時，目前型號的僅涉及胰島素的人造胰腺沒有有效的手段來迅速地抵消因已經(jīng)給藥的胰島 素而引起的血糖下降以及即將發(fā)生的低血糖癥。在正常人中，人體會通過釋放胰高血糖素 來自然地抵消快速的血糖降低，但在1型糖尿病患者中，由于減少的α細胞活性，這樣的功 能被削弱了。
[0014] 雙激素閉環(huán)泵或真正的人造胰腺是CGM-連接的胰島素泵，它能夠向患者輸送胰 島素和胰高血糖素。當血糖達到或預期將達到低血糖水平時，雙激素泵輸送胰高血糖素以 抵消低血糖。這種性能可以使患者的血糖在正常血糖水平的范圍內(nèi)高度地調(diào)節(jié)，如同非1 型糖尿病患者的胰腺那樣發(fā)揮作用。
[0015] 真正的雙激素泵需要在體溫或接近體溫的條件下穩(wěn)定至少3-7天的液體胰高血 糖素制劑。此外，制劑不能有刺激性，不能在植入輸送針的位置造成不舒服和疼痛。因此， 用于人造胰腺的胰高血糖素制劑必須不含有已知會產(chǎn)生刺激或溶血的組分，例如低pH物 質(zhì)或溶血卵磷脂。目前可用的兩部分的胰高血糖素試劑盒的制劑以及一些其它新出現(xiàn)的胰 高血糖素直接均不能滿足這些標準。
[0016] 胰高血糖素注射劑也用于在某些放射性造影過程中抑制胃腸蠕動。用于此應用的 胰高血糖素劑量小于兩部分急救盒中的lmg。因為兩部分胰高血糖素試劑盒只能一次性使 用，且未使用的部分要丟棄，因此當兩部分急救盒用于造影過程時，總會出現(xiàn)明顯的浪費。 因此，非常期望在液體形式時穩(wěn)定的且能以多劑量小瓶形式提供的新制劑。這樣的能夠采 用多劑量的液體制劑必須含有抗微生物防腐劑以防止微生物生長。
[0017] 總之，亟需新的胰高血糖素組合物，該組合物應是：
[0018] 1.液體的，并且準備好注射，以允許在救治嚴重的低血糖癥的患者時進行快速給 藥。
[0019] 2.在體溫或接近體溫的條件下（30_37°C )穩(wěn)定3-7天，以便能夠?qū)嶋H應用于雙激 素胰島素/胰高血糖素泵內(nèi)。
[0020] 3.在通常的儲存溫度（5或25°C )下穩(wěn)定1-2年，這是對商用藥品的儲存期限要 求。
[0021] 4.能夠從同一小瓶中提供多個劑量，以便在用于諸如胃腸道放射性檢查等低劑量 適用癥時減少浪費。
[0022] 在現(xiàn)有技術中尚未有已知的胰高血糖素組合物能夠滿足所有的以上四條要求。已 開發(fā)了大多數(shù)穩(wěn)定的胰高血糖素制劑以防止胰高血糖素聚集或凝膠化，即，解決胰高血糖 素在溶液狀態(tài)下的物理不穩(wěn)定性問題。雖然一些措施似乎已成功地減少了胰高血糖素的聚 集，但對于解決胰高血糖素的化學降解問題，進行了很少的嘗試。如果不將化學降解降低到 可接受的水平，任何胰高血糖素組合物在作為藥品時都將具有有限的應用。
[0023] 為了防止胰高血糖素聚集、凝膠化或沉淀，大多數(shù)已知的制劑應用水溶性表面活 性劑、洗滌劑或溶解胰高血糖素以形成澄清溶液的眾所周知的藥物增溶劑。這些嘗試包 括：使用高達六倍摩爾過量的陽離子或陰離子單價洗滌劑（英國專利第1202607號）；雞 蛋溶血卵憐脂（Schneider, A. B. and Edelhoch, H. J. 1972. Biol. Chem. 247:4986-4991); 溶血卵憐脂（Robinson，R.M.，et al. 1982. Biopolymers 21:1217-1228);在低 pH 下的陰 離子洗漆劑十二燒基硫酸鈉（SDS)膠束（Wu, C. -S. C. and Yang, J. Τ· 1978. Biochemistry 19:2117-2122)以及在中性 pH 下的 SDS 膠束出1'〇￥11，1^1?.311(1仇1讓1^(*，1(.1980· Biochim.Biophys. Acta 603:298-312);環(huán)糊精（Matilainen，L.，et al. 2008. J.Pharm Sci. 97 (7) :2720-9 和 Matilainen，L.et al. 2009. Eur.J.Pharm Sci. 36 (4-5) :412-20);溶 血磷脂（乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的1-?；?sn-甘油-3-磷酸酯）或其它洗滌劑，例 如十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)和SDS等等（歐洲專利第1061947號）；和溶血磷脂-蔗 組合（美國專利申請第2011/0097386號）。
[0024] 此前在解決胰高血糖素聚集問題的努力是基于使用某些水溶性表面活性劑或 洗滌劑。所使用的水溶性表面活性劑的一個流行實例是溶血磷脂或溶血卵磷脂。前綴 "lyso (溶血）"用于多種磷脂以表明在1-位或2-位不存在兩個脂肪酸之一（圖2)。卵磷 脂是天然存在的磷脂的混合物，同樣地，溶血卵磷脂是天然來源的溶血磷脂的混合物。
[0025] 與含有兩種脂肪酸（即，二?；┑牧字蚵蚜字煌字蚵蚜字ǔ２蝗?于水、是油質(zhì)的且沒有類似于洗滌劑的性質(zhì)），單脂肪酸（即單酰基）溶血磷脂是水溶性的， 并因為其具有洗滌劑性質(zhì)而溶解油性物質(zhì)。CTAB和SDS是含有單一長碳鏈（類似于單酰基 磷脂）的高度水溶性表面活性劑，一般用于家用洗滌劑。
[0026] 盡管在已知制劑中使用的水溶性表面活性劑的結(jié)構(gòu)多樣性，但均通過相同機制增 溶胰高血糖素。它們降低了水和胰高血糖素分子之間的疏水相互作用，破壞了聚集的胰高 血糖素或β-折疊（β-sheet)形式的胰高血糖素，并將胰高血糖素整合至由表面活性劑形 成的膠束內(nèi)。這樣的表面活性劑-增溶的胰高血糖素的最終組合物實際上是溶液。胰高血 糖素溶液組合物被認為是現(xiàn)有技術的理想目標，因為它被認為適用于胰高血糖素救治應用 或泵中，而諸如乳液的其它液體組合物被認為是不適合的。例如，Steiner，S.，等人（美國 專利公開第2011/0097386號）注意到：由于其被認為固有的高粘度，乳液對于應用于泵的 胰高血糖素而言并不是優(yōu)選的制劑。
