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      Ph20多肽變體、配制物及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):1252190閱讀:789來(lái)源:國(guó)知局
      Ph20多肽變體、配制物及其應(yīng)用的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供了修飾的PH20透明質(zhì)酸酶多肽,包括呈現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性和/或增加的活性的修飾的多肽。本發(fā)明還提供了組合物和配制物及其應(yīng)用。
      【專利說(shuō)明】PH20多肽變體、配制物及其應(yīng)用
      [0001] 相關(guān)申請(qǐng)
      [0002] 要求各自名稱為"PH20多肽變體、配制物及其應(yīng)用"的2011年12月30日申請(qǐng)的 美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/631,313和2012年11月1日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/796, 208的優(yōu) 先權(quán)。
      [0003] 本申請(qǐng)與同日申請(qǐng)的名稱為"PH20多肽變體、配制物及其應(yīng)用"的美國(guó)申請(qǐng)系 列號(hào)13/684,731相關(guān),該美國(guó)申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/631,313和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?61/796, 208的優(yōu)先權(quán)。
      [0004] 當(dāng)允許時(shí),每個(gè)上述相關(guān)申請(qǐng)的主題全文并入本文。
      [0005] 電子提交的序列表并入?yún)⒖?br> [0006] 電子版本序列表在此提交,其內(nèi)容全文并入本文。2012年12月28日創(chuàng)建的電子 文件大小為3. 48MB,名稱為3087seqPCl. txt。 發(fā)明領(lǐng)域
      [0007] 本發(fā)明提供了修飾的PH20透明質(zhì)酸酶多肽,包括呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性和/或增加的 活性的修飾多肽。本發(fā)明還提供了其組合物和配制物及應(yīng)用。
      [0008] 背景
      [0009] 乙酰透明質(zhì)酸(透明質(zhì)酸,HA)是在許多細(xì)胞的胞外基質(zhì)、特別是軟結(jié)締組織中 發(fā)現(xiàn)的一種多肽。HA也主要在哺乳動(dòng)物的皮膚、軟骨及在滑液中發(fā)現(xiàn)。乙酰透明質(zhì)酸也是 眼玻璃體的主要成分。HA在多個(gè)生理學(xué)過(guò)程中起作用,如在水和血漿蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起作用 (Laurent TC et al. (1992)FASEB J 6:2397-2404)。某些疾病與乙酰透明質(zhì)酸的表達(dá)和/ 或產(chǎn)生相關(guān)。乙酰透明質(zhì)酸降解酶如透明質(zhì)酸酶是降解乙酰透明質(zhì)酸的酶。通過(guò)催化HA 降解,乙酰透明質(zhì)酸降解酶(例如透明質(zhì)酸酶)可用于治療與HA或其它糖胺聚糖的積聚相 關(guān)的疾病或病癥。由于HA也是間隙屏障的主要成分,因此乙酰透明質(zhì)酸降解酶(例如透明 質(zhì)酸酶)增加組織通透性,并因此可用于增加治療劑的擴(kuò)散和輸送。許多透明質(zhì)酸酶已經(jīng) 治療性應(yīng)用(例如Hydase?、Vitrase?和Wydase?),典型作為分散和傳播劑與其它治療劑 組合。許多這些透明質(zhì)酸酶是羊或牛形式,其可以是免疫原性的以治療人。因此需要可用 于治療的改良的乙酰透明質(zhì)酸降解酶如透明質(zhì)酸酶及其組合物。
      [0010] 發(fā)明概述
      [0011] 本發(fā)明提供了修飾的PH20多肽,其與不具有修飾的PH20多肽相比具有改變的性 質(zhì)。所述修飾包括氨基酸置換、缺失和/或插入。本發(fā)明提供了每個(gè)氨基酸在PH20多肽中 的實(shí)際的詳細(xì)結(jié)構(gòu)/功能,以及提供了有助于在特定條件下改變性質(zhì)如穩(wěn)定性的殘基和基 因座的鑒別。因此,本發(fā)明提供了修飾的PH20多肽,其含有一或多個(gè)氨基酸置換,獲得在多 種條件下保留活性和/或呈現(xiàn)增加或改變的穩(wěn)定性的PH20多肽。活性保留可例如是透明 質(zhì)酸酶活性,其是不包含所述置換的PH20多肽活性的至少大約40%或更多。舉例的修飾 是氨基酸置換。對(duì)于本發(fā)明,氨基酸置換是用一個(gè)氨基酸字母后接其中發(fā)生置換的SEQ ID NO:3的相應(yīng)氨基酸位置而表示的。氨基酸殘基的一個(gè)氨基酸縮寫為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 (見(jiàn)例如表I),并用于本發(fā)明的描述和實(shí)施例中。例如,在參考SEQ ID NO:3所示氨基酸殘 基位置的PH20多肽中相應(yīng)于位置204的位置用P置換是指所述置換涵蓋SEQ ID NO:3所 示PH20多肽中F204P或者在另一 PH20多肽中相應(yīng)位置的相同置換。
      [0012] 本發(fā)明提供了修飾的PH20多肽,其在PH20多肽中含有至少一個(gè)氨基酸置換,其中 修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的PH20多肽相比呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性。增加的穩(wěn) 定性可以根據(jù)對(duì)使蛋白質(zhì)變性的一或多種蛋白質(zhì)條件的抗性增加而證明。在相同條件下對(duì) 比修飾的與未修飾的PH20的穩(wěn)定性。舉例的蛋白質(zhì)變性(或者使之變性,在本文可互換使 用)條件包括但不限于高于30°C或大約30°C的提高的溫度、攪拌、低鹽包括基本上或?qū)嵸|(zhì) 上或者無(wú)鹽,以及存在趨于變性蛋白質(zhì)的賦形劑。舉例的這種賦形劑是抗粘附劑、結(jié)合劑、 涂覆劑、充填劑和稀釋劑、香料、色素、潤(rùn)滑劑、助流劑、防腐劑、去污劑、吸附劑及其組合。
      [0013] 修飾的PH20多肽可以是這樣的多肽,其中其未修飾形式具有與SEQ ID NO: 3至少 大約68%的序列相同性并進(jìn)一步含有改變穩(wěn)定性的修飾和/或可以是與PH20相比包含多 如直至100、110、120、130、150個(gè)氨基酸差異但是仍保留未修飾的PH20多肽的酶活性特別 是至少大約40%活性并呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性如在變性條件下的穩(wěn)定性的PH20多肽。因此,本 發(fā)明包括修飾的PH20多肽,其與SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少68%或大約68% 的氨基酸序列相同性。本發(fā)明包括修飾的PH20多肽,其與SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具 有至少 70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %氨基酸序列相同性。舉例的這種修飾的PH20多肽是在PH20多肽中 含有氨基酸置換的多肽,其含有 SEQ ID N0:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、 870任一所示氨基酸殘基序列或者與SEQ ID N0:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、 861 或 870 任一序列至少 80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%相同的氨基酸序列。
      [0014] 例如,本發(fā)明提供了呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性的修飾的PH20多肽,其在PH20多肽中含 有賦予增加的穩(wěn)定性的氨基酸置換,其中增加的穩(wěn)定性是根據(jù)在存在一或多種蛋白質(zhì)變性 條件下對(duì)變性的抗性增加而證明,與不含有所述氨基酸置換的PH20多肽相比穩(wěn)定性增加, 及未修飾的PH20多肽由SEQ ID N0S:7所示氨基酸序列組成或者是可溶的PH20多肽的其 C-末端截短的片段或者與其具有至少85%序列相同性。如上所述,呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性的 修飾的PH20多肽呈現(xiàn)出對(duì)變性條件的增加的穩(wěn)定性,所述變性條件是高于或大約30°C的 溫度、攪拌、低鹽或無(wú)鹽、或者存在賦形劑或變性劑如抗粘附劑、結(jié)合劑、涂覆劑、充填劑和 稀釋劑、香料、色素、潤(rùn)滑劑、助流劑、防腐劑、去污劑、吸附劑或甜味劑及其組合,特別是防 腐劑。在呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性的這種修飾的PH20多肽的一些實(shí)例中,變性條件是溫度高于 30°C,及修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的未修飾的PH20多肽相比在所述溫度 呈現(xiàn)出較高的透明質(zhì)酸酶活性,其中所述活性是在相同條件下對(duì)比的。在其它實(shí)例中,蛋白 質(zhì)變性條件是存在低于IOOmM的低濃度鹽,及修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的 未修飾的PH20多肽相比在存在低濃度鹽條件下呈現(xiàn)增加的透明質(zhì)酸酶活性,其中所述活 性在相同條件下對(duì)比。
      [0015] 在呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性的任何上述修飾的PH20多肽的實(shí)例中,穩(wěn)定性可以基于多 種參數(shù)評(píng)定,包括透明質(zhì)酸酶活性、溶解性、聚集性和/或結(jié)晶化。穩(wěn)定性可以在存在變性 條件下評(píng)定。當(dāng)對(duì)比兩或更多個(gè)多肽的穩(wěn)定性時(shí),在相同條件下評(píng)定穩(wěn)定性。在一些情況 中,在本發(fā)明提供的PH20多肽中,修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的PH20多肽 的透明質(zhì)酸酶活性相比呈現(xiàn)至少120 %、130 %、135 %、140 %、145 %、150 %、160 %、170 %、 180 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 % U500 %, 2000 %, 3000 %, 4000 %, 5000 % 或更高的透明質(zhì)酸酶活性。
      [0016] 在呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性的修飾的PH20多肽的任何上述實(shí)例中,變性條件包括存在 使蛋白質(zhì)變性的賦形劑。舉例的這種條件是存在防腐劑如酚類防腐劑。本發(fā)明提供了修 飾的PH20多肽,其在存在抗微生物有效量的一或多種酚類防腐劑的條件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn) 定性??刮⑸镉行Я渴且换蚨喾N酚類防腐劑的總量,其可以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(%) 表示,是或者在(或者是至少大約或是大約)〇. 05% -0. 6%、0. 1% -0. 4%、0. 1% -0. 3%、 0· 15% -0· 325%、0· 15% -0· 25%、0· 1% -0· 2%、0· 2% -0· 3%或者 0· 3% -0· 4%之間,包 括端點(diǎn)。舉例的酚類防腐劑包括但不限于苯酚、間甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和對(duì)羥基苯甲酸 酯如對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、間甲酚、苯酚或者間甲酚和苯酚。舉例的通過(guò) 提供的修飾的PH20多肽實(shí)現(xiàn)的穩(wěn)定性是與修飾的PH20多肽在不存在防腐劑的條件下相比 在存在防腐劑條件下呈現(xiàn)至少15%或大約15%的透明質(zhì)酸酶活性至少4小時(shí)的那些?;钚?是在除了存在防腐劑之外的相同條件下對(duì)比。例如,本發(fā)明提供了修飾的PH20多肽,其在 存在酚類防腐劑條件下與不存在相同防腐劑條件下相比呈現(xiàn)至少(或者至少大約)16%、 17 %U8 %U9 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,65 %,70 %, 75%、80%、85%、90%、95%或更多的透明質(zhì)酸酶活性。因此,本發(fā)明提供了?!120多肽,在 本發(fā)明提供的修飾的PH20多肽之中,其由于氨基酸置換而與不具有這種置換的PH20多肽 相比是親酚性的(phenophilic)。本發(fā)明包括修飾的PH20多肽,其中所述透明質(zhì)酸酶活性 與修飾的PH20多肽在不存在防腐劑條件下在相同時(shí)間及在除了存在防腐劑之外的相同條 件下的透明質(zhì)酸酶活性相比呈現(xiàn)至少5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小 時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14 天、3周、4周或更長(zhǎng)時(shí)間。
      [0017] 在呈現(xiàn)對(duì)酚類防腐劑增加的穩(wěn)定性的修飾的PH20多肽的實(shí)例中,在酚類防腐劑 中增加的穩(wěn)定性可以在溫度條件下呈現(xiàn),所述溫度條件包括在例如〇°C -40°c如在或大約 在(TC -40°C、2°C -6°C、24°C -32°C及35°C -40°C之間的任何溫度。例如多肽在或在大約 30°C -45°C、35°C -45°C、30°C -37°C、35°C -37°C或 37°C -42°C之間的溫度呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定 性。特別修飾的PH20多肽和條件依賴于指定配制物、所述配制物暴露于的條件和/或指定 應(yīng)用。
      [0018] 特別的及舉例的呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性如對(duì)于酚類防腐劑增加的穩(wěn)定性的修飾的 PH20多肽包括含有一個(gè)氨基酸修飾如置換及如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個(gè)修飾的修飾組合的那些多肽。這 些包括修飾的PH20多肽,其含有一或多個(gè)氨基酸置換,其中至少一個(gè)置換是在相應(yīng)于(即 通過(guò)排列對(duì)比)選自如下位置的氨基酸位置的置換,所述如下位置參考SEQ ID N0:3所示 氨基酸位置:10、12、20、22、26、34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、 138、142、143、144、166、169、174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、 249、261、267、277、279、291、309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、 416、419、421、431、433、439、440、443或445,其中相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述 PH20多肽與SEQ ID N0:3所示多肽而鑒別的。舉例的這種修飾是在選自如下參考SEQ ID NO:3所示氨基酸殘基位置的位置用如下氨基酸置換的至少一個(gè)氨基酸置換:在相應(yīng)于位 置10的位置用甘氨酸(G);在相應(yīng)于位置12的位置用K ;在相應(yīng)于位置20的位置用S ;在 相應(yīng)于位置22的位置用T ;在相應(yīng)于位置26的位置用M ;在相應(yīng)于位置34的位置用W ;在 相應(yīng)于位置36的位置用N ;在相應(yīng)于位置46的位置用L ;在相應(yīng)于位置50的位置用M ;在 相應(yīng)于位置52的位置用T ;在相應(yīng)于位置52的位置用S ;在相應(yīng)于位置58的位置用C ;在 相應(yīng)于位置58的位置用K ;在相應(yīng)于位置58的位置用R ;在相應(yīng)于位置58的位置用N ;在 相應(yīng)于位置58的位置用Y ;在相應(yīng)于位置58的位置用P ;在相應(yīng)于位置58的位置用H ;在 相應(yīng)于位置68的位置用P ;在相應(yīng)于位置70的位置用V ;在相應(yīng)于位置74的位置用E ;在 相應(yīng)于位置82的位置用L ;在相應(yīng)于位置82的位置用N ;在相應(yīng)于位置83的位置用V ;在 相應(yīng)于位置83的位置用Q ;在相應(yīng)于位置83的位置用S ;在相應(yīng)于位置83的位置用G ;在 相應(yīng)于位置84的位置用N ;在相應(yīng)于位置86的位置用A ;在相應(yīng)于位置86的位置用K ;在 相應(yīng)于位置97的位置用E ;在相應(yīng)于位置97的位置用L ;在相應(yīng)于位置127的位置用R ;在 相應(yīng)于位置131的位置用R ;在相應(yīng)于位置138的位置用L ;在相應(yīng)于位置142的位置用K ; 在相應(yīng)于位置142的位置用N ;在相應(yīng)于位置142的位置用P ;在相應(yīng)于位置142的位置用 S ;在相應(yīng)于位置142的位置用T ;在相應(yīng)于位置143的位置用G ;在相應(yīng)于位置143的位置 用K ;在相應(yīng)于位置144的位置用T ;在相應(yīng)于位置166的位置用Q ;在相應(yīng)于位置166的位 置用T ;在相應(yīng)于位置169的位置用L ;在相應(yīng)于位置174的位置用G ;在相應(yīng)于位置174的 位置用N ;在相應(yīng)于位置193的位置用Q ;在相應(yīng)于位置195的位置用T ;在相應(yīng)于位置195 的位置用N ;在相應(yīng)于位置196的位置用E ;在相應(yīng)于位置196的位置用R ;在相應(yīng)于位置 204的位置用P ;在相應(yīng)于位置205的位置用A ;在相應(yīng)于位置205的位置用E ;在相應(yīng)于位 置206的位置用I ;在相應(yīng)于位置213的位置用A ;在相應(yīng)于位置219的位置用I ;在相應(yīng)于 位置234的位置用M ;在相應(yīng)于位置237的位置用T ;在相應(yīng)于位置238的位置用H ;在相應(yīng) 于位置240的位置用Q ;在相應(yīng)于位置249的位置用V ;在相應(yīng)于位置261的位置用A ;在 相應(yīng)于位置261的位置用K ;在相應(yīng)于位置267的位置用T ;在相應(yīng)于位置277的位置用K ; 在相應(yīng)于位置279的位置用H ;在相應(yīng)于位置279的位置用V ;在相應(yīng)于位置291的位置用 V ;在相應(yīng)于位置309的位置用E ;在相應(yīng)于位置310的位置用Q ;在相應(yīng)于位置314的位置 用Y ;在相應(yīng)于位置315的位置用Y ;在相應(yīng)于位置317的位置用N ;在相應(yīng)于位置317的位 置用W ;在相應(yīng)于位置318的位置用D ;在相應(yīng)于于位置347的位置用G ;在相應(yīng)于位置367 的位置用A ;在相應(yīng)于位置375的位置用R ;在相應(yīng)于位置376的位置用R ;在相應(yīng)于位置 399的位置用V ;在相應(yīng)于位置401的位置用E ;在相應(yīng)于位置407的位置用A ;在相應(yīng)于位 置416的位置用L ;在相應(yīng)于位置419的位置用K ;在相應(yīng)于位置421的位置用H ;在相應(yīng) 于位置431的位置用E ;在相應(yīng)于位置433的位置用T ;在相應(yīng)于位置433的位置用V ;在 相應(yīng)于位置439的位置用C ;在相應(yīng)于位置440的位置用P ;在相應(yīng)于位置443的位置用G ; 在相應(yīng)于位置445的位置用N。例如,修飾的PH20多肽可含有選自在如下相應(yīng)于參考SEQ ID NO:3所示氨基酸殘基位置的位置用如下氨基酸置換的至少一個(gè)氨基酸置換:在相應(yīng)于 位置52的位置用T,在相應(yīng)于位置58的位置用K,在相應(yīng)于位置58的位置用R,在相應(yīng)于位 置68的位置用P,在相應(yīng)于位置83的位置用V,在相應(yīng)于位置204的位置用P,在相應(yīng)于位 置261的位置用A,在相應(yīng)于位置267的位置用T,在相應(yīng)于位置277的位置用K及在相應(yīng) 于位置421的位置用Η。舉例的修飾的PH20多肽是在PH20多肽中參考SEQ ID NO:3所示 氨基酸殘基位置相應(yīng)于位置204的位置包括P (或者其保守氨基酸)的多肽。
      [0019] 因此,本發(fā)明提供了修飾的PH20多肽,其在PH20多肽中含有賦予增加穩(wěn)定性的氨 基酸置換,在存在酚類防腐劑條件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性,其中穩(wěn)定性與無(wú)所述氨基酸置換 的未修飾的多肽相比是增加的,及所述未修飾的PH20多肽具有SEQ ID NO: 7所示氨基酸序 列或者是其C-末端截短片段,其是可溶的PH20多肽或者與其具有至少85%序列相同性。 例如,未修飾的PH20多肽是可溶的PH20多肽,其具有SEQ ID NO: 3或32-66任一所示氨基 酸序列。在特別的實(shí)例中,所述修飾的PH20多肽與SEQ ID N0:3具有至少85%序列相同 性。在修飾的PH20多肽的任何這樣的實(shí)例中,所述多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75或更多個(gè)氨基酸置換。在本發(fā)明的實(shí)例中, 修飾的PH20多肽是人PH20。
      [0020] 修飾的PH20多肽在存在酚類防腐劑條件下呈現(xiàn)出穩(wěn)定性,與不存在酚類防腐 劑條件下透明質(zhì)酸酶活性相比其在存在防腐劑條件下呈現(xiàn)至少4小時(shí)的至少15%的透 明質(zhì)酸酶活性,其中所述活性是在除了存在酚類防腐劑之外的相同條件下對(duì)比的。在任 何上述實(shí)例中,修飾的PH20多肽在存在抗微生物有效量的一或多種酚類防腐劑條件下 是穩(wěn)定的,如一或多種酚類防腐劑的總量以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(%)表示,為或者 大約為 0.05% -0·6%、0· 1% -0·4%、0· 1% -0·3%、0· 15% -0·325%、0· 15% -0.25%、 0. I % -0. 2%、0. 2% -0. 3%或者0. 3% -0. 4%,包括端點(diǎn)。所述酚類防腐劑可以是苯酚、間 甲酚(m-甲酚)、苯甲醇或者對(duì)羥基苯甲酸酯如間甲酚、苯酚,或者間甲酚和苯酚。所述氨基 酸置換可以在參考SEQ ID N0:3所示氨基酸位置的氨基酸殘基204、58、10、12、20、22、26、 34、36、46、50、52、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、174、 193、195、196、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、310、 314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、443 或 445,其中相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)將所述PH20肽與SEQ ID NO: 3所示多肽排列對(duì)比而鑒別 的。例如,參考SEQ ID N0:3所示氨基酸殘基位置,所述氨基酸置換是在相應(yīng)于位置10的 位置的G ;在相應(yīng)于位置12的位置的K ;在相應(yīng)于位置20的位置的S ;在相應(yīng)于位置22的 位置的T ;在相應(yīng)于位置26的位置的M ;在相應(yīng)于位置34的位置的W ;在相應(yīng)于位置36的 位置的N ;在相應(yīng)于位置46的位置的L ;在相應(yīng)于位置50的位置的M ;在相應(yīng)于位52置的 位置的T ;在相應(yīng)于位置52的位置的S ;在相應(yīng)于位置58的位置的C ;在相應(yīng)于位置58的 位置的K ;在相應(yīng)于位置58的位置的R ;在相應(yīng)于位置58的位置的N ;在相應(yīng)于位置58的 位置的Y ;在相應(yīng)于位置58的位置的P ;在相應(yīng)于位置58的位置的H ;在相應(yīng)于位置68的 位置的P ;在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置74的位置的E ;在相應(yīng)于位置82的 位置的L ;在相應(yīng)于位置82的位置的N ;在相應(yīng)于位置83的位置的V ;在相應(yīng)于位置83的 位置的Q ;在相應(yīng)于位置83的位置的S ;在相應(yīng)于位置83的位置的G ;在相應(yīng)于位置84的 位置的N ;在相應(yīng)于位置86的位置的A ;在相應(yīng)于位置86的位置的K ;在相應(yīng)于位置97的 位置的E ;在相應(yīng)于位置97的位置的L ;在相應(yīng)于位置127的位置的R ;在相應(yīng)于位置131 的位置的R ;在相應(yīng)于位置138的位置的L ;在相應(yīng)于位置142的位置的K ;在相應(yīng)于位置 142的位置的N ;在相應(yīng)于位置142的位置的P ;在相應(yīng)于位置142的位置的S ;在相應(yīng)于位 置142的位置的T ;在相應(yīng)于位置143的位置的G ;在相應(yīng)于位置143的位置的K ;在相應(yīng)于 位置144的位置的T ;在相應(yīng)于位置166的位置的Q ;在相應(yīng)于位置166的位置的T ;在相應(yīng) 于位置169的位置的L ;在相應(yīng)于位置174的位置的G ;在相應(yīng)于位置174的位置的N ;在相 應(yīng)于位置193的位置的Q ;在相應(yīng)于位置195的位置的T ;在相應(yīng)于位置195的位置的N ;在 相應(yīng)于位置196的位置的E ;在相應(yīng)于位置196的位置的R ;在相應(yīng)于位置204的位置的P ; 在相應(yīng)于位置205的位置的A ;在相應(yīng)于位置205的位置的E ;在相應(yīng)于位置206的位置的 I ;在相應(yīng)于位置213的位置的A ;在相應(yīng)于位置219的位置的I ;在相應(yīng)于位置234的位置 的M ;在相應(yīng)于位置237的位置的T ;在相應(yīng)于位置238的位置的H ;在相應(yīng)于位置240的位 置的Q ;在相應(yīng)于位置249的位置的V ;在相應(yīng)于位置261的位置的A ;在相應(yīng)于位置261的 位置的K ;在相應(yīng)于位置267的位置的T ;在相應(yīng)于位置277的位置的K ;在相應(yīng)于位置279 的位置的H ;在相應(yīng)于位置279的位置的V ;在相應(yīng)于位置291的位置的V ;在相應(yīng)于位置 309的位置的E ;在相應(yīng)于位置310的位置的Q ;在相應(yīng)于位置314的位置的Y ;在相應(yīng)于位 置315的位置的Y ;在相應(yīng)于位置317的位置的N ;在相應(yīng)于位置317的位置的W ;在相應(yīng)于 位置318的位置的D ;在相應(yīng)于位置347的位置的G ;在相應(yīng)于位置367的位置的A ;在相應(yīng) 于位置375的位置的R ;在相應(yīng)于位置376的位置的R ;在相應(yīng)于位置399的位置的V ;在相 應(yīng)于位置401的位置的E ;在相應(yīng)于位置407的位置的A ;在相應(yīng)于位置416的位置的L ;在 相應(yīng)于位置419的位置的K ;在相應(yīng)于位置421的位置的H ;在相應(yīng)于位置431的位置的E ; 在相應(yīng)于位置433的位置的T ;在相應(yīng)于位置433的位置的V ;在相應(yīng)于位置439的位置的 C ;在相應(yīng)于位置440的位置的P ;在相應(yīng)于位置443的位置的G ;或者在相應(yīng)于位置445的 位置的N。特別地,參考SEQ ID NO:3所示氨基酸殘基位置,所述氨基酸置換是在相應(yīng)于位 置52的位置的T,在相應(yīng)于位置58的位置的K,在相應(yīng)于位置58的位置的R,在相應(yīng)于位置 68的位置的P,在相應(yīng)于位置83的位置的V,在相應(yīng)于位置204的位置的P,在相應(yīng)于位置 261的位置的A,在相應(yīng)于位置267的位置的T,在相應(yīng)于位置277的位置的K或者在相應(yīng)于 位置421的位置的H,如在相應(yīng)于位置204的位置的P或者在相應(yīng)于位置58的位置的R的 置換。呈現(xiàn)出對(duì)酚類防腐劑增加的穩(wěn)定性的修飾的PH20多肽可以是基本上純化的或分離 的。呈現(xiàn)出對(duì)酚類防腐劑增加的穩(wěn)定性的修飾的PH20多肽可以通過(guò)糖基化、唾液酸化、白 蛋白化、法尼基化、羧化、羥化和磷酸化而修飾,通常是糖基化的,其中所述多肽包含與至少 三個(gè)天冬酰胺(N)殘基如在相應(yīng)于SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基200、333和358的氨基酸殘 基的每一個(gè)連接的至少一個(gè)N-乙酰葡糖胺部分。呈現(xiàn)出對(duì)酚類防腐劑增加的穩(wěn)定性的修 飾的PH20多肽可以與聚合物如PEG或葡聚糖綴合和/或可以與是多聚化結(jié)構(gòu)域、毒素、可 檢測(cè)標(biāo)記或藥物的部分綴合。
      [0021] 在本發(fā)明提供的呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性的修飾的PH20多肽中,其是與不含有所述氨 基酸置換的PH20多肽相比在升高的溫度下呈現(xiàn)增加的透明質(zhì)酸酶活性,如與不含有所 述氨基酸置換的 PH20 多肽相比,至少 110 %、120 %、130 %、140 %、150 %、160 %、170 %、 180%、190%、200%、300%、400%、500%或更高的透明質(zhì)酸酶活性至少4小時(shí)。所述多肽 也是呈現(xiàn)活性的那些多肽、但是也是在升高的溫度典型呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性或其他性質(zhì)的那 些多肽,如與修飾的PH20多肽在或大約在2°C _8°C溫度的透明質(zhì)酸酶活性相比,在或大 約在 32°C -37°C溫度呈現(xiàn)至少 95%、96%、97%、98%、99%、100%、110%、120%、130%、 140 %、150 %、160 %、170 %、180 %、190 %、200 %、300 %、400 %、500 % 的透明質(zhì)酸酶活性至 少4小時(shí)的修飾的PH20多肽,其中活性是在除了溫度不同之外的相同條件下對(duì)比的。所述 透明質(zhì)酸酶活性與修飾的PH20多肽在或在大約2°C -8°C溫度的透明質(zhì)酸酶活性相比,在或 在大約32°C -37°C的升高的溫度在至少5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小 時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14 天、3周、4周或更長(zhǎng)時(shí)間之后呈現(xiàn),其中活性在除了溫度不同之外的相同條件下比較相同 時(shí)間。舉例的這種修飾的多肽是在相應(yīng)于選自如下參考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的氨 基酸位置含有至少一個(gè)氨基酸置換的那些多肽:1、11、12、14、20、26、29、34、50、58、70、82、 83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、195、206、212、213、219、 233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、368、371、374、389、392、 395、396、406、419、421、439和443,其中相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述?!120多肽與 SEQ ID NO:3所示多肽而鑒別的。舉例的突變包括例如參考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置 在相應(yīng)于位置1的位置用R置換;在相應(yīng)于位置11的位置用S ;在相應(yīng)于位置12的位置用 I ;在相應(yīng)于位置14的位置用V ;在相應(yīng)于位置20的位置用S ;在相應(yīng)于位置26的位置用M ; 在相應(yīng)于位置29的位置用R ;在相應(yīng)于位置34的位置用W ;在相應(yīng)于位置50的位置用M ; 在相應(yīng)于位置58的位置用K ;在相應(yīng)于位置58的位置用Q ;在相應(yīng)于位置58的位置用Q ; 在相應(yīng)于位置70的位置用V ;在相應(yīng)于位置82的位置用L ;在相應(yīng)于位置83的位置用Q ; 在相應(yīng)于位置84的位置用R ;在相應(yīng)于位置86的位置用A ;在相應(yīng)于位置87的位置用S ; 在相應(yīng)于位置140的位置用K ;在相應(yīng)于位置142的位置用S ;在相應(yīng)于位置142的位置用 T ;在相應(yīng)于位置143的位置用K ;在相應(yīng)于位置147的位置用S ;在相應(yīng)于位置152的位置 用T ;在相應(yīng)于位置166的位置用T ;在相應(yīng)于位置167的位置用D ;在相應(yīng)于位置172的位 置用A ;在相應(yīng)于位置174的位置用G ;在相應(yīng)于位置174的位置用N ;在相應(yīng)于位置178的 位置用R ;在相應(yīng)于位置193的位置用Q ;在相應(yīng)于位置195的位置用T ;在相應(yīng)于位置206 的位置用I ;在相應(yīng)于位置212的位置用S ;在相應(yīng)于位置213的位置用A ;在相應(yīng)于位置 219的位置用I ;在相應(yīng)于位置233的位置用G ;在相應(yīng)于位置237的位置用T ;在相應(yīng)于位 置240的位置用A ;在相應(yīng)于位置240的位置用Q ;在相應(yīng)于位置267的位置用T ;在相應(yīng)于 位置277的位置用E ;在相應(yīng)于位置291的位置用S ;在相應(yīng)于位置292的位置用H ;在相應(yīng) 于位置292的位置用V ;在相應(yīng)于位置309的位置用S ;在相應(yīng)于位置313的位置用H ;在相 應(yīng)于位置314的位置用S ;在相應(yīng)于位置317的位置用I ;在相應(yīng)于位置317的位置用T ;在 相應(yīng)于位置317的位置用W ;在相應(yīng)于位置318的位置用R ;在相應(yīng)于位置347的位置用G ; 在相應(yīng)于位置367的位置用A ;在相應(yīng)于位置368的位置用R ;在相應(yīng)于位置371的位置用 S ;在相應(yīng)于位置374的位置用P ;在相應(yīng)于位置389的位置用A ;在相應(yīng)于位置392的位置 用V ;在相應(yīng)于位置395的位置用A ;在相應(yīng)于位置396的位置用H ;在相應(yīng)于位置406的位 置用N ;在相應(yīng)于位置419的位置用H ;在相應(yīng)于位置419的位置用K ;在相應(yīng)于位置421的 位置用R ;在相應(yīng)于位置421的位置用S ;在相應(yīng)于位置439的位置用A ;在相應(yīng)于位置439 的位置用C ;及在相應(yīng)于位置443的位置用G。在本發(fā)明提供的特殊實(shí)例中,任何這種修飾 的PH20多肽含有一個(gè)氨基酸修飾如置換及如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個(gè)修飾的修飾組合。所述修飾如置換 可以在未修飾的PH20多肽中,其具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或者是其C-末端截短 的片段,其是可溶的PH20多肽,如SEQ ID NO: 3或32-66任一所示,或者與其具有至少85% 序列相同性。例如,任何這種修飾的PH20多肽與SEQ ID NO:3具有至少85%序列相同性。
      [0022] 本發(fā)明還提供了修飾的PH20多肽,其在低鹽條件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性,所述低 鹽條件如低于IOOmM的NaCl濃度,例如但不限于低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、 30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM或更低的NaCl濃度。在修飾的PH20多肽中,與不含有 所述氨基酸置換的PH20多肽相比,其在低濃度鹽條件下呈現(xiàn)增加的透明質(zhì)酸酶活性。這 種活性包括例如與不含有所述氨基酸置換的PH20多肽相比至少高于100%、或者至少 110 % U20 % U30 %, 140 % U50 % U60 %, 170 % U80 %, 190 % ,200 % ,300 % ,400 % ,500 % 或更高的透明質(zhì)酸酶活性。舉例的這種修飾的PH20多肽是在低濃度鹽條件如在或大約在 IOmMNaCl-IOOmM NaCl (包括端點(diǎn))(或者相應(yīng)濃度其它鹽或鹽混合物)條件下與在150mM NaCl中修飾的PH20多肽的透明質(zhì)酸酶活性相比呈現(xiàn)至少60%透明質(zhì)酸酶活性的那些多 肽,其中活性是在除了鹽濃度不同之外的相同條件下對(duì)比的。在本發(fā)明提供的特殊實(shí)例中, 任何這種修飾的PH20多肽含有一個(gè)氨基酸修飾如置換及如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100 和更多個(gè)修飾的修飾組合。所 述修飾如置換可以在未修飾的PH20多肽中,其具有SEQ ID N0:7所示氨基酸序列或者是其 C-末端截短的片段,其是可溶的PH20多肽,如SEQ ID NO: 3或32-66任一所示,或者與其具 有至少85%序列相同性。例如,任何這種修飾的PH20多肽與SEQ ID N0:3具有至少85% 序列相同性。
