專利名稱：一種修復脫礦牙本質的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物材料技術領域，涉及ー種修復脫礦牙本質的方法。
背景技術：
在牙本質粘接過程中，牙本質酸蝕脫礦致膠原纖維暴露，暴露膠原遭內源性基質金屬蛋白酶降解是限制樹脂ー牙本質粘接復合體壽命的關鍵因素。中度及深度齲齒病變也表現為牙本質層的脫礦和齲壞。解決這些問題都涉及到對脫礦的牙本質進行再礦化。隨著人們對牙本質精細結構、膠原纖維與礦物的有機結合情況知識的豐富，對非膠原蛋白在牙本質礦化中作用的認識以及生物礦化具體過程逐漸被人理解并在體外模擬，脫礦牙本質修復領域進入了仿生再礦化的時代。目前主流的仿生再礦化方式為用兩種牙本質非膠原蛋白的仿生類似物，在以Portland Cement作為鈣離子緩釋源的含磷溶液中成功地使酸蝕脫礦的牙本質再礦化，并且生成纖維內礦物和纖維外礦物。但是，這樣的方法耗時達四個月之久，不具備臨床實用性。而且，該裝置由鈣離子源，磷離子源，非膠原蛋白類似物等組成，太過復雜，難以讓臨床醫(yī)生從繁忙的工作中解脫。納米級無定形磷酸鈣顆粒作為存在于生物礦化過程中的前驅體，近年來受到越來越多的關注。有學者研究表明該顆粒內部高達10-20%的含水量和內部原子介于晶體和溶液的無序排列賦予了其類似液體的“流動性”，無定形顆粒憑借“流動性”預先復制模板的形貌和結構，然后逐漸失水、結晶、固化生成熱力學更穩(wěn)定的結晶態(tài)礦物。無定形磷酸鈣的基本構成單元是Ca9(PO4)6(Posner Cluster),這種物質被稱作“小團簇”,尺寸大約為0. 95nm，可以相互團聚為尺寸更大的礦物顆粒。本課題組在研究過程中發(fā)現，調控聚丙烯酸的濃度可以調控Posner Cluster的團聚，間接調控顆粒的直徑，依次方法可以制備出與牙本質天然礦物大小相近的無定形磷酸鈣顆粒。

所以，基于上述兩個特點，將這ー顆粒應用于脫礦牙本質的修復必將在短期內恢復其天然等級結構和優(yōu)良力學性能。但是相關研究在國內外尚無報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種修復脫礦牙本質的方法。本發(fā)明為解決上述技術問題所采取的技術方案是
本發(fā)明首先合成無定形磷酸鈣顆粒，然后再礦化脫礦牙本質。所述的合成無定形磷酸鈣顆粒具體是
用8 10g/L聚丙烯酸作為調控劑，在36 38°C下，使用0.1 0. 2M、PH為9. 5±0.1的磷酸氫ニ鈉水溶液和0. 2 0. 3M氯化鈣水溶液作為合成母液；采用滴定管在20 30分鐘內將氯化鈣水溶液按體積比1:1加入至磷酸氫ニ鈉水溶液中，過程中采用磁力攪拌器攪拌，并使用0.1M氫氧化鈉溶液調控pH保持在9.5±0.5區(qū)間；使得鈣離子最終濃度為
9.0 11. OmM，磷離子的最終濃度為5. 0 7. OmM，聚丙烯酸的最終濃度為300 1000吒/mL ;最終合成直徑為15 20nm的無定形磷酸鈣顆粒，該顆粒合成后以溶液形式貯存。所述的再礦化脫礦牙本質具體是
步驟1.收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機垂直于牙長軸先切除牙釉質，再切取厚度為0. 5 Imm的牙本質片。步驟2.將上述牙片放入質量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內的脫礦牙本質模型。步驟3.取15 20ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中。步驟4.將上述培養(yǎng)瓶放在35 38°C恒溫箱中，于7天后取出。本發(fā)明的有益效果具有很好的生物相容性；符合脫礦牙本質修復中提出的“最小損壞”原則，能以已有脫礦纖維為模板進行再礦化；相比于傳統礦化法，本方法由底部至上進行礦物生長，能夠恢復脫礦牙本質的礦物含量，保護膠原，防止脫礦進ー步發(fā)生；恢復了牙本質特殊的等級結構；恢復牙本質的超強力學性能；相比于已有的仿生礦化法，原料易得，體系更簡單；更重要的是，本方法中礦化完成所需要的時間大大僅為7天，對于再礦化脫礦牙本質技術來講是ー種突破。


圖1為實施例1，2，3中脫礦牙本質膠原的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。圖2為實施例1，2，3中不同濃度聚丙烯酸調控下的不同無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的掃描電鏡(SEM)圖片。

