一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)于一種疫苗組合物，其含有豬瘟病毒抗原、豬圓環(huán)病毒2型抗原、豬肺炎支原體抗原和疫苗佐劑。本發(fā)明還提供一種制備疫苗組合物的方法，采用水溶性疫苗佐劑配制含豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物，將所述混合物作為稀釋劑稀釋豬瘟病毒抗原。本發(fā)明的疫苗組合物，制備方法簡單，疫苗的效價(jià)含量高，免疫方便快捷，僅免疫1次就能夠同時(shí)預(yù)防或治療豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體三種病原感染，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟(jì)可靠。
【專利說明】一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明關(guān)于一種聯(lián)合疫苗組合物，特別關(guān)于一種豬瘟、豬圓環(huán)和豬肺炎支原體三聯(lián)混合疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬瘟是豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是高溫、微血管變性而引起全身出血、壞死、梗塞。早年又稱豬霍亂，對豬危害極為嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，但由于混合感染以及一些免疫抑制病原體的影響，造成了單用豬瘟疫苗防治效果的下降，豬瘟總有零星爆發(fā)。
[0003]豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus,縮寫:PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原，最早發(fā)現(xiàn)于加拿大(1991 )，很快在歐美及亞洲一些國家包括我國發(fā)生和流行，除PMWS外，TONS (豬皮炎與腎病綜合征)、PNP (增生性壞死性肺炎)、PRDC (豬呼吸道疾病綜合征)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)。PCV2及其相關(guān)的豬病，死亡率10%~30%不等，較嚴(yán)重的豬場在暴發(fā)本病時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的引起豬免疫障礙的重要傳染病。豬圓環(huán)病毒產(chǎn)生免疫抑制，容易發(fā)生烈性傳染病。
[0004]豬支原體性肺炎是由豬肺炎支原體引發(fā)的一種慢性肺炎，又稱豬地方流行性肺炎。長期以來，本病一直被認(rèn)為是對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失、最常發(fā)生、流行最廣、最難凈化的重要疫病之一。本病雖為老病，但近年來由于經(jīng)常和PRRSV、圓環(huán)病毒、豬瘟病毒等其它病原混合感染，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失而突顯出了其重要性。豬肺炎支原體是條件性致病菌，可使機(jī)體抵抗力降低，極易繼發(fā)感染鏈球菌病等，使病情加重和病死率升高，極易繼發(fā)感染豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型等，使病情加重和病死率升高。
[0005]本領(lǐng)域需要能產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答以同時(shí)抵抗豬肺炎支原體和豬圓環(huán)病毒2型及豬瘟病毒感染的疫苗，減少所述混合感染的發(fā)生率和/或減輕所述感染的嚴(yán)重性，或預(yù)防與所述感染有關(guān)的臨床表現(xiàn)，并且減少注射次數(shù)，降低動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，有效控制豬瘟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的正是要發(fā)明一種安全且有效的疫苗組合物，用于同時(shí)預(yù)防豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型病及豬支原體肺炎三種病原的混合感染引起的豬瘟防治效果下降，具體來說，本發(fā)明提供一種豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體的三聯(lián)疫苗組合物，其包含豬瘟病毒抗原、豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原。
[0007]優(yōu)選地，所述三聯(lián)疫苗組合物，包含豬瘟活病毒抗原、豬圓環(huán)病毒2型滅活抗原和豬肺炎支原體滅活抗原。[0008]豬 瘟活病毒抗原是指，包含至少一種在對豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗豬瘟病毒感染的免疫應(yīng)答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬瘟病毒為減毒形式的全病毒抗原，可以是選自細(xì)胞源豬瘟病毒、兔源豬瘟病毒、脾淋源豬瘟病毒中的一種或幾種。
[0009]優(yōu)選所述豬瘟病毒抗原為豬瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原。所述豬瘟兔化弱毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏，保藏號(hào)AV1412。
[0010]優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述的豬瘟病毒的含量為104_°~IO6 tlTCID5c/頭份，更優(yōu)選地IO5 tlTCID5ci/頭份。