      [0023] 本發(fā)明還提供了修飾的PH20多肽,其在PH20多肽中含有至少一個(gè)氨基酸置換,其 中修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的PH20多肽相比呈現(xiàn)增加的透明質(zhì)酸酶活 性。當(dāng)對(duì)比多肽活性時(shí),在相同條件下對(duì)比活性。這些是這樣的多肽,其中未修飾的PH20 與 SEQ ID N0:3 所示氨基酸序列呈現(xiàn)至少 68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列相同性,或者 所得修飾的PH20與SEQ ID N0:3所示氨基酸序列呈現(xiàn)出這種序列相同性。舉例的這種修飾 的PH20多肽是在SEQ ID N0:3、7、10、12、14、24、32-66、69或72所示氨基酸序列中含有氨 基酸置換的任何多肽,或者含有與SEQ ID NO: 3、7、10、12、14、24、32-66、69或72至少80%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 相 同的氨基酸序列的任何多肽。所述氨基酸置換也可以在SEQ ID N0:857、859、861或870所 示氨基酸序列中進(jìn)行,或者在與SEQ ID N0:857、859、861或870任一至少80%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的氨基酸 序列中進(jìn)行。特別地,本發(fā)明提供了修飾的PH20多肽,其在SEQ ID N0:3、7、32-66、69或72 所示氨基酸序列中含有氨基酸置換。在修飾的PH20多肽中,其是呈現(xiàn)不含有所述氨基酸置 換的PH20多肽的透明質(zhì)酸酶活性的至少120%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、 170 %, 180 % ,200 % ,250 % ,300 % ,350 % ,400 % ,500 %, 1500 % ,2000 % ,3000 % ,4000 %, 5000%或更高的那些多肽?;钚钥梢栽谌魏螠囟仍u(píng)定,特別是當(dāng)透明質(zhì)酸酶暴露于在或大 約在2°C_8°C的溫度時(shí)存在這種活性。這些修飾的PH20多肽在參考SEQ ID NO:3所示氨 基酸位置時(shí)相應(yīng)于選自如下位置的氨基酸位置含有至少一個(gè)氨基酸置換:1、12、15、24、26、 27、29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、 92、93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、 165、166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、 260、261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、 318、320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、 410、418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446 和 447,其 中相應(yīng)氨基酸位置通過(guò)排列對(duì)比PH20多肽與SEQ ID N0:3所示多肽而鑒別。舉例的修飾 包括參考SEQ ID NO: 3所示氨基酸位置選自如下置換的至少一個(gè)氨基酸置換:在相應(yīng)于位 置1的位置的組氨酸(H);在相應(yīng)于位置1的位置的Q ;在相應(yīng)于位置12的位置的E ;在相 應(yīng)于位置12的位置的T ;在相應(yīng)于位置15的位置的V ;在相應(yīng)于位置24的位置的E ;在相 應(yīng)于位置24的位置的H ;在相應(yīng)于位置26的位置的E ;在相應(yīng)于位置26的位置的K ;在相 應(yīng)于位置27的位置的K ;在相應(yīng)于位置27的位置的R ;在相應(yīng)于位置29的位置的E ;在相 應(yīng)于位置29的位置的I ;在相應(yīng)于位置29的位置的L ;在相應(yīng)于位置29的位置的M ;在相 應(yīng)于位置29的位置的P ;在相應(yīng)于位置29的位置的S ;在相應(yīng)于位置29的位置的V ;在相 應(yīng)于位置30的位置的G ;在相應(yīng)于位置30的位置的H ;在相應(yīng)于位置30的位置的K ;在相 應(yīng)于位置30的位置的M ;在相應(yīng)于位置30的位置的R ;在相應(yīng)于位置30的位置的S ;在相 應(yīng)于位置的位置31的A ;在相應(yīng)于位置31的位置的C ;在相應(yīng)于位置31的位置的H ;在相 應(yīng)于位置31的位置的I ;在相應(yīng)于位置31的位置的K ;在相應(yīng)于位置31的位置的L ;在相 應(yīng)于位置31的位置的P ;在相應(yīng)于位置31的位置的R ;在相應(yīng)于位置31的位置的S ;在相 應(yīng)于位置31的位置的T ;在相應(yīng)于位置31的位置的V ;在相應(yīng)于位置32的位置的F ;在相 應(yīng)于位置32的位置的G ;在相應(yīng)于位置32的位置的H ;在相應(yīng)于位置33的位置的W ;在相 應(yīng)于位置37的位置的F ;在相應(yīng)于位置39的位置的N ;在相應(yīng)于位置39的位置的T ;在相 應(yīng)于位置46的位置的R ;在相應(yīng)于位置48的位置的F ;在相應(yīng)于位置48的位置的H ;在相 應(yīng)于位置48的位置的N ;在相應(yīng)于位置52的位置的Q ;在相應(yīng)于位置58的位置的K ;在相 應(yīng)于位置58的位置的Q ;在相應(yīng)于位置63的位置的W ;在相應(yīng)于位置67的位置的V ;在相 應(yīng)于位置68的位置的H ;在相應(yīng)于位置68的位置的Q ;在相應(yīng)于位置69的位置的A ;在相 應(yīng)于位置69的位置的C ;在相應(yīng)于位置69的位置的F ;在相應(yīng)于位置69的位置的G ;在相 應(yīng)于位置69的位置的I ;在相應(yīng)于位置69的位置的L ;在相應(yīng)于位置69的位置的M ;在相 應(yīng)于位置69的位置的P ;在相應(yīng)于位置69的位置的R ;在相應(yīng)于位置69的位置的W ;在相 應(yīng)于位置69的位置的Y ;在相應(yīng)于位置70的位置的A ;在相應(yīng)于位置70的位置的C ;在相 應(yīng)于位置70的位置的F ;在相應(yīng)于位置70的位置的G ;在相應(yīng)于位置70的位置的H ;在相 應(yīng)于位置70的位置的K ;在相應(yīng)于位置70的位置的L ;在相應(yīng)于位置70的位置的N ;在相 應(yīng)于位置70的位置的P ;在相應(yīng)于位置70的位置的R ;在相應(yīng)于位置70的位置的S ;在相 應(yīng)于位置70的位置的T ;在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置71的位置的R ;在相 應(yīng)于位置71的位置的S ;在相應(yīng)于位置72的位置的M ;在相應(yīng)于位置72的位置的Q ;在相 應(yīng)于位置73的位置的H ;在相應(yīng)于位置73的位置的L ;在相應(yīng)于位置73的位置的W ;在相 應(yīng)于位置74的位置的A ;在相應(yīng)于位置74的位置的C ;在相應(yīng)于位置74的位置的G ;在相 應(yīng)于位置74的位置的N ;在相應(yīng)于位置74的位置的P ;在相應(yīng)于位置74的位置的R ;在相 應(yīng)于位置74的位置的S ;在相應(yīng)于位置74的位置的V ;在相應(yīng)于位置74的位置的W ;在相 應(yīng)于位置75的位置的F ;在相應(yīng)于位置75的位置的L ;在相應(yīng)于位置75的位置的R ;在相 應(yīng)于位置75的位置的T ;在相應(yīng)于位置84的位置的G ;在相應(yīng)于位置84的位置的R ;在相 應(yīng)于位置86的位置的A ;在相應(yīng)于位置87的位置的C ;在相應(yīng)于位置87的位置的T ;在相 應(yīng)于位置87的位置的Y ;在相應(yīng)于位置92的位置的C ;在相應(yīng)于位置93的位置的I ;在相 應(yīng)于位置93的位置的L ;在相應(yīng)于位置93的位置的R ;在相應(yīng)于位置93的位置的T ;在相 應(yīng)于位置94的位置的R ;在相應(yīng)于位置97的位置的G ;在相應(yīng)于位置118的位置的Q ;在相 應(yīng)于位置120的位置的F ;在相應(yīng)于位置120的位置的V ;在相應(yīng)于位置120的位置的Y ;在 相應(yīng)于位置127的位置的H ;在相應(yīng)于位置127的位置的N ;在相應(yīng)于位置131的位置的G ; 在相應(yīng)于位置131的位置的R ;在相應(yīng)于位置131的位置的V ;在相應(yīng)于位置135的位置的 D ;在相應(yīng)于位置135的位置的G ;在相應(yīng)于位置135的位置的R ;在相應(yīng)于位置141的位置 的H ;在相應(yīng)于位置141的位置的Y ;在相應(yīng)于位置142的位置的R ;在相應(yīng)于位置147的位 置的R ;在相應(yīng)于位置147的位置的V ;在相應(yīng)于位置148的位置的K ;在相應(yīng)于位置150的 位置的G ;在相應(yīng)于位置151的位置的K ;在相應(yīng)于位置151的位置的L ;在相應(yīng)于位置151 的位置的M ;在相應(yīng)于位置151的位置的Q ;在相應(yīng)于位置151的位置的R ;在相應(yīng)于位置 152的位置的R ;在相應(yīng)于位置155的位置的G ;在相應(yīng)于位置155的位置的K ;在相應(yīng)于位 置156的位置的D ;在相應(yīng)于位置163的位置的A ;在相應(yīng)于位置163的位置的E ;在相應(yīng)于 位置163的位置的K ;在相應(yīng)于位置163的位置的R ;在相應(yīng)于位置164的位置的M ;在相應(yīng) 于位置165的位置的D ;在相應(yīng)于位置165的位置的N ;在相應(yīng)于位置166的位置的A ;在相 應(yīng)于位置166的位置的F ;在相應(yīng)于位置166的位置的H ;在相應(yīng)于位置166的位置的L ;在 相應(yīng)于位置166的位置的Q ;在相應(yīng)于位置166的位置的R ;在相應(yīng)于位置166的位置的T ; 在相應(yīng)于位置166的位置的Y ;在相應(yīng)于位置169的位置的L ;在相應(yīng)于位置170的位置的 R ;在相應(yīng)于位置174的位置的K ;在相應(yīng)于位置198的位置的D ;在相應(yīng)于位置206的位置 的K ;在相應(yīng)于位置206的位置的L ;在相應(yīng)于位置212的位置的N ;在相應(yīng)于位置213的位 置的M ;在相應(yīng)于位置213的位置的N ;在相應(yīng)于位置215的位置的M ;在相應(yīng)于位置219的 位置的S ;在相應(yīng)于位置233的位置的K ;在相應(yīng)于位置233的位置的R ;在相應(yīng)于位置234 的位置的M ;在相應(yīng)于位置236的位置的R ;在相應(yīng)于位置237的位置的E ;在相應(yīng)于位置 238的位置的S ;在相應(yīng)于位置247的位置的I ;在相應(yīng)于位置257的位置的T ;在相應(yīng)于位 置259的位置的P ;在相應(yīng)于位置260的位置的Y ;在相應(yīng)于位置261的位置的K ;在相應(yīng)于 位置261的位置的N ;在相應(yīng)于位置263的位置的K ;在相應(yīng)于位置263的位置的R ;在相應(yīng) 于位置269的位置的A ;在相應(yīng)于位置271的位置的L ;在相應(yīng)于位置271的位置的M ;在相 應(yīng)于位置272的位置的T ;在相應(yīng)于位置276的位置的D ;在相應(yīng)于位置276的位置的S ;在 相應(yīng)于位置276的位置的Y ;在相應(yīng)于位置277的位置的K ;在相應(yīng)于位置277的位置的R ; 在相應(yīng)于位置277的位置的T ;在相應(yīng)于位置278的位置的H ;在相應(yīng)于位置278的位置的 K ;在相應(yīng)于位置278的位置的N ;在相應(yīng)于位置278的位置的R ;在相應(yīng)于位置278的位置 的S ;在相應(yīng)于位置278的位置的T ;在相應(yīng)于位置278的位置的Y ;在相應(yīng)于位置282的位 置的M ;在相應(yīng)于位置291的位置的V ;在相應(yīng)于位置293的位置的A ;在相應(yīng)于位置293的 位置的C ;在相應(yīng)于位置293的位置的F ;在相應(yīng)于位置293的位置的M ;在相應(yīng)于位置293 的位置的P ;在相應(yīng)于位置293的位置的Q ;在相應(yīng)于位置293的位置的V ;在相應(yīng)于位置 305的位置的E ;在相應(yīng)于位置308的位置的G ;在相應(yīng)于位置308的位置的N ;在相應(yīng)于位 置309的位置的E ;在相應(yīng)于位置309的位置的L ;在相應(yīng)于位置309的位置的N ;在相應(yīng)于 位置309的位置的Q ;在相應(yīng)于位置309的位置的R ;在相應(yīng)于位置309的位置的T ;在相應(yīng) 于位置310的位置的A ;在相應(yīng)于位置310的位置的G ;在相應(yīng)于位置313的位置的K ;在相 應(yīng)于位置313的位置的R ;在相應(yīng)于位置315的位置的H ;在相應(yīng)于位置317的位置的I ;在 相應(yīng)于位置317的位置的K ;在相應(yīng)于位置317的位置的R ;在相應(yīng)于位置318的位置的M ; 在相應(yīng)于位置320的位置的H ;在相應(yīng)于位置320的位置的K ;在相應(yīng)于位置320的位置的 R ;在相應(yīng)于位置324的位置的R ;在相應(yīng)于位置325的位置的A ;在相應(yīng)于位置325的位置 的D ;在相應(yīng)于位置325的位置的E ;在相應(yīng)于位置325的位置的G ;在相應(yīng)于位置325的位 置的H ;在相應(yīng)于位置325的位置的K ;在相應(yīng)于位置325的位置的M ;在相應(yīng)于位置325的 位置的N ;在相應(yīng)于位置325的位置的Q ;在相應(yīng)于位置325的位置的S ;在相應(yīng)于位置326 的位置的V ;在相應(yīng)于位置328的位置的I ;在相應(yīng)于位置328的位置的K ;在相應(yīng)于位置 328的位置的L ;在相應(yīng)于位置328的位置的S ;在相應(yīng)于位置328的位置的Y ;在相應(yīng)于位 置347的位置的G ;在相應(yīng)于位置347的位置的S ;在相應(yīng)于位置353的位置的V ;在相應(yīng)于 位置359的位置的T ;在相應(yīng)于位置371的位置的R ;在相應(yīng)于位置377的位置的P ;在相應(yīng) 于位置377的位置的T ;在相應(yīng)于位置380的位置的W ;在相應(yīng)于位置380的位置的Y ;在相 應(yīng)于位389置的位置的K ;在相應(yīng)于位置392的位置的M ;在相應(yīng)于位置395的位置的R ;在 相應(yīng)于位置399的位置的M ;在相應(yīng)于位置399的位置的T ;在相應(yīng)于位置399的位置的W ; 在相應(yīng)于位置405的位置的G ;在相應(yīng)于位置407的位置的D ;在相應(yīng)于位置407的位置的 Q ;在相應(yīng)于位置409的位置的A ;在相應(yīng)于位置409的位置的Q ;在相應(yīng)于位置410的位置 的T ;在相應(yīng)于位置418的位置的P ;在相應(yīng)于位置419的位置的F ;在相應(yīng)于位置419的位 置的I ;在相應(yīng)于位置419的位置的K ;在相應(yīng)于位置419的位置的R ;在相應(yīng)于位置419的 位置的S ;在相應(yīng)于位置421的位置的H ;在相應(yīng)于位置421的位置的K ;在相應(yīng)于位置421 的位置的N ;在相應(yīng)于位置421的位置的Q ;在相應(yīng)于位置421的位置的R ;在相應(yīng)于位置 421的位置的S ;在相應(yīng)于位置425的位置的K ;在相應(yīng)于位置431的位置的A ;在相應(yīng)于位 置431的位置的H ;在相應(yīng)于位置431的位置的K ;在相應(yīng)于位置431的位置的Q ;在相應(yīng)于 位置431的位置的R ;在相應(yīng)于位置431的位置的S ;在相應(yīng)于位置431的位置的V ;在相應(yīng) 于位置433的位置的L ;在相應(yīng)于位置433的位置的R ;在相應(yīng)于位置433的位置的T ;在相 應(yīng)于位置433的位置的V ;在相應(yīng)于位置436的位置的K ;在相應(yīng)于位置437的位置的I ;在 相應(yīng)于位置437的位置的M ;在相應(yīng)于位置438的位置的T ;在相應(yīng)于位置439的位置的V ; 在相應(yīng)于位置440的位置的H ;在相應(yīng)于位置440的位置的R ;在相應(yīng)于位置441的位置的 F ;在相應(yīng)于位置442的位置的R ;在相應(yīng)于位置443的位置的A ;在相應(yīng)于位置443的位置 的M ;在相應(yīng)于位置445的位置的M ;在相應(yīng)于位置445的位置的P ;在相應(yīng)于位置446的位 置的A ;在相應(yīng)于位置447的位置的D ;在相應(yīng)于位置447的位置的N ;和/或在相應(yīng)于位置 447的位置的Q。
      [0024] 在呈現(xiàn)增加的透明質(zhì)酸酶活性的多肽中,其是呈現(xiàn)至少2. 0倍不含有所述氨基酸 置換的PH20多肽的透明質(zhì)酸酶活性的那些多肽。例如,這些多肽是修飾的PH20多肽,其參 考 SEQ ID N0:3 所示位置在相應(yīng)于選自 24、29、31、48、58、69、70、75、84、97、165、166、271、 278、317、320、325和326位置的氨基酸位置含有至少一個(gè)氨基酸置換,其中相應(yīng)氨基酸位 置是通過(guò)排列對(duì)比PH20多肽與SEQ ID NO: 3所示多肽而鑒別的,如參考SEQ ID NO: 3所 示氨基酸位置含有選自如下置換的至少一個(gè)氨基酸置換的修飾的PH20多肽:在相應(yīng)于位 置24的位置的E ;在相應(yīng)于位置29的位置的E ;在相應(yīng)于位置31的位置的V ;在相應(yīng)于位 置48的位置的N ;在相應(yīng)于位置58的位置的K ;在相應(yīng)于位置58的位置的Q ;在相應(yīng)于位 置69的位置的A ;在相應(yīng)于位置69的位置的F ;在相應(yīng)于位置69的位置的G ;在相應(yīng)于位 置69的位置的P ;在相應(yīng)于位置69的位置的R ;在相應(yīng)于位置70的位置的A ;在相應(yīng)于位 置70的位置的F ;在相應(yīng)于位置70的位置的G ;在相應(yīng)于位置70的位置的H ;在相應(yīng)于位 置70的位置的H ;在相應(yīng)于位置70的位置的N ;在相應(yīng)于位置70的位置的R ;在相應(yīng)于位 置70的位置的T ;在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置75的位置的L ;在相應(yīng)于位 置75的位置的T ;在相應(yīng)于位置84的位置的G ;在相應(yīng)于位置97的位置的G ;在相應(yīng)于位 置165的位置的D ;在相應(yīng)于位置166的位置的L ;在相應(yīng)于位置166的位置的R ;在相應(yīng)于 位置166的位置的T ;在相應(yīng)于位置271的位置的L ;在相應(yīng)于位置278的位置的H ;在相應(yīng) 于位置278的位置的R ;在相應(yīng)于位置317的位置的K ;在相應(yīng)于位置320的位置的K ;在相 應(yīng)于位置325的位置的E ;在相應(yīng)于位置325的位置的G ;在相應(yīng)于位置325的位置的K ;在 相應(yīng)于位置325的位置的N ;在相應(yīng)于位置325的位置的Q ;及在相應(yīng)于位置326的位置的 V。
      [0025] 在本發(fā)明提供的呈現(xiàn)增加的透明質(zhì)酸酶活性的任何多肽中,任何這種修飾的PH20 多肽含有一個(gè)氨基酸修飾如置換及如至少或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100及更多個(gè)修飾的修飾組合。所述修飾如置換可以 在未修飾的PH20多肽中,其具有SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列或者是其C-末端截短的片 段,其是可溶的PH20多肽,如SEQ ID NO: 3或32-66任一所示,或者與其具有至少85%序列 相同性。例如,任何這種修飾的PH20多肽與SEQ ID N0:3具有至少85%序列相同性。
      [0026] 本發(fā)明還提供了修飾的PH20多肽,其在PH20多肽中含有至少一個(gè)氨基酸置換,其 序列如SEQ ID NO: 7所示,其C-末端截短的片段,其可溶的片段,或者在具有與SEQ ID NO: 7 所示氨基酸序列至少91 %相同的氨基酸序列的PH20多肽中,其中至少一個(gè)氨基酸置換是 在參考SEQ ID N0:3或7所示氨基酸位置相應(yīng)于選自如下位置的氨基酸位置:1、2、3、4、 5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、 102、103、104、105、106、107、108、110、114、117、118、119、120、122、124、125、127、128、130、 131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、 150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、 169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、 195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、245、 247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、 272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、 292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、 315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、331、334、335、338、339、342、343、 347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、 377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、 401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、 422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、 445、446和447,其中相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與SEQ ID NO: 3所示 多肽而鑒別的;且如果修飾的PH20多肽在相應(yīng)于位置13、47、131或219的位置含有氨基酸 置換,則所述置換不是用丙氨酸(A)置換。在這些修飾的PH20多肽中,其是呈現(xiàn)不含有所 述氨基酸置換的PH20多肽的至少40%透明質(zhì)酸酶活性的那些多肽,其中在本發(fā)明的所有 情況中均是在相同條件下對(duì)比活性。
      [0027] 本發(fā)明包括在SEQ ID N0:3、7、32-66、69和72任一所示氨基酸序列中或者在與 SEQ ID NO: 3、7、32-66、69或72任一呈現(xiàn)至少91 %序列相同性的氨基酸序列中含有氨基酸 置換的這些多肽。特別地,所述修飾的PH20多肽在SEQ ID N0:3、7、32-66、69或72中含有 氨基酸置換,其是SEQ ID N0:7的C末端截短的片段,或者具有與SEQ ID N0:7所示氨基酸 序列具有至少91 %相同性的氨基酸序列的PH20多肽。特別地,本發(fā)明提供的這種修飾的 PH20多肽是其中氨基酸置換是下表3所示氨基酸置換的那些多肽。例如,這種修飾的PH20 多肽包括在參考SEQ ID NO: 3所示氨基酸位置相應(yīng)于選自如下位置的氨基酸位置具有至 少一個(gè)氨基酸置換的那些多肽:1、6、8、9、10、11、12、14、15、20、22、24、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、46、47、48、49、50、52、58、59、63、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、79、82、83、84、86、87、89、90、92、93、94、97、102、104、107、114、118、120、127、128、 130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、155、 156、158、160、162、163、164、165、166、167、169、170、172、173、174、175、178、179、193、195、 196、198、204、205、206、209、212、213、215、219、220、221、222、232、233、234、235、236、237、 238、240、247、248、249、257、258、259、260、261、263、267、269、271、272、273、274、276、277、 278、279、282、283、285、287、289、291、292、293、298、305、307、308、309、310、313、314、315、 317、318、320、321、324、325、326、328、335、347、349、351、353、356、359、367、368、369、371、 373、374、375、376、377、380、381、383、385、389、392、393、395、396、399、401、404、405、406、 407、409、410、412、416、418、419、421、425、427、428、431、433、436、437、438、439、440、441、 442、443、444、445、446 或447。舉例的這種置換是含有參考SEQIDN0:3所示氨基酸位置 選自如下置換的至少一個(gè)氨基酸置換的那些:在相應(yīng)于位置1的位置的組氨酸(H);在相應(yīng) 于位置1的位置的A ;在相應(yīng)于位置1的位置的E ;在相應(yīng)于位置1的位置的G ;在相應(yīng)于位 置1的位置的K ;在相應(yīng)于位置1的位置的Q ;在相應(yīng)于位置1的位置的R ;在相應(yīng)于位置6 的位置的A ;在相應(yīng)于位置8的位置的M ;在相應(yīng)于位置9的位置的Q ;在相應(yīng)于位置10的 位置的G ;在相應(yīng)于位置10的位置的H ;在相應(yīng)于位置11的位置的S ;在相應(yīng)于位置12的 位置的E ;在相應(yīng)于位置12的位置的I ;在相應(yīng)于位置12的位置的K ;在相應(yīng)于位置12的 位置的T ;在相應(yīng)于位置14的位置的V ;在相應(yīng)于位置15的位置的V ;在相應(yīng)于位置15的 位置的M ;在相應(yīng)于位置20的位置的S ;在相應(yīng)于位置22的位置的T ;在相應(yīng)于位置24的 位置的E ;在相應(yīng)于位置24的位置的H ;在相應(yīng)于位置24的位置的R ;在相應(yīng)于位置26的 位置的A ;在相應(yīng)于位置26的位置的E ;在相應(yīng)于位置26的位置的K ;在相應(yīng)于位置26的 位置的M ;在相應(yīng)于位置26的位置的Q ;在相應(yīng)于位置26的位置的R ;在相應(yīng)于位置27的 位置的D ;在相應(yīng)于位置27的位置的K ;在相應(yīng)于位置27的位置的R ;在相應(yīng)于位置28的 位置的R ;在相應(yīng)于位置29的位置的E ;在相應(yīng)于位置29的位置的I ;在相應(yīng)于位置29的 位置的K ;在相應(yīng)于位置29的位置的L ;在相應(yīng)于位置29的位置的M ;在相應(yīng)于位置29的 位置的P ;在相應(yīng)于位置29的位置的R ;在相應(yīng)于位置29的位置的S ;在相應(yīng)于位置29的 位置的T ;在相應(yīng)于位置29的位置的V ;在相應(yīng)于位置30的位置的G ;在相應(yīng)于位置30的 位置的H ;在相應(yīng)于位置30的位置的K ;在相應(yīng)于位置30的位置的L ;在相應(yīng)于位置30的 位置的M ;在相應(yīng)于位置30的位置的R ;在相應(yīng)于位置30的位置的S ;在相應(yīng)于位置31的 位置的A ;在相應(yīng)于位置31的位置的C ;在相應(yīng)于位置31的位置的G ;在相應(yīng)于位置31的 位置的H ;在相應(yīng)于位置31的位置的I ;在相應(yīng)于位置31的位置的K ;在相應(yīng)于位置31的 位置的L ;在相應(yīng)于位置31的位置的P ;在相應(yīng)于位置31的位置的R ;在相應(yīng)于位置31的 位置的S ;在相應(yīng)于位置31的位置的T ;在相應(yīng)于位置31的位置的V ;在相應(yīng)于位置31的 位置的W ;在相應(yīng)于位置32的位置的C ;在相應(yīng)于位置32的位置的F ;在相應(yīng)于位置32的 位置的G ;在相應(yīng)于位置32的位置的H ;在相應(yīng)于位置33的位置的W ;在相應(yīng)于位置33的 位置的G ;在相應(yīng)于位置34的位置的W ;在相應(yīng)于位置35的位置的Q ;在相應(yīng)于位置35的 位置的V ;在相應(yīng)于位置36的位置的H ;在相應(yīng)于位置36的位置的N ;在相應(yīng)于位置37的 位置的F ;在相應(yīng)于位置37的位置的M ;在相應(yīng)于位置38的位置的Y ;在相應(yīng)于位置39的 位置的A ;在相應(yīng)于位置39的位置的L ;在相應(yīng)于位置39的位置的N ;在相應(yīng)于位置39的 位置的T ;在相應(yīng)于位置40的位置的L ;在相應(yīng)于位置41的位置的T ;在相應(yīng)于位置46的 位置的L ;在相應(yīng)于位置46的位置的R ;在相應(yīng)于位置47的位置的D ;在相應(yīng)于位置47的 位置的F ;在相應(yīng)于位置47的位置的T ;在相應(yīng)于位置47的位置的W ;在相應(yīng)于位置48的 位置的F ;在相應(yīng)于位置48的位置的H ;在相應(yīng)于位置48的位置的K ;在相應(yīng)于位置48的 位置的N ;在相應(yīng)于位置49的位置的R ;在相應(yīng)于位置50的位置的D ;在相應(yīng)于位置50的 位置的S ;在相應(yīng)于位置50的位置的M ;在相應(yīng)于位置52的位置的N ;在相應(yīng)于位置52的 位置的Q ;在相應(yīng)于位置52的位置的R ;在相應(yīng)于位置52的位置的S ;在相應(yīng)于位置52的 位置的T ;在相應(yīng)于位置58的位置的C ;在相應(yīng)于位置58的位置的K ;在相應(yīng)于位置58的 位置的L ;在相應(yīng)于位置58的位置的P ;在相應(yīng)于位置58的位置的Q ;在相應(yīng)于位置58的 位置的R ;在相應(yīng)于位置58的位置的H ;在相應(yīng)于位置58的位置的N ;在相應(yīng)于位置58的 位置的Y ;在相應(yīng)于位置59的位置的N ;在相應(yīng)于位置63的位置的K ;在相應(yīng)于位置63的 位置的L ;在相應(yīng)于位置63的位置的M ;在相應(yīng)于位置63的位置的R ;在相應(yīng)于位置63的 位置的W ;在相應(yīng)于位置67的位置的V ;在相應(yīng)于位置68的位置的H ;在相應(yīng)于位置68的 位置的P ;在相應(yīng)于位置68的位置的Q ;在相應(yīng)于位置69的位置的A ;在相應(yīng)于位置69的 位置的C ;在相應(yīng)于位置69的位置的E ;在相應(yīng)于位置69的位置的F ;在相應(yīng)于位置69的 位置的G ;在相應(yīng)于位置69的位置的I ;在相應(yīng)于位置69的位置的L ;在相應(yīng)于位置69的 位置的M ;在相應(yīng)于位置69的位置的P ;在相應(yīng)于位置69的位置的R ;在相應(yīng)于位置69的 位置的T ;在相應(yīng)于位置69的位置的W ;在相應(yīng)于位置69的位置的Y ;在相應(yīng)于位置70的 位置的A ;在相應(yīng)于位置70的位置的C ;在相應(yīng)于位置70的位置的F ;在相應(yīng)于位置70的 位置的G ;在相應(yīng)于位置70的位置的H ;在相應(yīng)于位置70的位置的K ;在相應(yīng)于位置70的 位置的L ;在相應(yīng)于位置70的位置的N ;在相應(yīng)于位置70的位置的P ;在相應(yīng)于位置70的 位置的R ;在相應(yīng)于位置70的位置的S ;在相應(yīng)于位置70的位置的T ;在相應(yīng)于位置70的 位置的V ;在相應(yīng)于位置70的位置的Y ;在相應(yīng)于位置71的位置的G ;在相應(yīng)于位置71的 位置的N ;在相應(yīng)于位置71的位置的R ;在相應(yīng)于位置71的位置的S ;在相應(yīng)于位置72的 位置的K ;在相應(yīng)于位置72的位置的M ;在相應(yīng)于位置72的位置的Q ;在相應(yīng)于位置73的 位置的A ;在相應(yīng)于位置73的位置的H ;在相應(yīng)于位置73的位置的K ;在相應(yīng)于位置73的 位置的L ;在相應(yīng)于位置73的位置的Q ;在相應(yīng)于位置73的位置的R ;在相應(yīng)于位置73的 位置的T ;在相應(yīng)于位置73的位置的W ;在相應(yīng)于位置74的位置的A ;在相應(yīng)于位置74的 位置的C ;在相應(yīng)于位置74的位置的E ;在相應(yīng)于位置74的位置的F ;在相應(yīng)于位置74的 位置的G ;在相應(yīng)于位置74的位置的H ;在相應(yīng)于位置74的位置的K ;在相應(yīng)于位置74的 位置的L ;在相應(yīng)于位置74的位置的M ;在相應(yīng)于位置74的位置的N ;在相應(yīng)于位置74的 位置的P ;在相應(yīng)于位置74的位置的R ;在相應(yīng)于位置74的位置的S ;在相應(yīng)于位置74的 位置的V ;在相應(yīng)于位置74的位置的W ;在相應(yīng)于位置75的位置的F ;在相應(yīng)于位置75的 位置的L ;在相應(yīng)于位置75的位置的M ;在相應(yīng)于位置75的位置的R ;在相應(yīng)于位置75的 位置的T ;在相應(yīng)于位置79的位置的L ;在相應(yīng)于位置82的位置的L ;在相應(yīng)于位置82的 位置的N ;在相應(yīng)于位置83的位置的V ;在相應(yīng)于位置83的位置的Q ;在相應(yīng)于位置83的 位置的S ;在相應(yīng)于位置83的位置的G ;在相應(yīng)于位置84的位置的E ;在相應(yīng)于位置84的 位置的F ;在相應(yīng)于位置84的位置的G ;在相應(yīng)于位置84的位置的N ;在相應(yīng)于位置84的 位置的R ;在相應(yīng)于位置86的位置的A ;在相應(yīng)于位置86的位置的H ;在相應(yīng)于位置86的 位置的K ;在相應(yīng)于位置86的位置的N ;在相應(yīng)于位置86的位置的S ;在相應(yīng)于位置86的 位置的T ;在相應(yīng)于位置86的位置的W ;在相應(yīng)于位置87的位置的C ;在相應(yīng)于位置87的 位置的G ;在相應(yīng)于位置87的位置的L ;在相應(yīng)于位置87的位置的M ;在相應(yīng)于位置87的 位置的R ;在相應(yīng)于位置87的位置的S ;在相應(yīng)于位置87的位置的T ;在相應(yīng)于位置87的 位置的V ;在相應(yīng)于位置87的位置的Y ;在相應(yīng)于位置89的位置的C ;在相應(yīng)于位置90的 位置的A ;在相應(yīng)于位置90的位置的E ;在相應(yīng)于位置90的位置的H ;在相應(yīng)于位置90的 位置的K ;在相應(yīng)于位置90的位置的N ;在相應(yīng)于位置90的位置的R ;在相應(yīng)于位置92的 位置的C ;在相應(yīng)于位置92的位置的L ;在相應(yīng)于位置93的位置的I ;在相應(yīng)于位置93的 位置的L ;在相應(yīng)于位置93的位置的Q ;在相應(yīng)于位置93的位置的R ;在相應(yīng)于位置93的 位置的S ;在相應(yīng)于位置93的位置的T ;在相應(yīng)于位置94的位置的D ;在相應(yīng)于位置94的 位置的Q ;在相應(yīng)于位置94的位置的R ;在相應(yīng)于位置97的位置的A ;在相應(yīng)于位置97的 氨基酸殘基的C ;在相應(yīng)于位置97的位置的D ;在相應(yīng)于位置97的位置的E ;在相應(yīng)于位置 97的位置的G ;在相應(yīng)于位置97的位置的L ;在相應(yīng)于位置97的位置的S ;在相應(yīng)于位置 102的位置的S ;在相應(yīng)于位置102的位置的T ;在相應(yīng)于位置104的位置的R ;在相應(yīng)于位 置107的位置的L ;在相應(yīng)于位置114的位置的A ;在相應(yīng)于位置118的位置的Q ;在相應(yīng)于 位置120的位置的H ;在相應(yīng)于位置120的位置的F ;在相應(yīng)于位置120的位置的I ;在相應(yīng) 于位置120的位置的S ;在相應(yīng)于位置120的位置的V ;在相應(yīng)于位置120的位置的Y ;在相 應(yīng)于位置127的位置的E ;在相應(yīng)于位置127的位置的H ;在相應(yīng)于位置127的位置的N ;在 相應(yīng)于位置127的位置的Q ;在相應(yīng)于位置127的位置的R ;在相應(yīng)于位置128的位置的I ; 在相應(yīng)于位置130的位置的R ;在相應(yīng)于位置131的位置的G ;在相應(yīng)于位置131的位置的 I ;在相應(yīng)于位置131的位置的M ;在相應(yīng)于位置131的位置的Q ;在相應(yīng)于位置131的位置 的R ;在相應(yīng)于位置131的位置的V ;在相應(yīng)于位置132的位置的N ;在相應(yīng)于位置132的位 置的L ;在相應(yīng)于位置135的位置的D ;在相應(yīng)于位置135的位置的G ;在相應(yīng)于位置135的 位置的R ;在相應(yīng)于位置138的位置的L ;在相應(yīng)于位置139的位置的T ;在相應(yīng)于位置140 的位置的K ;在相應(yīng)于位置141的位置的H ;在相應(yīng)于位置141的位置的R ;在相應(yīng)于位置 141的位置的S ;在相應(yīng)于位置141的位置的W ;在相應(yīng)于位置141的位置的Y ;在相應(yīng)于位 置142的位置的D ;在相應(yīng)于位置142的位置的G ;在相應(yīng)于位置142的位置的K ;在相應(yīng)于 位置142的位置的N ;在相應(yīng)于位置142的位置的P ;在相應(yīng)于位置142的位置的Q ;在相應(yīng) 于位置142的位置的R ;在相應(yīng)于位置142的位置的S ;在相應(yīng)于位置142的位置的T ;在相 應(yīng)于位置143的位置的G ;在相應(yīng)于位置143的位置的K ;在相應(yīng)于位置144的位置的R ;在 相應(yīng)于位置144的位置的T ;在相應(yīng)于位置146的位置的P ;在相應(yīng)于位置146的位置的R ; 在相應(yīng)于位置147的位置的A ;在相應(yīng)于位置147的位置的F ;在相應(yīng)于位置147的位置的 L ;在相應(yīng)于位置147的位置的R ;在相應(yīng)于位置147的位置的S ;在相應(yīng)于位置147的位置 的V ;在相應(yīng)于位置148的位置的H ;在相應(yīng)于位置148的位置的K ;在相應(yīng)于位置148的位 置的Q ;在相應(yīng)于位置149的位置的T ;在相應(yīng)于位置149的位置的V ;在相應(yīng)于位置150的 位置的A ;在相應(yīng)于位置150的位置的D ;在相應(yīng)于位置150的位置的G ;在相應(yīng)于位置150 的位置的N ;在相應(yīng)于位置150的位置的S ;在相應(yīng)于位置150的位置的W ;在相應(yīng)于位置 150的位置的Y ;在相應(yīng)于位置151的位置的A ;在相應(yīng)于位置151的位置的H ;在相應(yīng)于位 置151的位置的K ;在相應(yīng)于位置151的位置的L ;在相應(yīng)于位置151的位置的M ;在相應(yīng)于 位置151的位置的Q ;在相應(yīng)于位置151的位置的R ;在相應(yīng)于位置151的位置的S ;在相應(yīng) 于位置151的位置的T ;在相應(yīng)于位置151的位置的V ;在相應(yīng)于位置151的位置的W ;在相 應(yīng)于位置151的位置的Y ;在相應(yīng)于位置152的位置的R ;在相應(yīng)于位置152的位置的T ;在 相應(yīng)于位置152的位置的W ;在相應(yīng)于位置155的位置的D ;在相應(yīng)于位置155的位置的G ; 在相應(yīng)于位置155的位置的K ;在相應(yīng)于位置155的位置的R ;在相應(yīng)于位置156的位置的 D ;在相應(yīng)于位置158的位置的Q ;在相應(yīng)于位置158的位置的S ;在相應(yīng)于位置160的位置 的S ;在相應(yīng)于位置162的位置的E ;在相應(yīng)于位置163的位置的A ;在相應(yīng)于位置163的位 置的E ;在相應(yīng)于位置163的位置的K ;在相應(yīng)于位置163的位置的Q ;在相應(yīng)于位置163的 位置的R ;在相應(yīng)于位置163的位置的S ;在相應(yīng)于位置164的位置的M ;在相應(yīng)于位置164 的位置的V ;在相應(yīng)于位置165的位置的D ;在相應(yīng)于位置165的位置的F ;在相應(yīng)于位置 165的位置的N ;在相應(yīng)于位置165的位置的S ;在相應(yīng)于位置165的位置的V ;在相應(yīng)于位 置166的位置的A ;在相應(yīng)于位置166的位置的E ;在相應(yīng)于位置166的位置的F ;在相應(yīng)于 位置166的位置的H ;在相應(yīng)于位置166的位置的L ;在相應(yīng)于位置166的位置的Q ;在相應(yīng) 于位置166的位置的R ;在相應(yīng)于位置166的位置的T ;在相應(yīng)于位置166的位置的W ;在相 應(yīng)于位置166的位置的Y ;在相應(yīng)于位置167的位置的D ;在相應(yīng)于位置169的位置的L ;在 相應(yīng)于位置170的位置的R ;在相應(yīng)于位置172的位置的A ;在相應(yīng)于位置173的位置的R ; 在相應(yīng)于位置174的位置的G ;在相應(yīng)于位置174的位置的K ;在相應(yīng)于位置174的位置的 N ;在相應(yīng)于位置174的位置的R ;在相應(yīng)于位置174的位置的T ;在相應(yīng)于位置175的位置 的T ;在相應(yīng)于位置178的位置的K ;在相應(yīng)于位置178的位置的R ;在相應(yīng)于位置179的位 置的K ;在相應(yīng)于位置193的位置的Q ;在相應(yīng)于位置195的位置的T ;在相應(yīng)于位置195的 位置的N ;在相應(yīng)于位置196的位置的E ;在相應(yīng)于位置196的位置的R ;在相應(yīng)于位置198 的位置的D ;在相應(yīng)于位置204的位置的P ;在相應(yīng)于位置205的位置的A ;在相應(yīng)于位置 205的位置的E ;在相應(yīng)于位置205的位置的L ;在相應(yīng)于位置205的位置的T ;在相應(yīng)于位 置206的位置的I ;在相應(yīng)于位置206的位置的K ;在相應(yīng)于位置206的位置的L ;在相應(yīng)于 位置206的位置的R ;在相應(yīng)于位置209的位置的R ;在相應(yīng)于位置212的位置的N ;在相應(yīng) 于位置212的位置的S ;在相應(yīng)于位置213的位置的A ;在相應(yīng)于位置213的位置的M ;在相 應(yīng)于位置213的位置的N ;在相應(yīng)于位置215的位置的H ;在相應(yīng)于位置215的位置的M ;在 相應(yīng)于位置219的位置的I ;在相應(yīng)于位置219的位置的K ;在相應(yīng)于位置219的位置的S ; 在相應(yīng)于位置220的位置的H ;在相應(yīng)于位置220的位置的I ;在相應(yīng)于位置220的位置的 L ;在相應(yīng)于位置220的位置的V ;在相應(yīng)于位置221的位置的Q ;在相應(yīng)于位置222的位置 的G ;在相應(yīng)于位置232的位置的F ;在相應(yīng)于位置233的位置的G ;在相應(yīng)于位置233的位 置的K ;在相應(yīng)于位置233的位置的R ;在相應(yīng)于位置234的位置的M ;在相應(yīng)于位置235的 位置的A ;在相應(yīng)于位置236的位置的R ;在相應(yīng)于位置237的位置的C ;在相應(yīng)于位置237 的位置的E ;在相應(yīng)于位置237的位置的H ;在相應(yīng)于位置237的位置的Q ;在相應(yīng)于位置 237的位置的T ;在相應(yīng)于位置238的位置的E ;在相應(yīng)于氨基酸位置238的位置的H ;在相 應(yīng)于位置238的位置的S ;在相應(yīng)于位置240的位置的A ;在相應(yīng)于位置240的位置的Q ;在 相應(yīng)于位置247的位置的I ;在相應(yīng)于位置248的位置的A ;在相應(yīng)于位置249的位置的V ; 在相應(yīng)于位置257的位置的G ;在相應(yīng)于位置257的位置的T ;在相應(yīng)于位置257的位置的 R ;在相應(yīng)于位置258的位置的N ;在相應(yīng)于位置258的位置的S ;在相應(yīng)于位置259的位置 的P ;在相應(yīng)于位置260的位置的M ;在相應(yīng)于位置260的位置的Y ;在相應(yīng)于位置261的位 置的A ;在相應(yīng)于位置261的位置的K ;在相應(yīng)于位置261的位置的N ;在相應(yīng)于位置263的 位置的K ;在相應(yīng)于位置263的位置的R ;在相應(yīng)于位置267的位置的T ;在相應(yīng)于位置269 的位置的A ;在相應(yīng)于位置271的位置的L ;在相應(yīng)于位置271的位置的M ;在相應(yīng)于位置 272的位置的D ;在相應(yīng)于位置272的位置的T ;在相應(yīng)于位置273的位置的H ;在相應(yīng)于位 置273的位置的Y ;在相應(yīng)于位置274的位置的F ;在相應(yīng)于位置276的位置的D ;在相應(yīng)于 位置276的位置的H ;在相應(yīng)于位置276的位置的M ;在相應(yīng)于位置276的位置的R ;在相應(yīng) 于位置276的位置的S ;在相應(yīng)于位置276的位置的Y ;在相應(yīng)于位置277的位置的A ;在相 應(yīng)于位置277的位置的E ;在相應(yīng)于位置277的位置的H ;在相應(yīng)于位置277的位置的K ;在 相應(yīng)于位置277的位置的M ;在相應(yīng)于位置277的位置的N ;在相應(yīng)于位置277的位置的Q ; 在相應(yīng)于位置277的位置的R ;在相應(yīng)于位置277的位置的S ;在相應(yīng)于位置277的位置的 T ;在相應(yīng)于位置278的位置的E ;在相應(yīng)于位置278的位置的F ;在相應(yīng)于位置278的位置 的G ;在相應(yīng)于位置278的位置的H ;在相應(yīng)于位置278的位置的K ;在相應(yīng)于位置278的位 置的N ;在相應(yīng)于位置278的位置的R ;在相應(yīng)于位置278的位置的S ;在相應(yīng)于位置278的 位置的T ;在相應(yīng)于位置278的位置的Y ;在相應(yīng)于位置279的位置的H ;在相應(yīng)于位置282 的位置的M ;在相應(yīng)于位置283的位置的S ;在相應(yīng)于位置285的位置的H ;在相應(yīng)于位置 287的位置的T ;在相應(yīng)于位置289的位置的S ;在相應(yīng)于位置291的位置的S ;在相應(yīng)于位 置291的位置的V ;在相應(yīng)于位置292的位置的C ;在相應(yīng)于位置292的位置的F ;在相應(yīng)于 位置292的位置的H ;在相應(yīng)于位置292的位置的K ;在相應(yīng)于位置292的位置的R ;在相應(yīng) 于位置292的位置的V ;在相應(yīng)于位置293的位置的A ;在相應(yīng)于位置293的位置的C ;在相 應(yīng)于位置293的位置的D ;在相應(yīng)于位置293的位置的F ;在相應(yīng)于位置293的位置的K ;在 相應(yīng)于位置293的位置的M ;在相應(yīng)于位置293的位置的P ;在相應(yīng)于位置293的位置的Q ; 在相應(yīng)于位置293的位置的V ;在相應(yīng)于位置293的位置的Y ;在相應(yīng)于位置298的位置的 G ;在相應(yīng)于位置305的位置的E ;在相應(yīng)于位置307的位置的G ;在相應(yīng)于位置308的位置 的D ;在相應(yīng)于位置308的位置的G ;在相應(yīng)于位置308的位置的K ;在相應(yīng)于位置308的位 置的N ;在相應(yīng)于位置308的位置的R ;在相應(yīng)于位置309的位置的E ;在相應(yīng)于位置309的 位置的G ;在相應(yīng)于位置309的位置的H ;在相應(yīng)于位置309的位置的L ;在相應(yīng)于位置309 的位置的M ;在相應(yīng)于位置309的位置的N ;在相應(yīng)于位置309的位置的Q ;在相應(yīng)于位置 309的位置的R ;在相應(yīng)于位置309的位置的S ;在相應(yīng)于位置309的位置的T ;在相應(yīng)于位 置309的位置的V ;在相應(yīng)于位置310的位置的A ;在相應(yīng)于位置310的位置的G ;在相應(yīng)于 位置310的位置的Q ;在相應(yīng)于位置310的位置的S ;在相應(yīng)于位置313的位置的A ;在相應(yīng) 于位置313的位置的G ;在相應(yīng)于位置313的位置的H ;在相應(yīng)于位置313的位置的K ;在相 應(yīng)于位置313的位置的P ;在相應(yīng)于位置313的位置的R ;在相應(yīng)于位置313的位置的T ;在 相應(yīng)于位置313的位置的Y ;在相應(yīng)于位置314的位置的S ;在相應(yīng)于位置314的位置的Y ; 在相應(yīng)于位置315的位置的A ;在相應(yīng)于位置315的位置的H ;在相應(yīng)于位置315的位置的 Y ;在相應(yīng)于位置317的位置的A ;在相應(yīng)于位置317的位置的I ;在相應(yīng)于位置317的位置 的K ;在相應(yīng)于位置317的位置的N ;在相應(yīng)于位置317的位置的Q ;在相應(yīng)于位置317的位 置的R ;在相應(yīng)于位置317的位置的S ;在相應(yīng)于位置317的位置的T ;在相應(yīng)于位置317的 位置的W ;在相應(yīng)于位置318的位置的D ;在相應(yīng)于位置318的位置的H ;在相應(yīng)于位置318 的位置的K ;在相應(yīng)于位置318的位置的M ;在相應(yīng)于位置318的位置的R ;在相應(yīng)于位置 320的位置的H ;在相應(yīng)于位置320的位置的K ;在相應(yīng)于位置320的位置的R ;在相應(yīng)于位 置321的位置的R ;在相應(yīng)于位置321的位置的S ;在相應(yīng)于位置324的位置的N ;在相應(yīng)于 位置324的位置的R ;在相應(yīng)于位置325的位置的A ;在相應(yīng)于位置325的位置的D ;在相應(yīng) 于位置325的位置的E ;在相應(yīng)于位置325的位置的G ;在相應(yīng)于位置325的位置的H ;在相 應(yīng)于位置325的位置的K ;在相應(yīng)于位置325的位置的M ;在相應(yīng)于位置325的位置的N ;在 相應(yīng)于位置325的位置的Q ;在相應(yīng)于位置325的位置的S ;在相應(yīng)于位置325的位置的V ; 在相應(yīng)于位置326的位置的L ;在相應(yīng)于位置326的位置的V ;在相應(yīng)于位置328的位置的 C ;在相應(yīng)于位置328的位置的G ;在相應(yīng)于位置328的位置的I ;在相應(yīng)于位置328的位置 的K ;在相應(yīng)于位置328的位置的L ;在相應(yīng)于位置328的位置的S ;在相應(yīng)于位置328的位 置的Y ;在相應(yīng)于位置335的位置的S ;在相應(yīng)于位置347的位置的A ;在相應(yīng)于位置347的 位置的G ;在相應(yīng)于位置347的位置的S ;在相應(yīng)于位置349的位置的M ;在相應(yīng)于位置349 的位置的R ;在相應(yīng)于位置351的位置的S ;在相應(yīng)于位置353的位置的V ;在相應(yīng)于位置 356的位置的H ;在相應(yīng)于位置356的位置的S ;在相應(yīng)于位置359的位置的E ;在相應(yīng)于位 置359的位置的H ;在相應(yīng)于位置359的位置的T ;在相應(yīng)于位置367的位置的A ;在相應(yīng)于 位置367的位置的G ;在相應(yīng)于位置367的位置的K ;在相應(yīng)于位置367的位置的S ;在相應(yīng) 于位置368的位置的A ;在相應(yīng)于位置368的位置的E ;在相應(yīng)于位置368的位置的K ;在相 應(yīng)于氨基酸位置368的位置的L ;在相應(yīng)于氨基酸位置368的位置的M ;在相應(yīng)于位置368 的位置的R ;在相應(yīng)于氨基酸位置368的位置的T ;在相應(yīng)于位置369的位置的H ;在相應(yīng)于 位置369的位置的R ;在相應(yīng)于位置371的位置的F ;在相應(yīng)于位置371的位置的H ;在相應(yīng) 于位置371的位置的K ;在相應(yīng)于位置371的位置的L ;在相應(yīng)于位置371的位置的R ;在相 應(yīng)于位置371的位置的S ;在相應(yīng)于位置373的位置的M ;在相應(yīng)于位置374的位置的H ;在 相應(yīng)于位置374的位置的P ;在相應(yīng)于位置375的位置的A ;在相應(yīng)于位置375的位置的G ; 在相應(yīng)于位置375的位置的K ;在相應(yīng)于位置375的位置的R ;在相應(yīng)于位置376的位置的 D ;在相應(yīng)于位置376的位置的E ;在相應(yīng)于位置376的位置的Q ;在相應(yīng)于位置376的位置 的R ;在相應(yīng)于位置376的位置的T ;在相應(yīng)于位置376的位置的V ;在相應(yīng)于位置376的位 置的Y ;在相應(yīng)于位置377的位置的D ;在相應(yīng)于位置377的位置的E ;在相應(yīng)于位置377的 位置的H ;在相應(yīng)于位置377的位置的K ;在相應(yīng)于位置377的位置的P ;在相應(yīng)于位置377 的位置的R ;在相應(yīng)于位置377的位置的S ;在相應(yīng)于位置377的位置的T ;在相應(yīng)于位置 380的位置的W ;在相應(yīng)于位置380的位置的Y ;在相應(yīng)于位置381的位置的S ;在相應(yīng)于位 置383的位置的I ;在相應(yīng)于位置383的位置的K ;在相應(yīng)于位置383的位置的L ;在相應(yīng)于 位置383的位置的S ;在相應(yīng)于位置385的位置的A ;在相應(yīng)于位置385的位置的Q ;在相應(yīng) 于位置385的位置的V ;在相應(yīng)于位置389的位置的A ;在相應(yīng)于位置389的位置的G ;在相 應(yīng)于位置389的位置的L ;在相應(yīng)于位置389的位置的K ;在相應(yīng)于位置389的位置的Q ;在 相應(yīng)于位置389的位置的S ;在相應(yīng)于位置392的位置的A ;在相應(yīng)于位置392的位置的F ; 在相應(yīng)于位置392的位置的M ;在相應(yīng)于位置392的位置的Q ;在相應(yīng)于位置392的位置的 R ;在相應(yīng)于位置392的位置的V ;在相應(yīng)于位置393的位置的F ;在相應(yīng)于位置393的位置 的M ;在相應(yīng)于位置395的位置的A ;在相應(yīng)于位置395的位置的H ;在相應(yīng)于位置395的位 置的R ;在相應(yīng)于位置396的位置的A ;在相應(yīng)于位置396的位置的H ;在相應(yīng)于位置396的 位置的Q ;在相應(yīng)于位置396的位置的S ;在相應(yīng)于位置399的位置的K ;在相應(yīng)于位置399 的位置的M ;在相應(yīng)于位置399的位置的T ;在相應(yīng)于位置399的位置的V ;在相應(yīng)于位置 399的位置的W ;在相應(yīng)于位置401的位置的A ;在相應(yīng)于位置401的位置的E ;在相應(yīng)于位 置404的位置的A ;在相應(yīng)于位置405的位置的G ;在相應(yīng)于位置406的位置的F ;在相應(yīng)于 位置406的位置的N ;在相應(yīng)于位置407的位置的A ;在相應(yīng)于位置407的位置的D ;在相應(yīng) 于位置407的位置的E ;在相應(yīng)于位置407的位置的F ;在相應(yīng)于位置407的位置的H ;在相 應(yīng)于位置407的位置的Q ;在相應(yīng)于位置407的位置的P ;在相應(yīng)于位置409的位置的A ;在 相應(yīng)于位置409的位置的Q ;在相應(yīng)于位置410的位置的T ;在相應(yīng)于位置412的位置的Q ; 在相應(yīng)于位置412的位置的R ;在相應(yīng)于位置412的位置的V ;在相應(yīng)于位置416的位置的 L ;在相應(yīng)于位置418的位置的E ;在相應(yīng)于位置418的位置的L ;在相應(yīng)于位置418的位置 的P ;在相應(yīng)于位置418的位置的R ;在相應(yīng)于位置418的位置的V ;在相應(yīng)于位置419的位 置的F ;在相應(yīng)于位置419的位置的H ;在相應(yīng)于位置419的位置的I ;在相應(yīng)于位置419的 位置的K ;在相應(yīng)于位置419的位置的R ;在相應(yīng)于位置419的位置的S ;在相應(yīng)于位置419 的位置的Y ;在相應(yīng)于位置421的位置的A ;在相應(yīng)于位置421的位置的H ;在相應(yīng)于位置 421的位置的K ;在相應(yīng)于位置421的位置的N ;在相應(yīng)于位置421的位置的Q ;在相應(yīng)于位 置421的位置的R ;在相應(yīng)于位置421的位置的S ;在相應(yīng)于位置425的位置的G ;在相應(yīng)于 位置425的位置的K ;在相應(yīng)于位置427的位置的Q ;在相應(yīng)于位置427的位置的T ;在相應(yīng) 于位置428的位置的L ;在相應(yīng)于位置431的位置的A ;在相應(yīng)于位置431的位置的G ;在相 應(yīng)于位置431的位置的E ;在相應(yīng)于位置431的位置的H ;在相應(yīng)于位置431的位置的K ;在 相應(yīng)于位置431的位置的L ;在相應(yīng)于位置431的位置的N ;在相應(yīng)于位置431的位置的Q ; 在相應(yīng)于位置431的位置的R ;在相應(yīng)于位置431的位置的S ;在相應(yīng)于位置431的位置的 V ;在相應(yīng)于位置433的位置的A ;在相應(yīng)于位置433的位置的H ;在相應(yīng)于位置433的位置 的I ;在相應(yīng)于位置433的位置的K ;在相應(yīng)于位置433的位置的L ;在相應(yīng)于位置433的位 置的R ;在相應(yīng)于位置433的位置的T ;在相應(yīng)于位置433的位置的V ;在相應(yīng)于位置433的 位置的W ;在相應(yīng)于位置436的位置的K ;在相應(yīng)于位置437的位置的I ;在相應(yīng)于位置437 的位置的M ;在相應(yīng)于位置438的位置的A ;在相應(yīng)于位置438的位置的D ;在相應(yīng)于位置 438的位置的E ;在相應(yīng)于位置438的位置的L ;在相應(yīng)于位置438的位置的N ;在相應(yīng)于位 置438的位置的T ;在相應(yīng)于位置439的位置的A ;在相應(yīng)于位置439的位置的C ;在相應(yīng)于 位置439的位置的K ;在相應(yīng)于位置439的位置的P ;在相應(yīng)于位置439的位置的Q ;在相應(yīng) 于位置439的位置的T ;在相應(yīng)于位置439的位置的V ;在相應(yīng)于位置440的位置的D ;在相 應(yīng)于位置440的位置的H ;在相應(yīng)于位置440的位置的M ;在相應(yīng)于位置440的位置的P ;在 相應(yīng)于位置440的位置的R ;在相應(yīng)于位置440的位置的S ;在相應(yīng)于位置441的位置的A ; 在相應(yīng)于位置441的位置的F ;在相應(yīng)于位置442的位置的C ;在相應(yīng)于位置442的位置的 G ;在相應(yīng)于位置442的位置的R ;在相應(yīng)于位置443的位置的A ;在相應(yīng)于位置443的位置 的E ;在相應(yīng)于位置443的位置的F ;在相應(yīng)于位置443的位置的G ;在相應(yīng)于位置443的位 置的M ;在相應(yīng)于位置443的位置的N ;在相應(yīng)于位置444的位置的E ;在相應(yīng)于位置444的 位置的H ;在相應(yīng)于位置444的位置的V ;在相應(yīng)于位置445的位置的H ;在相應(yīng)于位置445 的位置的M ;在相應(yīng)于位置445的位置的N ;在相應(yīng)于位置445的位置的P ;在相應(yīng)于位置 445的位置的Q ;在相應(yīng)于位置445的位置的S ;在相應(yīng)于位置445的位置的T ;在相應(yīng)于位 置445的位置的V ;在相應(yīng)于位置445的位置的W ;在相應(yīng)于位置446的位置的A ;在相應(yīng)于 位置446的位置的M ;在相應(yīng)于位置446的位置的W ;在相應(yīng)于位置447的位置的D ;在相應(yīng) 于位置447的位置的E ;在相應(yīng)于位置447的位置的G ;在相應(yīng)于位置447的位置的I ;在相 應(yīng)于位置447的位置的N ;在相應(yīng)于位置447的位置的P ;在相應(yīng)于位置447的位置的Q ;在 相應(yīng)于位置447的位置的T,和/或在相應(yīng)于位置447的位置的V的置換。這些修飾的PH20 多肽是呈現(xiàn)出不含有所述特定氨基酸置換的PH20的至少40%活性的那些多肽?;钚钥梢?在例如不含有所述氨基酸置換的PH20多肽的透明質(zhì)酸酶活性的40 % -5000 %、 40 % -2000 %,40 % -1000 % AO % -500 % AO % -100 % >80 % -2000 %,80 % -600 %, 80% _200%、80% -300%之間變化。這種活性包括不含有所述氨基酸置換的PH20多肽的 透明質(zhì)酸酶活性的至少 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、120 %、130 %、140 %、150 %、 160 %U70 %U80 %U90 %,200 %,300 %,400 %,500 %,600 %,700 %,800 %,900 %, 1000 %、2000 %、3000 %或更多,在本發(fā)明所有情況中,所述活性均是在相同條件下對(duì)比的。
      [0028] 特別地,本發(fā)明提供了修飾的PH20多肽,其在SEQ ID N0:7所示PH20多肽、其C 末端截短的片段中或者在具有與SEQ ID N0:7所示氨基酸序列至少91%相同的氨基酸序 列的PH20多肽或者相應(yīng)截短的片段中含有至少一個(gè)氨基酸置換,其中所述修飾的PH20多 肽呈現(xiàn)出不含有所述氨基酸置換的PH20多肽的低于20%的透明質(zhì)酸酶活性,其中活性是 在相同條件下對(duì)比的;所述氨基酸置換是在參考SEQ ID N0:3或7所示氨基酸位置相應(yīng)于 選自如下位置的氨基酸位置:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、25、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、 125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、 150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、 172、173、174、175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、 213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、 232、233、234、235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、 252、253、254、255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、 272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、 293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、 313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、 355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、 374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、 393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、 414、415、416、417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、 438、439、440、441、442、443、444或447 ;相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與 SEQ ID NO:3所示多肽而鑒別的;及假定:
      [0029] (i)如果修飾的PH20多肽在相應(yīng)于位置200、333、358或393的位置含有氨基酸置 換,則所述置換不是用丙氨酸(A)置換;
      [0030] (ii)如果修飾的PH20多肽在相應(yīng)于位置111或249的位置含有氨基酸置換,則所 述置換不是用天冬酰胺(N)置換;
      [0031] (iii)如果修飾的PH20多肽在相應(yīng)于位置113的位置含有氨基酸置換,則所述置 換不是用谷氨酰胺(Q)置換;
      [0032] (iv)如果修飾的PH20多肽含有在相應(yīng)于位置176的位置的氨基酸置換,則所述置 換不是用甘氨酸(G)置換;及
      [0033] (V)如果修飾的PH20多肽在相應(yīng)于位置252的位置含有氨基酸置換,則所述置換 不是用蘇氨酸(T)置換。
      [0034] 舉例的這種修飾的PH20多肽是在具有SEQ ID N0:3、7、32-66、69或72任一所示 氨基酸序列的PH20多肽中或者在與SEQIDN0:3、7、32-66、69或72任一呈現(xiàn)至少91%序 列相同性的氨基酸序列中含有氨基酸置換的任何多肽。例如,修飾的PH20多肽在SEQ ID N0:3、7、32-66、69或72中含有氨基酸置換,其是SEQIDN0:7的C末端截短片段的多肽,或 者具有與SEQ ID N0:7所示氨基酸序列至少91%相同的氨基酸序列的PH20多肽。在本發(fā)明 提供的這種修飾的PH20多肽的實(shí)例中,修飾的PH20多肽可呈現(xiàn)與不具有所述修飾的PH20 相似或相同活性,或者可以呈現(xiàn)增加的活性或者低于不含有所述氨基酸置換的PH20多肽 的透明質(zhì)酸酶活性的 15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 9%、0· 8%、 0. 7%、0. 6%、0. 5%、0. 4%、0. 3%、0. 2%、0. 1%、0. 05%或更低的活性。舉例的這種修飾的 PH20多肽如表5所示。
      [0035] 在本發(fā)明提供的及上述任何及所有修飾的PH20多肽中,修飾的PH20多肽是不由 SEQ ID N0:3、6-66、69-72、856-861、869或870任一所示氨基酸序列組成的多肽。特別地, 在本發(fā)明在此或在別處提供的任何修飾的PH20多肽中,其在具有SEQ ID N0:3、7、69或72 任一所示氨基酸序列的PH20多肽中含有氨基酸置換,假定:(i)在修飾的PH20多肽僅包含 一個(gè)氨基酸置換的情況中,所述置換不相應(yīng)于參考SEQ ID N0:3所示氨基酸位置的氨基酸 置換 V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、E249Q、R252T、N333A 或 N358A ; (ii)在修飾的PH20多肽包含僅兩個(gè)氨基酸置換的情況中,所述置換不相應(yīng)于參考SEQ ID 勵(lì):3所示位置的氨基酸置換?134/14641、財(cái)74/^13認(rèn)、財(cái)74/吧194、附3認(rèn)/^2194或吧33八/ N358A ;及(iii)在修飾的PH20多肽含有僅三個(gè)氨基酸置換的情況中,所述置換不相應(yīng)于參 考SEQ ID N0:3所示氨基酸位置的氨基酸置換N47A/N131A/N219A。
      [0036] 任何上述修飾的PH20多肽及本發(fā)明提供和上述及下述的任何多肽可含有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48, 49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或更多個(gè)氨基酸置換。修飾的PH20多肽可包含信號(hào)序 列,包括天然序列與異源序列或者修飾的序列,及也包含缺少信號(hào)序列的成熟PH20多肽。
      [0037] 在本發(fā)明上述提供的及在下文描述的任何修飾的PH20多肽中,其是含有或具有 SEQ ID NO:73-855任一所示氨基酸序列或者與SEQ ID NO:73-855任一所示氨基酸序列呈 現(xiàn)至少 75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列相 同性的氨基酸序列的修飾的PH20多肽,其含有至少一個(gè)氨基酸置換如上述或本文別處所 述,參考SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的位置。在本發(fā)明提供的修飾的PH20多肽的任何實(shí) 例中,修飾的PH20多肽不具有或含有SEQ ID NOS: 8-31、69-72、856-861、869或870任一所 示氨基酸序列。
      [0038] 本發(fā)明提供的修飾的PH20多肽可以是基本上純化的或分離的,在中性pH可以呈 現(xiàn)出催化活性,可以在從細(xì)胞中表達(dá)時(shí)被分泌及可溶解于上清中,和/或可包含修飾的氨 基酸,如選自如下的修飾:糖基化,唾液酸化,白蛋白化,法尼基化,羧化,羥化,與聚合物綴 合如PEG化或者與葡聚糖綴合,與另一部分如多聚化結(jié)構(gòu)域、毒素、可檢測(cè)標(biāo)記或藥物綴 合,及磷酸化。修飾的PH20多肽可以是糖基化的,如通過(guò)含有與至少三個(gè)天冬酰胺(N)殘 基的每一個(gè)連接的至少一個(gè)N-乙酰葡糖胺部分而糖基化,其中例如所述三個(gè)天冬酰胺殘 基相應(yīng)于SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基200、333和358。多聚化結(jié)構(gòu)域包括Fc結(jié)構(gòu)域。
      [0039] 本發(fā)明還提供了核酸分子,其編碼本發(fā)明提供的任何修飾的PH20多肽。本發(fā)明提 供了含有所述核酸分子的載體,真核和原核載體。所述載體包括表達(dá)載體及包括哺乳動(dòng)物 載體,包括病毒載體。病毒載體包括腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、單純皰疫 病毒和巨細(xì)胞病毒載體,及其它這種病毒載體。感興趣的是溶瘤細(xì)胞載體,其聚集在腫瘤或 者靶向腫瘤。本發(fā)明還提供了含有所述核酸分子的細(xì)胞和含有所述載體的細(xì)胞。所述細(xì)胞 可以是原核或真核細(xì)胞,特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞,如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
      [0040] 本發(fā)明還提供了修飾的PH20多肽,其是通過(guò)任何提供的細(xì)胞產(chǎn)生的。因此,本發(fā) 明提供了產(chǎn)生修飾的PH20多肽的方法,通過(guò)在一定條件下培養(yǎng)本發(fā)明提供的任何細(xì)胞,在 所述條件下所述細(xì)胞產(chǎn)生和分泌編碼的修飾的PH20多肽,并且回收表達(dá)的多肽。本發(fā)明還 提供了產(chǎn)生修飾的PH20多肽的方法,通過(guò)將本發(fā)明提供的任何核酸或者本發(fā)明提供的任 何載體導(dǎo)入能將N-連接的糖部分摻入所述多肽中的細(xì)胞中,在所述細(xì)胞產(chǎn)生及分泌編碼 的修飾的PH20多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞,并且回收表達(dá)的多肽。在這種實(shí)例中,所述核 酸與啟動(dòng)子可操縱地連接。培養(yǎng)的細(xì)胞可以是真核細(xì)胞,如哺乳動(dòng)物細(xì)胞,例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢(CHO)細(xì)胞。
      [0041] 本發(fā)明還提供了藥物組合物,其含有本發(fā)明提供的任何修飾的PH20多肽或者本 發(fā)明提供的任何核酸或載體。所述組合物可以與其它物質(zhì)和/或其它成分如防腐劑一起 配制。所述組合物可以這樣配制,由此其成分、特別是PH20及任何其它活性物質(zhì)在預(yù)選條 件下保留活性或者是穩(wěn)定的。此外,如本文所述,所述PH20多肽被修飾,由此其在不同條 件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性。例如,本發(fā)明提供了組合物,其中修飾的PH20多肽在或在大約 2°C -8°C (包括端點(diǎn))溫度是穩(wěn)定(即如本文所述保持活性)至少1個(gè)月或者在或在大約 30°C_42°C (包括端點(diǎn))溫度穩(wěn)定至少3天。本發(fā)明提供了組合物,其中所述組合物中修飾 的PH20多肽在或在大約2°C _8°C (包括端點(diǎn))溫度穩(wěn)定至少2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè) 月、6個(gè)月、7個(gè)月、至少8個(gè)月、至少9個(gè)月、至少10個(gè)月、至少11個(gè)月、至少12個(gè)月、13個(gè) 月、14個(gè)月、15個(gè)月、16個(gè)月、17個(gè)月、18個(gè)月、19個(gè)月、20個(gè)月、21個(gè)月、22個(gè)月、23個(gè)月、 24個(gè)月、25個(gè)月、26個(gè)月、27個(gè)月、28個(gè)月、29個(gè)月或30個(gè)月。本發(fā)明還提供了組合物,其 中所述組合物中修飾的PH20多肽在或在大約30°C -42°C (包括端點(diǎn))溫度穩(wěn)定至少3天、 至少4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、21天、22 天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、60天或更 長(zhǎng)時(shí)間。所述藥物組合物可含有藥物可接受的賦形劑。
      [0042] 選擇所述條件、配制物、成分和修飾的PH20多肽以實(shí)現(xiàn)希望的穩(wěn)定性。所述藥 物組合物可以配制為直接給予或者可以按需要稀釋。其可以配制為多次或單一劑量給 予。舉例的組合物包括在或在大約如下濃度的修飾的PH20多肽:0. 1μ g/mL-ΙΟΟμ g/ mL、1 μ g/mL-50 μ g/mL 或 1 μ g/mL-20 μ g/mL、或者 10U/mL-5000U/mL、50U/mL-4000U/ mL、100U/mL-2000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL 或者 100U/mL-1000U/ mL。舉例的鹽包括如下濃度的NaCl,例如低于或大約為或?yàn)?00mM、180mM、150mM、140mM、 130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、25mM、20mM、15mM、 10mM、5mM 或更低,或者為或?yàn)榇蠹s 0. lmM-200mM、0. lmM-100mM、120mM-200mM、10mM-50mM、 10mM-90mM、80mM-200mM、80mM-140mM、50mM-100mM、80mM-100mM、50mM-80mM、IOOmM-HOmM 或 者 120mM-140mM。
      [0043] 所述藥物組合物可含有抗微生物有效量的防腐劑或者防腐劑混合物,如1、2、3、 4或更多種酚類防腐劑、非酚類防腐劑或者酚類防腐劑與非酚類防腐劑,例如但不限于苯 酚、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯銨、4-氯-1-丁醇、氯己定二鹽酸 鹽、氯己定二葡糖酸鹽、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脫 氫醋酸鈉、鄰甲酚、對(duì)甲酚、氯甲酚、溴棕三甲胺、氯化芐乙胺、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯 甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯及其任何組合。酚類包括例如苯酚、間甲酚(m-甲酚)、苯甲 醇及對(duì)羥基苯甲酸酯,如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯。一或多種防腐劑的抗 微生物有效濃度(質(zhì)量濃度(《八)百分比(%))可以是0.05 <%-0.6(%、0.1(%-0.4(%、 0· 1 % -0· 3 %、0· 15 % -0· 325 %、0· 15 % -0· 25 %、0· 1 % -0· 2 %、0· 2 % -0· 3 % 或 0.3%-0.4% (包括端點(diǎn))。舉例的藥物組合物中的防腐劑是苯酚、間甲酚或者苯酚與間 甲酚,所述配制物中以質(zhì)量濃度(w/v)百分比%表示的量是或大約是0.1%-0.25%的苯 酚與是或大約是0.05% -0.2%的間甲酚、是或大約是0. 10% -0.2%的苯酚與是或大約 是0.6 % -01. 8 %的間甲酚、是或大約是0. 1% -0. 15%的苯酚與0.8 % -0. 15 %間甲酚、 是或大約是〇. 10% -〇. 15%的苯酚與是或大約是0.06-0. 09%的間甲酚或者是或大約是 0. 12% -0. 18%的苯酚與是或大約是0. 14-0. 22%的間甲酚。
      [0044] 所述藥物組合物可含有進(jìn)一步的治療活性劑。所述活性劑可以配制在組合物中或 者與含有PH20組合物組合,但是在單獨(dú)的組合物中以單獨(dú)給予,相繼、間歇、同時(shí)或一起給 予。治療活性劑包括例如選自如下的物質(zhì):化療劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、殺阿米巴 蟲(chóng)劑、殺毛滴蟲(chóng)劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗驚厥劑、抗抑郁劑、和抗關(guān)節(jié)炎劑、抗真菌劑、 抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲(chóng)劑、抗組胺劑、α-腎上腺素能激動(dòng)劑、α阻斷劑、麻醉劑、支 氣管擴(kuò)張劑、生物殺滅劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素能阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心血管藥 物、避孕藥、減充血?jiǎng)?、利尿劑、抑郁劑、診斷劑、電解劑、催眠藥、激素制劑、高血糖制劑、肌 肉松弛劑、肌肉收縮劑、眼部用藥、擬副交感神經(jīng)劑、精神興奮劑、鎮(zhèn)靜劑、擬交感神經(jīng)劑、安 定劑、尿路用藥、陰道制劑、殺病毒劑、維生素制劑、非類固醇抗炎劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑 制劑、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物、有機(jī)分子和睡眠誘導(dǎo)劑。舉例的這種制劑是抗體,特別是 單克隆抗體、免疫球蛋白制備物、二膦酸酯/鹽、細(xì)胞因子、化療劑、凝血因子和胰島素。胰 島素包括例如基礎(chǔ)胰島素和快速作用胰島素,如普通胰島素,特別是重組人胰島素,及胰島 素類似物如賴脯胰島素、門冬胰島素或賴谷胰島素。特別的快速作用胰島素是具有SEQ ID Ν0:862所示氨基酸序列的A鏈和具有SEQ ID Ν0:863所示氨基酸序列的B鏈的那些胰島 素,或者具有SEQ ID NO:864的氨基酸殘基位置88-108所示氨基酸序列的A鏈和具有SEQ ID NO: 864的氨基酸殘基位置25-54所示氨基酸序列的B鏈的胰島素,或者選自具有SEQ ID NO: 862所示氨基酸序列的A鏈和具有SEQ ID NO: 865-867任一所示氨基酸序列的B鏈的胰 島素的胰島素類似物。所述組合物中快速作用胰島素的量可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定,但是典型可 以是 10U/mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-1000U/mL 或者 500U/mL-1000U/mL (包括 端點(diǎn))。
      [0045] 在特殊實(shí)例中,本發(fā)明提供了藥物組合物,其含有本發(fā)明提供的任何修飾的PH20 多肽,其呈現(xiàn)出對(duì)于酚類防腐劑和胰島素如快速作用胰島素的增加的穩(wěn)定性。修飾的PH20 多肽和胰島素可以治療有效量提供。例如,本發(fā)明提供了藥物組合物,其含有本發(fā)明提供的 任何修飾的PH20多肽,其呈現(xiàn)出對(duì)100U/mL-1000U/mL或大約100U/mL-1000U/mL量的酚類 防腐劑和10U/mL-1000U/mL或大約10U/mL-1000U/mL量的快速作用胰島素的增加的穩(wěn)定 性。例如,快速作用胰島素可以是胰島素類似物,如賴脯胰島素、門冬胰島素或賴谷胰島素 或者其它類似物。任何這種藥物組合物可以配制為pH為或?yàn)榇蠹s7. 0-7. 6。任何這種藥物 組合物也可以配制為含有鹽如NaCl,濃度為或?yàn)榇蠹s0. lmM-200mM,和/或含有抗微生物有 效量的至少一種防腐劑,其中所述組合物通常含有至少一種酚類防腐劑。所述抗微生物有 效量是一或多種防腐劑的總量,以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(%)表示,為0.05%-0.6%。所 述酚類防腐劑可以是苯酚、間甲酚(m-甲酚)、苯甲醇或者對(duì)羥基苯甲酸酯。在任何上述藥 物組合物的實(shí)例中,所述組合物也可以含有表面活性劑,如聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、山梨 糖醇、泊洛沙姆(poloxamer)或聚山梨醇酯,所述配制物中的量以質(zhì)量濃度(w/v)%表示, 為至少或至少大約0. 001% ;緩沖劑,其是非金屬結(jié)合劑或金屬結(jié)合劑,如Tris、組氨酸、磷 酸鹽或檸檬酸鹽,其中所述緩沖劑的濃度為或?yàn)榇蠹sImM-IOOmM ;甘油,濃度低于60mM ;抗 氧化劑,如半胱氨酸、色氨酸或甲硫氨酸,濃度為或?yàn)榇蠹s2mM-50mM,包括端點(diǎn);和/或鋅, 濃度為或?yàn)榇蠹s〇. 001-0. lmg/100單位胰島素(mg/100U)。本發(fā)明還提供了閉環(huán)系統(tǒng)、胰島 素泵(包括持續(xù)皮下注入胰島素(CSII)泵)和胰島素筆,其含有任何所述藥物組合物。所 述藥物組合物可用于治療糖尿病的方法或應(yīng)用中,所述糖尿病如1型糖尿病、2型糖尿病或 者妊娠糖尿病。
      [0046] 本發(fā)明提供的任何藥物組合物中的其它治療劑包括但不限于阿達(dá)木單抗、阿加糖 酶β、阿萊法塞、氨芐青霉素、阿那白滯素、抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗、抗胸腺細(xì)胞、阿奇霉素、貝 卡普勒明、卡泊芬凈、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、西妥昔單抗、西 司他丁、克拉維酸、克林霉素、達(dá)依泊汀α、達(dá)克珠單抗、白喉、白喉抗毒素、白喉類毒素、依 法珠單抗、腎上腺素、促紅細(xì)胞生成素 α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促卵泡 素 α、促卵泡素 β、磷苯妥英、禮雙胺、Gadopentetates、加替沙星、格拉默、GM-CSF's、戈舍 瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司瓊、流感嗜血桿菌B、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、 替伊莫單抗、Tiuxetans、免疫球蛋白、流感嗜血桿菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔單抗、賴 脯胰島素、75%中性賴脯魚(yú)精蛋白(neutral protamine lispro) (NPL)/25%賴脯胰島素、 50%中性魚(yú)精蛋白Hagedorn(NPH)/50%普通胰島素、70% NPH/30%普通胰島素;普通胰島 素、NPH胰島素、超級(jí)胰島素 (Ultra insulin)、特慢胰島素、和甘精胰島素、干擾素、干擾素 α、干擾素 β、干擾素 Y、干擾素 a-2a、干擾素 a2-b、干擾素 Alphacon、干擾素 α-η、干 擾素 β、干擾素 β-la's、干擾素 Y、干擾素 a-con、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮 咯酸、拉羅尼酶、左氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、勞拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎 病毒、麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹病毒疫苗、風(fēng)疹疫苗、甲羥孕酮、美羅培南、甲潑尼龍、咪達(dá)唑侖、 嗎啡、奧曲肽、奧馬珠單抗、昂丹司瓊、帕利珠單抗、泮托拉唑、培門冬酶、培非司亭、Peg-干 擾素 a-2a、Peg-干擾素 a_2b、培維索孟、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗和肺炎球 菌綴合物疫苗、異丙嗪、瑞替普酶、生長(zhǎng)激素、舒巴坦、舒馬普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破傷 風(fēng)純化類毒素、替卡西林、托西莫單抗、曲安西龍、曲安奈德、己曲安奈德、萬(wàn)古霉素、水痘帶 狀皰疹免疫球蛋白、水痘疫苗、其它疫苗、阿侖珠單抗、阿利維A酸、別嘌呤醇、六甲蜜胺、氨 磷汀、阿那曲唑、砒霜、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、BCG Live、貝沙羅汀、 博來(lái)霉素、白消安、靜脈內(nèi)白消安、口服白消安、卡普睪酮、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、卡莫 司汀與聚苯丙生、塞來(lái)昔布、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂 質(zhì)體、達(dá)卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素脂質(zhì)體、柔紅霉素、道諾霉素、地尼白介素2、右雷佐生、 多西他賽、多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體、丙酸屈他雄酮、Elliott's B溶液、表柔比星、阿法 依泊汀、雌氮芥、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16S、依西美坦、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、 氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟維司群、吉西他濱、吉妥珠單抗、奧佐米星、吉妥珠單抗奧佐米星、 羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、甲磺酸伊馬替尼、伊立替康、來(lái)曲唑、甲酰四氫葉酸、左旋咪 唑、洛莫司汀、CCNUs、氮芥(Mechlorethamines)、氮芥(Nitrogen mustards)、甲地孕酮、醋 酸甲地孕酮、美法侖、L-PAMs、巰嘌呤、6-巰嘌呤、美司鈉、氨甲喋呤、甲氧沙林、絲裂霉素類、 絲裂霉素 C、米托坦、米托蒽醌、諾龍、苯丙酸諾龍、若莫單抗、奧普瑞白介素、奧沙利鉬、紫杉 醇、帕瑪二磷酸、培加酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、光輝霉素、嚇?lè)茽栤c、嚇?lè)阅封c、丙 卡巴肼、奎納克林、拉布立酶、利妥普單抗、沙格司亭、鏈脲菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、 替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥(niǎo)嘌呤、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤、三亞乙基硫代磷酰胺(噻替派)、托泊替康、 托瑞米芬、曲妥珠單抗、維甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、唑來(lái) 膦酸(Zoledronates)、阿西維辛、阿柔比星、阿考達(dá)唑、阿克羅寧、阿多來(lái)新、阿地白介素、視 黃酸、阿利維A酸、9-順式-視黃酸、Alvocidibs、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨魯米特、 安吖啶、阿那昔酮、安西他濱、氨茴霉素、Apaziquones、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎 胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、Banoxantrones、Batabulins、巴馬司他、貝那昔濱、苯達(dá)莫司汀、 苯佐替派、比卡魯胺、比他舍平、比立考達(dá)、比生群、Bisnafide Dimesylates、比折來(lái)新、硼替 佐米、布喹那、溴匹立明、布度鈦、放線菌素 C、Canertinibs、卡醋胺、卡貝替姆、卡波醌、卡莫 氟、卡柔比星、卡折來(lái)新、西地芬戈、西馬多丁、苯丁酸氮芥、塞奧羅奈、西羅霉素、克蘭氟脲、 氯法拉濱、克立那托、地西他濱、右尼古地平、右?jiàn)W馬鉬、地扎胍寧、地Π 丫醌、Dibrospidiums、 地諾孕素、地那林、Disermolides、Dofequidars、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、達(dá)佐霉素、依考莫 司汀、依達(dá)曲沙、Edotecarins、依氟鳥(niǎo)氨酸、依拉克達(dá)、依利奈法德、依沙蘆星、乙啼替氟、恩 洛鉬、恩普氨酯、Enzastaurins、依匹哌陡、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依 托格魯、氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉濱、芬維A胺、氟甲睪酮、氟西他濱、磷喹酮、 福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他濱、吉羅酚、Gimatecans、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷 酰胺、伊莫福新、伊洛馬司他、伊美克、英丙舒凡、Indisulams、雙丙氧亞胺醌、白介素、白介 素-2s、重組白介素、茚托利辛、碘芐胍、異丙鉬、伊索拉定、Ixabepilones、酮曲沙、L-阿拉 諾新、蘭瑞肽、Lapatinibs、來(lái)多蒽瓊、亮丙瑞林、亮丙瑞林、來(lái)沙骨化醇、利阿唑、洛鉬、洛 美曲索、法尼醇蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑(Lonafarnibs)、洛索蒽醌、勒托替康、馬磷酰胺、甘露舒 凡、馬立馬司他、馬索羅酚、美坦辛、氮芥、美侖孕酮、美法侖、美諾立爾、美雄烷、美替辛德、 美托咪酯、氯苯氨陡、美妥替哌、米帕、米潑昔芬、米索硝唑、米丁度胺、Mitocarcins、絲裂 紅素、米托拉酮、米托潔林、米托胍腙、米托馬星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、 米伏布林、咪唑立賓、莫法羅汀、莫哌達(dá)醇、Mubritinibs、霉酚酸、奈達(dá)鉬、Neizarabines、 奈莫柔比星、硝氨丙卩丫陡、諾考達(dá)唑、諾拉霉素、諾拉曲塞、Nortopixantrones、奧馬鉬、 Ortataxels、奧替拉西、奧昔舒侖、氧芬胂、PatupiIones、培得星、培利霉素、Pelitrexols、 培美曲塞、溴新斯的明、培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、Picoplatins、吡奈非特、哌泊舒凡、 批非尼酮、批羅蒽醌、Pixantrones、Plevitrexeds、普洛美坦、泊非霉素、波尼莫司汀、普 羅帕脒、螺丙醇、嘌嘧替派、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、羅谷 亞胺、羅喹美克、鏈黑霉素、Sabarubicins、沙芬戈、沙鉬、司鉬、司莫司汀、辛曲秦、西左非 蘭、索布佐生、索拉非尼、Sparfosates、磷乙天冬氨酸、司帕霉素、鍺螺胺、螺莫司汀、螺鉬、 角S胺、鏈黑霉素、鏈伐立星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、Tacedinalines、他利霉素、他莫司汀、 Tariquidars、?;悄就?