圖3為實施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣顆粒紅外(FTIR)圖片和掃描電鏡(SEM)圖片。圖4為實施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的細節(jié)，掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。圖5為實施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的納米壓痕圖片。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進ー步闡述
實施例1 :
配備0. 25M氯化鈣(CaCl2)水溶液，0. 15M磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實驗的母液。取2. 4 mL Na2HPO4母液和2. OmL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用IM NaOH水溶液調節(jié)pH至9. 5 ±0. 1，常溫攪拌0. 5h，總體積為30mL。取2. 4mL CaCl2母液加水稀釋至30mL。用滴定管將30mL鈣液30加入30mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調控pH保持在9. 5±0. 5區(qū)間。最終，鈣離子濃度為10. OmM，磷離子濃度為6. OmM, PAA濃度為300ug/mL。保證整個滴加過程持續(xù)25 30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機垂直于牙長軸先切除牙釉質，再切取厚度為0. 5 Imm的牙本質片；然后用500 # -2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內的脫礦牙本質模型；取15ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養(yǎng)瓶放在37. 5°C恒溫箱中，于7天后取出。將再礦化的牙本質樣本一分為ニ，一半用酒精梯度脫水的方式進行干燥，做掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)的觀察，另一半不作脫水處理，直接進行納米壓痕檢測。實施例2:
配備0. 25M氯化鈣(CaCl2)水溶液，0. 15M磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實驗的母液。取2. 4 mL Na2HPO4母液和3. OmL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用IM NaOH水溶液調節(jié)pH至9. 5±0. 1，常溫攪拌0. 5 h，總體積為30mL。取2. 4mL CaCl2母液加水稀釋至30mL。用滴定管將30 mL鈣液30加入30mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調控pH保持在9. 5±0. 5區(qū)間。最終，鈣離子濃度為10.0 mM，磷離子濃度為6.0 mM，PAA濃度為500 ug/mL。保證整個滴加過程持續(xù)25 30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機垂直于牙長軸先切除牙釉質，再切取厚度為0.5 Imm的牙本質片；然后用500 # -2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內的脫礦牙本質模型；取15ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養(yǎng)瓶放在37. 5°C恒溫箱中，于7天后取出。將再礦化的牙本質樣本一分為ニ，一半用酒精梯度脫水的方式進行干燥，做掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)的觀察，另一半不作脫水處理，直接進行納米壓痕檢測。實施例3
配備0. 25M氯化鈣(CaCl2)水溶液，0. 15M磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實驗的母液。取2. 4 mL Na2HPO4母液和6. OmL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用IM NaOH水溶液調節(jié)pH至9. 5±0. 1，常溫攪拌0. 5 h，總體積為30 mL。取2. 4mL CaCl2母液加水稀釋至30mL。用滴定管將30mL鈣液30加入30 mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調控pH保持在9. 5±0. 5區(qū)間。鈣離子、磷離子最終濃度分別為10.0 mM和6.0 mM。最終，鈣離子濃度為10. OmM，磷離子濃度為6. 