[0011]豬圓環(huán)病毒2型滅活抗原為選自豬圓環(huán)病毒2型全病毒抗原，含有豬圓環(huán)病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含有豬圓環(huán)病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成分中一種或幾種。優(yōu)選所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成份。
[0012]本發(fā)明中，所述抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗PCV2感染的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式的全病毒抗原，可以是江蘇南農(nóng)高科豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北農(nóng)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的DBN-SX07株、哈爾濱維科豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的LG株、武漢科前豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的WH株中的一種或幾種。
[0013]優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物，豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活形式的豬圓環(huán)病毒2型SH株全病毒。所述豬圓環(huán)病毒2型SH株(Porcine Circovirus Type2, strain SH),在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏號(hào)為CGMCC N0.2389。
[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述的滅活的豬圓環(huán)病毒2型滅活前含量為IO4 0 ~IO6.0TCID50/ 頭份，更優(yōu)選地 IO5.0TCID50/ 頭份。
[0015]豬肺炎支原體抗原是指，包含至少一種在對豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗豬肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，所述豬肺炎支原體抗原是豬肺炎支原體全細(xì)胞菌苗，優(yōu)選滅活形式的豬肺炎支原體細(xì)菌，含有至少豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。優(yōu)選地豬肺炎支原體抗原是滅活形式的J株或豬肺炎支原體HN0613株全細(xì)胞菌體。最優(yōu)選地，豬肺炎支原體抗原是滅活形式的豬肺炎支原體HN0613株全細(xì)胞菌體。所述豬肺炎支原體 HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M2012230，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏日期為2012年6月13日。
[0016]豬支原體肺炎抗原還可以包含以下疫苗組合物中的任一種抗原如勃林格殷格翰公司的豬支原體肺炎滅活疫苗和西班牙海博萊生物大藥廠的喜可舒的J株、美國先靈葆雅公司的豬支原體肺炎滅活疫苗(Myco Silcnccr")、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFend的MH P-5722-3株、梅里亞動(dòng)物保健公司的豬克喘的BQ14株、南京天邦豬肺炎支原體的168株、普萊柯豬肺炎支原體HN0613株中的一種或幾種。
[0017]優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述的滅活的豬肺炎支原體滅活前含量為107_°~110 0MHDCE/頭份，更優(yōu)選地108_°~IO9 ciMHDCE/頭份，更優(yōu)選地IO9 ciMHDCE/頭份。[0018]優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括疫苗佐劑，所述疫苗佐劑為GelOl (法國SEPPIC)、氫氧化招膠、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂膠、ISA206 (法國SEPPIC)或ISA760VG (法國SEPPIC)中的一種或幾種的組合。本發(fā)明所用的疫苗佐劑優(yōu)選水溶性疫苗佐劑，例如Ge IOI佐劑。
[0019]優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑優(yōu)選為2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0020]本發(fā)明提供了一種制備所述疫苗組合物的方法，包括如下步驟:采用疫苗佐劑配制含豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物，將豬瘟病毒抗原與凍干保護(hù)劑混合制備含豬瘟病毒抗原的組合物，然后用所述混合物稀釋所述含豬瘟病毒抗原的組合物，得含豬圓環(huán)病毒2型抗原、豬肺炎支原體抗原和豬瘟病毒抗原的三聯(lián)疫苗組合物。
[0021]優(yōu)選地，先將豬肺炎支原體菌液和豬圓環(huán)病毒2型病毒液分別進(jìn)行滅活，然后將滅活檢驗(yàn)合格的豬肺炎支原體抗原和豬圓環(huán)病毒2型抗原分別進(jìn)行濃縮，配苗，制備得到滅活苗部分；豬瘟病毒液加入凍干保護(hù)劑，制備得到活苗部分，用所述滅活苗部分稀釋所述活苗部分，即得所述含有圓環(huán)病毒抗原、豬肺炎支原體抗原和豬瘟病毒抗原的三聯(lián)疫苗組合物。