、Tecogalans、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替羅昔隆、硫咪噪呤、 硫咪嘌呤、噻唑羧胺核苷、噻氯咪索、替洛隆、汀考達(dá)、噻莫西酸、替拉扎明、Topixantrones、 曲貝替定、海鞘素743、曲托龍、曲西立濱、曲洛司坦、三甲曲沙、Triplatin Tetranitrates、 曲普瑞林、曲磷胺、妥布氯唑、烏苯美司、烏瑞替派、伐司樸達(dá)、伐普肽、維替泊芬、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng) 春地辛、長(zhǎng)春匹定、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春米特、長(zhǎng)春甘酯、長(zhǎng)春西醇、長(zhǎng)春羅新、長(zhǎng)春羅定、長(zhǎng)春曲 醇、長(zhǎng)春利定、伏氯唑、黃鏈霉素 A、胍甲環(huán)素、折尼鉬、亞芐維C(2H)、凈司他丁、佐柔比星、 Zosuquidars、乙酰唑胺、阿昔洛韋、膽影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、變應(yīng)原浸出物、α 1-蛋 白酶抑制劑、前列地爾、阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶堿、阿米替林、異戊巴比妥、氨力 農(nóng)、鎮(zhèn)痛藥、抗-脊髓灰質(zhì)炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破傷風(fēng)免疫球蛋白、破傷風(fēng)疫苗、抗凝 血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精氨酸、抗壞血酸、阿替洛爾、阿曲庫(kù)銨、阿托品、金硫葡 糖、硫唑嘌呤、氨曲南、桿菌肽、巴氯芬、巴利昔單抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、 比伐盧定、肉毒抗毒素、溴芐銨、布美他尼、布比卡因、丁丙諾啡、布托啡諾、降鈣素、骨化三 醇、鈣、卷曲霉素、卡波前列素、肉堿、頭孢孟多、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑肟、 頭孢呋辛、氯霉素、氯普魯卡因、氯喹、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸軟骨素、絨毛膜促性腺激素 α、 鉻、西多福韋、西咪替丁、環(huán)丙沙星、順阿曲庫(kù)銨、可樂(lè)定、可待因、秋水仙堿、粘菌素、膠原、 Corticorelin ovine triflutates、促皮質(zhì)素、二十四肽促皮質(zhì)素、氰鈷胺、環(huán)孢菌素、半胱 氨酸、達(dá)昔單抗、達(dá)福普汀、達(dá)肝素、達(dá)那肝素、丹曲林、去鐵胺、去氨加壓素、地塞米松、右美 托咪定、右泛醇、右旋糖酐、右旋糖酐鐵、泛影酸、地西泮、二氮嗪、雙環(huán)維林、Digibinds、地 高辛、雙氫麥角胺、地爾硫卓、苯海拉明、雙嘧達(dá)莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯銨、多沙普 侖、度骨化醇、多西環(huán)素、氟哌利多、二羥丙茶堿、依地酸、依酚氯銨、依那普利拉、麻黃堿、依 前列醇、麥角1丐化醇、麥角新堿、厄他培南、紅霉素、艾司洛爾、雌二醇、Estrogenics、依他尼 酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、羥乙磷酸、依托咪酯、法莫替丁、非諾多泮、芬太尼、氟馬西尼、熒 光素、氟奮乃靜、葉酸、甲吡唑、福米韋生、磺達(dá)肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、釓特醇、釓 弗塞胺、更昔洛韋、慶大霉素、胰高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆溴銨、戈那瑞林、絨毛膜促 性腺激素、嗜血桿菌B多糖、氯化血紅素、Herbals、組胺、肼苯噠嗪、氫化可的松、氫嗎啡酮、 羥鈷胺、羥嗪、莨菪堿、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺、碘拉酸、碘 克沙酸、碘昔蘭、異煙肼、異丙腎上腺素、日本腦炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉貝洛爾、來(lái)匹 盧定、左布比卡因、左甲狀腺素、林可霉素、碘塞羅寧、促黃體激素、萊姆病疫苗、錳福地吡、 Manthtols、腦膜炎球菌多糖疫苗、哌替啶、甲哌卡因、美索達(dá)嗪、間羥胺、美沙酮、美索巴莫、 美索比妥、甲基多巴類、甲基麥角新堿、甲氧氯普胺、美托洛爾、甲硝唑、米諾環(huán)素、米伐克 龍、魚(yú)肝油酸、莫西沙星、莫羅單抗-CD3、麥考酚酸嗎乙酯、萘夫西林、納布啡、納美芬、納洛 酮、新斯的明、煙酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普鈉、去甲腎上腺素、奧芬那君、苯唑西林、羥 嗎啡酮、土霉素、縮宮素、潘可龍、泛醇、泛酸、罌粟堿、PEG干擾素 α 2A、青霉素 G、噴他脒、噴 他佐辛、戊巴比妥、全氟丙烷、奮乃靜、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧腎上腺素、苯妥英、毒扁豆 堿、植物甲萘醌、多粘菌素、解磷定、丙胺卡因、普魯卡因胺、普魯卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘 洛爾、吡啶斯的明氫氧化物、維生素 Β6、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、 雷尼替丁、瑞芬太尼、核黃素、利福平、羅哌卡因、釤、東莨菪堿、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人 蛋氨生長(zhǎng)素、壯觀霉素、鏈激酶、鏈霉素、琥珀酰膽堿、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他羅利姆、特 布他林、特立帕肽、睪酮、破傷風(fēng)抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸鹽/酯、茶堿、硫胺素、硫乙 拉嗪、硫噴妥、促甲狀腺激素、亭扎肝素、替羅非班、妥布霉素、妥拉唑啉、甲苯磺丁脲、托拉 塞米、氨甲環(huán)酸、曲羅尼爾、三氟拉嗪、曲美芐胺、甲氧芐啶、氨丁三醇、結(jié)核菌素、傷寒疫苗、 尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸、加壓素、維庫(kù)溴銨、維拉帕米、伏立康唑、華法林、黃熱病疫苗、 齊多夫定、鋅、鹽酸齊拉西酮、阿克拉霉素、放線菌素、阿霉素、偶氮絲氨酸、6_氮尿苷、嗜癌 素、色霉素、二甲葉酸、6-疊氮-5-氧-L-正亮氨酸、依諾他濱、氟尿苷、橄欖霉素、吡柔比星、 吡曲克辛、蝶羅呤、替加氟、殺結(jié)核菌素、阿替普酶、阿西莫單抗、貝伐珠單抗、A型肉毒菌毒 素、B型肉毒菌毒素、卡羅單抗噴地肽、達(dá)克珠單抗、阿法鏈道酶、替加色羅α、戊酸印西洛 馬、碘-131 ;抗生素物質(zhì);血管發(fā)生抑制劑;抗白內(nèi)障和抗糖尿病視網(wǎng)膜病變藥物;碳酸酐 酶抑制劑;瞳孔放大劑;光動(dòng)力治療劑;前列腺素類似物;生長(zhǎng)因子;抗腫瘤藥物;抗代謝 物;抗病毒藥物;殺阿米巴劑和抗原生動(dòng)物劑;抗結(jié)核藥和抗麻風(fēng)藥;抗毒素和抗蛇毒素; 抗血友病因子,抗抑制劑凝血復(fù)合物,抗凝血酶III,凝血因子V,凝血因子IX,血漿蛋白級(jí) 分,von Willebrand因子;抗血小板制劑,集落刺激因子(CSF);紅細(xì)胞生成刺激物;止血?jiǎng)?和白蛋白;免疫球蛋白;凝血酶抑制劑;抗凝血?jiǎng)?;類固醇抗炎藥物,選自阿氯米松、阿爾孕 酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)酮、可的 松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羥米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯、甘 草次酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼縮松、膚輕松、醋酸氟輕松、氟可丁、氟可龍、氟米 龍、氟培龍、氟潑尼定、氟潑尼龍、丙酮縮氟氫羥龍、氟替卡松、福莫可他、氯氟舒松、齒倍他 索(halobetasols)、鹵米松、鹵潑尼松、氫可他酯、氫化可的松、氯替潑諾碳酸乙酯、馬潑尼 酮、甲羥松、甲潑尼松、甲潑尼龍、糠酸莫米松、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼松龍、潑尼松、強(qiáng)的 松龍戊酸酯、潑尼立定、利美索龍、替可的松和曲安西龍;二十二醇,前列腺素類藥物,前列 腺素類似物,抗前列腺素和前列腺素前體;縮瞳劑,膽堿能藥和抗膽堿酯酶;及抗變態(tài)反應(yīng) 藥。
      [0047] 所述組合物和修飾的PH20多肽可用于治療通常通過(guò)所述PH20多肽或所述治療活 性劑治療的任何病癥。這些病癥包括例如其中乙酰透明質(zhì)酸起作用或者乙酰透明質(zhì)酸與疾 病病因由于例如乙酰透明質(zhì)酸積聚或過(guò)度產(chǎn)生而相關(guān)的病癥。因此,本發(fā)明提供了所述組 合物和修飾的PH20多肽通過(guò)給予任何修飾的PH20多肽或本發(fā)明提供的組合物用于治療乙 酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥的方法和應(yīng)用。乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥包括例如炎癥疾 病和腫瘤或癌癥,包括晚期癌癥、轉(zhuǎn)移癌癥和未分化癌癥,如卵巢癌、原位癌(ISC)、鱗狀細(xì) 胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。所述PH20多肽可以是修飾 的,以呈現(xiàn)出對(duì)于這種治療的增加的半衰期。例如,針對(duì)這種治療,所述PH20多肽可以用聚 合物如PEG部分修飾。
      [0048] 本發(fā)明還提供了增加治療劑輸送至對(duì)象的方法,通過(guò):給予對(duì)象本發(fā)明提供的任 何修飾的PH20多肽或組合物,并給予所述治療劑。所述治療劑可以在同一組合物中給予或 者單獨(dú)給予,可以在給予PH20多肽之前或之后、同時(shí)或間歇給予。給予包括任何途徑,包括 靜脈內(nèi)和皮下給予,如與給予所述治療劑同時(shí)、間歇或隨后。所述治療劑包括上述、本文別 處和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何那些制劑。
      [0049] 本發(fā)明還提供了通過(guò)給予本發(fā)明提供的修飾的PH20多肽或組合物治療糖胺聚糖 過(guò)量、治療腫瘤、治療糖胺聚糖在腦中積聚、治療心血管疾病、治療眼部病癥、治療肺部疾 病、增加化療劑滲透進(jìn)實(shí)體腫瘤中、治療蜂窩組織、治療增殖性病癥、或者增加藥物和其它 治療劑的生物利用度的方法。
      [0050] 本發(fā)明還提供了藥物組合物以用于治療乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥、用于輸送 治療劑至對(duì)象、治療糖胺聚糖過(guò)量、治療腫瘤、治療糖胺聚糖在腦中積聚、治療心血管病癥、 治療眼部病癥、治療肺部疾病、增加化療劑滲透至實(shí)體腫瘤中、治療蜂窩組織、治療增殖性 病癥,或者增加藥物及其它治療劑的生物利用度,以及含有PH20多肽的組合物的任何其它 應(yīng)用。
      [0051] 本發(fā)明提供了鑒別或選擇在變性條件下呈現(xiàn)穩(wěn)定性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解 酶的方法,其包括如下步驟:a)檢測(cè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶在含有變性劑的組合物中 和/或在變性條件下的活性;b)檢測(cè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶在與a)除了不存在變性 劑或變性條件之外相同的組合物中和/或在相同條件下的活性;及c)選擇或鑒別修飾的乙 酰透明質(zhì)酸降解酶,其呈現(xiàn)出在a)中的活性是在b)中活性的至少5%。在這種實(shí)例中,所述 活性是透明質(zhì)酸酶活性。在所述方法的一些實(shí)例中,如果在a)中的活性是在b)中活性的至 少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85 %、90 %、95 %或更高,選擇或鑒別修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶,例如如果在a)中的活性 是在b)中活性的至少40%或更高,選擇或鑒別修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。所述方法也可 以包括步驟:d)對(duì)比修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶在a)中的活性與未修飾的乙酰透明質(zhì)酸 降解酶在相同條件下檢測(cè)的活性;及e)鑒別或選擇修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶,其與未修 飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比呈現(xiàn)至少120 %、130 %、135 %、140 %、145 %、150 %、160 %、 170 %, 180 % ,200 % ,250 % ,300 % ,350 % ,400 % ,500 %, 1500 % ,2000 % ,3000 % ,4000 %, 5000 %或更高的透明質(zhì)酸酶活性。
      [0052] 本發(fā)明還提供了一種鑒別或選擇修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的方法,所述酶在變 性條件下呈現(xiàn)穩(wěn)定性如增加的穩(wěn)定性,所述方法包括如下步驟:a)檢測(cè)修飾的乙酰透明質(zhì) 酸降解酶在含有變性劑的組合物中和/或在變性條件下的活性;b)檢測(cè)相應(yīng)未修飾的乙 酰透明質(zhì)酸降解酶在含有與a)相同的變性劑的組合物中和/或在與a)相同變性條件下 的活性,其中活性在a)相同的條件下檢測(cè);及c)選擇或鑒別呈現(xiàn)出比未修飾的乙酰透明 質(zhì)酸降解酶更高活性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶,從而鑒別或選擇在變性條件下呈現(xiàn)出 增加的穩(wěn)定性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。在這樣的實(shí)例中,所述活性可以是透明質(zhì)酸 酶活性。在所述方法的實(shí)例中,如果所述活性與未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比是其 至少 120 %、130 %、135 %、140 %、145 %、150 %、160 %、170 %、180 %、200 %、250 %、300 %、 350 %、400 %、500 %、1500 %、2000 %、3000 %、4000 %、5000 % 或更高活性,則選擇或鑒別修 飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。在這樣的實(shí)例中,所述方法還可包括另外的步驟:d)檢測(cè)含有 變性劑的組合物中和/或在變性條件下選擇的或鑒別的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的活 性;e)在除了不存在變性劑或變性條件之外,在與d)相同的組合物和/或在相同條件下檢 測(cè)相同的選擇或鑒別的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的活性;及f)選擇或鑒別呈現(xiàn)出在d) 中的活性是在e)中活性的至少5%的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。在這樣的實(shí)例中,所述 活性是透明質(zhì)酸酶活性。在所述方法的一些實(shí)例中,如果在d)中所述活性是在e)中活性 的至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%或更高,選擇或鑒別修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶,例如如果在d)中 所述活性是在e)中活性的至少40%或更多,選擇或鑒別修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。
      [0053] 在本發(fā)明提供的鑒別或選擇修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的任何方法中,所述變性 劑或變性條件是由溫度、攪動(dòng)、無(wú)鹽或低鹽或者存在賦形劑導(dǎo)致的。例如,所述變性劑或條 件是由為或大約為30°C -42°C如高于或高于大約30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、 37°C、38°C、39°C、40°C、41°C或42°C的升高的溫度所致。在其它實(shí)例中,所述變性劑或變 性條件是不存在鹽或低于IOOmM的低鹽,如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、 25mM、20mM、15mM、10mM、5mM的低鹽。在進(jìn)一步的實(shí)例中,所述變性劑或條件是選自如下的 變性賦形劑:抗粘附劑、結(jié)合劑、涂覆劑、充填劑和稀釋劑、香料、色素、潤(rùn)滑劑、助流劑、防腐 齊U、吸附劑和甜味劑。
      [0054] 在本發(fā)明提供的鑒別或選擇修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的任何方法的特殊實(shí)例 中,所述變性劑或條件是防腐劑,例如酚類防腐劑。所述酚類防腐劑可以是苯酚、間甲酚 (m-甲酚)、苯甲醇或者對(duì)羥基苯甲酸酯。例如,所述變性劑或條件是防腐劑,其是苯酚和 /或間甲酚。在這樣的實(shí)例中,所述組合物中酚類防腐劑的總量以質(zhì)量濃度(w/v)百分 比(% )表示,是或大約是 〇· 05% -ο. 6%、0· 1% -ο. 4%、0· 1% -ο. 3%、0· 15% -ο. 325%、 0· 15% -0· 25%、0· 1% -0· 2%、0· 2% -0· 3%或 0· 3% -0· 4%。
      [0055] 在本發(fā)明提供的鑒別或選擇修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的任何方法中,在檢測(cè)在 a)和/或b)中乙酰透明質(zhì)酸降解酶組合物的活性之前,將乙酰透明質(zhì)酸降解酶暴露于變性 條件或變性劑預(yù)定時(shí)間。所述預(yù)定時(shí)間是用戶根據(jù)待進(jìn)化或選擇的特定乙酰透明質(zhì)酸降解 酶、特定的變性條件或變性劑、變性條件或變性劑的量或程度、乙酰透明質(zhì)酸降解酶的應(yīng)用 或使用及其它相似因素而選擇的時(shí)間。例如,所述預(yù)定時(shí)間可以是或大約是1分鐘至1個(gè) 月、1分鐘-3周、1分鐘-2周、1分鐘-1周、1分鐘-24小時(shí)、1分鐘-12小時(shí)、30分鐘-6小 時(shí)或者1小時(shí)-4小時(shí),如至少或大約至少30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6 小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天、6天、7 天、2周或1個(gè)月。
      [0056] 在本發(fā)明提供的鑒別或選擇修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的任何方法中,所述修飾 的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是與未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比含有氨基酸置換、插入或缺 失的酶。例如,所述修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與未修飾形式的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比 含有氨基酸置換,如1個(gè)氨基酸置換或者2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸置換。在所述 方法的特殊方面,篩選修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的文庫(kù)或集合以進(jìn)化或鑒別或選擇在變 性條件下呈現(xiàn)穩(wěn)定性如增加的穩(wěn)定性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。因此,在本發(fā)明方法 的實(shí)例中,在a)和/或b)中檢測(cè)多個(gè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。在這樣的實(shí)例中,所述 多個(gè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與相應(yīng)未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比被修飾,以產(chǎn)生 修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶集合,其中該集合中的每個(gè)修飾的蛋白質(zhì)均在a)和/或b)中 檢測(cè)。在所述集合或文庫(kù)中,每個(gè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與未修飾形式的乙酰透明質(zhì) 酸降解酶相比含有一個(gè)氨基酸置換,由此所述多個(gè)修飾的酶是這樣的,即在每個(gè)修飾的位 置的氨基酸由除了在該位置的原始氨基酸之外的至多1-19種其它氨基酸置換,其中每個(gè) 修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶含有不同的氨基酸置換,沿著乙酰透明質(zhì)酸降解酶長(zhǎng)度或者其 選擇的一部分的每個(gè)氨基酸被置換。
      [0057] 在本發(fā)明提供的任何方法中,修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與未修飾的乙酰透明質(zhì) 酸降解酶相比由于氨基酸的插入、缺失或置換而被修飾。未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶可 以是軟骨素酶或者可以是透明質(zhì)酸酶。在本發(fā)明的實(shí)例中,未修飾的透明質(zhì)酸酶是PH20透 明質(zhì)酸酶或者是其缺少C-末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨附著位點(diǎn)或者GPI錨附著位點(diǎn)的 一部分的截短形式,其中所述截短形式呈現(xiàn)透明質(zhì)酸酶活性。PH20透明質(zhì)酸酶可以是人、 猴、牛、羊、大鼠、狐貍、小鼠或豚鼠 PH20。在特殊實(shí)例中,所述PH20透明質(zhì)酸酶是人PH20 或其C末端截短形式。例如,未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是具有SEQ ID N0:3、7、10、12、 14、24、32-66、69、72、857、859、861、870任一所示氨基酸序列或者與SEQIDN0:3、7、10、12、 14、24、32-66、69、72、857、859、861、870 任一具有至少 80%序列相同性如與 SEQ ID N0:3、 7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、或 870 任一具有至少85%、86%、87%、88%、 89!%、90!%、91!%、92!%、93!%、94!%、95!%、96!%、97!%、98!%、99序列相問(wèn)性的氣基酸序列 的酶。在特定的實(shí)例中,未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是PH20透明質(zhì)酸酶,其具有SEQ ID N0:3、7、32-66、69或72任一所示氨基酸序列或者與SEQIDN0:3、7、32-66、69或72任一呈 現(xiàn)至少85%序列相同性的氨基酸序列,如與SEQ ID N0:3、7、32-66、69或72任一呈現(xiàn)至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序 列相同性的氨基酸序列。
      [0058] 在本發(fā)明提供的鑒別或選擇呈現(xiàn)穩(wěn)定性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的任何方 法中,所述方法在體外進(jìn)行。本發(fā)明還提供了重復(fù)的方法,其中所述方法的步驟重復(fù)多次, 其中在每次重復(fù)中,產(chǎn)生并檢測(cè)選擇的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的進(jìn)一步修飾的乙酰透 明質(zhì)酸降解酶,其中所述修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶被進(jìn)化為在變性條件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn) 定性。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明提供的任何方法鑒別的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。
      [0059] 附圖簡(jiǎn)述
      [0060] 圖1示出全長(zhǎng)人PH20(SEQ ID NO: 7示出)及其可溶的C末端截短變體的氨基酸 序列。舉例的全長(zhǎng)PH20的C末端截短變體的C末端氨基酸殘基以粗體字表示。舉例的全 長(zhǎng)PH20的C末端截短變體的完整氨基酸序列也在SEQ ID N0:3和32-66中提供。舉例的可 溶PH20的C末端氨基酸殘基以下劃線示出,其完整序列在SEQ ID NO: 3中示出。舉例的非 限制性的氨基酸置換的位置以高亮示出。相應(yīng)位置可以通過(guò)排列對(duì)比感興趣的序列與SEQ ID N0:3、7或32-66任一所示序列、特別是SEQ ID N0:3所示序列而鑒別。
      [0061] 圖2示出舉例的SEQ ID勵(lì):3所示人可溶?!120與其它?!120多肽的排列對(duì)比。"*" 是指排列對(duì)比的殘基是相同的,":"是指排列對(duì)比的殘基是不相同的,但是是相似的且在排 列對(duì)比的位置含有保守氨基酸殘基,"是指排列對(duì)比的殘基是相似的且在排列對(duì)比的位 置含有半保守氨基酸殘基。舉例的非限制性的氨基酸置換的相應(yīng)位置以加亮示出。例如,圖 2A示出SEQ ID NO: 3所示人可溶PH20與SEQ ID NO: 10所示黑猩猩PH20的排列對(duì)比。圖 2B示出SEQIDN0:3所示人可溶PH20與SEQIDN0:12所示獼猴PH20的排列對(duì)比。圖2C 示出SEQ ID NO: 3所示人可溶PH20與SEQ ID NO: 14所示食蟹猴PH20的排列對(duì)比。圖2D 示出SEQ ID NO: 3所示人可溶PH20與SEQ ID NO: 16所示牛PH20的排列對(duì)比。圖2E示出 SEQ ID NO: 3所示人可溶PH20與SEQ ID NO: 20所示小鼠 PH20的排列對(duì)比。圖2F示出SEQ ID NO: 3所示人可溶PH20與SEQ ID NO: 22所示大鼠 PH20的排列對(duì)比。圖2G示出SEQ ID NO: 3所示人可溶PH20與SEQ ID NO: 24所示兔PH20的排列對(duì)比。圖2H示出SEQ ID NO: 3 所示人可溶PH20與SEQ ID NO: 29所示豚鼠 PH20的排列對(duì)比。圖21示出SEQ ID NO: 3所 示人可溶PH20與SEQ ID NO: 31所示狐貍PH20的排列對(duì)比。圖2J示出SEQ ID NO: 3所示 人可溶PH20與SEQ ID N0:857所示長(zhǎng)臂猿PH20的排列對(duì)比。圖2K示出SEQ ID N0:3所 示人可溶PH20與SEQ ID NO:859所示狨猴PH20的排列對(duì)比。圖2L示出SEQ ID NO: 3所 示人可溶PH20與SEQ ID N0:861所示猩猩PH20的排列對(duì)比。
      [0062] 發(fā)明詳述
      [0063] 大綱
      [0064] A.定義
      [0065] B. PH20透明質(zhì)酸酶
      [0066] 1.結(jié)構(gòu)
      [0067] 2.功能
      [0068] 3.可溶的PH20多肽
      [0069] C.修飾的PH20多肽
      [0070] 1.活性突變體
      [0071] a.增加的活性
      [0072] b.增加的穩(wěn)定性
      [0073] i.耐酚類
      [0074] ii.耐熱
      [0075] iii.無(wú)鹽
      [0076] 2.失活的突變體
      [0077] 3.另外的修飾
      [0078] a.降低的免疫原性
      [0079] b.與聚合物綴合
      [0080] D.鑒別具有改變的性質(zhì)或活性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的方法
      [0081] 1.乙酰透明質(zhì)酸降解酶與修飾的透明質(zhì)酸降解酶的文庫(kù)
      [0082] 2.針對(duì)希望的活性或性質(zhì)進(jìn)行篩選或檢測(cè)
      [0083] 3.選擇或鑒別
      [0084] 4.重復(fù)方法
      [0085] E.修飾的多肽及編碼核酸分子的產(chǎn)生
      [0086] 1.編碼PH20多肽的核酸的分離或制備
      [0087] 2.突變體或修飾的核酸和編碼多肽的產(chǎn)生
      [0088] 3.載體和細(xì)胞
      [0089] 4.表達(dá)
      [0090] a.原核細(xì)胞
      [0091] b.酵母細(xì)胞
      [0092] c.昆蟲(chóng)和昆蟲(chóng)細(xì)胞
      [0093] d.哺乳動(dòng)物表達(dá)
      [0094] e.植物和植物細(xì)胞
      [0095] 5.純化
      [0096] 6.通過(guò)PEG化修飾多肽
      [0097] F.藥物組合物和配制物、劑量及給予
      [0098] 1.配制物(液體、可注射的溶液和乳狀液)
      [0099] a.凍干
      [0100] b.舉例的配制物
      [0101] i.NaCl
      [0102] ii. pH和緩沖液
      [0103] iii.防腐劑
      [0104] iv.穩(wěn)定劑
      [0105] 2.其它給予途徑的組合物
      [0106] 3.劑量及給予
      [0107] 4.舉例的PH20-胰島素共配制物
      [0108] 5.包裝、產(chǎn)品和試劑盒
      [0109] G.評(píng)定透明質(zhì)酸酶活性的方法
      [oho] 1.透明質(zhì)酸酶活性
      [0111] 2.溶解性
      [0112] 3.純度、結(jié)晶化或聚集
      [0113] 4.藥效學(xué)/藥動(dòng)學(xué)
      [0114] H.治療和組合治療的方法
      [0115] 1.輸送治療劑的方法
      [0116] 輸送胰島素
      [0117] 2.治療乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病和病癥的方法
      [0118] 3.其它應(yīng)用
      [0119] 4.避孕
      [0120] I.實(shí)施例
      [0121] A.定義
      [0122] 除非特別定義,本文中使用的所有技術(shù)和學(xué)術(shù)用語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員通常理解的相同含義。在本說(shuō)明書中提及的所有專利、專利申請(qǐng)、公開(kāi)的申請(qǐng)和公開(kāi)、 GenBank序列、數(shù)據(jù)庫(kù)、網(wǎng)站及其它公開(kāi)的材料除非特別指出則均以其全部?jī)?nèi)容并入本文作 參考。在本文術(shù)語(yǔ)有多個(gè)定義的情況中,以當(dāng)前章節(jié)定義為準(zhǔn)。在參考URL或其它這種標(biāo) 識(shí)符或地址的情況中,應(yīng)理解這種標(biāo)識(shí)符可以改變,互聯(lián)網(wǎng)上特定信息可以來(lái)來(lái)往往,但是 通過(guò)搜索互聯(lián)網(wǎng)可以發(fā)現(xiàn)等價(jià)信息。參考表明這種信息的可利用性和公眾傳播。
      [0123] 如本文所用,乙酰透明質(zhì)酸降解酶是指催化乙酰透明質(zhì)酸聚合物(也稱作透明 質(zhì)酸或HA)裂解為小分子量片段的酶。舉例的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是透明質(zhì)酸酶及特別 的軟骨素酶和裂解酶,其具有使乙酰透明質(zhì)酸解聚的能力。是透明質(zhì)酸降解酶的舉例的 軟骨素酶包括但不限于軟骨素 ABC裂解酶(也稱作軟骨素酶ABC)、軟骨素 AC裂解酶(也 稱作硫酸軟骨素裂解酶或者硫酸軟骨素消除酶(eliminase))及軟骨素 C裂解酶。軟骨 素 ABC裂解酶含有兩種酶,即硫酸軟骨素-ABC內(nèi)裂解酶(endolyase) (EC 4. 2. 2. 20)和 硫酸軟骨素-ABC外裂解酶(exolyase) (EC 4. 2. 2. 21)。舉例的硫酸軟骨素-ABC內(nèi)裂 解酶和硫酸軟骨素-ABC外裂解酶包括但不限于來(lái)自普通變形菌(Proteus vulgaris) 和Pedobacter heparinus的那些酶(普通變形菌硫酸軟骨素-ABC內(nèi)裂解酶如SEQ ID N0:922 所不;Sato et al.(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(l):39-46)。來(lái)自細(xì) 菌的舉例的軟骨素酶AC酶包括但不限于來(lái)自Pedobacter heparinus的酶,如SEQ ID NO:923所示;來(lái)自Victivallis vadensis的酶,如SEQ ID NO:924所示;及來(lái)自金黃節(jié)桿 菌(Arthrobacter aurescens)的酶(Tkalec et al. (2000)Applied and Environmental Microbiology 66(I):29-35 ;Ernst et al. (1995)Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5) :387-444)。來(lái)自細(xì)菌的舉例的軟骨素酶C酶包括但不 限于來(lái)自鏈球菌屬(Streptococcus)和黃桿菌屬(Flavobacterium)的那些酶(Hibi et al. (1989)FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4 ;Michelacci et al. (1976)J.Biol. Chem. 251:1154-8 ;Tsuda et al. (1999) Eur.J.Biochem. 262:127-133)。
      [0124] 如本文所用,透明質(zhì)酸酶是指一類降解乙酰透明質(zhì)酸的酶。透明質(zhì)酸酶包括但不 限于細(xì)菌透明質(zhì)酸酶(EC 4. 2. 2.1或EC 4.2.99.1),來(lái)自水蛭、其它寄生蟲(chóng)和甲殼綱動(dòng)物 的透明質(zhì)酸酶(EC 3. 2. 1. 36),以及哺乳動(dòng)物型透明質(zhì)酸酶(EC 3. 2. 1. 35)。透明質(zhì)酸酶 包括任何非人源酶,包括但不限于源于鼠、犬、貓、野兔、禽類、牛、羊、豬、馬、魚(yú)、蛙、細(xì)菌的 酶,以及來(lái)自水蛭、其它寄生蟲(chóng)和甲殼綱動(dòng)物的任何酶。舉例的人透明質(zhì)酸酶包括HYAL1、 HYAL2、HYAL3、HYAL4和PH20。透明質(zhì)酸酶也包括可溶的透明質(zhì)酸酶,包括羊和牛PH20,及 可溶的 PH20。舉例的透明質(zhì)酸酶包括 SEQ ID N0:6、7-31、69、70、71、72、856-861、869-921 所示任何酶,其成熟形式(缺少信號(hào)序列)或者其等位基因或種變體。透明質(zhì)酸酶也包括 呈現(xiàn)透明質(zhì)酸酶活性的其截短形式,包括是可溶的C末端截短變體。
      [0125] 如本文所用,PH20是指一種類型透明質(zhì)酸酶,其在精子中出現(xiàn)且是中性活性的。 PH-20發(fā)生在精子表面,及在溶酶體衍生的頂體中,在此其與頂體膜內(nèi)面結(jié)合。PH20包括 任何來(lái)源的那些,包括但不限于源于人、黑猩猩、食蟹猴、獼猴、鼠、牛、羊、豚鼠、兔和大鼠。 舉例的PH20多肽包括前體和成熟形式,包括來(lái)自人(SEQ ID N0:6和7)、黑猩猩(SEQ ID N0:8、9、10、869 和 870)、獼猴(SEQIDN0:11和12)、食蟹猴(SEQIDN0:13和14)、牛(例 如SEQIDN0:15-18) ;小鼠(SEQIDN0:19和20);大鼠(SEQIDN0:21和22);兔(SEQID NO:23和24);綿羊(SEQ ID NO:25-27)、豚鼠 (SEQ ID NO:28和29);狐貍(SEQ ID NO:30和 31);長(zhǎng)臂猿(SEQ ID NO:856和857)、狨猴(SEQ ID NO:858和859)和猩猩(SEQ ID NO:860 和861)。提及PH20包括前體PH20多肽和成熟PH20多肽(如其中已經(jīng)除去信號(hào)序列的那 些)、具有活性的其截短形式,及包括等位基因變體和種變體、由剪接變體編碼的變體,及 其它變體,包括與SEQ ID N0:7所示前體多肽或者其成熟形式具有至少40%、45%、50%、 55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序列相同性的 多肽。PH20多肽也包括含有化學(xué)或翻譯后修飾的那些多肽,及不含有化學(xué)或翻譯后修飾的 那些多肽。這種修飾包括但不限于PEG化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羥化、磷酸 化,及本領(lǐng)域已知的其它多肽修飾。舉例的可商購(gòu)的?;蜓蚩扇芡该髻|(zhì)酸酶是Vitrase?:透 明質(zhì)酸酶(羊透明質(zhì)酸酶)和Amphadase?:透明質(zhì)酸酶(牛透明質(zhì)酸酶)。
      [0126] 如本文所用,可溶的PH20是指特征在于在生理?xiàng)l件下其溶解性的多肽。通常,可 溶的PH20缺少全部或部分糖磷脂酰錨(GPI)附著序列,或者不能足以錨定細(xì)胞膜。例如,可 溶的PH20可以是PH20的C末端截短變體,缺少相應(yīng)于全部或部分糖磷脂酰(GPI)錨附著 序列的連續(xù)氨基酸序列。因此,在從細(xì)胞中表達(dá)時(shí),可溶的PH20分泌進(jìn)培養(yǎng)基中??扇艿?PH20蛋白質(zhì)可以通過(guò)其在加熱至37?的Triton X-114溶液中分配進(jìn)水相而區(qū)分(Bordier et al.,(1981)J. Biol. Chem. ,256:1604-7)。膜錨定的如脂質(zhì)錨定的透明質(zhì)酸酶將分配進(jìn) 去污劑富集相,但是在用磷脂酶C處理后將分配進(jìn)去污劑不足相或水相。本發(fā)明包括的可 溶的PH20透明質(zhì)酸酶是膜錨定的透明質(zhì)酸酶,其中與透明質(zhì)酸酶錨定膜相關(guān)的一或多個(gè) 區(qū)域已經(jīng)除去或修飾,其中所述可溶形式保留透明質(zhì)酸酶活性。可溶的透明質(zhì)酸酶包括重 組的可溶透明質(zhì)酸酶及包含于或純化自天然來(lái)源的那些酶,例如羊或牛的睪丸提取物。舉 例的這種可溶的透明質(zhì)酸酶是可溶的人PH20(SEQ ID NO: 3或32-66)。其它可溶的透明質(zhì) 酸酶包括羊(SEQ ID N0:25-27)和牛(SEQ ID N0:16*18)PH20。
      [0127] 如本文所用,可溶的人PH20(sHuPH20)包括在人PH20的C末端缺少包括全部或部 分糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨序列的連續(xù)氨基酸序列的人PH20多肽(C-末端截短的PH20多 肽),由此在表達(dá)時(shí),所述多肽在生理?xiàng)l件下是可溶的。例如,可溶的人PH20多肽是前體形 式SEQ ID NO: 6所示人PH20的C末端截短多肽,或者SEQ ID NO: 7的缺少信號(hào)序列的其成 熟形式,或者其等位基因變體(例如SEQ ID N0:68-72任一所示)。溶解性可以通過(guò)任何合 適方法評(píng)定,證實(shí)了在生理?xiàng)l件下的溶解性。舉例的這種方法是Triton? X-114測(cè)定,其評(píng) 定了分配進(jìn)水溶液相并如上述。此外,可溶的人PH20多肽如果在CHO細(xì)胞如CHO-S細(xì)胞中 產(chǎn)生,則是在細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)和分泌的多肽。然而,可溶的人PH20多肽不限于在CHO細(xì) 胞中產(chǎn)生的那些,可以在任何細(xì)胞或通過(guò)任何方法產(chǎn)生,包括重組表達(dá)和多肽合成。在CHO 細(xì)胞中分泌是被定義的。因此,如果多肽可以在CHO細(xì)胞中表達(dá)和分泌且在培養(yǎng)基中是可 溶的,即當(dāng)用Triton? X-114提取時(shí)分配進(jìn)水相,則無(wú)論其是否是如此產(chǎn)生的,其是可溶的 PH20多肽。sHuPH20多肽的前體多肽可包括信號(hào)序列,如異源或非異源(即天然的)信號(hào) 序列。舉例的前體是包括信號(hào)序列如在氨基酸位置1-35(見(jiàn)例如SEQ ID N0:6的氨基酸 1-35)的天然的35個(gè)氨基酸的信號(hào)序列的那些多肽。
      [0128] 如本文所用,"天然"或"野生型"的PH20多肽是指由天然或天然發(fā)生的PH20基因 編碼的PH20多肽,包括等位基因變體,其天然存在于生物體中包括人和其它動(dòng)物中。不提 及物種的野生型PH20是指涵蓋任何種的野生型PH20。野生型PH20多肽是編碼的前體多肽、 其片段及其加工的形式,如缺少信號(hào)序列的成熟形式以及其任何翻譯前或翻譯后加工或修 飾形式。也包括天然PH20多肽是翻譯后修飾的那些多肽,包括但不限于通過(guò)糖基化、羧化 和/或羥化修飾的那些多肽。舉例的野生型人PH20的氨基酸序列在SEQ ID N0:6和7中 示出,那些等位基因變體包括其成熟形式在SEQ ID N0:68-72中示出。其它動(dòng)物產(chǎn)生天然 PH20,包括但不限于SEQ ID N0:8-31、856-861、869或870任一所示天然或野生型序列。
      [0129] 如本文所用,修飾是對(duì)多肽的氨基酸序列或核酸分子的核苷酸序列的修飾,分別 包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置換。修飾也可以包括由于與另一部分直接或間接綴 合或連接而發(fā)生的分子的翻譯后修飾或其它改變。修飾多肽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知,例如通過(guò)使用重組DNA方法進(jìn)行。
      [0130] 如本文所用,"修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶"是指與參考的或未修飾的乙酰透明質(zhì) 酸降解酶相比含有修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。所述修飾可以是氨基酸置換(取代)、插入 (添加)或缺失一或多個(gè)氨基酸殘基。所述氨基酸殘基可以是天然或非天然氨基酸。在一 些情況中,所述修飾可以是翻譯后修飾。修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與參考的或未修飾的 乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比可具有至多150個(gè)氨基酸差異,只要所得修飾的乙酰透明質(zhì)酸降 解酶呈現(xiàn)透明質(zhì)酸酶活性即可。典型地,修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶含有1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個(gè)氨基酸修飾。