0 mM, PAA濃度為1000 ug/mL。保證整個滴加過程持續(xù)25 30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機垂直于牙長軸先切除牙釉質，再切取厚度為0. 5 Imm的牙本質片；然后用500#-2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內的脫礦牙本質模型；取15ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養(yǎng)瓶放在37. 5°C恒溫箱中，于7天后取出。將再礦化的牙本質樣本一分為ニ，一半用酒精梯度脫水的方式進行干燥，做掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)的觀察，另一半不作脫水處理，直接進行納米壓痕檢測。圖1為實施例1，2，3中脫礦牙本質膠原的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。可以看出脫礦之后剩下膠原纖維網架，在透射電鏡成像中襯度低。圖2為實施例1，2，3中不同濃度聚丙烯酸調控下的不同無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的掃描電鏡(SEM)圖片。可以看出牙本質膠原基質表面形成礦物層，單根膠原纖維得到礦化，膠原纖維仍然裸露。圖3為實施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣顆粒紅外(FTIR)圖片和掃描電鏡(SEM)圖片。可以看出初始ACP顆粒尺寸為 15 nm,約14天之后相變成 100 nm針狀顆粒。圖4為實施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的細節(jié)，掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。可以看出礦化層礦物密度和礦物有序性與基底天然牙本質相當。圖5為實施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的納米壓痕圖片?？梢钥闯鲈俚V化牙本質力學性能表現比脫礦牙本質大幅加強，接近天 然牙本質。
權利要求
1.一種修復脫礦牙本質的方法，其特征在于該方法首先合成無定形磷酸鈣顆粒，然后再礦化脫礦牙本質；所述的合成無定形磷酸鈣顆粒具體是用8 10g/L聚丙烯酸作為調控劑，在36 38°C下，使用O.1 O. 2M、PH為9. 5±0.1的磷酸氫二鈉水溶液和O. 2 O. 3M氯化鈣水溶液作為合成母液；采用滴定管在20 30分鐘內將氯化鈣水溶液按體積比1:1加入至磷酸氫二鈉水溶液中，過程中采用磁力攪拌器攪拌，并使用O.1M氫氧化鈉溶液調控pH保持在9.5±0.5區(qū)間；使得鈣離子最終濃度為,9. O 11. OmM，磷離子的最終濃度為5. O 7. OmM，聚丙烯酸的最終濃度為300 1000 μδ/mL ;最終合成直徑為15 20nm的無定形磷酸鈣顆粒，該顆粒合成后以溶液形式貯存；所述的再礦化脫礦牙本質具體是步驟1.收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機垂直于牙長軸先切除牙釉質，再切取厚度為O. 5 Imm的牙本質片；步驟2.將上述牙片放入質量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內的脫礦牙本質模型；步驟3.取15 20ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；步驟4.將上述培養(yǎng)瓶放在35 38°C恒溫箱中，于7天后取出。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種修復脫礦牙本質的方法?，F有修復脫礦牙本質的方法是采用兩種牙本質非膠原蛋白類似物，借助于波特蘭水門汀緩釋體系來實現的，但是這種方法裝置過于復雜，達到全層礦化所需的時間需4個月之久。本發(fā)明方法先用簡便易得的聚丙烯酸作為調節(jié)劑，以鈣離子和磷離子作為原料，合成15-20nm尺寸具有流動性的無定形磷酸鈣顆粒；然后于7天之內再礦化脫礦的牙本質，恢復了脫礦牙本質天然的等級結構，而再礦化后的牙本質的力學性能也達到了與天然牙本質相當的水平。本發(fā)明與現有再礦化技術相比，在達到同樣恢復等級結構和力學性能的基礎上，裝置簡單，耗時短，更為有效的解決了再礦化脫礦牙本質這一問題。
文檔編號A61K6/033GK103027845SQ20131000517
公開日2013年4月10日 申請日期2013年1月6日 優(yōu)先權日2013年1月6日
發(fā)明者顧新華, 唐?？? 陳怡 , 王建明, 孫健 申請人:浙江大學