[0027] 成問題的是，對于應用于可注射的藥物而言，水溶性表面活性劑的毒性或刺激性 通常太大。例如，很早就已知，由于其溶血性質(zhì)，溶血磷脂或溶血卵磷脂會使紅細胞細胞 溶角軍(Wilbur, K. M. , et al. 1943. Journal of Cellular and Comparative Physiology 22 (3) : 233-249)。因此，溶血磷脂或溶血卵磷脂的快速皮下注射會在注射部位引起局部組 織損傷和劇痛。在使用雙激素胰島素/胰高血糖素泵時可能會發(fā)生的延長時間地連續(xù)地皮 下輸注基于溶血卵磷脂的胰高血糖素，會使插針部位的疼痛和刺激加劇。此外，在本發(fā)明提 出時，溶血磷脂質(zhì)、溶血卵磷脂、SDS或CTAB都還未被FDA批準用于可皮下注射的藥物（即， 它們均未列在FDA的惰性成分目錄中）。此外，雖然現(xiàn)有技術中基于水溶性表面活性劑的組 合物有效地減少了胰高血糖素聚集，但這些手段均未表現(xiàn)出減緩胰高血糖素在溶液中的化 學降解。實際上，水溶性表面活性劑具有加速胰高血糖素降解的潛在性，因為在水溶液中， 單體或解聚集的胰高血糖素比聚集的或β-折疊形式的胰高血糖素更傾向于被離子或水 分子攻擊。
[0028] Kornfelt等人（美國專利第5, 652, 216號）描述了包含胰高血糖素和穩(wěn)定量的藥 物可接受的兩性電解質(zhì)的酸性藥物制劑（例如，pH 2. 8)，該兩性電解質(zhì)例如氨基酸或二肽 或其混合物。穩(wěn)定量被定義為〇.卜50微摩爾，等于14. 9ng/mL-7. 45 μ g/mL的氨基酸蛋氨 酸（MW = 149)。雖然Kornfelt等人的發(fā)明解決了胰高血糖素的物理和化學穩(wěn)定性，但當皮 下注射時，酸性組合物是非常具有刺激性，也不適用于泵應用，因為患者將在皮下針位置經(jīng) 受持續(xù)的長時間的疼痛。Kornfelt等人（同上）并未公開胰高血糖素的乳液組合物的任何 應用或兩性電解質(zhì)在胰高血糖素的乳液組合物中的任何應用。
[0029] 因此，仍然亟需可以在物理上和化學上穩(wěn)定胰高血糖素，同時不采用任何水溶性 的表面活性劑、酸性、毒性或刺激性試劑的液體組合物。本發(fā)明的令人驚訝的特征解決了這 個需求以及其它需求。
[0030] 發(fā)明概述
[0031] 在第一方面，本發(fā)明提供了水包油型納米乳液組合物，其包含胰高血糖素、油相和 水相，其中胰高血糖素不聚集，并在37°C下儲存3-7天后，保持不低于其濃度的75%，其中 油相是平均直徑小于約200nm的油滴形式。
[0032] 在第二方面，本發(fā)明提供了包含胰高血糖素、磷脂、中鏈油和糖的凍干的干組合 物，其中，在與水混合后，凍干的干組合物形成了本發(fā)明的納米乳液。
[0033] 在第三方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的納米乳液的方法。所述方法包括：混合胰 高血糖素和水相；加入磷脂和油；混合并均勻化以形成平均液滴大小為直徑不大于200nm 的納米乳液；使該納米乳液通過〇. 2微米的過濾器。制備本發(fā)明的干組合物的方法還包括 將納米乳液凍干。
[0034] 在第四方面，本發(fā)明提供了治療需要胰高血糖素的患者的方法。該方法包括對患 者給予本發(fā)明的組合物。
[0035] 本發(fā)明涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即，通過水包油型納米乳液中的油滴，使得胰高血糖 素可溶且保持在無聚集的狀態(tài)，其中油滴具有超過一定最小值的總的液滴表面積，或"臨界 的液滴表面積"。
[0036] 本發(fā)明涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，S卩，通過水包油型納米乳液中的油滴使得胰高血糖 素在化學上穩(wěn)定，其中超過50%的胰高血糖素與油滴相關，且在這樣的納米乳液中總的溶 解的離子濃度低于一定限度，或"臨界的離子含量限度"。
[0037] 在一個實施方案中，納米乳液并不含有任何添加的有機溶劑、溶血卵磷脂、溶血磷 月旨、水溶性表面活性劑或環(huán)糊精，但仍能溶解胰高血糖素，并使其保持在無聚集的狀態(tài)。由 于油滴不溶于水且完全不具有表面活性劑或清潔劑的性質(zhì)，因此由納米乳液組合物提供的 溶解或解聚集機制不同于現(xiàn)有技術中公開的任何其它組合物，后者依賴于溶劑、溶血卵磷 月旨、溶血磷脂、水溶性表面活性劑或環(huán)糊精以溶解/解聚集胰高血糖素。因此，所述納米乳 液組合物是出乎意料之外的，且根據(jù)先前已知的系統(tǒng)和理論是無法預測的。
[0038] 附圖的簡要說明
[0039] 圖1是胰高血糖素的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0040] 圖2顯示了磷脂和溶血磷脂的結(jié)構(gòu)。R1或R2表示脂肪酸的烷基鏈，分別地，X為 磷脂酰膽堿（PC)中的膽堿、磷脂酰甘油（PG)中的甘油、磷脂酰乙醇胺（PE)中的乙醇胺或 磷脂酰絲氨酸（PS)中的絲氨酸。卵磷脂是PC與其它磷脂的混合物。PC或含有不少于75 重量％的PC的卵磷脂是用于本發(fā)明的納米乳液中的優(yōu)選的磷脂。下面還顯示了磷脂酰膽 堿（二肉豆蘧?；?磷脂酰膽堿或DMPC)和溶血磷脂酰膽堿（溶血肉豆蘧酰基-磷脂酰膽 堿或LMPC)的實例，它們是美國專利申請2011/0097386中的優(yōu)選的增溶劑。
[0041] 圖3顯示了新鮮制備的（圖版1)和降解的胰高血糖素樣品（圖版2)的典型的色 譜圖。此分析方法可以分離和量化胰高血糖素的主要降解產(chǎn)物，即，多種天冬氨酸裂解和谷 氨酰胺脫酰胺化降解產(chǎn)物和氧化產(chǎn)物（圖版2)。圖3圖版3比較了在25°C儲存2個月后， 本發(fā)明的納米乳液（F-22)與來自禮來公司的注射用的Glucagon (rDNA源）中存在的降解 產(chǎn)物的程度。