      [0131] 如本文所用,未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是指用于進(jìn)行本發(fā)明提供的修飾而選 擇的起始多肽。所述起始多肽可以是天然發(fā)生的野生型形式的多肽。此外,起始多肽可以被 改變或突變,由此其與天然野生型同種型不同,但是相對(duì)于本文產(chǎn)生的隨后修飾的多肽仍 被稱作起始未修飾的多肽。因此,本領(lǐng)域已知的已經(jīng)被修飾為與未修飾的參考蛋白質(zhì)相比 具有希望的特定活性或性質(zhì)增加或降低的現(xiàn)有蛋白質(zhì)可以選擇并用作起始未修飾的多肽。 例如,已經(jīng)從其天然形式通過(guò)一或多個(gè)單氨基酸改變而修飾并具有希望的性質(zhì)增加或降低 如氨基酸殘基變化以改變糖基化的蛋白質(zhì)可以選擇用于修飾,并因此在本文稱作未修飾的 蛋白質(zhì)以進(jìn)行進(jìn)一步修飾。未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶包括人和非人乙酰透明質(zhì)酸降解 酶,包括來(lái)自非人哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。舉例的未修飾的乙酰透明質(zhì)酸 降解酶是SEQ ID NO: 2、3、6、7-66、68-72、856-861、869-924任一所示那些酶,或者呈現(xiàn)透明 質(zhì)酸酶活性的其成熟的C末端截短形式,或者與SEQ ID N0:2、3、6、7-66、68-72、856-861、 869-924 任一呈現(xiàn)至少 75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、 94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列相同性的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。應(yīng)理解未修飾的乙 酰透明質(zhì)酸降解酶通常是不含有所述修飾如修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的氨基酸置換的 酶。
      [0132] 如本文所用,"修飾的PH20多肽"或者"變體PH20多肽"是指這樣的PH20多肽, 在其氨基酸序列中與參考的未修飾的PH20多肽相比含有至少一個(gè)氨基酸修飾如本文所述 的至少一個(gè)氨基酸置換。修飾的PH20多肽可具有至多150個(gè)氨基酸置換,只要所得修飾 的PH20多肽呈現(xiàn)透明質(zhì)酸酶活性即可。典型地,修飾的PH20多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個(gè)氨基酸置換。應(yīng)理解修飾的 PH20多肽除了如本文所述至少一個(gè)氨基酸置換之外也可包含任一或多個(gè)其它修飾。
      [0133] 如本文所用,未修飾的PH20多肽是指選擇用于本發(fā)明提供的修飾的起始PH20多 肽。所述起始多肽可以是天然發(fā)生的野生型形式多肽。此外,所述起始多肽可以被改變或突 變,由此其與天然野生型同種型不同,但是相對(duì)于本文產(chǎn)生的隨后的修飾的多肽仍稱作起 始未修飾的多肽。因此,可以選擇本領(lǐng)域已知的已經(jīng)被修飾為特定活性或性質(zhì)與未修飾的 參考蛋白質(zhì)相比具有希望的增加或降低的現(xiàn)有蛋白質(zhì)并用作起始未修飾的多肽。例如,可 以選擇已經(jīng)從其天然形式通過(guò)一或多個(gè)單氨基酸變化而修飾并具有希望的性質(zhì)增加或降 低如氨基酸殘基變化以改變糖基化的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾,并因此在本文仍稱作未修飾的以進(jìn) 行進(jìn)一步修飾。舉例的未修飾的PH20多肽是人PH20多肽或者其等位基因或種變體或者其 它變體,包括成熟或前體多肽。例如,舉例的參考PH20多肽是SEQ ID NO: 7、69或72所示 成熟全長(zhǎng)PH20多肽,或者其C末端截短形式如SEQ ID NO: 3和32-66任一所示,或者與SEQ ID N0:3、7、32-66、69 或 72 任一呈現(xiàn)至少 68%、69%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的卩!120 多肽。參考的PH20多肽也可包括相應(yīng)前體形式,如SEQ ID NO: 2、6、68、70、71所示,或者其 它前體形式,或者與 SEQ ID N0:2、6、68、70、71 任一呈現(xiàn)至少 68%、69%、70%、75%、80%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序 列相同性的PH20多肽。應(yīng)理解未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶通常是不含有所述修飾如修 飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的氨基酸置換的酶。
      [0134] 如本文所用,N-連接的部分是指多肽的天冬酰胺(N)氨基酸殘基,其能通過(guò)多肽 的翻譯后修飾而被糖基化。舉例的人PH20的N-連接的部分包括SEQ ID N0:3或7所示氨 基酸序列的氨基酸N47、N131、N200、N219、N333、N358和N365 (相應(yīng)于SEQ ID N0:6所示人 PH20 的氨基酸殘基 N82、N166、N235、N254、N368、N393 和 N490)。
      [0135] 如本文所用,N-糖基化多肽是指含有至少三個(gè)N-連接的氨基酸殘基的寡糖連接 的PH20多肽,例如N-連接的部分相應(yīng)于SEQ ID N0:3或7的氨基酸殘基N200、N333和 N358。N-糖基化的多肽可包括這樣的多肽,其中3、4、5和直至所有N-連接的部分均與寡糖 連接。所述N-連接的寡糖可包括寡甘露糖、復(fù)合物、雜交體或者硫酸寡糖,或者其它寡糖和 單糖。
      [0136] 如本文所用,N-部分糖基化的多肽是指這樣的多肽,其最低限度含有與至少3個(gè) N-連接的部分連接的N-乙酰葡糖胺聚糖。部分糖基化的多肽可包括多種聚糖形式,包括單 糖、寡糖,及分支的糖形式,包括通過(guò)用End 〇H、EndoFl、EndoF2和/或End〇F3處理多肽形成 的那些多肽。
      [0137] 如本文所用,"條件"是指可影響蛋白質(zhì)或物質(zhì)活性或性質(zhì)的任何參數(shù)。對(duì)于本發(fā) 明而言,條件通常是指配制物中除了活性劑(例如修飾的PH20透明質(zhì)酸酶)之外存在賦形 齊U、載體或其它成分,包括其量;溫度;時(shí)間(例如貯存或暴露時(shí)間);貯存容器;貯存性質(zhì) (例如攪動(dòng))和/或與暴露或應(yīng)用相關(guān)的其它條件。
      [0138] 如本文所用,關(guān)于蛋白質(zhì)所用術(shù)語(yǔ)"變性"是指蛋白質(zhì)的生物化學(xué)改變,由此蛋白 質(zhì)的性質(zhì)或活性被降低或消除。所述生物化學(xué)改變可以是蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化至未折 疊(unfold)。所述性質(zhì)或活性可以完全消除或者可以降低10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%、95% 或更多。
      [0139] 如本文所用,性質(zhì)是指物理或結(jié)構(gòu)性質(zhì),如三維結(jié)構(gòu)、pi、半衰期、構(gòu)象及其它這種 物理特性。例如,性質(zhì)的改變可以通過(guò)蛋白質(zhì)的溶解性、聚集或結(jié)晶化而顯示。
      [0140] 如本文所用,活性是指多肽或其一部分與全長(zhǎng)(完整)蛋白質(zhì)相關(guān)的功能活性。 功能活性包括但不限于生物學(xué)活性、催化或酶活性、抗原性(結(jié)合或與多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗多 肽抗體的能力)、免疫原性、形成多聚體的能力以及特異性結(jié)合所述多肽的受體或配體的能 力。
      [0141] 如本文所用,透明質(zhì)酸酶活性是指通過(guò)酶促催化透明質(zhì)酸裂解的能力。關(guān)于透 明質(zhì)酸酶的美國(guó)藥典United States Pharmacopeia(USP)XXII測(cè)定間接確定了透明質(zhì)酸 酶活性,通過(guò)測(cè)量在使所述酶與HA在37°C反應(yīng)30分鐘后剩余的較高分子量透明質(zhì)酸或 乙酰透明質(zhì)酸(HA)底物的量而確定(USP XXII-NF XVII(1990)644-645United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD)。參考標(biāo)準(zhǔn)溶液可用于測(cè)定中以確定任 何透明質(zhì)酸酶的相對(duì)活性單位。確定透明質(zhì)酸酶如PH20包括修飾的PH20多肽的透明質(zhì) 酸酶活性的體外測(cè)定為本領(lǐng)域已知并在本文中描述。舉例的測(cè)定包括本文描述的微濁度 (microturbidity)測(cè)定,其測(cè)量透明質(zhì)酸酶對(duì)透明質(zhì)酸的間接裂解,通過(guò)檢測(cè)當(dāng)未裂解的 透明質(zhì)酸與血清白蛋白結(jié)合時(shí)形成的不溶沉淀而測(cè)量??梢允褂脜⒖紭?biāo)準(zhǔn),例如產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn) 曲線以確定檢測(cè)的透明質(zhì)酸酶的單位活性。
      [0142] 如本文所用,中性活性是指PH20多肽在中性pH如在或在大約pH 6. Ο-pH 7. 8通 過(guò)酶促催化透明質(zhì)酸裂解的能力。
      [0143] 如本文所用,"增加的活性"是指修飾的PH20透明質(zhì)酸酶,當(dāng)在相同條件下檢測(cè)時(shí), 修飾的PH20透明質(zhì)酸酶與不含有所述氨基酸置換的未修飾的PH20透明質(zhì)酸酶相比呈現(xiàn)更 高的透明質(zhì)酸酶活性。例如,修飾的PH20透明質(zhì)酸酶呈現(xiàn)未修飾的或參考的PH20透明質(zhì)酸 酶活性的至少或大約至少 110 %、120 %、130 %、140 %、150 %、160 %、170 %、180 %、190 %、 200 %、250 %、300 %、400 %、500 %、600 %、700 %、800 %、900 %、1000 % 或更多。
      [0144] 如本文所用,蛋白質(zhì)的"溶解性"是指蛋白質(zhì)在水溶液中是均質(zhì)的,其中蛋白質(zhì)分 子擴(kuò)散且不自發(fā)沉淀。因此,可溶的蛋白質(zhì)溶液是其中在含有所述蛋白質(zhì)的溶液中不存在 可見(jiàn)的或離散粒子的溶液,由此所述粒子不可被容易過(guò)濾。通常,如果在溶液中無(wú)可見(jiàn)或離 散粒子,則蛋白質(zhì)是可溶的。例如如果其不含有或含有很少的可以通過(guò)用孔徑為0.22 μ m 的濾器除去的粒子,則蛋白質(zhì)是可溶的。
      [0145] 如本文所用,蛋白質(zhì)的聚集或結(jié)晶化是指在含有所述蛋白質(zhì)的溶液中存在可見(jiàn)的 或離散顆粒。典型地,所述顆粒大小大于?ο μ m,如大于15 μ m、20 μ m、25 μ m、30 μ m、40 μ m、 50 μ m或更大。聚集或結(jié)晶化可以由于溶解性降低、蛋白質(zhì)變性增加或者共價(jià)鍵形成而導(dǎo) 致。
      [0146] 如本文所用,"變性條件"是指任何條件或物質(zhì),當(dāng)暴露于蛋白質(zhì)時(shí),其影響蛋白質(zhì) 的降解或變性,通常是蛋白質(zhì)的三級(jí)或二級(jí)結(jié)構(gòu)喪失或部分喪失的結(jié)果。變性條件可導(dǎo)致 如活性喪失或降低、溶解性喪失或降低、聚集和/或結(jié)晶化的結(jié)果。所述變性條件不需要是 使蛋白質(zhì)完全失活的條件,而是導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性隨著時(shí)間而降低的條件。因此,如果蛋白質(zhì) 的活性在存在所述條件較不存在所述條件下降低至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70 %、80 %、90 %、95 %或更多,則該條件是變性條件。變性條件可以是由于外部壓力或物理 條件(例如攪動(dòng)、溫度、貯存時(shí)間、無(wú)穩(wěn)定劑)所致或者可以是由于存在變性劑所致。例如, 所述變性條件可以是由于加熱、酸或化學(xué)變性劑所致。舉例的變性條件包括但不限于存在 強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、濃縮的無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)溶劑(例如乙醇或氯仿)、尿素、高或低PH值(pH值極限)、 升高的溫度(例如加熱)、存在可以變性的賦形劑(例如酚類防腐劑或去污劑)及低或基本 沒(méi)有另外為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所需的穩(wěn)定劑(例如NaCl)。
      [0147] 如本文所用,"變性劑"是指導(dǎo)致變性的任何物質(zhì)、分子或化合物。例如,變性劑可 包括強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、濃縮的無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)溶劑(例如乙醇或氯仿)、防腐劑、去污劑或其它賦形 劑。
      [0148] 如本文所用,"變性條件抗性"是指與變性相關(guān)或者由變性所致的蛋白質(zhì)的性質(zhì)或 活性降低或消除的任何量的減少。例如,變性與增加的結(jié)晶化或聚集、降低的溶解性或降 低的活性相關(guān)或?qū)е逻@些現(xiàn)象。因此,變性抗性是指蛋白質(zhì)當(dāng)暴露于變性條件時(shí)與參考蛋 白質(zhì)(例如未修飾的酶)相比呈現(xiàn)降低的聚集或結(jié)晶化、增加的溶解性或者增加的或更高 的活性(例如透明質(zhì)酸酶活性)。變性條件抗性不需要是絕對(duì)的或永久的,但是可以是由 于修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的變性較未修飾的酶在變性條件下更緩慢出現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)的,由 此修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的活性或性質(zhì)實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)時(shí)間。例如,修飾的乙酰透明質(zhì)酸降 解酶如修飾的PH20透明質(zhì)酸酶如果在存在變性條件或變性劑下較未修飾的多肽呈現(xiàn)例如 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、…20%、…30%、…40%、…50%、… 60%、...、70%、…80%、…90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%或更多的變性抗性,則其呈現(xiàn)出變性條件抗性。在一些情況中,修飾的多肽與未修飾 的多肽相比呈現(xiàn) 105%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、300%、400%、500% 或更 多的增加的變性抗性。
      [0149] 如本文所用,修飾的PH20透明質(zhì)酸酶的穩(wěn)定性是指其呈現(xiàn)出對(duì)由變性條件或變 性劑所致變性的抗性。修飾的PH20多肽如果在存在變性條件或變性劑下保留一些活性,如 原始或初始透明質(zhì)酸酶在暴露于變性條件之前的活性的至少20%、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%、80%、90%或更多,則其呈現(xiàn)穩(wěn)定性。通常,修飾的?!120透明質(zhì)酸酶如果在變性條件 下與在不存在所述變性條件下相比保留至少50%或更多的透明質(zhì)酸酶活性,則其是穩(wěn)定 的。評(píng)定透明質(zhì)酸酶活性的測(cè)定為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并在本文中描述。應(yīng)理解所述酶的 穩(wěn)定性不需要是永久或長(zhǎng)期的,而是在需要該活性時(shí)期顯示即可。例如,修飾的PH20透明 質(zhì)酸酶如果在暴露時(shí)或在暴露于一或多種變性條件或變性劑期間(例如存在變性賦形劑 如防腐劑)呈現(xiàn)至少2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、1天、2天、3天、4天、 5天、6天、1周、1個(gè)月、6個(gè)月或者1年時(shí)間的活性,則其是穩(wěn)定的。例如,修飾的PH20透明 質(zhì)酸酶如果在暴露時(shí)或暴露于一或多種變性條件或變性劑(例如存在變性賦形劑如防腐 齊U )期間在或在大約2°C _8°C (包括端點(diǎn))的溫度呈現(xiàn)至少1個(gè)月的活性或者在或在大約 30°C _42°C (包括端點(diǎn))的溫度呈現(xiàn)至少3天的活性,則其是穩(wěn)定的。
      [0150] 因此,本發(fā)明提供的配制物或共配制物的"穩(wěn)定"或"穩(wěn)定性"是指其中修飾的乙 酰透明質(zhì)酸降解酶如修飾的PH20透明質(zhì)酸酶在暴露于一或多種變性條件或變性劑(例如 存在變性賦形劑如防腐劑)時(shí)在或在大約2°C _8°C溫度穩(wěn)定至少1個(gè)月或者在或在大約 30°C -42°C溫度穩(wěn)定至少3天。
      [0151] 如本文所用,修飾的PH20透明質(zhì)酸酶的"增加的穩(wěn)定性"是指在存在相同變性 條件(例如存在變性賦形劑如防腐劑)下,修飾的PH20透明質(zhì)酸酶與不含有所述氨基酸 置換的未修飾的PH20透明質(zhì)酸酶相比呈現(xiàn)更高的透明質(zhì)酸酶活性。例如,修飾的PH20 透明質(zhì)酸酶如果在存在變性條件(例如存在變性賦形劑如防腐劑)下呈現(xiàn)至少或大約至 少 110 %、120 %、130 %、140 %、150 %、160 %、170 %、180 %、190 %、200 %、250 %、300 %、 400 %、500 %、600 %、700 %、800 %、900 %、1000 %或更高的未修飾的或參考的PH20透明質(zhì) 酸酶的活性,則其呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性。
      [0152] 如本文所用,"升高的溫度"是指高于室溫或環(huán)境溫度的溫度。通常,升高的溫度是 至少高于或高于大約30°C,如30°C -42°C,通常是32°C -37°C或者35°C -37°C (包括端點(diǎn)) 的溫度。
      [0153] 如本文所用,室溫是指通常在大約或在18°C至大約或在32°C的范圍。本領(lǐng)域技術(shù) 人員意識(shí)到室溫隨著場(chǎng)所和主導(dǎo)條件而變化。例如,室溫在溫?zé)釟夂蛳氯缫獯罄虻驴怂_ 斯可以更高。
      [0154] 如本文所用,"在相同條件下對(duì)比"蛋白質(zhì)是指對(duì)不同的蛋白質(zhì)相同或基本上相同 地處理,由此可影響蛋白質(zhì)或物質(zhì)的活性或性質(zhì)的一或多個(gè)條件在檢測(cè)物質(zhì)之間不改變或 基本上不改變。例如,當(dāng)將修飾的PH20多肽的透明質(zhì)酸酶活性與未修飾的PH20多肽對(duì)比 時(shí),任一或多個(gè)條件如多肽的量或濃度、所述配制物中除了活性物質(zhì)(例如修飾的PH20透 明質(zhì)酸酶)之外賦形劑、載體或其它成分的存在包括量、溫度、貯存時(shí)間、貯存容器、貯存性 質(zhì)(例如攪動(dòng))和/或與暴露或使用相關(guān)的其它條件在對(duì)比的多肽之間和之中是相同的或 基本上相同的。
      [0155] 如本文所用,"預(yù)定時(shí)間"是指預(yù)先確定或決定的時(shí)間。例如,預(yù)定時(shí)間可以是與 乙酰透明質(zhì)酸降解酶的活性的希望的持續(xù)時(shí)間相關(guān)的根據(jù)蛋白質(zhì)的希望的應(yīng)用或使用而 預(yù)先選擇的時(shí)間。預(yù)定時(shí)間可以是小時(shí)、天、月或年。例如,預(yù)定時(shí)間可以是至少大約或大 約2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2 周、3周、1個(gè)月、6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間。
      [0156] 如本文所用,"貯存"是指配制物一旦制備之后不是立即給予對(duì)象,而是在使用之 前在特定條件(例如特定溫度、時(shí)間和/或形式(例如液體或凍干形式))下保持一段時(shí) 間。例如,液體配制物在給予對(duì)象之前在不同溫度下可保持幾天、幾周、幾個(gè)月或幾年,所述 溫度如冷藏(〇°C -KTC,如2° -8°C )、室溫(例如直至32°C,如18°C至大約或至32°C )或 者升高的溫度(例如 30°C -42°C,如 32°C -37°C或 35°C -37°C )。
      [0157] 如本文所用,"賦形劑"是指活性物質(zhì)的配制物中的化合物,當(dāng)不存在所述活性物 質(zhì)給予時(shí)其不提供活性物質(zhì)的生物學(xué)作用。舉例的賦形劑包括但不限于鹽、緩沖劑、穩(wěn)定 齊?、滲透壓修飾劑、金屬、聚合物、表面活性劑、防腐劑、氨基酸和糖。
      [0158] 如本文所用,穩(wěn)定劑是指如果需要時(shí)在所述配制物中加入的化合物,以保護(hù)修飾 的ΡΗ20多肽或其它活性物質(zhì)免于降解,如由于本發(fā)明的配制物當(dāng)處理、貯存或使用時(shí)暴露 于變性條件所致。因此,本發(fā)明包括防止蛋白質(zhì)被組合物中其它成分降解的物質(zhì)。舉例的 這種物質(zhì)是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、鹽和緩沖劑、表面活性劑、抑制劑或底物 以及如本文所述其它物質(zhì)。
      [0159] 如本文所用,抗微生物效力檢測(cè)或防腐劑效力檢測(cè)(PET)證實(shí)產(chǎn)物中防腐劑系統(tǒng) 的效力。將產(chǎn)物用控制數(shù)量的特定生物體接種。然后該檢測(cè)對(duì)比在對(duì)照樣品與檢測(cè)樣品上 在28天期間的微生物的水平。通常,目標(biāo)市場(chǎng)具有不同的PET要求。例如,美國(guó)藥典(USP) 與歐洲藥典(EP)的PET要求是不同的。進(jìn)行抗微生物效力檢測(cè)的參數(shù),包括在不同的市場(chǎng) 中,是為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
      [0160] 如本文所用,防腐劑的抗微生物有效量是指防腐劑殺死或抑制樣品中由于貯存或 使用而導(dǎo)入的微生物生物體增殖的量。例如,對(duì)于多劑量容器,抗微生物有效量的防腐劑 抑制可能由重復(fù)抽取各次劑量而導(dǎo)入的微生物的生長(zhǎng)。USP和EP (ΕΡΑ和ΕΡΒ)具有抗微生 物要求,其確定了防腐劑效力并在嚴(yán)格性上有變化。例如,抗微生物有效量的防腐劑是這 樣的量,由此在抗微生物防腐劑效力檢測(cè)(APET)中,在接種之后7天出現(xiàn)的細(xì)菌生物體減 少至少I. Ologltl單位。在特殊的實(shí)例中,防腐劑的抗微生物有效量是這樣的量,由此在接 種后7天出現(xiàn)細(xì)菌生物體減少至少I. Ologltl單位,在接種后14天出現(xiàn)細(xì)菌生物體減少至 少3. Ologltl單位,在接種后28天出現(xiàn)細(xì)菌生物體不再進(jìn)一步增加,及在接種后7天出現(xiàn)真 菌生物體至少不增加。在進(jìn)一步的實(shí)例中,防腐劑的抗微生物有效量是這樣的量,由此在接 種后24小時(shí)細(xì)菌生物體減少至少I. Ologltl單位,在接種后7天出現(xiàn)細(xì)菌生物體減少至少 3. Ologltl單位,在接種后28天出現(xiàn)細(xì)菌生物體不再進(jìn)一步增加,在接種14天后真菌生物體 減少至少I. Ologltl單位,及在接種后28天真菌生物體不再進(jìn)一步增加。在另一實(shí)例中,防 腐劑的抗微生物有效量是這樣的量,由此在用具有微生物接種體的組合物接種后6小時(shí)出 現(xiàn)細(xì)菌生物體減少至少2. Ologltl單位,在接種后24小時(shí)出現(xiàn)細(xì)菌生物體減少至少3. Ologltl 單位,在接種后28天出現(xiàn)細(xì)菌生物體不再?gòu)?fù)原,在接種后7天出現(xiàn)真菌生物體減少至少 2. Ologltl單位,及在接種后28天出現(xiàn)真菌生物體至少不再進(jìn)一步增加。
      [0161] 如本文所用,"防腐劑"是指天然發(fā)生或合成或重組產(chǎn)生的物質(zhì),當(dāng)將其加入分子 或蛋白質(zhì)組合物中時(shí),防止所述組合物中微生物生長(zhǎng)包括細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)。
      [0162] 如本文所用,"酚類防腐劑"是指這樣的防腐劑,其含有附著于芳香碳環(huán)如苯環(huán)的 一個(gè)羥基基團(tuán)。舉例的酚類防腐劑包括但不限于苯酚、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲 酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯。例如,甲酚包括間-甲酚(m-甲酚)具有 在酚分子的苯環(huán)上取代的甲基。
      [0163] 如本文所用,"親酚的"是指蛋白質(zhì)如修飾的PH20多肽,其在存在抗微生物有效量 的防腐劑條件下呈現(xiàn)出穩(wěn)定性。術(shù)語(yǔ)"耐酚"與"親酚"在本文可互換使用且具有相同含義。 例如,是耐酚或親酚的修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的未修飾的PH20透明質(zhì) 酸酶相比當(dāng)在含有酚類防腐劑的相同變性條件下檢測(cè)時(shí)典型呈現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性。例如, 修飾的PH20透明質(zhì)酸酶在存在酚類防腐劑的條件下呈現(xiàn)至少或大約至少110%、120%、 130 %U40 %U50 %U60 %U70 %U80 %U90 %,200 %,250 %,300 %,400 %,500 600 %、700 %、800 %、900 %、1000 %或更高的未修飾的或參考的PH20透明質(zhì)酸酶的活性。
      [0164] 如本文所用,"耐熱"是指蛋白質(zhì)如修飾的PH20多肽在高于或大約30°C如 30°C -42°C及通常為32°C -37°C或35°C -37°C的升高的溫度下呈現(xiàn)穩(wěn)定性。例如,耐熱的 修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的未修飾的PH20透明質(zhì)酸酶相比當(dāng)在相同的升 高的溫度變性條件下檢測(cè)時(shí)典型呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性。例如,修飾的PH20透明質(zhì)酸酶在升高 溫度下呈現(xiàn)出未修飾的或參考的PH20透明質(zhì)酸酶的至少或大約至少110%、120%、130%、 140 %U50 %U60 %U70 %U80 %U90 %,200 %,250 %,300 %A00 %>500 %,600 700 %、800 %、900 %、1000 % 或更高的活性。
      [0165] 如本文所用,術(shù)語(yǔ)"去污劑"與術(shù)語(yǔ)"表面活性劑"或"表面活性物質(zhì)"可互換使用。 表面活性劑典型是兩親有機(jī)化合物,即含有疏水性基團(tuán)(尾端)和親水性基團(tuán)(頭端), 其使得表面活性劑可溶解于有機(jī)溶劑和水中。表面活性劑通過(guò)在其頭端存在形式上荷電 基團(tuán)而分類。非離子型表面活性劑在其頭端無(wú)荷電基團(tuán),而離子型表面活性劑在其頭端攜 帶凈電荷。兩性離子表面活性劑含有具有兩個(gè)相反電荷基團(tuán)的頭端。通常的表面活性劑 的一些實(shí)例包括:陰離子表面活性劑(基于硫酸鹽、磺酸鹽或羧酸鹽陰離子):全氟辛酸鹽 (PF0A或PF0)、全氟辛烷磺酸(PFOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸銨及其它烷基 硫酸鹽、月桂醇聚醚硫酸酯鈉(也稱作月桂基乙醚硫酸鈉,或SLES)、烷基苯磺酸鹽;陽(yáng)離子 表面活性劑(基于季銨陽(yáng)離子):十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)a. La.溴化十六碳烷基三 甲銨,及其它燒基三甲基銨鹽、氯化十六燒批陡(CPC)、聚乙氧基牛脂胺(polyethoxylated tallow amine,Ρ0ΕΑ)、苯扎氯銨(BAC)、芐索氯銨(BZT);兩性離子表面活性劑(兩性的): 十二燒基甜菜堿;椰油酰胺丙基甜菜堿;coco ampho glycinate ;非離子表面活性劑:燒基 聚(環(huán)氧乙烷),烷基苯酚聚(環(huán)氧乙烷)、聚(環(huán)氧乙烷)和聚(環(huán)氧丙烷)的共聚物(商 業(yè)上稱作泊洛沙姆或Poloxamines)、烷基多聚葡糖苷,包括辛基葡糖苷、癸基麥芽糖苷、月旨 肪醇(例如十六燒醇和油醇)、椰子酰胺MEA、椰子酰胺DEA、聚山梨醇酯(Tween 20、Tween 80等)、Triton去污劑,及十二烷基二甲胺氧化物。
      [0166] 如本文所用,"緩沖劑"是指一種物質(zhì),通常是溶液,盡管加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿及溫度、 壓力、體積或氧化還原電位的外部影響,其可以保持其PH恒定。緩沖劑防止另一化學(xué)物質(zhì) 的濃度改變,如防止氫離子濃度(pH)顯著改變的質(zhì)子供體和受體系統(tǒng)。所有緩沖劑的pH 值均是溫度和濃度依賴性的。維持pH值或范圍的緩沖劑的選擇可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基 于已知緩沖劑的緩沖能力而根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。舉例的緩沖劑包括但不限于碳酸氫鹽緩沖劑、 二甲基胂酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑或者Tris緩沖劑。例如,Tris緩沖劑(氨丁三醇)是 一種基于胺的緩沖劑,其PKa為8. 06,有效pH范圍在7. 9-9. 2之間。對(duì)于Tris緩沖劑,溫 度每降低1°C,pH增加大約0. 03單位,及每10倍稀釋降低0. 03-0. 05單位。
      [0167] 如本文所用,天然發(fā)生的α-氨基酸的殘基是天然發(fā)現(xiàn)的那些20個(gè)α-氨基酸殘 基,其通過(guò)在人體中荷電的tRNA分子與其關(guān)聯(lián)的mRNA密碼子的特異性識(shí)別摻入蛋白質(zhì)中。
      [0168] 如本文所用,核酸包括DNA、RNA及其類似物,包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸 可以是單鏈或雙鏈的。當(dāng)提及探針或引物時(shí),其任選是標(biāo)記的,如用可檢測(cè)標(biāo)記如熒光標(biāo)記 或放射性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記,涵蓋單鏈分子。這種分子典型長(zhǎng)度為其靶是統(tǒng)計(jì)學(xué)獨(dú)特的或者低 拷貝數(shù)(典型低于5個(gè),通常低于3個(gè))以探查或引發(fā)文庫(kù)。通常,探針或引物含有與感興 趣的基因互補(bǔ)或相同的至少14、16或30個(gè)連續(xù)核苷酸序列。探針和引物的長(zhǎng)度可以是10、 20、30、50、100或更多個(gè)核酸。
      [0169] 如本文所用,肽是指長(zhǎng)度為2-40個(gè)氨基酸的多肽。
      [0170] 如本文所用,在本發(fā)明提供的各個(gè)氨基酸序列中存在的氨基酸是根據(jù)其已知的三 個(gè)字母或一個(gè)字母縮寫(表1)鑒別的。在各個(gè)核酸片段中存在的核苷酸根據(jù)本領(lǐng)域常用 的標(biāo)準(zhǔn)單字母命名法命名。
      [0171] 如本文所用,"氨基酸"是含有氨基和羧酸基團(tuán)的有機(jī)化合物。多肽含有兩或更多 個(gè)氨基酸。對(duì)于本發(fā)明而言,氨基酸包括20個(gè)天然發(fā)生的氨基酸、非天然氨基酸及氨基酸 類似物(即其中α-碳具有側(cè)鏈的氨基酸)。
      [0172] 如本文所用,"氨基酸殘基"是指多肽在其肽鍵化學(xué)消化(水解)形成的氨基酸。 本發(fā)明描述的氨基酸殘基假定是"L"異構(gòu)體形式。如此命名的"D"異構(gòu)體形式殘基可以由 任何L-氨基酸殘基取代,只要所述多肽保留希望的功能性質(zhì)即可。NH 2是指在多肽的氨基末 端存在的游離氨基基團(tuán)。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游離羧基基團(tuán)。與在J. Biol. Chem. ,243:3557-3559 (1968)中描述及采用的 37 C.F.R· § § 1.821-1. 822 的標(biāo)準(zhǔn)多肽命 名法一致,氨基酸殘基的縮寫在表1中示出:
      [0173] 表卜對(duì)照表
      [0174]
      【權(quán)利要求】
      1. 修飾的PH20多肽,其在PH20多肽中包含至少一個(gè)氨基酸置換,其中: 所述修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的PH20多肽相比呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性; 及 增加的穩(wěn)定性表現(xiàn)為在存在一或多種蛋白質(zhì)變性條件下對(duì)變性的增加的抗性。
      2. 權(quán)利要求1的修飾的PH20多肽,其中所述蛋白質(zhì)變性條件選自高于30°C的升高的 溫度、攪拌、低鹽或無(wú)鹽、存在賦形劑和變性劑。
      3. 權(quán)利要求2的修飾的PH20多肽,其中所述蛋白質(zhì)變性條件由于存在賦形劑或變性劑 所致,所述賦形劑或變性劑選自抗粘附劑、粘合劑、涂覆劑、充填劑和稀釋劑、香料、色素、潤(rùn) 滑劑、助流劑、防腐劑、去污劑、吸附劑或者甜味劑及其組合中的一或多種。
      4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽與SEQ ID N0:3 所示氨基酸序列呈現(xiàn)至少68%的氨基酸序列相同性。
      5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是在具有SEQ ID N0:3、7或32-66所示氨基酸序列或者與SEQ ID N0:3、7或32-66任一至少85%相同的氨 基酸序列的未修飾的PH20多肽中。
      6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是在具有與SEQ ID NO:3、7或32-66任一呈現(xiàn)至少91 %序列相同性的氨基酸序列的PH20多肽中。
      7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中: 所述修飾的PH20多肽在存在變性條件下與不含有所述氨基酸置換的未修飾的PH20多 肽相比呈現(xiàn)高于110%的透明質(zhì)酸酶活性;或者 所述修飾的PH20多肽在存在變性條件下與不存在所述變性條件下的透明質(zhì)酸酶活性 相比呈現(xiàn)至少 15%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、 84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%或更多的透明質(zhì)酸酶活性;或者 所述修飾的PH20多肽在存在變性條件下與在不存在所述變性條件下透明質(zhì)酸酶活性 相比呈現(xiàn)至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的溶解性;或者 所述修飾的PH20多肽在存在變性條件下與在不存在所述變性條件下的透明質(zhì)酸酶活 性相比呈現(xiàn)低于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或更低的聚集或結(jié)晶化。
      8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述PH20多肽在存在變性條件下穩(wěn) 定至少4小時(shí)。
      9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述變性條件包含酚類防腐劑。
      10. 權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽在存在抗微生 物有效量的一或多種酚類防腐劑時(shí)是穩(wěn)定的。
      11. 權(quán)利要求10的修飾的PH20多肽,其中所述抗微生物有效量是一或多種酚類防腐 劑的總量,以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(% )表示為或大約為0. 05% -0. 6%、0. 1% -0. 4%、 0· 1 % -0· 3 %、0· 15 % -0· 325 %、0· 15 % -0· 25 %、0· 1 % -0· 2 %、0· 2 % -0· 3 % 或者 0.3% -0.4%,包括端點(diǎn)。
      12. 權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述酚類防腐劑選自苯酚、間甲酚 (m-甲酚)、苯甲醇和對(duì)羥基苯甲酸酯中的一或多種。
      13. 權(quán)利要求12的修飾的PH20多肽,其中所述防腐劑是對(duì)羥基苯甲酸酯,其是對(duì)羥基 苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯。
      14. 權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述防腐劑是酚類防腐劑,其是 m-甲酚、苯酚,或者m-甲酚和苯酚。
      15. 權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中: 所述修飾的PH20多肽在存在防腐劑條件下與不存在所述防腐劑條件下的透明質(zhì)酸酶 活性相比呈現(xiàn)至少15%的透明質(zhì)酸酶活性至少4小時(shí),其中所述活性在除了存在防腐劑之 外的相同條件下對(duì)比。
      16. 權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含在相應(yīng)于選自如下的參考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置的至少一個(gè)氨基酸置換:10、12、20、22、26、 34、36、46、50、52、58、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、 174、193、195、196、204、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、 309、310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、 440、443 或 445,其中相應(yīng)氨基酸位置通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與SEQIDN0:3所示多 肽而鑒別。
      17. 權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含選自如下置換的至少一個(gè)氨基酸 置換,所述置換的位置相應(yīng)于參考SEQ ID NO:3所示氨基酸殘基位置的位置: 在相應(yīng)于位置10的位置的G ;在相應(yīng)于位置12的位置的K ;在相應(yīng)于位置20的位置 的S ;在相應(yīng)于位置22的位置的T ;在相應(yīng)于位置26的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置34的位置 的W ;在相應(yīng)于位置36的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置46的位置的L ;在相應(yīng)于位置50的位置 的Μ ;在相應(yīng)于位置52的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置52的位置的S ;在相應(yīng)于位置58的位置 的C ;在相應(yīng)于位置58的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置58的位置的R ;在相應(yīng)于位置58的位置 的Ν ;在相應(yīng)于位置58的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置58的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置58的位置 的Η ;在相應(yīng)于位置68的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置74的位置 的Ε ;在相應(yīng)于位置82的位置的L ;在相應(yīng)于位置82的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置83的位置 的V ;在相應(yīng)于位置83的位置的Q ;在相應(yīng)于位置83的位置的S ;在相應(yīng)于位置83的位置 的G ;在相應(yīng)于位置84的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置86的位置的A ;在相應(yīng)于位置86的位置 的K ;在相應(yīng)于位置97的位置的E ;在相應(yīng)于位置97的位置的L ;在相應(yīng)于位置127的位置 的R ;在相應(yīng)于位置131的位置的R ;在相應(yīng)于位置138的位置的L ;在相應(yīng)于位置142的位 置的K ;在相應(yīng)于位置142的位置的N ;在相應(yīng)于位置142的位置的P ;在相應(yīng)于位置142的 位置的S ;在相應(yīng)于位置142的位置的T ;在相應(yīng)于位置143的位置的G ;在相應(yīng)于位置143 的位置的K ;在相應(yīng)于位置144的位置的T ;在相應(yīng)于位置166的位置的Q ;在相應(yīng)于位置 166的位置的T ;在相應(yīng)于位置169的位置的L ;在相應(yīng)于位置174的位置的G ;在相應(yīng)于位 置174的位置的N ;在相應(yīng)于位置193的位置的Q ;在相應(yīng)于位置195的位置的T ;在相應(yīng)于 位置195的位置的N ;在相應(yīng)于位置196的位置的E ;在相應(yīng)于位置196的位置的R ;在相應(yīng) 于位置204的位置的P ;在相應(yīng)于位置205的位置的A ;在相應(yīng)于位置205的位置的E ;在相 應(yīng)于位置206的位置的I ;在相應(yīng)于位置213的位置的A ;在相應(yīng)于位置219的位置的I ;在 相應(yīng)于位置234的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置237的位置的T ;在相應(yīng)于位置238的位置的Η ; 在相應(yīng)于位置240的位置的Q ;在相應(yīng)于位置249的位置的V ;在相應(yīng)于位置261的位置的 A ;在相應(yīng)于位置261的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置267的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置277的位置 的K ;在相應(yīng)于位置279的位置的Η ;在相應(yīng)于位置279的位置的V ;在相應(yīng)于位置291的位 置的V ;在相應(yīng)于位置309的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置310的位置的Q ;在相應(yīng)于位置314的 位置的Υ ;在相應(yīng)于位置315的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置317的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置317 的位置的W ;在相應(yīng)于位置318的位置的D ;在相應(yīng)于位置347的位置的G ;在相應(yīng)于位置 367的位置的A ;在相應(yīng)于位置375的位置的R ;在相應(yīng)于位置376的位置的R ;在相應(yīng)于位 置399的位置的V ;在相應(yīng)于位置401的位置的E ;在相應(yīng)于位置407的位置的A ;在相應(yīng)于 位置416的位置的L ;在相應(yīng)于位置419的位置的K ;在相應(yīng)于位置421的位置的Η ;在相應(yīng) 于位置431的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置433的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置433的位置的V ;在相 應(yīng)于位置439的位置的C ;在相應(yīng)于位置440的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置443的位置的G ;以 及在相應(yīng)于位置445的位置的Ν。