[0022]優(yōu)選地，所述滅活苗部分包含豬圓環(huán)病毒抗原、豬肺炎支原體抗原和GelOl佐劑，豬圓環(huán)病毒抗原含量為104_°~IO6 tlTCID5c/頭份，豬肺炎支原體抗原含量為107_°~110 0MHDCE/頭份，GelOl佐劑，基于所述滅活苗部分含量為12%(V/V);所述活苗部分中豬瘟病毒含量為104_°~IO6 tlTCID5ci/頭份，用所述滅活苗部分稀釋所述豬瘟活苗部分，優(yōu)選1:1(頭份/頭份)，制成三聯(lián)混合疫苗。
[0023]本發(fā)明還提供一種所述疫苗組合物在制備預(yù)防或治療豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型、豬支原體肺炎的藥品中的用途。
[0024]本發(fā)明提供的三聯(lián)用疫苗組合物與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存乃至全部使用過程均需在較低溫度下進(jìn)行，即所謂的“冷鏈”，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運(yùn)作，費(fèi)用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運(yùn)作的費(fèi)用，因此具有顯著的優(yōu)越性。
[0025]本發(fā)明的豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體抗原組合物及使用該組合物制備的預(yù)防和治療豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體感染三聯(lián)疫苗，不會(huì)產(chǎn)生抗原成份的相互免疫干擾或影響。預(yù)防和治療豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體感染的三聯(lián)疫苗與豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型或豬肺炎支原體的單疫苗的效力相比，在對豬注射免疫過程中，豬體的應(yīng)激反應(yīng)出人預(yù)料地小，因此，本發(fā)明的三聯(lián)疫苗安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn)的不良反應(yīng)。
[0026] 此外，本發(fā)明提供的三聯(lián)疫苗組合物，制備方法簡單，疫苗的效價(jià)含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的多次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上三種疾病的疫苗及其免疫方法相比，本發(fā)明僅免疫I次就能夠預(yù)防豬瘟、豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體三種病原感染，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟(jì)可靠。
【具體實(shí)施方式】[0027]以下配合本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段。
[0028]本發(fā)明所述“每頭份”或“/頭份”是指每頭豬每次用疫苗量。未作特別說明之處，在本發(fā)明的實(shí)施方式中所述“每頭份”或“/頭份”為2ml。本發(fā)明所述疫苗佐劑包括但不限于:Gel01 (法國SEPPIC)、氫氧化招膠、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂膠、ISA206 (法國SEPPIC)或ISA760VG (法國SEPPIC)，優(yōu)選水溶性疫苗佐劑，例如GelOl (法國 SEPPIC)。
[0029]本發(fā)明所述凍干保護(hù)劑的例子，包括但不限于:明膠水溶液、乳糖水溶液及其混合物，優(yōu)選2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0030]實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的制備
[0031]I菌株來源
[0032]制造及檢驗(yàn)本品用的豬圓環(huán)病毒2型毒株為PCV-2毒株SH株，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏號(hào)為CGMCCN0.2389 。
[0033]制造及檢驗(yàn)本品用的豬肺炎支原體囷株為HN0613株，在中國典型培養(yǎng)物保減中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012 年 6 月 13 日，保藏編號(hào):CCTCC N0.M2012230。
[0034]制造及檢驗(yàn)本品用的豬瘟病毒毒株為豬瘟兔化弱毒株(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏，保藏號(hào)AV1412)。
[0035]2疫苗半成品的制備及檢驗(yàn)
[0036]2.1生產(chǎn)用種子的制備
[0037]2.1.1豬肺炎支原體:
[0038]一級種子的繁殖:凍干菌種(HN0613株，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2012230)，用液體培養(yǎng)基稀釋，劃線接種于固體培養(yǎng)基平皿上，置37°C培養(yǎng)7d，選擇生長良好的菌落，接種于固體培養(yǎng)基斜面上，37°C培養(yǎng)7d，作為一級種子。
[0039]二級種子的繁殖:取少量液體培養(yǎng)基洗一級種子的斜面培養(yǎng)物，接種于液體培養(yǎng)基大管中，置37°C培養(yǎng)7d，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為二級種子。