[0042] 圖4為在40°C時、在不同的pH值條件下，本發(fā)明的納米乳液中胰高血糖素降解的 速率分布圖。
[0043] 圖5為描述本發(fā)明的胰高血糖素納米乳液（F-22)的半透明外觀的照片。
[0044] 圖6顯示了凍干的胰高血糖素納米乳液（F-22)的外觀，以及再生的液體納米乳液 (向所述凍干的納米乳液中加入水后）的半透明外觀。
[0045] 圖7顯示了與禮來公司的注射用的Glucagon (rDNA源）相比，胰高血糖素納米乳 液（F-22)在小鼠中的藥效學特征譜（見實施例15)。
[0046] 發(fā)明的詳細說明
[0047] I.概述
[0048] 本發(fā)明涉及液體的即注型組合物，其中胰高血糖素在物理上和化學上均穩(wěn)定。特 別地，本發(fā)明公開了水包油型納米乳液組合物，其包含胰高血糖素，基本上由胰高血糖素組 成，或由胰高血糖素組成，即
[0049] (a)基本上不含有膠凝的或沉淀的胰高血糖素的液體，
[0050] (b) pH中性或微酸性，
[0051] (c)粘度低，易通過細針注射，
[0052] (d)不含任何水溶性表面活性劑，包括溶血磷脂或溶血卵磷脂，
[0053] (e)在30_37°C下能物理和化學穩(wěn)定至少3-7天，
[0054] (f)在普通的儲存溫度（例如5或25°C )下物理和化學穩(wěn)定至少1年，以及
[0055] (g)能夠從同一小瓶中提供多個劑量。
[0056] II.定義
[0057] 本文所用的多個術語具有如下定義：
[0058] 本文所用的"約"描述了目標值上下浮動10%的數(shù)量范圍。例如，"約100"意為在 90和110之間的任何數(shù)值，包括90和110。
[0059] 本文中所用的短語"可接受的可注射性標準"是液體制劑通過特定的注射器/針 頭結(jié)構(gòu)的可注射性的量化定義。在本發(fā)明中，可接受的可注射性標準是用1.5磅的力將特 定的液體以約〇. 9cc/min的速度從配備有28G 1/2英寸針頭的3mm I. D.胰島素注射器中 (例如，U_100 3/1 Occ Insulin Syringe(膜島素注射器）（Becton, Dickinson and Co.); 28G 1/2針頭（Becton, Dickinson and Co·))擠出。此標準代表了人手可以舒適地使用注 射器的一般的力或可以由醫(yī)療器械泵進行遞送的一般的力以及所得到的擠出速率。
[0060] 本文所用的"聚集的胰高血糖素"或"胰高血糖素聚集"意為在含有胰高血糖素的 液體組合物中存在可見的胰高血糖素顆粒、纖維或凝膠化。胰高血糖素聚集物、纖維或凝膠 無法通過0.2-微米的濾膜。
[0061] 本文所用的"抗微生物防腐劑"是指可加入液體組合物中以抑制細菌和真菌的生 長的藥物添加劑。本發(fā)明中可用的抗微生物防腐劑包括，但不限于，甲酚、苯酚、苯甲醇、乙 醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸酯類、咪唑烷基脲、苯扎氯銨、乙二胺四乙酸（EDTA)或其鹽、或其 組合。
[0062] "抗氧化劑"是指可加入液體組合物中以防止活性藥物或非活性組分氧化的藥物 添加劑?？寡趸瘎┌ㄟ€原劑、金屬離子螯合劑和惰性氣體。
[0063] 術語"水相"指含有水溶性添加劑的水溶液，所述水溶性添加劑例如在乳液中的pH 調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、抗氧化劑、抗微生物防腐劑、張性調(diào)節(jié)劑/滲透壓調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的乳液 中，水相是油滴懸浮于其中的連續(xù)相，并被稱為分散相。通過超濾方法可將水相與油相分 離，這允許用其它的具有更合適組成的水溶液交換水相，例如用具有更低離子含量的溶液 交換（如實施例6中）。在某些實施方案中，優(yōu)選的水相含有最小量的非肽物質(zhì)和可溶于水 的各種離子物質(zhì)。
[0064] 本文所用的"體溫或接近體溫"是30°C至40°C之間。
[0065] 本文所用的"化學穩(wěn)定性"或"化學上穩(wěn)定的"意為組合物的狀態(tài)，其在2_8°C保存 1年及37°C保存3-7天后，保留的胰高血糖素含量不少于最初胰高血糖素含量的75%。 [0066] 本文所用的"臨界液滴表面積"是指要求能溶解并穩(wěn)定1毫克的胰高血糖素的本 發(fā)明的納米乳液中最小的總的液滴表面積。根據(jù)本發(fā)明的納米乳液，在總的液滴表面積中， 臨界液滴表面積被估計為約3. OX 106mm2(實施例1)。例如，要制備胰高血糖素濃度為lmg/ mL的本發(fā)明的納米乳液，每毫升這樣的納米乳液必須含有約3. OX 106mm2的總的液滴表面 積。在另一個實例中，要制備胰高血糖素濃度為0. 5mg/mL的本發(fā)明的納米乳液，每毫升這 樣的納米乳液必須含有至少約1. 5X 106mm2的總的液滴表面積。為了達到臨界液滴表面積， 納米乳液必須含有足夠量的油相，且油相必須縮小到足夠小的油滴。在某些實施方案中，油 相濃度為約20%，對于每lmg所溶解的胰高血糖素，平均液滴直徑不大于200nm。在另一實 施方案中，油相濃度為約10 %至20%，對于每lmg所溶解的胰高血糖素，平均液滴直徑為 100nm至200nm。在優(yōu)選的實施方案中，油相濃度為約15%，對于每lmg所溶解的胰高血糖 素，平均液滴直徑小于150nm。
[0067] 本文所用的"臨界離子含量限度"是本發(fā)明的納米乳液中所容許的非肽和水溶性 離子的最大量，其中胰高血糖素保持化學和物理穩(wěn)定。如果高于臨界離子含量限度，胰高血 糖素的化學和物理穩(wěn)定性可能受到不利影響。乳液中的全部的非肽和水溶性離子濃度可以 通過測定電導率來估計。本發(fā)明的納米乳液的臨界離子含量限度的值被定量地定義為相當 于在相同的測量條件下測定的〇. 12%氯化鈉水溶液的電導率。