      18. 權(quán)利要求10-17任一項(xiàng)的修飾的ΡΗ20多肽,其包含選自如下置換的至少一個(gè)氨基 酸置換,所述置換的位置相應(yīng)于參考SEQ ID ΝΟ:3所示氨基酸殘基位置的位置: 在相應(yīng)于位置52的位置的Τ,在相應(yīng)于位置58的位置的Κ,在相應(yīng)于位置58的位置的 R,在相應(yīng)于位置68的位置的Ρ,在相應(yīng)于位置83的位置的V,在相應(yīng)于位置204的位置的 Ρ,在相應(yīng)于位置261的位置的Α,在相應(yīng)于位置267的位置的Τ,在相應(yīng)于位置277的位置 的Κ及在相應(yīng)于位置421的位置的Η。
      19. 權(quán)利要求10-18任一項(xiàng)的修飾的ΡΗ20多肽,其包含在ΡΗ20多肽中在相應(yīng)于參考 SEQ ID NO:3所示氨基酸殘基位置的位置204的位置的Ρ置換。
      20. 權(quán)利要求10-18任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含在PH20多肽中在相應(yīng)于參考 SEQ ID NO: 3所示氨基酸位置的位置58的位置的R置換。
      21. 權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中: 所述修飾的 PH20 多肽在或大約在 30°C _45°C、35°C _45°C、30°C _37°C、35°C _37°C或者 37°C -42°C的溫度呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性; 所述修飾的PH20多肽在升高的溫度與不含有所述氨基酸置換的未修飾的PH20多肽相 比呈現(xiàn)更高的透明質(zhì)酸酶活性;以及 所述活性是在相同條件下對(duì)比的。
      22. 權(quán)利要求21的修飾的PH20多肽,其包含在相應(yīng)于選自如下位置的氨基酸位置的 至少一個(gè)氨基酸置換,所述如下位置參考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置:1、11、12、14、20、 26、29、34、50、58、70、82、83、84、86、87、140、142、143、147、152、166、167、172、174、178、193、 195、206、212、213、219、233、237、240、267、277、291、292、309、313、314、317、318、347、367、 368、371、374、389、392、395、396、406、419、421、439 和 443,其中相應(yīng)氨基酸位置通過(guò)排列 對(duì)比所述PH20多肽與SEQ ID N0:3所示多肽而鑒別。
      23. 權(quán)利要求22的修飾的PH20多肽,其包含選自如下相應(yīng)于參考SEQ ID NO: 3所示氨 基酸位置的位置的至少一個(gè)氨基酸置換: 在相應(yīng)于位置1的位置的R ;在相應(yīng)于位置11的位置的S ;在相應(yīng)于位置12的位置的 I ;在相應(yīng)于位置14的位置的V ;在相應(yīng)于位置20的位置的S ;在相應(yīng)于位置26的位置的Μ ; 在相應(yīng)于位置29的位置的R ;在相應(yīng)于位置34的位置的W ;在相應(yīng)于位置50的位置的Μ ; 在相應(yīng)于位置58的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置58的位置的Q ;在相應(yīng)于位置58的位置的Q ; 在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置82的位置的L ;在相應(yīng)于位置83的位置的Q ; 在相應(yīng)于位置84的位置的R ;在相應(yīng)于位置86的位置的A ;在相應(yīng)于位置87的位置的S ; 在相應(yīng)于位置140的位置的K ;在相應(yīng)于位置142的位置的S ;在相應(yīng)于位置142的位置的 T ;在相應(yīng)于位置143的位置的K ;在相應(yīng)于位置147的位置的S ;在相應(yīng)于位置152的位置 的T ;在相應(yīng)于位置166的位置的T ;在相應(yīng)于位置167的位置的D ;在相應(yīng)于位置172的位 置的A ;在相應(yīng)于位置174的位置的G ;在相應(yīng)于位置174的位置的N ;在相應(yīng)于位置178的 位置的R ;在相應(yīng)于位置193的位置的Q ;在相應(yīng)于位置195的位置的T ;在相應(yīng)于位置206 的位置的I ;在相應(yīng)于位置212的位置的S ;在相應(yīng)于位置213的位置的A ;在相應(yīng)于位置 219的位置的I ;在相應(yīng)于位置233的位置的G ;在相應(yīng)于位置237的位置的T ;在相應(yīng)于位 置240的位置的A ;在相應(yīng)于位置240的位置的Q ;在相應(yīng)于位置267的位置的T ;在相應(yīng)于 位置277的位置的E ;在相應(yīng)于位置291的位置的S ;在相應(yīng)于位置292的位置的Η ;在相應(yīng) 于位置292的位置的V ;在相應(yīng)于位置309的位置的S ;在相應(yīng)于位置313的位置的Η ;在相 應(yīng)于位置314的位置的S ;在相應(yīng)于位置317的位置的I ;在相應(yīng)于位置317的位置的Τ ;在 相應(yīng)于位置317的位置的W ;在相應(yīng)于位置318的位置的R ;在相應(yīng)于位置347的位置的G ; 在相應(yīng)于位置367的位置的A ;在相應(yīng)于位置368的位置的R ;在相應(yīng)于位置371的位置的 S ;在相應(yīng)于位置374的位置的P ;在相應(yīng)于位置389的位置的A ;在相應(yīng)于位置392的位置 的V ;在相應(yīng)于位置395的位置的A ;在相應(yīng)于位置396的位置的Η ;在相應(yīng)于位置406的位 置的Ν ;在相應(yīng)于位置419的位置的Η ;在相應(yīng)于位置419的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置421的 位置的R ;在相應(yīng)于位置421的位置的S ;在相應(yīng)于位置439的位置的A ;在相應(yīng)于位置439 的位置的C ;及在相應(yīng)于位置443的位置的G。
      24. 權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中: 所述修飾的PH20多肽在存在低于100mM的低濃度NaCl的條件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性; 所述修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的未修飾的PH20多肽相比在存在低濃 度鹽的條件下呈現(xiàn)增加的透明質(zhì)酸酶活性;以及 所述活性是在相同條件下對(duì)比的。
      25. 修飾的PH20多肽,其在PH20多肽中包含至少一個(gè)氨基酸置換,其中: 所述修飾的PH20多肽與不含有所述氨基酸置換的PH20多肽相比呈現(xiàn)為至少120%透 明質(zhì)酸酶活性的增加的透明質(zhì)酸酶活性。
      26. 權(quán)利要求25的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽與SEQ ID N0:3所示 氨基酸序列呈現(xiàn)至少68%的氨基酸序列相同性。
      27. 權(quán)利要求25或26的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是在具有SEQ ID NO: 3、7或32-66任一所示氨基酸序列或者與SEQ ID NO: 3、7或32-66任一所示序列呈現(xiàn)至 少85%序列相同性的氨基酸序列的未修飾的PH20多肽中。
      28. 權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含在相應(yīng)于選自如下參考SEQ ID N0:3所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置的至少一個(gè)氨基酸置換:1、12、15、24、26、27、 29、30、31、32、33、37、39、46、48、52、58、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、84、86、87、92、 93、94、97、118、120、127、131、135、141、142、147、148、150、151、152、155、156、163、164、165、 166、169、170、174、198、206、209、212、213、215、219、233、234、236、238、247、257、259、260、 261、263、269、271、272、276、277、278、282、291、293、305、308、309、310、313、315、317、318、 320、324、325、326、328、347、353、359、371、377、380、389、392、395、399、405、407、409、410、 418、419、421、425、431、433、436、437、438、439、440、441、442、443、445、446 和 447,其中相 應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與SEQ ID NO: 3所示多肽而鑒別。
      29.權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含選自如下參考SEQ ID NO:3所 示氨基酸位置的置換的至少一個(gè)氨基酸置換: 在相應(yīng)于位置1的位置的組氨酸(H);在相應(yīng)于位置1的位置的Q ;在相應(yīng)于位置12的 位置的E ;在相應(yīng)于位置12的位置的T ;在相應(yīng)于位置15的位置的V ;在相應(yīng)于位置24的 位置的E ;在相應(yīng)于位置24的位置的Η ;在相應(yīng)于位置26的位置的E ;在相應(yīng)于位置26的 位置的Κ ;在相應(yīng)于位置27的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置27的位置的R ;在相應(yīng)于位置29的 位置的Ε ;在相應(yīng)于位置29的位置的I ;在相應(yīng)于位置29的位置的L ;在相應(yīng)于位置29的 位置的Μ ;在相應(yīng)于位置29的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置29的位置的S ;在相應(yīng)于位置29的 位置的V ;在相應(yīng)于位置30的位置的G ;在相應(yīng)于位置30的位置的Η ;在相應(yīng)于位置30的 位置的Κ ;在相應(yīng)于位置30的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置30的位置的R ;在相應(yīng)于位置30的 位置的S ;在相應(yīng)于位置31的位置的A ;在相應(yīng)于位置31的位置的C ;在相應(yīng)于位置31的 位置的Η ;在相應(yīng)于位置31的位置的I ;在相應(yīng)于位置31的位置的K ;在相應(yīng)于位置31的 位置的L ;在相應(yīng)于位置31的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置31的位置的R ;在相應(yīng)于位置31的 位置的S ;在相應(yīng)于位置31的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置31的位置的V ;在相應(yīng)于位置32的 位置的F ;在相應(yīng)于位置32的位置的G ;在相應(yīng)于位置32的位置的Η ;在相應(yīng)于位置33的 位置的W ;在相應(yīng)于位置37的位置的F ;在相應(yīng)于位置39的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置39的 位置的Τ ;在相應(yīng)于位置46的位置的R ;在相應(yīng)于位置48的位置的F ;在相應(yīng)于位置48的 位置的Η ;在相應(yīng)于位置48的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置52的位置的Q ;在相應(yīng)于位置58的 位置的Κ ;在相應(yīng)于位置58的位置的Q ;在相應(yīng)于位置63的位置的W ;在相應(yīng)于位置67的 位置的V ;在相應(yīng)于位置68的位置的Η ;在相應(yīng)于位置68的位置的Q ;在相應(yīng)于位置69的 位置的A ;在相應(yīng)于位置69的位置的C ;在相應(yīng)于位置69的位置的F ;在相應(yīng)于位置69的 位置的G ;在相應(yīng)于位置69的位置的I ;在相應(yīng)于位置69的位置的L ;在相應(yīng)于位置69的 位置的Μ ;在相應(yīng)于位置69的位置的P ;在相應(yīng)于位置69的位置的R ;在相應(yīng)于位置69的 位置的W ;在相應(yīng)于位置69的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置70的位置的A ;在相應(yīng)于位置70的 位置的C ;在相應(yīng)于位置70的位置的F ;在相應(yīng)于位置70的位置的G ;在相應(yīng)于位置70的 位置的Η ;在相應(yīng)于位置70的位置的K ;在相應(yīng)于位置70的位置的L ;在相應(yīng)于位置70的 位置的Ν ;在相應(yīng)于位置70的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置70的位置的R ;在相應(yīng)于位置70的 位置的S ;在相應(yīng)于位置70的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置71的 位置的R ;在相應(yīng)于位置71的位置的S ;在相應(yīng)于位置72的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置72的 位置的Q ;在相應(yīng)于位置73的位置的Η ;在相應(yīng)于位置73的位置的L ;在相應(yīng)于位置73的 位置的W ;在相應(yīng)于位置74的位置的A ;在相應(yīng)于位置74的位置的C ;在相應(yīng)于位置74的 位置的G ;在相應(yīng)于位置74的位置的N ;在相應(yīng)于位置74的位置的P ;在相應(yīng)于位置74的 位置的R ;在相應(yīng)于位置74的位置的S ;在相應(yīng)于位置74的位置的V ;在相應(yīng)于位置74的 位置的W ;在相應(yīng)于位置75的位置的F ;在相應(yīng)于位置75的位置的L ;在相應(yīng)于位置75的 位置的R ;在相應(yīng)于位置75的位置的T ;在相應(yīng)于位置84的位置的G ;在相應(yīng)于位置84的 位置的R ;在相應(yīng)于位置86的位置的A ;在相應(yīng)于位置87的位置的C ;在相應(yīng)于位置87的 位置的T ;在相應(yīng)于位置87的位置的Y ;在相應(yīng)于位置92的位置的C ;在相應(yīng)于位置93的 位置的I ;在相應(yīng)于位置93的位置的L ;在相應(yīng)于位置93的位置的R ;在相應(yīng)于位置93的 位置的T ;在相應(yīng)于位置94的位置的R ;在相應(yīng)于位置97的位置的G ;在相應(yīng)于位置118的 位置的Q ;在相應(yīng)于位置120的位置的F ;在相應(yīng)于位置120的位置的V ;在相應(yīng)于位置120 的位置的Y ;在相應(yīng)于位置127的位置的Η ;在相應(yīng)于位置127的位置的N ;在相應(yīng)于位置 131的位置的G ;在相應(yīng)于位置131的位置的R ;在相應(yīng)于位置131的位置的V ;在相應(yīng)于位 置135的位置的D ;在相應(yīng)于位置135的位置的G ;在相應(yīng)于位置135的位置的R ;在相應(yīng)于 位置141的位置的Η ;在相應(yīng)于位置141的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置142的位置的R ;在相應(yīng) 于位置147的位置的R ;在相應(yīng)于位置147的位置的V ;在相應(yīng)于位置148的位置的Κ ;在相 應(yīng)于位置150的位置的G ;在相應(yīng)于位置151的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置151的位置的L ;在 相應(yīng)于位置151的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置151的位置的Q ;在相應(yīng)于位置151的位置的R ; 在相應(yīng)于位置152的位置的R ;在相應(yīng)于位置155的位置的G ;在相應(yīng)于位置155的位置的 Κ ;在相應(yīng)于位置156的位置的D ;在相應(yīng)于位置163的位置的A ;在相應(yīng)于位置163的位置 的E ;在相應(yīng)于位置163的位置的K ;在相應(yīng)于位置163的位置的R ;在相應(yīng)于位置164的位 置的Μ ;在相應(yīng)于位置165的位置的D ;在相應(yīng)于位置165的位置的N ;在相應(yīng)于位置166的 位置的A ;在相應(yīng)于位置166的位置的F ;在相應(yīng)于位置166的位置的Η ;在相應(yīng)于位置166 的位置的L ;在相應(yīng)于位置166的位置的Q ;在相應(yīng)于位置166的位置的R ;在相應(yīng)于位置 166的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置166的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置169的位置的L ;在相應(yīng)于位 置170的位置的R ;在相應(yīng)于位置174的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置198的位置的D ;在相應(yīng)于 位置206的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置206的位置的L ;在相應(yīng)于位置212的位置的Ν ;在相應(yīng) 于位置213的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置213的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置215的位置的Μ ;在相 應(yīng)于位置219的位置的S ;在相應(yīng)于位置233的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置233的位置的R ;在 相應(yīng)于位置234的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置236的位置的R ;在相應(yīng)于位置237的位置的Ε ; 在相應(yīng)于位置238的位置的S ;在相應(yīng)于位置247的位置的I ;在相應(yīng)于位置257的位置的 Τ ;在相應(yīng)于位置259的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置260的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置261的位置 的Κ ;在相應(yīng)于位置261的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置263的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置263的位 置的R ;在相應(yīng)于位置269的位置的A ;在相應(yīng)于位置271的位置的L ;在相應(yīng)于位置271的 位置的Μ ;在相應(yīng)于位置272的位置的T ;在相應(yīng)于位置276的位置的D ;在相應(yīng)于位置276 的位置的S ;在相應(yīng)于位置276的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置277的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置 277的位置的R ;在相應(yīng)于位置277的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置278的位置的Η ;在相應(yīng)于位 置278的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置278的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置278的位置的R ;在相應(yīng)于 位置278的位置的S ;在相應(yīng)于位置278的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置278的位置的Υ ;在相應(yīng) 于位置282的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置291的位置的V ;在相應(yīng)于位置293的位置的A ;在相 應(yīng)于位置293的位置的C ;在相應(yīng)于位置293的位置的F ;在相應(yīng)于位置293的位置的Μ ;在 相應(yīng)于位置293的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置293的位置的Q ;在相應(yīng)于位置293的位置的V ; 在相應(yīng)于位置305的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置308的位置的G ;在相應(yīng)于位置308的位置的 Ν ;在相應(yīng)于位置309的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置309的位置的L ;在相應(yīng)于位置309的位置 的Ν ;在相應(yīng)于位置309的位置的Q ;在相應(yīng)于位置309的位置的R ;在相應(yīng)于位置309的位 置的Τ ;在相應(yīng)于位置310的位置的A ;在相應(yīng)于位置310的位置的G ;在相應(yīng)于位置313的 位置的K ;在相應(yīng)于位置313的位置的R ;在相應(yīng)于位置315的位置的Η ;在相應(yīng)于位置317 的位置的I ;在相應(yīng)于位置317的位置的K ;在相應(yīng)于位置317的位置的R ;在相應(yīng)于位置 318的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置320的位置的Η ;在相應(yīng)于位置320的位置的K ;在相應(yīng)于位 置320的位置的R ;在相應(yīng)于位置324的位置的R ;在相應(yīng)于位置325的位置的A ;在相應(yīng)于 位置325的位置的D ;在相應(yīng)于位置325的位置的E ;在相應(yīng)于位置325的位置的G ;在相應(yīng) 于位置325的位置的Η ;在相應(yīng)于位置325的位置的K ;在相應(yīng)于位置325的位置的Μ ;在相 應(yīng)于位置325的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置325的位置的Q ;在相應(yīng)于位置325的位置的S ;在 相應(yīng)于位置326的位置的V ;在相應(yīng)于位置328的位置的I ;在相應(yīng)于位置328的位置的Κ ; 在相應(yīng)于位置328的位置的L ;在相應(yīng)于位置328的位置的S ;在相應(yīng)于位置328的位置的 Υ ;在相應(yīng)于位置347的位置的G ;在相應(yīng)于位置347的位置的S ;在相應(yīng)于位置353的位置 的V ;在相應(yīng)于位置359的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置371的位置的R ;在相應(yīng)于位置377的位 置的Ρ ;在相應(yīng)于位置377的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置380的位置的W ;在相應(yīng)于位置380的 位置的Υ ;在相應(yīng)于位置389的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置392的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置395 的位置的R ;在相應(yīng)于位置399的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置399的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置 399的位置的W ;在相應(yīng)于位置405的位置的G ;在相應(yīng)于位置407的位置的D ;在相應(yīng)于位 置407的位置的Q ;在相應(yīng)于位置409的位置的A ;在相應(yīng)于位置409的位置的Q ;在相應(yīng)于 位置410的位置的T ;在相應(yīng)于位置418的位置的P ;在相應(yīng)于位置419的位置的F ;在相應(yīng) 于位置419的位置的I ;在相應(yīng)于位置419的位置的K ;在相應(yīng)于位置419的位置的R ;在相 應(yīng)于位置419的位置的S ;在相應(yīng)于位置421的位置的Η ;在相應(yīng)于位置421的位置的K ;在 相應(yīng)于位置421的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置421的位置的Q ;在相應(yīng)于位置421的位置的R ; 在相應(yīng)于位置421的位置的S ;在相應(yīng)于位置425的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置431的位置的 A ;在相應(yīng)于位置431的位置的Η ;在相應(yīng)于位置431的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置431的位置 的Q ;在相應(yīng)于位置431的位置的R ;在相應(yīng)于位置431的位置的S ;在相應(yīng)于位置431的位 置的V ;在相應(yīng)于位置433的位置的L ;在相應(yīng)于位置433的位置的R ;在相應(yīng)于位置433的 位置的Τ ;在相應(yīng)于位置433的位置的V ;在相應(yīng)于位置436的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置437 的位置的I ;在相應(yīng)于位置437的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置438的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置 439的位置的V ;在相應(yīng)于位置440的位置的Η ;在相應(yīng)于位置440的位置的R ;在相應(yīng)于位 置441的位置的F ;在相應(yīng)于位置442的位置的R ;在相應(yīng)于位置443的位置的A ;在相應(yīng)于 位置443的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置445的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置445的位置的P ;在相應(yīng) 于位置446的位置的A ;在相應(yīng)于位置447的位置的D ;在相應(yīng)于位置447的位置的Ν ;和/ 或在相應(yīng)于位置447的位置的Q。
      30. 權(quán)利要求25-29任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽與不含有所 述氨基酸置換的PH20多肽相比呈現(xiàn)至少2. 0倍的透明質(zhì)酸酶活性。
      31. 權(quán)利要求30的修飾的PH20多肽,其包含在相應(yīng)于選自參考SEQ ID NO: 3所示位置 的 24、29、31、48、58、69、70、75、84、97、165、166、271、278、317、320、325和 326 的位置的氨基 酸位置的至少一個(gè)氨基酸置換,其中相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與SEQ ID NO:3所示多肽而鑒別的。
      32. 權(quán)利要求31的修飾的PH20的多肽,其包含選自如下在參考SEQ ID NO: 3所示氨基 酸位置的位置的置換的至少一個(gè)氨基酸置換: 在相應(yīng)于位置24的位置的E ;在相應(yīng)于位置29的位置的E ;在相應(yīng)于位置31的位置 的V ;在相應(yīng)于位置48的位置的N ;在相應(yīng)于位置58的位置的K ;在相應(yīng)于位置58的位置 的Q ;在相應(yīng)于位置69的位置的A ;在相應(yīng)于位置69的位置的F ;在相應(yīng)于位置69的位置 的G ;在相應(yīng)于位置69的位置的P ;在相應(yīng)于位置69的位置的R ;在相應(yīng)于位置70的位置 的A ;在相應(yīng)于位置70的位置的F ;在相應(yīng)于位置70的位置的G ;在相應(yīng)于位置70的位置 的Η ;在相應(yīng)于位置70的位置的Η ;在相應(yīng)于位置70的位置的N ;在相應(yīng)于位置70的位置 的R ;在相應(yīng)于位置70的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置75的位置 的L ;在相應(yīng)于位置75的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置84的位置的G ;在相應(yīng)于位置97的位置 的G ;在相應(yīng)于位置165的位置的D ;在相應(yīng)于位置166的位置的L ;在相應(yīng)于位置166的位 置的R ;在相應(yīng)于位置166的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置271的位置的L ;在相應(yīng)于位置278的 位置的Η ;在相應(yīng)于位置278的位置的R ;在相應(yīng)于位置317的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置320 的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置325的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置325的位置的G ;在相應(yīng)于位置 325的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置325的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置325的位置的Q ;及在相應(yīng)于 位置326的位置的V。
      33. 修飾的ΡΗ20多肽,其在SEQ ID勵(lì):7所示?!120多肽、其(:-末端截短的片段或者在 具有與SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少91%相同的氨基酸序列的PH20多肽中包含至少 一個(gè)氨基酸置換,其中: 所述至少一個(gè)氨基酸置換是在相應(yīng)于選自如下參考SEQ ID NO:3或7所示氨基酸位置 的位置的氨基酸位置:1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、24、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、 59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、 90、91、92、93、94、96、97、98、99、102、103、104、105、106、107、108、110、114、117,118、119、 120、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、 162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、 181、182、183、184、186、192、193、195、196、197、198、200、202、204、205、206、208、209、211、 212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、 236、237、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、259、260、261、263、 264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、282、283、284、 285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、 308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、328、 331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、 368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、 393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、407、409、410、411、412、413、414、 415、416、417、418、419、420、421、422、425、426、427、428、431、432、433、434、435、436、437、 438、439、440、441、442、443、444、445、446和 447; 相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與SEQ ID NO:3所示多肽而鑒別;及 條件是如果所述修飾的PH20多肽含有在相應(yīng)于位置13、47、131或219的位置的氨基 酸置換,則所述置換不是用丙氨酸(A)置換。
      34. 權(quán)利要求33的修飾的PH20多肽,其中: 所述修飾的PH20多肽呈現(xiàn)出不含有所述氨基酸置換的PH20多肽的至少40%的透明質(zhì) 酸酶活性;及 所述活性是在相同條件下對(duì)比的。
      35. 權(quán)利要求33或34的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是在具有SEQ ID NO:3、7或32-66任一所示氨基酸序列或者與SEQ ID NO:3、7或32-66任一呈現(xiàn)至少91% 序列相同性的氨基酸序列的未修飾的PH20多肽中。
      36. 權(quán)利要求33-35任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是表3中所示的 氨基酸置換。
      37. 修飾的PH20多肽,其在SEQ ID勵(lì):7所示?!120多肽、其(:-末端截短的片段或者在 具有與SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少91%相同的氨基酸序列的PH20多肽中包含至少 一個(gè)氨基酸置換,其中: 所述修飾的PH20多肽呈現(xiàn)出低于20%的不含有所述氨基酸置換的PH20多肽的透明質(zhì) 酸酶活性; 所述活性是在相同條件下對(duì)比的; 所述氨基酸置換是在相應(yīng)于選自如下參考SEQ ID NO:3或7所示氨基酸位置的位置 的氨基酸位置:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、27、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、 128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、 154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、 175、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、 195、197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、 235、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、 255、256、257、258、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、 275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、 296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、 316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、331、333、334、335、336、337、338、 339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、 358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、 377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、 396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、408、410、411、412、413、414、415、416、 417、419、420、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、434、437、438、439、440、 441、442、443、444 或 447 ; 相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與SEQ ID NO:3所示多肽而鑒別的;及 條件是: (i)如果所述修飾的PH20多肽含有在相應(yīng)于位置200、333、358或393的位置的氨基酸 置換,則所述置換不是用丙氨酸(A)置換; (ii) 如果所述修飾的PH20多肽含有在相應(yīng)于位置111或249的位置的氨基酸置換,則 所述置換不是用天冬酰胺(N)置換; (iii) 如果所述修飾的PH20多肽含有在相應(yīng)于位置113的位置的氨基酸置換,則所述 置換不是用谷氨酰胺(Q)置換; (iv) 如果所述修飾的PH20多肽含有在相應(yīng)于位置176的位置的氨基酸置換,則所述置 換不是用甘氨酸(G)置換;及 (v) 如果所述修飾的PH20多肽含有在相應(yīng)于位置252的位置的氨基酸置換,則所述置 換不是用蘇氨酸(T)置換。
      38. 權(quán)利要求37的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是在具有SEQ ID NO: 3、7或 32-66任一所示氨基酸序列或者與SEQ ID NO: 3、7或32-66任一呈現(xiàn)至少91 %序列相同性 的氨基酸序列的未修飾的PH20多肽中。
      39. 權(quán)利要求37或38的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是表5所示的氨基酸 置換。
      40. 權(quán)利要求1-39任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20不是由SEQ ID N0:3、6-66、69、72、856-861、869或870任一所示任何氨基酸序列組成的。
      41. 權(quán)利要求1-40任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換是在具有SEQ ID N0:3、7、69或72任一所示任何氨基酸序列的未修飾的PH20多肽中,條件是: (i) 其中所述修飾的PH20多肽僅包含單一氨基酸置換,所述置換不相應(yīng)于參考SEQ ID N0:3 所示氨基酸位置的氨基酸置換 V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、 E249Q、R252T、N333A 或 N358A ; (ii) 其中所述修飾的PH20多肽僅包含兩個(gè)氨基酸置換,所述置換不相應(yīng)于參考SEQ ID N0:3 所示位置的氨基酸置換 P13A/L464W、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N219A 或 N333A/N358A ;及 (iii) 其中所述修飾的PH20多肽僅包含三個(gè)氨基酸置換,所述置換不相應(yīng)于參考SEQ ID N0:3所示氨基酸位置的氨基酸置換N47A/N131A/N219A。
      42. 權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述多肽是人多肽。
      43. 權(quán)利要求1-42任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述氨基酸置換不是在相應(yīng)于參考 SEQ ID NO:3的位置204的位置具有脯氨酸(P)的天然或野生型PH20多肽中。
      44. 權(quán)利要求1-43任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48, 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90或更多個(gè)氨基酸置換。
      45. 權(quán)利要求1-44任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其是缺少信號(hào)序列的成熟PH20多肽。
      46. 修飾的PH20多肽,其包含SEQ ID NO:73-855任一所示氨基酸序列或者與SEQ ID NO:73-855 任一所示氨基酸序列呈現(xiàn)至少 75%、80%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %、99 %或更高序列相同性的氨基酸序列。
      47. 權(quán)利要求1-46任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其在中性pH呈現(xiàn)催化活性。
      48. 權(quán)利要求1-47任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽是在從細(xì)胞 中表達(dá)時(shí)分泌的,且可溶解于上清中。
      49. 權(quán)利要求1-48任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其是基本上純化的或分離的。
      50. 權(quán)利要求1-49任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其通過(guò)選自糖基化、唾液酸化、白蛋白 化、法尼基化、羧化、羥基化和磷酸化的修飾方式而修飾。
      51. 權(quán)利要求50的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽是糖基化的,其中所述 多肽包含至少N-乙酰葡糖胺部分,與至少三個(gè)天冬酰胺(N)殘基的每一個(gè)連接。
      52. 權(quán)利要求51的修飾的PH20多肽,其中所述三個(gè)天冬酰胺殘基相應(yīng)于SEQ ID NO: 3 的氨基酸殘基200、333和358。
      53. 權(quán)利要求1-52任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其通過(guò)與聚合物綴合而修飾。