[0040]2.1.2豬圓環(huán)病毒2型:將毒種用MEM液體培養(yǎng)基作1:9稀釋，然后按細(xì)胞培養(yǎng)液體積的5% (V/V)接種于PK15細(xì)胞(購自中國獸藥監(jiān)察所)培養(yǎng)，37°C吸附30分鐘，加入含4% (V/V)體積犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，37°C培養(yǎng)4曰，凍融2~3次,收獲病毒,作為生產(chǎn)用毒種。
[0041]2.1.3豬瘟病毒:用細(xì)胞維持液，將新鮮脾毒制成0.3% (V/V)~0.5% (V/V)的病毒懸液，接種生長良好的ST細(xì)胞，置36~37°C繼續(xù)培養(yǎng)。每隔4~5天收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液，經(jīng)安全性、純凈性和特異性檢驗(yàn)合格后，作為生產(chǎn)用毒種。在_15°C以下保存，不超過6個(gè)月。
[0042]2.2制苗用菌液和病毒液的制備
[0043]2.2.1豬肺炎支原體菌液的制備:將液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的豬肺炎支原體二級種子液以1:10 (v/v)接種于液體培養(yǎng)基中。37°C下培養(yǎng)3飛日，培養(yǎng)物下降0.5個(gè)pH值以上，純粹檢驗(yàn)合格后，再以同樣的方式擴(kuò)大培養(yǎng)(繼代次不超過6代)。培養(yǎng)結(jié)束后，取樣，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)應(yīng)純粹。
[0044]2.2.2豬圓環(huán)病毒2型液的制備:用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法。將長滿單層的PK15細(xì)胞(購自ATCC)，倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，將毒種液按細(xì)胞培養(yǎng)液體積5%的接種量接種于PK15細(xì)胞上，輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶2周，37°C吸附30分鐘，加入細(xì)胞維持液，置37°C旋轉(zhuǎn)(10-12轉(zhuǎn)/小時(shí))培養(yǎng)。每日觀察廣2次，細(xì)胞生長良好，37°C培養(yǎng)4日收獲細(xì)胞和細(xì)胞液，凍融3次，置-20°C以下保存，應(yīng)不超過2個(gè)月。
[0045]2.2.3豬瘟病毒液的制備:取已形成良好單層的ST細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去營養(yǎng)液，接種含3% (V/V)~5% (V/V)生產(chǎn)用細(xì)胞毒種的維持液，置36~37°C后繼續(xù)培養(yǎng)。接毒后5天作第一次收獲換液，以后每隔4天收獲換液I次。各收次病毒培養(yǎng)液分別取樣檢驗(yàn)，應(yīng)符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。收獲的病毒液置_15°C以下保存，應(yīng)不超過3個(gè)月。
[0046]2.3含量測定
[0047]2.3.1豬肺炎支原體菌體含量測定:用PCR方法對培養(yǎng)物進(jìn)行計(jì)數(shù)。10倍系列稀釋所檢培養(yǎng)物，然后做PCR，PCR檢出的最低限量為3Χ10_3μ8 (相當(dāng)于1000個(gè)左右的菌體)，按稀釋的倍數(shù)計(jì)數(shù)菌體數(shù)(沈青春，譚青松，王琴等人，PCR方法測定Mhp培養(yǎng)物菌數(shù)[J]，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(1):55~57)。培養(yǎng)物含量應(yīng)為I~2X 109MHDCE/ml。(MHDCE=豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物，即IMHDCE相當(dāng)于I個(gè)豬肺炎支原體)。
[0048]2.3.2豬圓環(huán)病毒2型含量測定:將病毒液用MEM維持液做10倍系列稀釋，取10_5、10_6、10_73個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種96孔培養(yǎng)板PK15細(xì)胞單層4孔，每孔0.1ml,同時(shí)設(shè)立陰性對照，在37°C含5% (V/V) CO2的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，換含2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；用冷丙酮固定細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)測定每個(gè)稀釋度含有PCV-2陽性細(xì)胞(呈綠色)的孔數(shù)，根據(jù)Karber氏法計(jì)算病Μ TCID500 每 ml 病毒含量應(yīng)≥ IO5 5TCID5tltj
[0049]2.3.3豬瘟病毒含量測定:各收次病毒培養(yǎng)液分別采用間接免疫熒光法進(jìn)行TCID5tl測定。每ml病毒含量應(yīng)≥IO6-5TCID500
[0050]2.4 滅活
[0051]2.4.1豬圓環(huán)病毒2型液的滅活:將檢驗(yàn)合格病毒液，按病毒液總量加入終濃度為0.2%的甲醛溶液(V/V)，隨即充分搖勻升溫，當(dāng)溫度升至37°C時(shí)開始計(jì)時(shí)，保持18小時(shí)滅活完畢，加入0.2wt%的焦亞硫酸鈉終止滅活,取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。