[0068] 本文所用的"清潔劑"是可溶于水的表面活性劑，可用于用水溶解和清除油性物 質(zhì)。
[0069] 本文所用的"電導率"指物質(zhì)傳導電流的能力的測量值。在水中，電導率通過溶解 的離子介導，并與總的溶解的離子含量成正比。胰高血糖素乳液或溶液的電導率通過使用 電導率儀測定，以μ Siemens/cm或μ S/cm為單位（實施例6)。電導率測量值高度地取決 于溫度、單獨的電導率儀和樣品容器。因此，必須使用相同的測定儀-容器配置并在相同的 溫度下進行對比測量。對于電導率的測量，使用具有已知NaCl濃度的標準溶液校準電導率 儀。然后使用同樣的電導率儀-容器配置測定乳液中所溶解的離子濃度，并以氯化鈉溶液 的濃度單位表示（例如，在水中的NaCl % w/v)。
[0070] 本文所用的"乳液"是不能混溶的油相和水相的混合物。典型的乳液是光學不透 明的，并具有有限的穩(wěn)定性，這一點與本發(fā)明的更加透明和穩(wěn)定的納米乳液形成對比。
[0071] 本文所用的"可過濾的"意為液體通過具有一定孔徑（例如0.2微米）的濾膜的 能力。
[0072] 本文所用的術語"細針"包括小直徑、中空的皮下注射器針頭，其與注射器或泵一 起使用以用于皮下、靜脈內(nèi)，或其它類型的注射。針的外直徑由針規(guī)系統(tǒng)表示。根據(jù)Stubs 針規(guī)系統(tǒng)，普通的醫(yī)用皮下注射器針頭范圍從7規(guī)格（G)(最大）到33規(guī)格G (最小）。因 此，本文所用的"細針"包括從21G-33G的針，優(yōu)選25G-31G，最優(yōu)選27G-31G。
[0073] 本文所用的術語"可注射的"意為滿足上述定義的可接受的可注射性標準的液體。
[0074] 本文所用的"胰高血糖素"指全長肽，胰高血糖素，其成分式為C153H225N 43049S，分子 量3, 483Da，由含有29個氨基酸殘基的單鏈多肽組成。胰高血糖素的氨基酸序列如圖1所 /_J、1 〇
[0075] 本文所用的"卵磷脂"是來源于天然來源的磷脂的混合物?？勺⑸涞穆蚜字?來源于蛋或大豆的卵磷脂，其已經(jīng)過純化，基本上無刺激性物質(zhì)、致敏性物質(zhì)、致炎因子或 導致其它有害生物反應的物質(zhì)。對于本發(fā)明，優(yōu)選的卵磷脂包括那些含有超過75%磷脂酰 膽堿（PC)的卵磷脂，其不溶于水，且基本不含溶血卵磷脂（即，含有不超過1-4重量％的 溶血卵磷脂）。優(yōu)選的卵磷脂的實例包括但不限于商品名為LIPOID S 75、LIPOID S 100、 LIPOID E 80，以及 Phospholipon 90G 的卵磷脂產(chǎn)品。
[0076] 本文所用的"溶血磷脂"包括溶血磷脂酰膽堿，如下所述，其是一類源自磷脂并由 磷脂分子的部分水解、去除一個脂肪酸基團所得的化合物（圖2)。溶血磷脂是天然存在的， 可以通過合成得到。與磷脂不同，溶血磷脂具有水溶性表面活性劑特征，能夠溶解多種親 脂性物質(zhì)，包括神經(jīng)髓磷脂和細胞膜。已知溶血磷脂會導致溶血，具有這樣的生物活性，對 于注射來說是不安全的。示例性的合成溶血磷脂包括溶血肉豆蘧酰基磷脂酰膽堿（LMPC)、 肉豆蘧酰基溶血磷脂酰膽堿（LPCM)、溶血棕櫚?；字Ｄ憠A（LPPC)，如美國專利申請 2011/0097386和歐洲專利1061947所公開的。
[0077] 本文所用的"溶血卵磷脂"也被稱為"溶血磷脂酰膽堿"，是溶血磷脂的一個亞類， 其由卵磷脂部分水解并去除一個脂肪酸基團而形成。水解通常是磷脂酶A2的酶作用的結(jié) 果。溶血卵磷脂的水溶性、清潔劑性質(zhì)和溶血性質(zhì)多與溶血磷脂相同。
[0078] 根據(jù)本發(fā)明，溶血磷脂（包括溶血卵磷脂）是不合需要的，必須避免出現(xiàn)在胰高血 糖素的可注射的乳液組合物中。這樣的水溶性表面活性劑可以溶解乳液油滴，并破壞胰高 血糖素與油滴的締合，導致降低胰高血糖素物理和化學穩(wěn)定性。此外，還知道溶血磷脂和溶 血卵磷脂是溶血的，如通過注射給予時對人具有毒性。
[0079] 本文所用的"平均液滴表面積"是液滴的表面積，其通過測定乳液中液滴的平均半 徑，使用球體的表面積公式經(jīng)計算得到：A = 4 π r2,其中A是平均液滴表面積，r是乳液中 油滴的平均半徑，其通常通過使用動態(tài)光散射技術而測定。
[0080] 本文所用的"平均液滴體積"是液滴的體積，其通過測定乳液中液滴的平均半徑， 使用球體的體積公式經(jīng)計算得到：V = (4/3) π r3,其中V是平均液體體積，r是油滴的平均 半徑，其通常通過使用動態(tài)光散射技術而測定。
[0081] 本文所用的油滴的"平均半徑"或"平均直徑"是通過使用動態(tài)光散射法或激光衍 射法的乳液的測量值。通常平均半徑/直徑的值用納米表示。
[0082] 本文所用的"中鏈油"也稱為"中鏈甘油三酯"（"MCTs"），是甘油的中鏈（6至12 個碳）脂肪酸酯。MCT可以源自天然來源，也可以是經(jīng)合成制備的。優(yōu)選的MCT的實例包括 商品名為 CR0DAM0L GTCC-PN，Miglyol 812 或 Neobees M-5 的 MCT 產(chǎn)品。
[0083] 術語"金屬離子螯合劑或螯合劑"包括可安全用于可注射產(chǎn)品的金屬離子螯合劑。 金屬離子螯合劑通過結(jié)合金屬離子而起作用，從而降低該金屬離子對氧化、水解或其它降 解反應的催化作用。可用于本發(fā)明的金屬螯合劑可以包括乙二胺四乙酸（EDTA，乙二胺四乙 酸鹽）、甘氨酸和檸檬酸及其各自的鹽或其混合物。
[0084] 本文所用的"納米乳液"是具有總的液滴表面積超過臨界液滴表面積的水包油型 乳液?？偟囊旱伪砻娣e與油相的濃度成正比，并與液滴大小成反比。為了超出臨界液滴表 面積，納米乳液必須含有足夠高濃度的油相，同時液滴的尺寸足夠小。
[0085] 本文所用的"中性pH值"是pH值范圍為4至8,優(yōu)選5. 2至7. 2。"微酸性"意為 pH范圍從約2. 5至4,優(yōu)選2. 7至3. 5。