      54. 權(quán)利要求53的修飾的PH20多肽,其中所述聚合物是葡聚糖或PEG。
      55. 權(quán)利要求1-54任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽與選自多聚 化結(jié)構(gòu)域、毒素、可檢測(cè)標(biāo)記或藥物的部分綴合。
      56. 權(quán)利要求55的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽與Fc結(jié)構(gòu)域綴合。
      57. 核酸分子,其編碼權(quán)利要求1-48任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽。
      58. 載體,其包含權(quán)利要求57的核酸分子。
      59. 權(quán)利要求58的載體,其是真核或原核載體。
      60. 權(quán)利要求58或59的載體,其是哺乳動(dòng)物載體或病毒載體。
      61. 權(quán)利要求60的載體,其是病毒載體,其中所述病毒載體是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體或者痘苗病毒載體。
      62. 細(xì)胞,其包含權(quán)利要求58-61任一項(xiàng)的載體。
      63. 權(quán)利要求62的細(xì)胞,其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
      64. 權(quán)利要求63的細(xì)胞,其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞。
      65. 修飾的PH20多肽,其由權(quán)利要求62-64任一項(xiàng)的細(xì)胞產(chǎn)生。
      66. 產(chǎn)生修飾的PH20多肽的方法,包括: 將權(quán)利要求57的核酸或者權(quán)利要求58-61任一項(xiàng)的載體導(dǎo)入能將N-連接的糖部分摻 入多肽的細(xì)胞中; 在一定條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞,其中編碼的修飾的PH20多肽由所述細(xì)胞產(chǎn)生和分泌;及 回收表達(dá)的多肽。
      67. 權(quán)利要求66的方法,其中所述核酸與啟動(dòng)子可操縱地連接。
      68. 權(quán)利要求66或67的方法,其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
      69. 權(quán)利要求66-68任一項(xiàng)的方法,其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
      70. 權(quán)利要求66-69任一項(xiàng)的方法,其中所述細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞。
      71. 藥物組合物,其包含權(quán)利要求1-56任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽。
      72. 權(quán)利要求71的藥物組合物,其中所述組合物中修飾的PH20多肽在或在大約2°C至 8°C且包括端點(diǎn)的溫度穩(wěn)定至少1個(gè)月,或者在或在大約30°C至42°C且包括端點(diǎn)的溫度穩(wěn) 定至少3天。
      73. 權(quán)利要求71或72的藥物組合物,其中所述藥物組合物包含藥物可接受的賦形劑。
      74. 權(quán)利要求71-73任一項(xiàng)的藥物組合物,其用于單劑給予。
      75. 權(quán)利要求71-73任一項(xiàng)的藥物組合物,其用于多劑給予。
      76. 權(quán)利要求71-75任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述修飾的PH20多肽的濃度是或是大 約 0· 1 μ g/mL 至 100 μ g/mL、1 μ g/mL 至 50 μ g/mL 或者 1 μ g/mL 至 20 μ g/mL。
      77. 權(quán)利要求71-76任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述修飾的PH20多肽的量是或是 大約 10U/mL-5000U/mL、50U/mL-4000U/mL、100U/mL-2000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/ mL-2000U/mL 或者 100U/mL-1000U/mL。
      78. 權(quán)利要求71-77任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述組合物的體積是或是大約 0. 5mL_50mL、lmL-lOmL 或者 lmL_5mL〇
      79. 權(quán)利要求71-78任一項(xiàng)的藥物組合物,其包含濃度為低于或大約或?yàn)?00mM、 180mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、 25mM、20mM、15mM、10mM、5mM 或更低的 NaCl。
      80. 權(quán)利要求71-79任一項(xiàng)的藥物組合物,其包含濃度為或大約為0. lmM-200mM、 0. ImM-lOOmM、120mM-200mM、10mM-50mM、10mM-90mM、80mM-200mM、80mM-140mM、50mM-100mM、 80mM-100mM、50mM-80mM、100mM-140mM 或 120mM-140mM 的 NaCl。
      81. 權(quán)利要求71-80任一項(xiàng)的藥物組合物,其包含抗微生物有效量的防腐劑或者防腐 劑混合物。
      82. 權(quán)利要求81的藥物組合物,其中所述防腐劑是酚類防腐劑、非酚類防腐劑或者酚 類防腐劑及非酚類防腐劑。
      83. 權(quán)利要求81或82的藥物組合物,其中所述防腐劑選自苯酚、m-甲酚、對(duì)羥基苯甲 酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯銨、4-氯-1- 丁醇、氯己定二鹽酸鹽、氯己定二葡糖酸鹽、 L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脫氫醋酸鈉、鄰甲酚、對(duì)甲 酚、氯甲酚、溴棕三甲銨、芐索氯銨、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸 丁酯及其任何組合。
      84. 權(quán)利要求81-83任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述組合物含有僅一種防腐劑。
      85. 權(quán)利要求81-83任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述組合物含有2、3或4種不同防腐劑 的防腐劑混合物。
      86. 權(quán)利要求71-85任一項(xiàng)的藥物組合物,其包含至少一種酚類防腐劑。
      87. 權(quán)利要求86的藥物組合物,其中所述防腐劑選自苯酚、間甲酚(m-甲酚)、苯甲醇 和對(duì)羥基苯甲酸酯。
      88. 權(quán)利要求87的藥物組合物,其中所述防腐劑是對(duì)羥基苯甲酸酯,其是對(duì)羥基苯甲 酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯。
      89. 權(quán)利要求81-88任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述抗微生物有效量是一或多種防 腐劑的總量,以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(% )表示,其為0.05% -0·6%、0· 1% -0.4%、 0· 1 % -0· 3 %、0· 15 % -0· 325 %、0· 15 % -0· 25 %、0· 1 % -0· 2 %、0· 2 % -0· 3 % 或者 0.3% -0.4%,包括端點(diǎn)。
      90. 權(quán)利要求71-89任一項(xiàng)的藥物組合物,其包含治療活性劑。
      91. 權(quán)利要求90的藥物組合物,其中所述治療劑與所述組合物配制或者在單獨(dú)組合物 中。
      92. 權(quán)利要求90或91的藥物組合物,其中所述治療性物質(zhì)是多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物、 小分子或者有機(jī)分子。
      93. 權(quán)利要求90-92任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述治療活性劑選自化療劑、止痛劑、 抗炎劑、抗微生物劑、殺阿米巴蟲(chóng)劑、殺毛滴蟲(chóng)劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗驚厥劑、抗抑郁 齊?、及抗關(guān)節(jié)炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲(chóng)劑、抗組胺劑、α -腎上腺素能 激動(dòng)劑、α阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、生物殺滅劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素能阻 斷劑、鈣通道阻斷劑、心血管藥物、避孕藥、減充血?jiǎng)?、利尿劑、抑郁劑、診斷劑、電解劑、催眠 藥、激素制劑、高血糖制劑、肌肉松弛劑、肌肉收縮劑、眼科用藥、擬副交感神經(jīng)劑、精神興奮 齊U、鎮(zhèn)靜劑、擬交感神經(jīng)劑、安定劑、尿路用藥、陰道制劑、殺病毒劑、維生素制劑、非類固醇 抗炎劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、或者睡眠誘導(dǎo)劑。
      94. 權(quán)利要求90-93任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述治療劑選自抗體、免疫球蛋白、二 膦酸鹽、細(xì)胞因子、化療劑、凝血因子和胰島素。
      95. 權(quán)利要求94的藥物組合物,其中所述治療劑是速效胰島素。
      96. 權(quán)利要求95的藥物組合物,其中所述速效胰島素是普通胰島素或者胰島素類似 物。
      97. 權(quán)利要求95或96的藥物組合物,其中所述速效胰島素是普通胰島素,其是人胰島 素或豬胰島素。
      98. 權(quán)利要求95-97任一項(xiàng)的藥物組合物,其中: 所述速效胰島素包含具有SEQ ID ΝΟ:862所示氨基酸序列的Α鏈及具有SEQ ID ΝΟ:863 所示氨基酸序列的Β鏈;或者 所述速效胰島素包含具有SEQ ID Ν0:864的氨基酸殘基位置88-108所示氨基酸序列 的Α鏈及具有SEQ ID NO:864的氨基酸殘基位置25-54所示氨基酸序列的Β鏈。
      99. 權(quán)利要求95或96的藥物組合物,其中所述速效胰島素是選自賴脯胰島素、門冬胰 島素或賴谷胰島素的胰島素類似物。
      100. 權(quán)利要求99的藥物組合物,其中所述胰島素類似物選自具有SEQ ID NO: 862所示 氨基酸序列的A鏈和具有SEQ NO:865-867任一所示氨基酸序列的B鏈的胰島素。
      101. 權(quán)利要求95-100任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述速效胰島素的量是或是大約 10U/mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-1000U/mL 或者 500U/mL-1000U/mL,包括端 點(diǎn)。
      102. 權(quán)利要求90-93任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述治療劑選自阿達(dá)木單抗、阿加糖 酶β、阿萊法塞、氨芐青霉素、阿那白滯素、抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗、抗胸腺細(xì)胞、阿奇霉素、貝 卡普勒明、卡泊芬凈、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、西妥昔單抗、西 司他丁、克拉維酸、克林霉素、達(dá)依泊汀α、達(dá)克珠單抗、白喉、白喉抗毒素、白喉類毒素、依 法珠單抗、腎上腺素、促紅細(xì)胞生成素 α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促卵 泡素 ct、促卵泡素 β、磷苯妥英、禮雙胺、Gadopentetates、加替沙星、格拉默、GM-CSF's、 戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司瓊、流感嗜血桿菌B、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲肝疫苗、乙 肝疫苗、替伊莫單抗、Tiuxetans、免疫球蛋白、流感嗜血桿菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔 單抗、賴脯胰島素、75 %中性賴脯魚(yú)精蛋白(NPL)/25 %賴脯胰島素、50 %中性魚(yú)精蛋白 Hagedorn(NPH)/50%普通胰島素、70% NPH/30%普通胰島素;普通胰島素、NPH胰島素、 超級(jí)胰島素、特慢胰島素、和甘精胰島素、干擾素、干擾素 α、干擾素 β、干擾素Y、干擾 素 a-2a、干擾素 a2-b、干擾素 Alphacon、干擾素 α-η、干擾素 β、干擾素 β-la、干擾 素 Υ、干擾素 a-con、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉羅尼酶、左氧氟沙星、 利多卡因、利奈唑胺、勞拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹病 毒疫苗、風(fēng)疹疫苗、甲羥孕酮、美羅培南、甲潑尼龍、咪達(dá)唑侖、嗎啡、奧曲肽、奧馬珠單抗、 昂丹司瓊、帕利珠單抗、泮托拉唑、培門冬酶、培非司亭、Peg-干擾素 a -2a、Peg-干擾素 a-2b、培維索孟、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗和肺炎球菌綴合物疫苗、異丙嗪、 瑞替普酶、生長(zhǎng)激素、舒巴坦、舒馬普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破傷風(fēng)純化類毒素、替卡西 林、托西莫單抗、曲安西龍、曲安奈德、己曲安奈德、萬(wàn)古霉素、水痘帶狀皰疹免疫球蛋白、 水痘疫苗、其它疫苗、阿侖珠單抗、阿利維A酸、別嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、砒 霜、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、BCG Live、貝沙羅汀、博來(lái)霉素、白消安、 靜脈內(nèi)白消安、口服白消安、卡普睪酮、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、卡莫司汀與聚苯丙生、 塞來(lái)昔布、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質(zhì)體、達(dá)卡巴嗪、 更生霉素、柔紅霉素脂質(zhì)體、柔紅霉素、道諾霉素、地尼白介素2、右雷佐生、多西他賽、多柔 比星、多柔比星脂質(zhì)體、丙酸屈他雄酮、Elliott's B溶液、表柔比星、阿法依泊汀、雌氮芥、 依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16s、依西美坦、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、5-氟 尿嘧啶、氟維司群、吉西他濱、吉妥珠單抗、奧佐米星、吉妥珠單抗奧佐米星、羥基脲、伊達(dá) 比星、異環(huán)磷酰胺、甲磺酸伊馬替尼、伊立替康、來(lái)曲唑、甲酰四氫葉酸、左旋咪唑、洛莫司 汀、CCNUs、氮芥(Mechlorethamines)、氮芥(Nitrogen mustards)、甲地孕酮、醋酸甲地孕 酮、美法侖、L-PAMs、巰嘌呤、6-巰嘌呤、美司鈉、氨甲喋呤、甲氧沙林、絲裂霉素類、絲裂霉 素 C、米托坦、米托蒽醌、諾龍、苯丙酸諾龍、若莫單抗、奧普瑞白介素、奧沙利鉬、紫杉醇、帕 瑪二磷酸、培加酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、光輝霉素、嚇?lè)茽栤c、嚇?lè)阅封c、丙卡巴 肼、奎納克林、拉布立酶、利妥普單抗、沙格司亭、鏈脲菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替 尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥(niǎo)嘌呤、6_硫代鳥(niǎo)嘌呤、三亞乙基硫代磷酰胺(噻替派)、托泊替康、托 瑞米芬、曲妥珠單抗、維甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、唑來(lái)膦 酸、阿西維辛、阿柔比星、阿考達(dá)唑、阿克羅寧、阿多來(lái)新、阿地白介素、視黃酸、阿利維A酸、 9_順式-視黃酸、Alvocidibs、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨魯米特、安吖啶、阿那昔酮、 安西他濱、氨茴霉素、Apaziquones、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎胞苷、阿扎替派、阿 佐霉素、Banoxantrones、Batabulins、巴馬司他、貝那昔濱、苯達(dá)莫司汀、苯佐替派、比卡魯 胺、比他舍平、比立考達(dá)、比生群、Bisnafide Dimesylates、比折來(lái)新、硼替佐米、布喹那、溴 匹立明、布度鈦、放線菌素 C、Canertinibs、卡醋胺、卡貝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、 卡折來(lái)新、西地芬戈、西馬多丁、苯丁酸氮芥、塞奧羅奈、西羅霉素、克蘭氟脲、氯法拉濱、克 立那托、地西他濱、右尼古地平、右?jiàn)W馬鉬、地扎胍寧、地吖醌、Dibrospidiums、地諾孕素、 地那林、Disermolides、Dofequidars、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、達(dá)佐霉素、依考莫司汀、依達(dá) 曲沙、Edotecarins、依氟鳥(niǎo)氨酸、依拉克達(dá)、依利奈法德、依沙蘆星、乙啼替氟、恩洛鉬、恩 普氨酯、Enzastaurins、依匹哌陡、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依托格魯、 氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉濱、芬維A胺、氟甲睪酮、氟西他濱、磷喹酮、福司曲 星、福曲他明、加柔比星、加洛他濱、吉羅酚、Gimatecans、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷酰胺、伊 莫福新、伊洛馬司他、伊美克、英丙舒凡、Indisulams、雙丙氧亞胺醌、白介素、白介素-2s、 重組白介素、茚托利辛、碘芐胍、異丙鉬、伊索拉定、Ixabepilones、酮曲沙、L-阿拉諾新、蘭 瑞肽、Lapatinibs、來(lái)多蒽瓊、亮丙瑞林、亮丙瑞林、來(lái)沙骨化醇、利阿唑、洛鉬、洛美曲索、 法尼醇蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、洛索蒽醌、勒托替康、馬磷酰胺、甘露舒凡、馬立馬司他、馬索羅 酚、美坦辛、氮芥、美侖孕酮、美法侖、美諾立爾、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯氨啶、美 妥替哌、米帕、米潑昔芬、米索硝唑、米丁度胺、Mitocarcins、絲裂紅素、米托拉酮、米托潔 林、米托胍腙、米托馬星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立賓、 莫法羅汀、莫哌達(dá)醇、Mubritinibs、霉酚酸、奈達(dá)鉬、Neizarabines、奈莫柔比星、硝氨丙口丫 陡、諾考達(dá)唑、諾拉霉素、諾拉曲塞、Nortopixantrones、奧馬鉬、Ortataxels、奧替拉西、奧 昔舒侖、氧芬胂、Patupilones、培得星、培利霉素、Pelitrexols、培美曲塞、溴新斯的明、 培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、Picoplatins、吡奈非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡羅蒽醌、 Pixantrones、Plevitrexeds、普洛美坦、泊非霉素、波尼莫司汀、普羅帕脒、螺丙醇、噪啼替 派、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、羅谷亞胺、羅喹美克、鏈黑霉 素、Sabarubicins、沙芬戈、沙鉬、司鉬、司莫司汀、辛曲秦、西左非蘭、索布佐生、索拉非尼、 Sparfosates、磷乙天冬氨酸、司帕霉素、鍺螺胺、螺莫司汀、螺鉬、角鯊胺、鏈黑霉素、鏈伐立 星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、Tacedinalines、他利霉素、他莫司汀、Tariquidars、?;悄就?、 Tecogalans、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替羅昔隆、硫咪嘌呤、硫咪嘌呤、噻唑羧胺核苷、 噻氯咪索、替洛隆、汀考達(dá)、噻莫西酸、替拉扎明、Topixantrones、曲貝替定、海鞘素743、曲 托龍、曲西立濱、曲洛司坦、三甲曲沙、Triplatin Tetranitrates、曲普瑞林、曲磷胺、妥布 氯唑、烏苯美司、烏瑞替派、伐司樸達(dá)、伐普肽、維替泊芬、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春匹定、長(zhǎng)春 氟寧、長(zhǎng)春米特、長(zhǎng)春甘酯、長(zhǎng)春西醇、長(zhǎng)春羅新、長(zhǎng)春羅定、長(zhǎng)春曲醇、長(zhǎng)春利定、伏氯唑、黃 鏈霉素 A、胍甲環(huán)素、折尼鉬、亞芐維C(2H)、凈司他丁、佐柔比星、Zosuquidars、乙酰唑胺、 阿昔洛韋、膽影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、變應(yīng)原浸出物、α 1-蛋白酶抑制劑、前列地爾、 阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶堿、阿米替林、異戊巴比妥、氨力農(nóng)、鎮(zhèn)痛藥、抗-脊髓灰 質(zhì)炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破傷風(fēng)免疫球蛋白、破傷風(fēng)疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、 阿加曲班、精氨酸、抗壞血酸、阿替洛爾、阿曲庫(kù)銨、阿托品、金硫葡糖、硫唑嘌呤、氨曲南、桿 菌肽、巴氯芬、巴利昔單抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、比伐盧定、肉毒抗毒素、 溴芐銨、布美他尼、布比卡因、丁丙諾啡、布托啡諾、降鈣素、骨化三醇、鈣、卷曲霉素、卡波 前列素、肉堿、頭孢孟多、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢呋辛、氯霉素、氯 普魯卡因、氯喹、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸軟骨素、絨毛膜促性腺激素 α、鉻、西多福韋、西咪替 丁、環(huán)丙沙星、順阿曲庫(kù)銨、可樂(lè)定、可待因、秋水仙堿、粘菌素、膠原、Corticorelin ovine triflutates、促皮質(zhì)素、二十四肽促皮質(zhì)素、氰鈷胺、環(huán)孢菌素、半胱氨酸、達(dá)昔單抗、達(dá)福 普汀、達(dá)肝素、達(dá)那肝素、丹曲林、去鐵胺、去氨加壓素、地塞米松、右美托咪定、右泛醇、右旋 糖酐、右旋糖酐鐵、泛影酸、地西泮、二氮嗪、雙環(huán)維林、Digibinds、地高辛、雙氫麥角胺、地 爾硫卓、苯海拉明、雙嘧達(dá)莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯銨、多沙普侖、度骨化醇、多西環(huán) 素、氟哌利多、二羥丙茶堿、依地酸、依酚氯銨、依那普利拉、麻黃堿、依前列醇、麥角鈣化醇、 麥角新堿、厄他培南、紅霉素、艾司洛爾、雌二醇、Estrogenics、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙 碘油、羥乙磷酸、依托咪酯、法莫替丁、非諾多泮、芬太尼、氟馬西尼、熒光素、氟奮乃靜、葉 酸、甲吡唑、福米韋生、磺達(dá)肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、釓特醇、釓弗塞胺、更昔洛韋、 慶大霉素、胰高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆溴銨、戈那瑞林、絨毛膜促性腺激素、嗜血桿 菌B多糖、氯化血紅素、Herbals、組胺、肼苯噠嗪、氫化可的松、氫嗎啡酮、羥鈷胺、羥嗪、莨 菪堿、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺、碘拉酸、碘克沙酸、碘昔蘭、 異煙肼、異丙腎上腺素、日本腦炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉貝洛爾、來(lái)匹盧定、左布比卡 因、左甲狀腺素、林可霉素、碘塞羅寧、促黃體激素、萊姆病疫苗、錳福地吡、Manthtols、腦 膜炎球菌多糖疫苗、哌替啶、甲哌卡因、美索達(dá)嗪、間羥胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲 基多巴類、甲基麥角新堿、甲氧氯普胺、美托洛爾、甲硝唑、米諾環(huán)素、米伐克龍、魚(yú)肝油酸、 莫西沙星、莫羅單抗-CD3、麥考酚酸嗎乙酯、萘夫西林、納布啡、納美芬、納洛酮、新斯的明、 煙酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普鈉、去甲腎上腺素、奧芬那君、苯唑西林、羥嗎啡酮、土霉 素、縮宮素、潘可龍、泛醇、泛酸、罌粟堿、PEG干擾素 ci2A、青霉素 G、噴他脒、噴他佐辛、戊 巴比妥、全氟丙烷、奮乃靜、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧腎上腺素、苯妥英、毒扁豆堿、植物甲 萘醌、多粘菌素、解磷定、丙胺卡因、普魯卡因胺、普魯卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛爾、批 啶斯的明氫氧化物、維生素 B6、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替 丁、瑞芬太尼、核黃素、利福平、羅哌卡因、釤、東莨菪堿、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人蛋氨生 長(zhǎng)素、壯觀霉素、鏈激酶、鏈霉素、琥珀酰膽堿、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他羅利姆、特布他林、 特立帕肽、睪酮、破傷風(fēng)抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸鹽/酯、茶堿、硫胺素、硫乙拉嗪、硫 噴妥、促甲狀腺激素、亭扎肝素、替羅非班、妥布霉素、妥拉唑啉、甲苯磺丁脲、托拉塞米、氨 甲環(huán)酸、曲羅尼爾、三氟拉嗪、曲美芐胺、甲氧芐啶、氨丁三醇、結(jié)核菌素、傷寒疫苗、尿促卵 泡素、尿激酶、丙戊酸、加壓素、維庫(kù)溴銨、維拉帕米、伏立康唑、華法林、黃熱病疫苗、齊多夫 定、鋅、鹽酸齊拉西酮、阿克拉霉素、放線菌素、阿霉素、偶氮絲氨酸、6-氮尿苷、嗜癌素、色霉 素、二甲葉酸、6-疊氮-5-氧-L-正亮氨酸、依諾他濱、氟尿苷、橄欖霉素、吡柔比星、吡曲 克辛、蝶羅呤、替加氟、殺結(jié)核菌素、阿替普酶、阿西莫單抗、貝伐珠單抗、A型肉毒菌毒素、 B型肉毒菌毒素、卡羅單抗噴地肽、達(dá)克珠單抗、阿法鏈道酶、替加色羅α、戊酸印西洛馬、 碘-131 ;抗生素物質(zhì);血管發(fā)生抑制劑;抗白內(nèi)障和抗糖尿病視網(wǎng)膜病變藥物;碳酸酐酶抑 制劑;瞳孔放大劑;光動(dòng)力治療劑;前列腺素類似物;生長(zhǎng)因子;抗腫瘤藥物;抗代謝物;抗 病毒藥物;殺阿米巴劑和抗原生動(dòng)物劑;抗結(jié)核藥和抗麻風(fēng)藥;抗毒素和抗蛇毒素;抗血友 病因子,抗抑制劑凝血復(fù)合物,抗凝血酶III,凝血因子V,凝血因子IX,血漿蛋白級(jí)分,von Willebrand因子;抗血小板制劑,集落刺激因子(CSF);紅細(xì)胞生成刺激物;止血?jiǎng)┖桶椎?白;免疫球蛋白;凝血酶抑制劑;抗凝血?jiǎng)?;類固醇抗炎藥物,選自阿氯米松、阿爾孕酮、倍 氯米松、倍他米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)酮、可的松、可 的伐唑、地夫可特、地奈德、去羥米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯、甘草次 酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼縮松、膚輕松、醋酸氟輕松、氟可丁、氟可龍、氟米龍、 氟培龍、氟潑尼定、氟潑尼龍、丙酮縮氟氫羥龍、氟替卡松、福莫可他、氯氟舒松、齒倍他索、 鹵米松、鹵潑尼松、氫可他酯、氫化可的松、氯替潑諾碳酸乙酯、馬潑尼酮、甲羥松、甲潑尼 松、甲潑尼龍、糠酸莫米松、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼松龍、潑尼松、強(qiáng)的松龍戊酸酯、潑尼 立定、利美索龍、替可的松和曲安西龍;docosenoid,前列腺素類藥物,前列腺素類似物,抗 前列腺素和前列腺素前體;縮瞳劑,膽堿能藥和抗膽堿酯酶;及抗變態(tài)反應(yīng)藥。
      103. 權(quán)利要求71-102任一項(xiàng)的藥物組合物,其是液體組合物。
      104. -種共配制物,其包含: 治療有效量的權(quán)利要求1-56任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽;及 治療有效量的速效胰島素。
      105. -種共配制物,其包含治療有效量的權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽; 及 治療有效量的速效胰島素。
      106. 權(quán)利要求104或105的共配制物,其中所述配制物中修飾的PH20多肽在或在大 約2°C -8°C且包括端點(diǎn)的溫度穩(wěn)定至少1個(gè)月,或者在或在大約30°C -42°C且包括端點(diǎn)的 溫度穩(wěn)定至少3天。
      107. 權(quán)利要求104-106任一項(xiàng)的共配制物,其中所述修飾的PH20多肽的量是或是大約 100U/mL-1000U/mL、200U/mL-800U/mL 或者 400U/mL-800U/mL。
      108. 權(quán)利要求104-107任一項(xiàng)的共配制物,其中所述速效胰島素是普通胰島素或者胰 島素類似物。
      109. 權(quán)利要求104-108任一項(xiàng)的共配制物,其中所述速效胰島素是普通胰島素,其是 人胰島素或豬胰島素。
      110. 權(quán)利要求104-109任一項(xiàng)的共配制物,其中: 所述速效胰島素包含具有SEQ ID NO:862所示氨基酸序列的A鏈和具有SEQ ID NO:863 所示氨基酸序列的B鏈;或者 所述速效胰島素包含具有SEQ ID N0:864的氨基酸殘基位置88-108所示氨基酸序列 的A鏈和具有SEQ ID NO:864的氨基酸殘基位置25-54所示氨基酸序列的B鏈。
      111. 權(quán)利要求104-108任一項(xiàng)的共配制物,其中所述速效胰島素是選自賴脯胰島素、 門冬胰島素和賴谷胰島素的胰島素類似物。
      112. 權(quán)利要求111的共配制物,其中所述胰島素類似物選自具有SEQ ID N0:862所示 氨基酸序列的A鏈和具有SEQ NO:865-867任一所示氨基酸序列的B鏈的胰島素。
      113. 權(quán)利要求104-112任一項(xiàng)的共配制物,其中速效胰島素的量是或是大約10U/ mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-1000U/mL 或者 500U/mL-1000U/mL,包括端點(diǎn)。
      114. 權(quán)利要求104-113任一項(xiàng)的共配制物,其pH為或?yàn)榇蠹s7. 0-7. 6。
      115. 權(quán)利要求104-114任一項(xiàng)的共配制物,其包含濃度為或?yàn)榇蠹s0. lmM-200mM、 0. ImM-lOOmM、120mM-200mM、10mM-50mM、10mM-90mM、80mM-200mM、80mM-140mM、50mM-100mM、 80mM-100mM、50mM-80mM、100mM-140mM 或 120mM-140mM 的 NaCl。
      116. 權(quán)利要求104-115任一項(xiàng)的共配制物,其包含抗微生物有效量的至少一種防腐 劑。
      117. 權(quán)利要求116的共配制物,其中所述抗微生物有效量是一或多種防腐劑的總 量,以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(% )表示,為 0· 05% -0· 6%、0· 1% -0· 4%、0· 1% -0· 3%、 0· 15% -0· 325%、0· 15% -0· 25%、0· 1% -0· 2%、0· 2% -0· 3%或者 0· 3% -0· 4%,包括端 點(diǎn)。
      118. 權(quán)利要求116或117的共配制物,其中所述防腐劑是酚類防腐劑、非酚類防腐劑或 者酚類防腐劑及非酚類防腐劑。
      119. 權(quán)利要求116-118任一項(xiàng)的共配制物,其中所述防腐劑選自苯酚、m-甲酚、對(duì)羥基 苯甲酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯銨、4-氯-1- 丁醇、氯己定二鹽酸鹽、氯己定二葡糖酸 鹽、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇、醋酸苯汞、甘油、咪脲、氯己定、脫氫醋酸鈉、鄰甲酚、對(duì) 甲酚、氯甲酚、溴棕三甲銨、芐索氯銨、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲 酸丁酯及其任意組合。
      120. 權(quán)利要求116-119任一項(xiàng)的共配制物,其中所述組合物含有僅一種防腐劑。
      121. 權(quán)利要求116-119任一項(xiàng)的共配制物,其中所述組合物含有2、3或4種不同防腐 劑的防腐劑混合物。
      122. 權(quán)利要求104-121任一項(xiàng)的共配制物,其包含至少一種酚類防腐劑。
      123. 權(quán)利要求122的共配制物,其中所述防腐劑選自苯酚、間甲酚(m-甲酚)、苯甲醇 和對(duì)羥基苯甲酸酯。
      124. 權(quán)利要求123的共配制物,其中所述防腐劑是對(duì)羥基苯甲酸酯,其是對(duì)羥基苯甲 酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯。
      125. 權(quán)利要求104-124任一項(xiàng)的共配制物,其包含表面活性劑,所述表面活性劑的量 以配制物中質(zhì)量濃度(w/v)百分比%表示,為至少或至少大約0. 001%、0. 005%、0. 01%、 0. 015 %,0. 02 %,0. 025 %,0. 03 %,0. 035 %,0. 04 %,0. 045 %,0. 05 %,0. 055 %,0. 06 %, 0· 065%、0· 07% · 0· 08%或 0· 9%。
      126. 權(quán)利要求125的共配制物,其中所述表面活性劑選自聚丙二醇、聚乙二醇、甘油、 山梨糖醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。
      127. 權(quán)利要求126的共配制物,其中所述表面活性劑選自泊洛沙姆188、聚山梨酯20 和聚山梨酯80。
      128. 權(quán)利要求104-127任一項(xiàng)的共配制物,其包含緩沖劑,所述緩沖劑是非金屬結(jié)合 劑或者是金屬結(jié)合劑。
      129. 權(quán)利要求128的共配制物,其中所述緩沖劑選自Tris、組氨酸、磷酸鹽和檸檬酸鹽 緩沖劑。
      130. 權(quán)利要求128或129的共配制物,其中所述緩沖劑的濃度是或大約是ImM-lOOmM、 10mM-50mM 或者 20mM-40mM。
      131. 權(quán)利要求104-130任一項(xiàng)的共配制物,其包含濃度低于60mM、低于55mM、低于 50mM、低于45mM、低于40mM、低于35mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、低于15mM、低于 10mM的甘油。
      132. 權(quán)利要求104-131任一項(xiàng)的共配制物,其包含抗氧化劑。
      133. 權(quán)利要求132的共配制物,其中所述抗氧化劑選自半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
      134. 權(quán)利要求132或133的共配制物,其中所述抗氧化劑的濃度是或大約是 2mM-50mM、5mM-40mM、5mM-20mM 或者 10mM-20mM,包括端點(diǎn)。
      135. 權(quán)利要求104-134任一項(xiàng)的共配制物,其包含鋅。
      136. 權(quán)利要求135的共配制物,其中鋅的濃度是或大約是0. 001-0. lmg/100單位胰島 素(mg/100U)、0· 001-0. 05mg/100U 或者 0· 01-0. 05mg/100U。
      137. 閉環(huán)系統(tǒng),其包含權(quán)利要求105-136任一項(xiàng)的共配制物。
      138. 胰島素泵,其包含權(quán)利要求105-136任一項(xiàng)的共配制物。
      139. 胰島素筆,其包含權(quán)利要求105-136任一項(xiàng)的共配制物。
      140. -種治療乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥的方法,所述方法包括給予對(duì)象權(quán)利要求 1-56任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽或者權(quán)利要求71-103任一項(xiàng)的藥物組合物。
      141. 權(quán)利要求140的方法,其中所述乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥是炎性疾病或者腫 瘤或癌癥。
      142. 權(quán)利要求141的方法,其中所述腫瘤是實(shí)體腫瘤。
      143. 權(quán)利要求140-142任一項(xiàng)的方法,其中所述乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥選自晚 期癌癥、轉(zhuǎn)移癌癥和未分化癌癥。
      144. 權(quán)利要求140-143任一項(xiàng)的方法,其中所述乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥選自 卵巢癌、原位癌(ISC)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和結(jié)腸 癌。
      145. 治療糖尿病的方法,所述方法包括給予對(duì)象權(quán)利要求95-101任一項(xiàng)的藥物組合 物或者權(quán)利要求104-136任一項(xiàng)的共配制物。
      146. 權(quán)利要求145的方法,其中所述糖尿病選自1型糖尿病、2型糖尿病或者妊娠糖尿 病。
      147. -種增加治療劑輸送至對(duì)象的方法,包括: 給予對(duì)象權(quán)利要求1-56任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽、權(quán)利要求71-103任一項(xiàng)的藥物組 合物或者權(quán)利要求104-136任一項(xiàng)的共配制物;及 給予治療劑。
      148. 權(quán)利要求147的方法,其中所述給予是皮下給予。
      149. 權(quán)利要求147或148的方法,其中所述修飾的PH20多肽或包含修飾的PH20多肽 的組合物是在給予所述治療劑之前、同時(shí)、間歇或隨后給予的。
      150. 權(quán)利要求147-149任一項(xiàng)的方法,其中所述治療劑是多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物、小 分子或有機(jī)分子。
      151. 權(quán)利要求147-150任一項(xiàng)的方法,其中所述治療劑選自化療劑、止痛劑、抗炎劑、 抗微生物劑、殺阿米巴蟲(chóng)劑、殺毛滴蟲(chóng)劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗驚厥劑、抗抑郁劑、及抗 關(guān)節(jié)炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲(chóng)劑、抗組胺劑、α -腎上腺素能激動(dòng)劑、 α阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、生物殺滅劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素能阻斷劑、鈣 通道阻斷劑、心血管藥物、避孕藥、減充血?jiǎng)?、利尿劑、抑郁劑、診斷劑、電解劑、催眠藥、激素 制劑、高血糖制劑、肌肉松弛劑、肌肉收縮劑、眼科用藥、擬副交感神經(jīng)劑、精神興奮劑、鎮(zhèn)靜 齊U、擬交感神經(jīng)劑、安定劑、尿路用藥、陰道制劑、殺病毒劑、維生素制劑、非類固醇抗炎劑、 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、或者睡眠誘導(dǎo)劑。
      152. 權(quán)利要求147-151任一項(xiàng)的方法,其中所述治療劑選自抗體、免疫球蛋白、二膦酸 鹽、細(xì)胞因子、化療劑、凝血因子和胰島素。
      153. 權(quán)利要求152的方法,其中所述治療劑是胰島素,其是速效胰島素。
      154. 權(quán)利要求153的方法,其中所述速效胰島素是普通胰島素或者胰島素類似物。
      155. 權(quán)利要求153或154的方法,其中所述速效胰島素是普通胰島素,其是人胰島素或 者豬胰島素。
      156. 權(quán)利要求153-155任一項(xiàng)的方法,其中: 所述速效胰島素包含具有SEQ ID ΝΟ:862所示氨基酸序列的Α鏈和具有SEQ ID ΝΟ:863 所示氨基酸序列的Β鏈;或者 所述速效胰島素包含具有SEQ ID Ν0:864的氨基酸殘基位置88-108所示氨基酸序列 的Α鏈和具有SEQ ID NO:864的氨基酸殘基位置25-54所示氨基酸序列的Β鏈。
      157. 權(quán)利要求153或154的方法,其中所述速效胰島素是選自賴脯胰島素、門冬胰島素 或賴谷胰島素的胰島素類似物。
      158. 權(quán)利要求157的方法,其中所述胰島素類似物包含具有SEQ ID N0:862所示氨基 酸序列的A鏈和選自SEQ NO:865-867任一所示氨基酸序列的B鏈。