[0052]2.4.2豬肺炎支原體菌液的滅活:將檢驗(yàn)合格的豬肺炎支原體菌液，按菌液體積總量緩慢加入終濃度為0.2%的甲醛溶液(V/V)，放37°C滅活，其間每隔4小時(shí)攪拌一次，24小時(shí)后取出，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。
[0053]2.5 濃縮
[0054]將滅活檢驗(yàn)合格的豬肺炎支原體菌液和豬圓環(huán)病毒2型液分別采用超濾濃縮技術(shù)進(jìn)行濃縮，濃縮后抗原含量分別為10nMHDCE/ml，107 0TCID50/mL.[0055]實(shí)施例2豬瘟、豬圓環(huán)和豬肺炎支原體三聯(lián)混合疫苗組合物的制備
[0056]I豬圓環(huán)和豬肺炎支原體二聯(lián)滅活疫苗制備
[0057]1.1防腐劑的配制
[0058]1% (w/v)的硫柳萊水溶液:lg硫柳萊溶解于100mL純化水，121°C高壓滅菌30min備用。[0059]1.2稀釋劑的配制
[0060]無菌的PBS緩沖溶液:在900ml純化水內(nèi)溶解8g氯化鈉、0.25g氯化鉀、3.63g磷酸氫二鈉、0.24g磷酸二氫鉀，然后定容至1L，121°C高壓滅菌30min備用。
[0061]1.3疫苗佐劑處理
[0062]GelOl (法國SEPPIC)佐劑滅菌:將GelOl (法國SEPPIC)佐劑轉(zhuǎn)入可滅菌容器內(nèi)，121 °C高壓滅菌30min備用。
[0063]1.4 配苗
[0064]通過無菌操作，將實(shí)施例1中制備的濃縮豬圓環(huán)和豬肺炎支原體抗原與佐劑、稀釋劑等按照不同配比混合后，用乳化機(jī)低速，例如在轉(zhuǎn)速為10-12轉(zhuǎn)/h下攪拌30min。滅活疫苗部分豬圓環(huán)病毒抗原含量為104_°~IO6 tlTCID5ci/頭份，豬肺炎支原體抗原含量為IO7 0~IOici ciMHDCE/頭份，GelOl佐劑，基于所述滅活苗部分含量為12% (V/V)。
[0065]2豬瘟疫苗的制備
[0066]將檢驗(yàn)合格的豬瘟各收次病毒液，混合于同一容器，分別取適量混勻的病毒液進(jìn)行濃縮和稀釋，加入凍干保護(hù)劑(2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以l:l(v/v)比例配制)以1:1 (v/v)比例混合后充分混勻，定量分裝，迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，制成每頭份病毒含量分別為 104_°TCID5(1、IO5 tlTCID5ci 和 IO6 tlTCID5ci 的活疫苗部分。
[0067]3三聯(lián)苗的制備
[0068]將實(shí)施例1中所制備的濃縮抗原按照表1的配比進(jìn)行疫苗配制。使用前取滅活苗部分稀釋活苗部分。
[0069]表1疫苗配比具體實(shí)施案例
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種疫苗組合物，其特征在于，含有豬瘟病毒抗原、豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬瘟病毒抗原為豬瘟活病毒抗原，優(yōu)選為豬瘟病毒兔化弱毒株全病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位成份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體滅活抗原，優(yōu)選為滅活的全細(xì)胞菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬瘟病毒含量為IO4-0~IO6 tlTCID5ci/頭份，所述豬肺炎支原體含量為107_°~IOici ciMHDCE/頭份，所述豬圓環(huán)病毒2型含量為IO4 0~IO6 0TCID50/頭份。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還包括疫苗佐劑，所述疫苗佐劑為GelOl (法國SEPPIC)、氫氧化招膠、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol )、蜂膠、ISA206 (法國SEPPIC)或ISA760VG (法國SEPPIC)中的一種或幾種的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還包括凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑為2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以l:l(v/v)比例混合所得的混合物。
8.一種制備疫苗組合物的方法，其特征在于，包括如下步驟:采用疫苗佐劑配制含豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物，將豬瘟病毒抗原與凍干保護(hù)劑混合制備含豬瘟病毒抗原的組合物，然后用所述混合物稀釋所述含豬瘟病毒抗原的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬肺炎支原體抗原的混合物為二聯(lián)滅活疫苗，所述含豬瘟病毒抗原的組合物為凍干活疫苗。
10.權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或控制豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體混合感染的藥品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/02GK103908665SQ201310001446
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月5日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司