[0086] 本文所用的"油"指單一的甘油三酯或甘油三酯的混合物（例如：三酰基甘油或三 ?；视王ィ湓隗w溫，例如約37°C下是液體，用于可注射的藥物時是藥理學可接受的。 甘油三酯是源自甘油和三個脂肪酯的酯。"油"可以源自天然來源或經(jīng)合成所得。實例包括 植物油、動物油、天然來源油中的中鏈油，或三辛酸甘油酯、三油酸甘油酯，或合成油中的三 肉豆蘧酸甘油酯。對于本發(fā)明，優(yōu)選的油是植物油，更優(yōu)選的油是中鏈油。
[0087] 本文所用的"水包油型乳液"是油相以小滴形式（分散相）懸浮或分散在水相（連 續(xù)相）中的乳液。
[0088] 本文所用的"油相"指乳液中的與水不混溶的相，包含油和磷脂。油相也可以包含 其它親脂性添加劑，包括抗氧化劑和抗微生物防腐劑等，以及如本發(fā)明的納米乳液中的胰 高血糖素。在某些實施方案中，油相以大小為直徑小于200nm、優(yōu)選小于150nm、最優(yōu)選小于 100nm的小油滴形式存在。
[0089] 本文所用的"滲透壓"是以每千克溶液中溶質(zhì)的毫滲摩爾表示的溶液的濃度。本 發(fā)明的納米乳液的優(yōu)選的滲透壓是280-700m0sm/kg。
[0090] 本文所用的"乳液的水相中胰高血糖素的百分比"是水相中胰高血糖素量占乳液 中胰高血糖素總量的比例的度量值，即，乳液的水相中胰高血糖素的百分比是水相中胰高 血糖素的量除以乳液中胰高血糖素的量X 1〇〇的值。乳液的水相中胰高血糖素的量可以通 過以下方法測定：首先通過超濾將水相與油相分離，接著用HPLC法分析所分離的水相中的 胰高血糖素的濃度（實施例2和10)。
[0091] 本文所用的術語"pH緩沖劑"或"pH緩沖鹽"包括可電離的pH緩沖鹽，例如磷酸 鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸氫鹽等，以及反離子，例如銨離子、鈉離子或鉀離子等。
[0092] 本文所用的"磷脂"指任何的具有兩個脂肪酸和一個共價連接至小的有機分子 (例如膽堿、乙醇胺、甘油、絲氨酸或無（在圖2中標注為"X"部分）的磷酸根離子的甘油 的三酯。因此，示例性磷脂包括磷脂酰膽堿（PC)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰甘油（PG)、 磷脂酰絲氨酸（PS)，以及磷脂酸（PA)。脂肪酸通常具有約10至約18個碳原子，具有多種 飽和度。對于本發(fā)明，"磷脂"可以指單一磷脂種類或多種磷脂的混合物。本發(fā)明中可用 的磷脂可得自天然來源或通過合成制得。天然來源的磷脂指卵磷脂。合成的磷脂的實例 包括：1，2-二肉豆蘧?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿（DMPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油 基-3-磷酸乙醇胺（DSPE)、1，2-二肉豆蘧?；?sn-甘油基-3-磷酸甘油，鈉鹽（DMPG，Na) 以及1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸-L-絲氨酸，鈉鹽（DPPS，Na)。在某些實施方 案中，用于本發(fā)明的優(yōu)選的合成磷脂是水溶性的磷脂酰膽堿，例如1，2-二月桂酰基-sn-甘 油基-3-磷酸膽堿（DLPC)、1，2-二肉豆蘧?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿（DMPC)、1，2-二 棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿（DPPC)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿 (DSPC)、1-棕櫚酰基-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿（P0PC)及其混合物。
[0093] 本文所用的"物理穩(wěn)定性"或"物理穩(wěn)定的"是關于含有胰高血糖素的液體組合物， 其中胰高血糖素的凝膠化、纖維，或沉淀基本不存在，并且該組合物符合"可接受的可注射 性標準"或該組合物可以通過0. 2或0. 45微米過濾器過濾。
[0094] 本文所用的可用于本發(fā)明的"還原劑"包括，但不限于，抗壞血酸、抗壞血酸鹽、抗 壞血酸棕櫚酸酯、偏亞硫酸氫鹽、沒食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚、丁羥甲苯、生育酚、蛋氨 酸、檸檬酸、檸檬酸鹽、還原性糖、例如葡萄糖、果糖、甘油醛、半乳糖、乳糖、麥芽糖、其鹽或 其混合物。
[0095] 本文所用的術語"基本沒有"意為少于組合物總重量的1%。
[0096] 本文所用的"糖"指可被加入液體組合物中以調(diào)節(jié)本發(fā)明的乳液的滲透壓或張性 的碳水化合物添加劑?？捎糜诒景l(fā)明的糖包括，但不限于單糖、二糖、多糖、丙二醇、聚乙二 醇、甘油、多元醇、糊精、環(huán)糊精、淀粉、纖維素和纖維素衍生物、或其混合物。例如，在某些實 施方案中，糖是甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖、果糖、木糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、葡 萄糖、葡聚糖，或其混合物。在其它實施方案中，優(yōu)選的糖是甘油或蔗糖。
[0097] 本文所用的"溶液"指澄清、均勻的只由一相組成的混合物。
[0098] 本文所用的"表面活性劑"指降低液體的表面張力或兩種液體之間的界面張力的 化合物。
[0099] 本文所用的術語"張性調(diào)節(jié)劑/滲透壓調(diào)節(jié)劑"包括可被加入至可注射的藥理活 性劑中并能用于調(diào)節(jié)滲透壓的藥物添加劑。本發(fā)明中可用的張性調(diào)節(jié)劑/滲透壓調(diào)節(jié)劑包 括，但不限于乳糖、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘油、甘露醇，及其混合物。