      159. 權(quán)利要求147-151任一項(xiàng)的方法,其中所述治療劑選自阿達(dá)木單抗、阿加糖酶 β、阿萊法塞、氨芐青霉素、阿那白滯素、抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗、抗胸腺細(xì)胞、阿奇霉素、貝卡 普勒明、卡泊芬凈、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、西妥昔單抗、西司 他丁、克拉維酸、克林霉素、達(dá)依泊汀α、達(dá)克珠單抗、白喉、白喉抗毒素、白喉類毒素、依 法珠單抗、腎上腺素、促紅細(xì)胞生成素 α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促卵 泡素 ct、促卵泡素 β、磷苯妥英、禮雙胺、Gadopentetates、加替沙星、格拉默、GM-CSF's、 戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、格拉司瓊、流感嗜血桿菌B、氟哌啶醇、肝炎疫苗、甲肝疫苗、乙 肝疫苗、替伊莫單抗、Tiuxetans、免疫球蛋白、流感嗜血桿菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔 單抗、賴脯胰島素、75 %中性賴脯魚(yú)精蛋白(NPL)/25 %賴脯胰島素、50 %中性魚(yú)精蛋白 Hagedorn(NPH)/50%普通胰島素、70% NPH/30%普通胰島素;普通胰島素、NPH胰島素、 超級(jí)胰島素、特慢胰島素、和甘精胰島素、干擾素、干擾素 α、干擾素 β、干擾素Y、干擾 素 a-2a、干擾素 a2_b、干擾素 Alphacon、干擾素 α-η、干擾素 β、干擾素 β-la、干擾 素 Υ、干擾素 a-con、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉羅尼酶、左氧氟沙星、 利多卡因、利奈唑胺、勞拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹病 毒疫苗、風(fēng)疹疫苗、甲羥孕酮、美羅培南、甲潑尼龍、咪達(dá)唑侖、嗎啡、奧曲肽、奧馬珠單抗、 昂丹司瓊、帕利珠單抗、泮托拉唑、培門冬酶、培非司亭、Peg-干擾素 a -2a、Peg-干擾素 a-2b、培維索孟、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗和肺炎球菌綴合物疫苗、異丙嗪、 瑞替普酶、生長(zhǎng)激素、舒巴坦、舒馬普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破傷風(fēng)純化類毒素、替卡西 林、托西莫單抗、曲安西龍、曲安奈德、己曲安奈德、萬(wàn)古霉素、水痘帶狀皰疹免疫球蛋白、 水痘疫苗、其它疫苗、阿侖珠單抗、阿利維A酸、別嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、砒 霜、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、BCG Live、貝沙羅汀、博來(lái)霉素、白消安、 靜脈內(nèi)白消安、口服白消安、卡普睪酮、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、卡莫司汀與聚苯丙生、 塞來(lái)昔布、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質(zhì)體、達(dá)卡巴嗪、 更生霉素、柔紅霉素脂質(zhì)體、柔紅霉素、道諾霉素、地尼白介素2、右雷佐生、多西他賽、多柔 比星、多柔比星脂質(zhì)體、丙酸屈他雄酮、Elliott's B溶液、表柔比星、阿法依泊汀、雌氮芥、 依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷VP-16s、依西美坦、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、5-氟 尿嘧啶、氟維司群、吉西他濱、吉妥珠單抗、奧佐米星、吉妥珠單抗奧佐米星、羥基脲、伊達(dá) 比星、異環(huán)磷酰胺、甲磺酸伊馬替尼、伊立替康、來(lái)曲唑、甲酰四氫葉酸、左旋咪唑、洛莫司 汀、CCNUs、氮芥(Mechlorethamines)、氮芥(Nitrogen mustards)、甲地孕酮、醋酸甲地孕 酮、美法侖、L-PAMs、巰嘌呤、6-巰嘌呤、美司鈉、氨甲喋呤、甲氧沙林、絲裂霉素類、絲裂霉 素 C、米托坦、米托蒽醌、諾龍、苯丙酸諾龍、若莫單抗、奧普瑞白介素、奧沙利鉬、紫杉醇、帕 瑪二磷酸、培加酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普利霉素、光輝霉素、嚇?lè)茽栤c、嚇?lè)阅封c、丙卡巴 肼、奎納克林、拉布立酶、利妥普單抗、沙格司亭、鏈脲菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替 尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥(niǎo)嘌呤、6_硫代鳥(niǎo)嘌呤、三亞乙基硫代磷酰胺(噻替派)、托泊替康、托 瑞米芬、曲妥珠單抗、維甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、唑來(lái)膦 酸、阿西維辛、阿柔比星、阿考達(dá)唑、阿克羅寧、阿多來(lái)新、阿地白介素、視黃酸、阿利維A酸、 9_順式-視黃酸、Alvocidibs、安巴腙、安波霉素、阿美蒽醌、氨魯米特、安吖啶、阿那昔酮、 安西他濱、氨茴霉素、Apaziquones、精美司那、曲林菌素、阿莫司汀、阿扎胞苷、阿扎替派、阿 佐霉素、Banoxantrones、Batabulins、巴馬司他、貝那昔濱、苯達(dá)莫司汀、苯佐替派、比卡魯 胺、比他舍平、比立考達(dá)、比生群、Bisnafide Dimesylates、比折來(lái)新、硼替佐米、布喹那、溴 匹立明、布度鈦、放線菌素 C、Canertinibs、卡醋胺、卡貝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、 卡折來(lái)新、西地芬戈、西馬多丁、苯丁酸氮芥、塞奧羅奈、西羅霉素、克蘭氟脲、氯法拉濱、克 立那托、地西他濱、右尼古地平、右?jiàn)W馬鉬、地扎胍寧、地吖醌、Dibrospidiums、地諾孕素、 地那林、Disermolides、Dofequidars、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、達(dá)佐霉素、依考莫司汀、依達(dá) 曲沙、Edotecarins、依氟鳥(niǎo)氨酸、依拉克達(dá)、依利奈法德、依沙蘆星、乙啼替氟、恩洛鉬、恩 普氨酯、Enzastaurins、依匹哌陡、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他硝唑、依托格魯、 氯苯乙嘧胺、依昔舒林、法倔唑、法扎拉濱、芬維A胺、氟甲睪酮、氟西他濱、磷喹酮、福司曲 星、福曲他明、加柔比星、加洛他濱、吉羅酚、Gimatecans、吉美嘧啶、格洛沙腙、葡磷酰胺、伊 莫福新、伊洛馬司他、伊美克、英丙舒凡、Indisulams、雙丙氧亞胺醌、白介素、白介素-2s、 重組白介素、茚托利辛、碘芐胍、異丙鉬、伊索拉定、Ixabepilones、酮曲沙、L-阿拉諾新、蘭 瑞肽、Lapatinibs、來(lái)多蒽瓊、亮丙瑞林、亮丙瑞林、來(lái)沙骨化醇、利阿唑、洛鉬、洛美曲索、 法尼醇蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、洛索蒽醌、勒托替康、馬磷酰胺、甘露舒凡、馬立馬司他、馬索羅 酚、美坦辛、氮芥、美侖孕酮、美法侖、美諾立爾、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯氨啶、美 妥替哌、米帕、米潑昔芬、米索硝唑、米丁度胺、Mitocarcins、絲裂紅素、米托拉酮、米托潔 林、米托胍腙、米托馬星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立賓、 莫法羅汀、莫哌達(dá)醇、Mubritinibs、霉酚酸、奈達(dá)鉬、Neizarabines、奈莫柔比星、硝氨丙口丫 陡、諾考達(dá)唑、諾拉霉素、諾拉曲塞、Nortopixantrones、奧馬鉬、Ortataxels、奧替拉西、奧 昔舒侖、氧芬胂、Patupilones、培得星、培利霉素、Pelitrexols、培美曲塞、溴新斯的明、 培洛霉素、培磷酰胺、哌立福辛、Picoplatins、吡奈非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡羅蒽醌、 Pixantrones、Plevitrexeds、普洛美坦、泊非霉素、波尼莫司汀、普羅帕脒、螺丙醇、噪啼替 派、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、羅谷亞胺、羅喹美克、鏈黑霉 素、Sabarubicins、沙芬戈、沙鉬、司鉬、司莫司汀、辛曲秦、西左非蘭、索布佐生、索拉非尼、 Sparfosates、磷乙天冬氨酸、司帕霉素、鍺螺胺、螺莫司汀、螺鉬、角鯊胺、鏈黑霉素、鏈伐立 星、磺磷酰胺、磺氯苯脲、Tacedinalines、他利霉素、他莫司汀、Tariquidars、?;悄就?、 Tecogalans、替加氟、替洛蒽醌、替莫泊芬、替羅昔隆、硫咪嘌呤、硫咪嘌呤、噻唑羧胺核苷、 噻氯咪索、替洛隆、汀考達(dá)、噻莫西酸、替拉扎明、Topixantrones、曲貝替定、海鞘素743、曲 托龍、曲西立濱、曲洛司坦、三甲曲沙、Triplatin Tetranitrates、曲普瑞林、曲磷胺、妥布 氯唑、烏苯美司、烏瑞替派、伐司樸達(dá)、伐普肽、維替泊芬、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春匹定、長(zhǎng)春 氟寧、長(zhǎng)春米特、長(zhǎng)春甘酯、長(zhǎng)春西醇、長(zhǎng)春羅新、長(zhǎng)春羅定、長(zhǎng)春曲醇、長(zhǎng)春利定、伏氯唑、黃 鏈霉素 A、胍甲環(huán)素、折尼鉬、亞芐維C(2H)、凈司他丁、佐柔比星、Zosuquidars、乙酰唑胺、 阿昔洛韋、膽影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、變應(yīng)原浸出物、α 1-蛋白酶抑制劑、前列地爾、 阿米卡星、氨基酸、氨基己酸、氨茶堿、阿米替林、異戊巴比妥、氨力農(nóng)、鎮(zhèn)痛藥、抗-脊髓灰 質(zhì)炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破傷風(fēng)免疫球蛋白、破傷風(fēng)疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、 阿加曲班、精氨酸、抗壞血酸、阿替洛爾、阿曲庫(kù)銨、阿托品、金硫葡糖、硫唑嘌呤、氨曲南、桿 菌肽、巴氯芬、巴利昔單抗、苯甲酸、苯扎托品、倍他米松、生物素、比伐盧定、肉毒抗毒素、 溴芐銨、布美他尼、布比卡因、丁丙諾啡、布托啡諾、降鈣素、骨化三醇、鈣、卷曲霉素、卡波 前列素、肉堿、頭孢孟多、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢呋辛、氯霉素、氯 普魯卡因、氯喹、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸軟骨素、絨毛膜促性腺激素 α、鉻、西多福韋、西咪替 丁、環(huán)丙沙星、順阿曲庫(kù)銨、可樂(lè)定、可待因、秋水仙堿、粘菌素、膠原、Corticorelin ovine triflutates、促皮質(zhì)素、二十四肽促皮質(zhì)素、氰鈷胺、環(huán)孢菌素、半胱氨酸、達(dá)昔單抗、達(dá)福 普汀、達(dá)肝素、達(dá)那肝素、丹曲林、去鐵胺、去氨加壓素、地塞米松、右美托咪定、右泛醇、右旋 糖酐、右旋糖酐鐵、泛影酸、地西泮、二氮嗪、雙環(huán)維林、Digibinds、地高辛、雙氫麥角胺、地 爾硫卓、苯海拉明、雙嘧達(dá)莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯銨、多沙普侖、度骨化醇、多西環(huán) 素、氟哌利多、二羥丙茶堿、依地酸、依酚氯銨、依那普利拉、麻黃堿、依前列醇、麥角鈣化醇、 麥角新堿、厄他培南、紅霉素、艾司洛爾、雌二醇、Estrogenics、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙 碘油、羥乙磷酸、依托咪酯、法莫替丁、非諾多泮、芬太尼、氟馬西尼、熒光素、氟奮乃靜、葉 酸、甲吡唑、福米韋生、磺達(dá)肝素、膦甲酸、磷苯妥英、呋塞米、釓特醇、釓弗塞胺、更昔洛韋、 慶大霉素、胰高血糖素、葡萄糖、甘氨酸、格隆溴銨、戈那瑞林、絨毛膜促性腺激素、嗜血桿 菌B多糖、氯化血紅素、Herbals、組胺、肼苯噠嗪、氫化可的松、氫嗎啡酮、羥鈷胺、羥嗪、莨 菪堿、伊布利特、伊米苷酶、靛胭脂、吲哚美辛、碘化物、碘普胺、碘拉酸、碘克沙酸、碘昔蘭、 異煙肼、異丙腎上腺素、日本腦炎疫苗、卡那霉素、氯胺酮、拉貝洛爾、來(lái)匹盧定、左布比卡 因、左甲狀腺素、林可霉素、碘塞羅寧、促黃體激素、萊姆病疫苗、錳福地吡、Manthtols、腦 膜炎球菌多糖疫苗、哌替啶、甲哌卡因、美索達(dá)嗪、間羥胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲 基多巴類、甲基麥角新堿、甲氧氯普胺、美托洛爾、甲硝唑、米諾環(huán)素、米伐克龍、魚(yú)肝油酸、 莫西沙星、莫羅單抗-CD3、麥考酚酸嗎乙酯、萘夫西林、納布啡、納美芬、納洛酮、新斯的明、 煙酰胺、尼卡地平、硝酸甘油、硝普鈉、去甲腎上腺素、奧芬那君、苯唑西林、羥嗎啡酮、土霉 素、縮宮素、潘可龍、泛醇、泛酸、罌粟堿、PEG干擾素 ci2A、青霉素 G、噴他脒、噴他佐辛、戊 巴比妥、全氟丙烷、奮乃靜、苯巴比妥、酚妥拉明、去氧腎上腺素、苯妥英、毒扁豆堿、植物甲 萘醌、多粘菌素、解磷定、丙胺卡因、普魯卡因胺、普魯卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛爾、批 啶斯的明氫氧化物、維生素 B6、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替 丁、瑞芬太尼、核黃素、利福平、羅哌卡因、釤、東莨菪堿、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、人蛋氨生 長(zhǎng)素、壯觀霉素、鏈激酶、鏈霉素、琥珀酰膽堿、舒芬太尼、磺胺甲噁唑、他羅利姆、特布他林、 特立帕肽、睪酮、破傷風(fēng)抗毒素、丁卡因、十四烷基硫酸鹽/酯、茶堿、硫胺素、硫乙拉嗪、硫 噴妥、促甲狀腺激素、亭扎肝素、替羅非班、妥布霉素、妥拉唑啉、甲苯磺丁脲、托拉塞米、氨 甲環(huán)酸、曲羅尼爾、三氟拉嗪、曲美芐胺、甲氧芐啶、氨丁三醇、結(jié)核菌素、傷寒疫苗、尿促卵 泡素、尿激酶、丙戊酸、加壓素、維庫(kù)溴銨、維拉帕米、伏立康唑、華法林、黃熱病疫苗、齊多夫 定、鋅、鹽酸齊拉西酮、阿克拉霉素、放線菌素、阿霉素、偶氮絲氨酸、6-氮尿苷、嗜癌素、色霉 素、二甲葉酸、6-疊氮-5-氧-L-正亮氨酸、依諾他濱、氟尿苷、橄欖霉素、吡柔比星、吡曲 克辛、蝶羅呤、替加氟、殺結(jié)核菌素、阿替普酶、阿西莫單抗、貝伐珠單抗、A型肉毒菌毒素、 B型肉毒菌毒素、卡羅單抗噴地肽、達(dá)克珠單抗、阿法鏈道酶、替加色羅α、戊酸印西洛馬、 碘-131 ;抗生素物質(zhì);血管發(fā)生抑制劑;抗白內(nèi)障和抗糖尿病視網(wǎng)膜病變藥物;碳酸酐酶抑 制劑;瞳孔放大劑;光動(dòng)力治療劑;前列腺素類似物;生長(zhǎng)因子;抗腫瘤藥物;抗代謝物;抗 病毒藥物;殺阿米巴劑和抗原生動(dòng)物劑;抗結(jié)核藥和抗麻風(fēng)藥;抗毒素和抗蛇毒素;抗血友 病因子,抗抑制劑凝血復(fù)合物,抗凝血酶III,凝血因子V,凝血因子IX,血漿蛋白級(jí)分,von Willebrand因子;抗血小板制劑,集落刺激因子(CSF);紅細(xì)胞生成刺激物;止血?jiǎng)┖桶椎?白;免疫球蛋白;凝血酶抑制劑;抗凝血?jiǎng)活惞檀伎寡姿幬?,選自阿氯米松、阿爾孕酮、倍 氯米松、倍他米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)酮、可的松、可 的伐唑、地夫可特、地奈德、去羥米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯、甘草次 酸、氟扎可特、氟二氯松、氟米松、氟尼縮松、膚輕松、醋酸氟輕松、氟可丁、氟可龍、氟米龍、 氟培龍、氟潑尼定、氟潑尼龍、丙酮縮氟氫羥龍、氟替卡松、福莫可他、氯氟舒松、齒倍他索、 鹵米松、鹵潑尼松、氫可他酯、氫化可的松、氯替潑諾碳酸乙酯、馬潑尼酮、甲羥松、甲潑尼 松、甲潑尼龍、糠酸莫米松、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼松龍、潑尼松、強(qiáng)的松龍戊酸酯、潑尼 立定、利美索龍、替可的松和曲安西龍;docosenoid,前列腺素類藥物,前列腺素類似物,抗 前列腺素和前列腺素前體;縮瞳劑,膽堿能藥和抗膽堿酯酶;及抗變態(tài)反應(yīng)藥。
      160. 治療糖胺聚糖過(guò)量、治療腫瘤、治療糖胺聚糖在腦中積聚、治療心血管疾病、治療 眼科病癥、治療肺部疾病、增加化療劑滲透進(jìn)實(shí)體腫瘤中、治療蜂窩組織、治療增生性病癥、 或者增加藥物和其它治療劑的生物利用度的方法,包括給予對(duì)象權(quán)利要求1-56任一項(xiàng)的 修飾的PH20多肽或者權(quán)利要求71-103任一項(xiàng)的藥物組合物。
      161. 權(quán)利要求71-103任一項(xiàng)的藥物組合物,其用于治療乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病 癥。
      162. 權(quán)利要求95-101任一項(xiàng)的藥物組合物或權(quán)利要求104-136任一項(xiàng)的共配制物,其 用于治療糖尿病。
      163. 權(quán)利要求71-103任一項(xiàng)的藥物組合物,其用于將治療劑輸送至對(duì)象。
      164. 權(quán)利要求71-103任一項(xiàng)的藥物組合物,其用于治療糖胺聚糖過(guò)量、治療腫瘤、治 療糖胺聚糖在腦中積聚、治療心血管病癥、治療眼科病癥、治療肺部疾病、增加化療劑滲透 至實(shí)體腫瘤中、治療蜂窩組織、治療增生性病癥、或者增加藥物及其它治療劑的生物利用 度。
      165. 鑒別或選擇在變性條件下呈現(xiàn)穩(wěn)定性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的方法,其 中: 所述方法包括: a) 檢測(cè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶在包含變性劑的組合物中和/或在變性條件下的 活性; b) 檢測(cè)所述修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶在除了不存在所述變性劑或變性條件之外的 與a)相同的組合物中和/或在相同條件下的活性;及 c) 選擇或鑒別在a)中呈現(xiàn)活性是在b)中活性的至少5%的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解 酶;和/或 所述方法包括: a) 檢測(cè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶在包含變性劑的組合物中和/或在變性條件下的 活性; b) 檢測(cè)相應(yīng)未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶在含有與a)相同的變性劑的組合物中和/ 或在相同變性條件下的活性,其中在與a)相同的條件下檢測(cè)所述活性;及 c) 選擇或鑒別呈現(xiàn)更高活性的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶,所述活性與所述未修飾的 乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比是其活性的至少120%。
      166. 權(quán)利要求165的方法,其中所述活性是透明質(zhì)酸酶活性。
      167. 權(quán)利要求165或166的方法,包括: d) 對(duì)比在相同條件下在a)中選擇或鑒別的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的活性與所述 未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的活性;及 e) 鑒別或選擇與所述未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比呈現(xiàn)至少 135 %U40 %U45 %U50 %U60 %U70 %U80 %,200 %,250 %,300 %,350 %A00 %> 500 %、1500 %、2000 %、3000 %、4000 %、5000 %或更多的透明質(zhì)酸酶活性的修飾的乙酰透 明質(zhì)酸-降解酶。
      168. 權(quán)利要求165-167任一項(xiàng)的方法,其中所述變性劑或條件是由溫度、攪拌、無(wú)鹽或 低鹽或者存在賦形劑所致的。
      169. 權(quán)利要求165-167任一項(xiàng)的方法,其中所述變性劑或條件是變性賦形劑,其選自 抗粘附劑、結(jié)合劑、涂覆劑、充填劑和稀釋劑、香料、色素、潤(rùn)滑劑、助流劑、防腐劑、吸附劑和 甜味劑。
      170. 權(quán)利要求169的方法,其中所述變性劑或條件是防腐劑。
      171. 權(quán)利要求170的方法,其中所述防腐劑是酚類防腐劑。
      172. 權(quán)利要求171的方法,其中所述酚類防腐劑選自苯酚、間甲酚(m-甲酚)、苯甲醇 和對(duì)羥基苯甲酸酯。
      173. 權(quán)利要求172的方法,其中所述防腐劑是苯酚和/或m-甲酚。
      174. 權(quán)利要求171-173任一項(xiàng)的方法,其中所述組合物中以質(zhì)量濃度(w/v)百分比 (%)表示的酚類防腐劑的總量是或者是大約0.05%-0.6%、0.1%-0.4%、0.1%-0.3%、 0· 15% -0· 325%、0· 15% -0· 25%、0· 1% -0· 2%、0· 2% -0· 3%或者 0· 3% -0· 4%,包括端 點(diǎn)。
      175. 權(quán)利要求165-174任一項(xiàng)的方法,其中在a)和b)中檢測(cè)乙酰透明質(zhì)酸降解酶組 合物的活性之前,將所述乙酰透明質(zhì)酸降解酶暴露于所述變性條件或變性劑預(yù)定時(shí)間。
      176. 權(quán)利要求175的方法,其中所述預(yù)定時(shí)間是或是大約1分鐘至1個(gè)月,1分鐘至3 周,1分鐘至2周,1分鐘至1周,1分鐘至24小時(shí),1分鐘至12小時(shí),30分鐘至6小時(shí)或者 1小時(shí)至4小時(shí)。
      177. 權(quán)利要求165-176任一項(xiàng)的方法,其中所述修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與未修飾 的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比包含氨基酸置換、氨基酸插入或缺失。
      178. 權(quán)利要求177的方法,其中所述修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與所述未修飾形式的 乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比含有僅一個(gè)氨基酸置換或者2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸 置換。
      179. 權(quán)利要求165-178任一項(xiàng)的方法,其中檢測(cè)在a)和/或b)中的多個(gè)修飾的乙酰 透明質(zhì)酸降解酶。
      180. 權(quán)利要求179的方法,其中: 與相應(yīng)未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶相比,所述多個(gè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶被修 飾,產(chǎn)生修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶集合,其中在a)和/或b)中檢測(cè)所述集合中每個(gè)修飾 的蛋白質(zhì),其中 所述集合中每個(gè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶與所述未修飾形式的乙酰透明質(zhì)酸降解 酶相比含有僅一個(gè)氨基酸置換; 在所述集合中,在每個(gè)修飾的位置的氨基酸由除了在該位置的原始氨基酸之外的至多 1-19個(gè)其它氨基酸置換,其中每個(gè)修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶含有不同的氨基酸置換;及 在所述集合中,沿著所述乙酰透明質(zhì)酸降解酶的長(zhǎng)度或者其選擇的一部分的每個(gè)氨基 酸被置換。
      181. 權(quán)利要求165-180任一項(xiàng)的方法,其中所述未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是軟骨 素酶或者是透明質(zhì)酸酶。
      182. 權(quán)利要求181的方法,其中所述未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是透明質(zhì)酸酶,其 是PH20透明質(zhì)酸酶或者其缺少C-末端糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨附著位點(diǎn)或者GPI錨附 著位點(diǎn)的一部分的截短形式,其中所述截短形式呈現(xiàn)透明質(zhì)酸酶活性。
      183. 權(quán)利要求182的方法,其中所述未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶是PH20透明質(zhì)酸 酶,其選自人、猴、牛、羊、大鼠、狐貍、小鼠或豚鼠 PH20。
      184. 權(quán)利要求183的方法,其中所述未修飾的透明質(zhì)酸酶是人PH20或者其C末端截短 形式。
      185. 權(quán)利要求165-184任一項(xiàng)的方法,其中所述未修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶具有 SEQ ID N0:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、870 任一所示氨基酸序列或者與 SEQ ID N0:3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、857、859、861、870任一是至少80%序列相同性 的氨基酸序列。
      186. 權(quán)利要求165-185任一項(xiàng)的方法,其在體外進(jìn)行。
      187. 權(quán)利要求165-186任一項(xiàng)的方法,進(jìn)一步包括重復(fù)多次所述步驟,其中在每次重 復(fù)中,產(chǎn)生并檢測(cè)選擇的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶的進(jìn)一步修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解 酶,其中所述修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶被進(jìn)化為在變性條件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性。
      188. 通過(guò)權(quán)利要求165-187任一項(xiàng)的方法鑒別的修飾的乙酰透明質(zhì)酸降解酶。
      189. 在存在酚類防腐劑條件下呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性的修飾的PH20多肽,其在PH20多肽 中包含氨基酸置換,其中: 所述氨基酸置換賦予所述增加的穩(wěn)定性; 與無(wú)所述氨基酸置換的未修飾的多肽相比穩(wěn)定性是增加的;及 所述未修飾的PH20多肽由SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列組成或者是其C-末端截短片 段,其為可溶的PH20多肽,或者與其具有至少85%序列相同性。
      190. 權(quán)利要求189的修飾的PH20多肽,其中所述未修飾的PH20多肽是可溶的PH20多 肽,其由SEQ ID NO:3或32-66任一所示任何氨基酸序列組成。
      191. 權(quán)利要求189或190的修飾的PH20多肽,其與SEQ ID N0:3具有至少85%序列 相同性。
      192. 權(quán)利要求189-191任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48, 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75 或更多個(gè)氨基酸置換。
      193. 權(quán)利要求189-192任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其是人PH20。
      194. 權(quán)利要求189-193任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽在存在 防腐劑條件下與不存在所述酚類防腐劑條件下的透明質(zhì)酸酶活性相比呈現(xiàn)至少15%的透 明質(zhì)酸酶活性至少4小時(shí),其中所述活性是在除了存在酚類防腐劑之外相同的條件下對(duì)比 的。
      195. 權(quán)利要求189-194任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽在存在 抗微生物有效量的一或多種酚類防腐劑的條件下是穩(wěn)定的。
      196. 權(quán)利要求195的修飾的PH20多肽,其中所述抗微生物有效量是一或多種酚 類防腐劑的總量,以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(%)表示,是或者是大約0.05%-0.6%、 0. 1 % -0. 4 % ,0. 1 % -0. 3 %,0. 15 % -〇. 325 %,0. 15 % -〇. 25 %,0. 1 % -〇. 2 %, 0.2% -0.3%或者 0.3% -0.4%,包括端點(diǎn)。
      197. 權(quán)利要求189-196任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述酚類防腐劑選自苯酚、間 甲酚(m-甲酚)、苯甲醇和對(duì)羥基苯甲酸酯中的一或多種。
      198. 權(quán)利要求189-197任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述防腐劑是酚類防腐劑,其 是m-甲酚、苯酚或者m-甲酚和苯酚。
      199. 權(quán)利要求189-198任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其在相應(yīng)于選自如下參考SEQ ID NO:3所示氨基酸位置的位置的氨基酸位置包含至少一個(gè)氨基酸置換:204、58、10、12、20、 22、26、34、36、46、50、52、68、70、74、82、83、84、86、97、127、131、138、142、143、144、166、169、 174、193、195、196、205、206、213、219、234、237、238、240、249、261、267、277、279、291、309、 310、314、315、317、318、347、367、375、376、399、401、407、416、419、421、431、433、439、440、 443或445,其中相應(yīng)氨基酸位置是通過(guò)排列對(duì)比所述PH20多肽與SEQ ID NO: 3所示多肽 而鑒別的。
      200. 權(quán)利要求189-199任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含選自如下置換的至少一個(gè)氨 基酸置換,所述如下置換的位置相應(yīng)于參考SEQ ID N0:3所示氨基酸殘基位置的位置: 在相應(yīng)于位置10的位置的G ;在相應(yīng)于位置12的位置的K ;在相應(yīng)于位置20的位置 的S ;在相應(yīng)于位置22的位置的T ;在相應(yīng)于位置26的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置34的位置 的W ;在相應(yīng)于位置36的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置46的位置的L ;在相應(yīng)于位置50的位置 的Μ ;在相應(yīng)于位置52的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置52的位置的S ;在相應(yīng)于位置58的位置 的C ;在相應(yīng)于位置58的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置58的位置的R ;在相應(yīng)于位置58的位置 的Ν ;在相應(yīng)于位置58的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置58的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置58的位置 的Η ;在相應(yīng)于位置68的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置70的位置的V ;在相應(yīng)于位置74的位置 的Ε ;在相應(yīng)于位置82的位置的L ;在相應(yīng)于位置82的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置83的位置 的V ;在相應(yīng)于位置83的位置的Q ;在相應(yīng)于位置83的位置的S ;在相應(yīng)于位置83的位置 的G ;在相應(yīng)于位置84的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置86的位置的A ;在相應(yīng)于位置86的位置 的K ;在相應(yīng)于位置97的位置的E ;在相應(yīng)于位置97的位置的L ;在相應(yīng)于位置127的位置 的R ;在相應(yīng)于位置131的位置的R ;在相應(yīng)于位置138的位置的L ;在相應(yīng)于位置142的位 置的K ;在相應(yīng)于位置142的位置的N ;在相應(yīng)于位置142的位置的P ;在相應(yīng)于位置142的 位置的S ;在相應(yīng)于位置142的位置的T ;在相應(yīng)于位置143的位置的G ;在相應(yīng)于位置143 的位置的K ;在相應(yīng)于位置144的位置的T ;在相應(yīng)于位置166的位置的Q ;在相應(yīng)于位置 166的位置的T ;在相應(yīng)于位置169的位置的L ;在相應(yīng)于位置174的位置的G ;在相應(yīng)于位 置174的位置的N ;在相應(yīng)于位置193的位置的Q ;在相應(yīng)于位置195的位置的T ;在相應(yīng)于 位置195的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置196的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置196的位置的R ;在相應(yīng) 于位置204的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置205的位置的A ;在相應(yīng)于位置205的位置的Ε ;在相 應(yīng)于位置206的位置的I ;在相應(yīng)于位置213的位置的A ;在相應(yīng)于位置219的位置的I ;在 相應(yīng)于位置234的位置的Μ ;在相應(yīng)于位置237的位置的T ;在相應(yīng)于位置238的位置的Η ; 在相應(yīng)于位置240的位置的Q ;在相應(yīng)于位置249的位置的V ;在相應(yīng)于位置261的位置的 A ;在相應(yīng)于位置261的位置的Κ ;在相應(yīng)于位置267的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置277的位置 的K ;在相應(yīng)于位置279的位置的Η ;在相應(yīng)于位置279的位置的V ;在相應(yīng)于位置291的位 置的V ;在相應(yīng)于位置309的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置310的位置的Q ;在相應(yīng)于位置314的 位置的Υ ;在相應(yīng)于位置315的位置的Υ ;在相應(yīng)于位置317的位置的Ν ;在相應(yīng)于位置317 的位置的W ;在相應(yīng)于位置318的位置的D ;在相應(yīng)于位置347的位置的G ;在相應(yīng)于位置 367的位置的A ;在相應(yīng)于位置375的位置的R ;在相應(yīng)于位置376的位置的R ;在相應(yīng)于位 置399的位置的V ;在相應(yīng)于位置401的位置的E ;在相應(yīng)于位置407的位置的A ;在相應(yīng)于 位置416的位置的L ;在相應(yīng)于位置419的位置的K ;在相應(yīng)于位置421的位置的Η ;在相應(yīng) 于位置431的位置的Ε ;在相應(yīng)于位置433的位置的Τ ;在相應(yīng)于位置433的位置的V ;在相 應(yīng)于位置439的位置的C ;在相應(yīng)于位置440的位置的Ρ ;在相應(yīng)于位置443的位置的G ;及 在相應(yīng)于位置445的位置的Ν。
      201. 權(quán)利要求189-200任一項(xiàng)的修飾的ΡΗ20多肽,其包含選自如下置換的至少一個(gè)氨 基酸置換,所述如下置換的位置相應(yīng)于參考SEQ ID ΝΟ:3所示氨基酸殘基位置的位置: 在相應(yīng)于位置52的位置的Τ、在相應(yīng)于位置58的位置的Κ、在相應(yīng)于位置58的位置的 R、在相應(yīng)于位置68的位置的Ρ、在相應(yīng)于位置83的位置的V、在相應(yīng)于位置204的位置的 Ρ、在相應(yīng)于位置261的位置的Α、在相應(yīng)于位置267的位置的Τ、在相應(yīng)于位置277的位置 的Κ及在相應(yīng)于位置421的位置的Η。
      202. 權(quán)利要求189-201任一項(xiàng)的修飾的ΡΗ20多肽,其包含在相應(yīng)于在ΡΗ20多肽中參 考SEQ ID NO:3所示氨基酸殘基位置的位置204的位置用Ρ的置換。
      203. 權(quán)利要求189-202任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其包含在相應(yīng)于PH20多肽中參考 SEQ ID NO:3所示氨基酸殘基位置的位置58的位置用R的置換。
      204. 權(quán)利要求189-203任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其是基本上純化的或分離的。
      205. 權(quán)利要求189-204任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其是通過(guò)選自如下的修飾方式修飾 的:糖基化、唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羥化和磷酸化。
      206. 權(quán)利要求189-205任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽是糖基 化的,其中所述多肽包含與至少三個(gè)天冬酰胺(N)殘基的每個(gè)均連接的至少一個(gè)N-乙酰葡 糖胺部分。
      207. 權(quán)利要求206的修飾的PH20多肽,其中所述三個(gè)天冬酰胺殘基相應(yīng)于SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基200、333和358。
      208. 權(quán)利要求189-207任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其通過(guò)與聚合物綴合而修飾。
      209. 權(quán)利要求208的修飾的PH20多肽,其中所述聚合物是葡聚糖或PEG。
      210. 權(quán)利要求189-209任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽,其中所述修飾的PH20多肽與選自 多聚化結(jié)構(gòu)域、毒素、可檢測(cè)標(biāo)記或藥物的部分綴合。
      211. 核酸分子,其編碼權(quán)利要求189-203任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽。
      212. 載體,其包含權(quán)利要求211的核酸分子。
      213. 權(quán)利要求212的載體,其是真核或原核載體。
      214. 權(quán)利要求213的載體,其是哺乳動(dòng)物載體或病毒載體。
      215. 細(xì)胞,其包含權(quán)利要求212-214任一項(xiàng)的載體。
      216. 產(chǎn)生修飾的PH20多肽的方法,包括: 將權(quán)利要求211的核酸導(dǎo)入能將N-連接的糖部分摻入所述多肽中的細(xì)胞中; 將所述細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng),其中所述細(xì)胞產(chǎn)生和分泌編碼的修飾的PH20多肽;及 回收表達(dá)的多肽。
      217. 藥物組合物,其包含權(quán)利要求189-210任一項(xiàng)的修飾的PH20多肽。
      218. 權(quán)利要求217的藥物組合物,其包含治療活性劑。
      219. 權(quán)利要求218的藥物組合物,其中所述治療劑是胰島素,其是速效胰島素。
      220. 權(quán)利要求219的藥物組合物,其中: 修飾的PH20多肽的量是或者是大約100U/mL-1000U/mL ;及 速效胰島素的量是或是大約10U/mL-1000U/mL。
      221. 權(quán)利要求220的藥物組合物,其中: 所述pH是或是大約7. 0-7. 6 ;及 進(jìn)一步包含: 濃度是或是大約〇. lmM-200mM的NaCl ;及 抗微生物有效量的至少一種防腐劑,其中所述組合物含有至少一種酚類防腐劑。
      222. 權(quán)利要求221的藥物組合物,其中所述抗微生物有效量是一或多種防腐劑的總 量,以質(zhì)量濃度(w/v)百分比(%)表示,其是0.05% -0.6%。
      223. 權(quán)利要求221或222的藥物組合物,其中所述防腐劑選自苯酚、間甲酚(m-甲酚)、 苯甲醇及對(duì)羥基苯甲酸酯。
      224. 權(quán)利要求220-223任一項(xiàng)的藥物組合物,進(jìn)一步包含: 表面活性劑,其在所述配制物中質(zhì)量濃度(w/v) %的量為至少或至少大約0.001% ; 緩沖劑,其是非金屬結(jié)合劑或者是金屬結(jié)合劑,其中所述緩沖劑的濃度是或是大約 ImM-lOOmM ; 甘油,濃度低于60mM; 抗氧化劑,濃度為或者為大約2mM-50mM,包括端點(diǎn);和/或 鋅,濃度為或?yàn)榇蠹s〇· 001-0. lmg/100單位胰島素(mg/100U)。
      225. 權(quán)利要求224的藥物組合物,其中所述表面活性劑選自聚丙二醇、聚乙二醇、甘 油、山梨糖醇、泊洛沙姆和聚山梨酯。
      226. 權(quán)利要求224的藥物組合物,其中所述緩沖劑選自Tris、組氨酸、磷酸鹽和檸檬酸 鹽緩沖劑。
      227. 權(quán)利要求224的藥物組合物,其中所述抗氧化劑選自半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨 酸。
      228. 閉環(huán)系統(tǒng)、胰島素泵或胰島素針,其包含權(quán)利要求219-227任一項(xiàng)的藥物組合物。
      229. -種治療乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病癥、治療與糖胺聚糖過(guò)量相關(guān)的病癥、治療 腫瘤、治療腦中糖胺聚糖聚集、治療心血管疾病、治療眼科病癥、治療肺部疾病、增加化療劑 滲透進(jìn)實(shí)體腫瘤中、治療蜂窩組織、治療增生性疾病、增加治療劑輸送至對(duì)象或者增加藥物 及其它治療劑的生物利用度的方法,包括給予對(duì)象權(quán)利要求189-210任一項(xiàng)的修飾的PH20 多肽或者權(quán)利要求217-227任一項(xiàng)的藥物組合物。
      230. 權(quán)利要求217-227任一項(xiàng)的藥物組合物,其用于治療乙酰透明質(zhì)酸相關(guān)疾病或病 癥、治療與糖胺聚糖過(guò)量相關(guān)的病癥、治療腫瘤、治療腦中糖胺聚糖聚集、治療心血管疾病、 治療眼科病癥、治療肺部疾病、增加化療劑滲透進(jìn)實(shí)體腫瘤中、治療蜂窩組織、治療增生性 疾病、增加治療劑輸送至對(duì)象或者增加藥物及其它治療劑的生物利用度。
      231. 治療糖尿病的方法,包括給予對(duì)象權(quán)利要求219-227任一項(xiàng)的藥物組合物。
      232. 權(quán)利要求219-227任一項(xiàng)的藥物組合物,其用于治療糖尿病。
      【文檔編號(hào)】A61K38/43GK104244968SQ201280070954
      【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月30日
      【發(fā)明者】G·衛(wèi), H·M·謝潑德, Q·趙, R·J·康納 申請(qǐng)人:哈洛齊梅公司
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