[0100] 本文所用的"總的液滴表面積"是指在一定體積的納米乳液中所有油滴的總表面 積。此數(shù)字是通過平均液滴表面積乘以油滴總數(shù)而估算得到的。
[0101] 本文所用的乳液中的"油滴總數(shù)"是通過總的油相體積除以乳液的平均液滴體積 而計算得到的。
[0102] 本文所用的"超濾"（UF)指各種膜過濾技術，其中靜水壓力迫使液體通過半透膜。 懸浮的固體、油滴或高分子量或大體積的溶質(zhì)被保留，而水和低分子量的溶質(zhì)（例如水溶 性離子）通過膜。此分離方法通常用于工業(yè)和研究，以純化和濃縮高分子溶液，特別是蛋白 質(zhì)溶液。超濾與滲透過濾、微濾、納濾或氣體分離并無本質(zhì)上的不同，區(qū)別只在于其保留的 分子的大小。以切向流或死端模式使用超濾。超濾可用于保留胰高血糖素-締合的油滴， 同時洗滌水相以除去不合需要的離子以提高胰高血糖素的化學穩(wěn)定性。
[0103] 本文所用的"植物油"指源自植物種子或堅果的油。示例性植物油包括，但不限于 杏仁油、琉璃苣油、黑加侖籽油、玉米油、紅花油、大豆油、芝麻油、棉籽油、花生油、橄欖油、 菜籽油、椰子油、棕櫚油、芥花籽油等等。植物油通常含有長鏈甘油三酯，它由三個脂肪酸 (一般約14至約22個碳原子長度，且根據(jù)油的來源不同，具有含不同數(shù)目和位置的不飽和 鍵的鏈）與甘油上的三個羥基基團形成酯鍵而得到。在某些實施方案中，高純度（也稱為 "超精煉"）的植物油通常用于確保藥物級別的水包油型乳液的安全性和穩(wěn)定性。
[0104] 本文所用的"水可溶的/水溶性"指固體或液體溶質(zhì)可溶于水中以形成均質(zhì)溶液， 達到在每十重量份的水中含有不少于一重量份的溶質(zhì)的程度。
[0105] 本文所用的"水溶性表面活性劑"是通過降低水和其它液體之間或水和固體之間 的界面張力，幫助溶解化合物以形成澄清的單一相水溶液的化合物。例如，溶血卵磷脂是水 溶性表面活性劑，而卵磷脂不是水溶性表面活性劑。
[0106] 本文所用的"切向流過濾"，也被稱為"錯流過濾"，不同于死端過濾，其中進料通過 半透膜，固體或乳液液滴被截留在過濾器中而濾液、例如乳液的水相，在另一端被釋放。在 切向流過濾中，進料流的主要部分切向地流經(jīng)過濾器的表面，而不是垂直地進入過濾器。切 向流過濾的主要優(yōu)勢在于濾餅（可能會堵塞住過濾器）在過濾過程中基本上被切向流洗掉 了，從而提高了過濾單元可以操作的時間長度。切向流過濾有時與"滲透過濾"互換使用。 半透膜是允許特定的小分子或離子經(jīng)擴散或強制擴散通過該膜，同時保留大小大于膜孔徑 大小的固體或油滴（例如在103-106道爾頓之間）的膜。在某些實施方案中，用于本發(fā)明的 乳液的優(yōu)選的切向流過濾膜孔徑大小在3K到100K MWCO(截留分子量）之間。
[0107] III.發(fā)明的組合物
[0108] 本發(fā)明提供了包含胰高血糖素、油相和水相的水包油型納米乳液組合物。在一些 實施方案中，該納米乳液組合物包含胰高血糖素、水相和油相，其中油相以平均直徑小于 200nm的納米大小的液滴形式存在。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含胰高血糖素、油 相和水相的水包油型納米乳液組合物，其中胰高血糖素沒有聚集，在37°C儲存3-7天后保 持不小于其濃度的75%，且其中油相以平均直徑小于約200nm的油滴形式存在。
[0109] 所述納米乳液可以含有任意適合量的胰高血糖素。一般來說，納米乳液含有的胰 高血糖素的量為約〇. 01mg/mL至約2mg/mL。例如，本發(fā)明的納米乳液組合物可含有0. 1至 1. 5mg/mL胰高血糖素，或0. 5至1. 5mg/mL胰高血糖素。納米乳液組合物可含有約0. 5mg/ mL、約 0. 6mg/mL、約 0. 7mg/mL、約 0. 8mg/mL、約 0. 9mg/mL、約 1. Omg/mL、約 1. lmg/mL、約 1. 2mg/mL、約 1. 3mg/mL、約 1. 4mg/mL 以及約 1. 5mg/mL 胰高血糖素。
[0110] 在一些實施方案中，本發(fā)明的納米乳液組合物含有6. 1-29重量％，更優(yōu)選10重 量％至20重量％的油相。例如，所述納米乳液可含有約10重量％、約11重量％、約12重 量％、約13重量％、約14重量％、約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、 約19重量％，或約20重量％的油相。
[0111] 在一些實施方案中，納米乳液組合物含有水相和油相，其中油相含有胰高血糖素、 油和磷脂。在一些實施方案中，油相含有磷脂和油。
[0112] 在一些實施方案中，納米乳液組合物包括水相中的胰高血糖素、油和磷脂，其中胰 高血糖素保持無聚集的、無膠凝的或無沉淀的形式。
[0113] 納米乳液可含有任何適合量的油。一般來說，納米乳液含有的油的量為約0. 1重 量％至約10重量％。在一些實施方案中，納米乳液組合物含有0. 25重量％至7. 5重量％ 的油，更優(yōu)選1重量％至5重量％的油。例如，納米乳液可以含有約0. 5重量％、約0. 75重 量％、約1.0重量％、約1.25重量％、約1.5重量％、約1.75重量％、約2重量％、約2. 5重 量％、約3重量％、約4重量％或約5重量％的油或油的混合物。
[0114] 一般來說，油相中的油是甘油三酯（例如三?；视突蛉；视王ィ?，單獨的 或組合的，在體溫下其是液體，且對于用于可注射的藥物而言是藥理學可接受的。油可來 源于天然來源或經(jīng)合成所得。油的實例包括，但不限于植物油、動物油、天然來源的油中的 中鏈油，或三辛酸甘油酯、三油酸甘油酯，或合成油中的三肉豆蘧酸甘油酯。植物油的實例 包括，但不限于杏仁油、琉璃苣油、黑加侖籽油、玉米油、紅花油、大豆油、芝麻油、棉籽油、 花生油、橄欖油、菜籽油、椰子油、棕櫚油、芥花籽油等等。"中鏈油"也稱為"中鏈甘油三 酯"（"MCTs"），其是甘油的中鏈（6至12個碳）脂肪酸酯。中鏈甘油三酯可源自天然來源 或經(jīng)合成得到。
[0115] 在一些實施方案中，油是植物油，例如芝麻油、蓖麻油、玉米油或大豆油。在一些實 施方案中，油是合成的油。在一些實施方案中，油是中鏈油。本發(fā)明的一些實施方案提供了 納米乳液，其中油是中鏈油、植物油、或其組合。
[0116] 納米乳液可含有任何合適量的磷脂。在一些實施方案中，本發(fā)明的納米乳液組合 物含有5重量％至20重量％，更優(yōu)選7. 5重量％至12. 5重量％的磷脂。例如，納米乳液可 含有約7. 5重量％、約8重量％、約8. 5重量％、約9重量％、約9. 5重量％、約10重量％、 約10. 5重量％、約11重量％、約11. 5重量％、約12重量％或約12. 5重量％的磷脂或磷脂 的混合物。本發(fā)明的一些實施方案提供了納米乳液，其中油相為納米乳液的約10重量％至 20重量％，且磷脂濃度大于油濃度。
[0117] 任何合適的磷脂均可用于本發(fā)明的納米乳液中。合適的磷脂包括磷脂酰膽堿 (PC)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰甘油（PG)、磷脂酰絲氨酸（PS)以及磷脂酸（PA)?？捎糜?本發(fā)明的磷脂可從天然來源中得到或經(jīng)合成制成。天然來源的磷脂指卵磷脂。合成的磷脂 包括，但不限于 DMPC、DSPE、DMPG, Na、DPPS, Na、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC 和 P0PC，如本文所描 述。
[0118] 在一些實施方案中，磷脂是卵磷脂。在一些實施方案中，磷脂是蛋卵磷脂或大豆卵 磷脂。在一些實施方案中，納米乳液含有水相和油相，其中油相含有胰高血糖素、中鏈油和 來源于蛋或大豆的卵磷脂。本發(fā)明的一些實施方案提供了用蛋卵磷脂或大豆卵磷脂制成的 納米乳液，該蛋卵磷脂或大豆卵磷脂具有的殘留的溶血卵磷脂含量小于卵磷脂重量的5%。
[0119] 一般來說，本發(fā)明的納米乳液含有約70重量％至約95重量％的量的水相。在一 些實施方案中，本發(fā)明的納米乳液組合物含有71-92重量％，更優(yōu)選80重量％至90重量％ 的水相。例如，納米乳液可包括約80重量％、約81重量％、約82重量％、約83重量％、約 84重量％、約85重量％、約86重量％、約87重量％、約88重量％、約89重量％，或約90重 量％的水相。
[0120] 在一些實施方案中，每毫升納米乳液組合物含有0.5_2mg胰高血糖素、5-100mg 油、50-200mg 磷脂和 700-900mg 水相。
[0121] 本發(fā)明的納米乳液可具有任意合適的pH值。一般來說，本發(fā)明的納米乳液的pH 值在約2. 7至約8之間。更優(yōu)選地，pH值在約2. 7至約7. 2之間。例如，pH值可為約2. 7、 2· 8、2· 9、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 7、3· 9、4· 0、4· 2、4· 4、4· 6、4· 8、5· 0、5· 2、5· 4、5· 6、 5. 8、6. 0、6. 2,、6. 4、6. 6、6. 8、7. 0或7. 2。納米乳液的pH值可以通過混合組分并加入酸或 堿來實現(xiàn)，和/或通過使用超濾、透析、凝膠過濾或其它合適的技術用具有預期pH值的其它 水溶液交換納米乳液的水相來實現(xiàn)。本發(fā)明的一些實施方案提供了納米乳液，其中pH值在 約2. 7至約7. 5之間。在一些實施方案中，納米乳液具有中性pH值。
[0122] 令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)胰高血糖素的穩(wěn)定依賴于納米乳液中油滴的大小和表面積。不 希望受任何特定理論的束縛，認為納米乳液組合物的每一液滴是由具有表面覆層的油芯組 成，該表面覆層富含磷脂，磷脂是雙極性基分子，由親水的"頭部"和親脂性的"尾部"組成 (圖2)。認為在油滴表面上的磷脂通過提供能使胰高血糖素以非聚集形式存在的環(huán)境從而 溶解乳液中的胰高血糖素。胰高血糖素是不可溶的，基本沒有在水相中發(fā)現(xiàn)（如實施例10 中所示）且在純油中也不溶，因此，胰高血糖素不太可能優(yōu)先分布至油滴芯中。而是認為胰 高血糖素分子存在于油滴表面的磷脂層中。因此，油滴可能用胰高血糖素分子與磷脂的層 包裹。由于這種肽在熱力學上被油相和水相所排斥，因而油滴的表面成為了胰高血糖素存 在的默認位置。通過定位在油滴表面，胰高血糖素分子較少地暴露于疏水性和氫鍵效應，否 則疏水性和氫鍵效應會促使β -折疊形成和/或聚集，這樣會使胰高血糖素從乳液中沉淀 出來。
[0123] 因此，總的液滴表面積成為本發(fā)明的納米乳液的重要組成特征?？偟囊旱伪砻娣e 可通過液滴總數(shù)乘以乳液中單獨液滴的平均表面積而估算得到。當油相體積固定時，總的 液滴表面積與液滴大小成反比，即，液滴越小，總的液滴表面積越大。
[0124] 本發(fā)明的納米乳液中液滴總數(shù)可以通過總的油相體積除以液滴的平均體積而計 算得到。當油相體積固定時，液滴總數(shù)也與液滴大小成反比，即，液滴越小，液滴數(shù)越大。下 面的表1說明了當油相濃度固定時，總的液滴表面積和液滴數(shù)與平均液滴大小之間的關 系。
[0125] 表 1
[0126]
【權(quán)利要求】
1. 水包油型納米乳液組合物，其包含： 胰高血糖素、 油相，和 水相， 其中在37°C下儲存3-7天后，所述胰高血糖素不聚集并保持不少于其濃度的75%，并 且其中所述油相是以平均直徑小于約200nm的油滴形式存在。
2. 如權(quán)利要求1所述的納米乳液，其中所述油相包含磷脂和油。
3. 如權(quán)利要求2所述的納米乳液，其中所述油相為所述納米乳液的約10重量％至20 重量％，以及所述磷脂濃度不小于所述油濃度。
4. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中不少于50%的所述胰高血 糖素與所述油相非共價締合。
5. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中總的液滴表面積超過了對于 所述納米乳液中含有的每毫克胰高血糖素的臨界液滴表面積。
6. 如權(quán)利要求5中所述的納米乳液，其中所述臨界液滴表面積是3. OX 106mm2。
7. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中離子含量低于臨界離子含量 限度，當通過電導率測量時，所述臨界離子含量限度等于0. 12% w/w氯化鈉溶液的電導率。
8. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中所述納米乳液由蛋卵磷脂或 大豆卵磷脂制成，所述蛋卵磷脂或大豆卵磷脂具有的溶血卵磷脂含量低于所述卵磷脂重量 的5%。
9. 如權(quán)利要求2至8中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中所述油是中鏈油、植物油， 或其組合。
10. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中所述納米乳液的pH為約 2. 7 至約 7. 5。
11. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中所述納米乳液能通過 0.2-微米過濾器進行過濾。
12. 包含約0. 25mg/mL至1. 5mg/mL胰高血糖素、約10重量％至17. 5重量％磷脂、約 0. 5重量％至5重量％油和水相的納米乳液，其中所述納米乳液中油滴具有小于約200nm的 平均直徑，以及，其中在37°C下儲存3-7天后所述胰高血糖素不聚集，并保持不少于其濃度 的 75%。
13. 包含約lmg/mL胰高血糖素、約10重量％卵磷脂、約0. 5重量％至5重量％中鏈油 和水相的納米乳液，其中在37°C下儲存3-7天后，所述納米乳液中胰高血糖素不聚集，并保 持不少于其濃度的75%，且，其中 ： (a) 不少于50%的所述胰高血糖素與所述油相非共價締合， (b) 總的液滴表面積超過臨界液滴表面積，或超過對于所述納米乳液中所含的每毫克 胰高血糖素的液滴表面積3. OX 106mm2， (c) 所述納米乳液的電導率不大于用電導率儀測量的0. 15 % w/w氯化鈉水溶液的電導 率，以及 (d) pH為約2. 7至約7. 5。
14. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其中所述納米乳液還包含至少 一種抗氧化劑，所述抗氧化劑選自EDTA、蛋氨酸、果糖、葡萄糖、半胱氨酸、谷胱甘肽或其鹽 或它們的組合。
15. 如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液，其還包含抗微生物防腐劑，所述 抗微生物防腐劑選自EDTA、苯甲醇、尼泊金酯類、焦亞硫酸鈉、甲酚，或其鹽或其組合。
16. 包含胰高血糖素、磷脂、中鏈油和糖的凍干的干組合物，其中，在與水混合后，所述 凍干的干組合物形成如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液。
17. 包含胰高血糖素、磷脂、中鏈油和糖的凍干的干組合物，其中，在與水混合后，所述 凍干的干組合物形成納米乳液，其中在37°C下儲存3-7天后，胰高血糖素不聚集，并且保持 不少于其濃度的75%，以及，其中 (a) 不少于50%的所述胰高血糖素與所述油相非共價締合， (b) 總的液滴表面積超過臨界液滴表面積，或超過對于所述納米乳液中所含的每毫克 胰高血糖素的液滴表面積3. OX 106mm2， (c) 所述納米乳液的電導率不大于0. 15% w/w氯化鈉水溶液的電導率，且 (d) pH為約2. 7至約7. 5。
18. 上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中將所述組合物提供在小瓶或注 射器中。
19. 上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述胰高血糖素從泵中給藥，或 通過皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑經(jīng)針從注射器中給藥。
20. 如權(quán)利要求1、12或13中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述納米乳液是即注型 的。
21. 如權(quán)利要求16或17所述的組合物，其中所述凍干的組合物在注射前與水混合。
22. 制備前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的納米乳液的方法，所述方法包括： (e) 合并胰高血糖素和水相 (f) 加入磷脂和油 (g) 混合并均質(zhì)化以形成平均液滴大小為直徑不大于200納米的納米乳液，以及 (h) 使所述納米乳液通過0. 2微米過濾器。
23. 制備權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的干組合物的方法，所述方法包括： (e) 合并胰高血糖素和水相 (f) 加入磷脂和油 (g) 混合并均質(zhì)化以形成平均液滴大小為直徑不大于200納米的納米乳液， (h) 使所述納米乳液通過0. 2微米過濾器，以及 (i) 凍干所述納米乳液。
24. 治療需要胰高血糖素的患者的方法，包括對所述患者給予如前述權(quán)利要求中任一 權(quán)利要求所述的納米乳液。
【文檔編號】A61K47/44GK104159570SQ201280070556
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月29日
【發(fā)明者】陳獻, 諾曼·基思·奧麗達, 陳海靚, 豪·胡·丹格 申請人:陳獻