一種免疫避孕核酸疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種免疫避孕核酸疫苗，其包含編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列，其中所述編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表達載體中。所述真核表達載體可以為pCAGGS。本發(fā)明還提供了所述免疫避孕核酸疫苗的制備方法。所述核酸疫苗免疫小鼠后能誘發(fā)機體產(chǎn)生高滴度的特異性抗小鼠Izumo抗體，降低小鼠的生殖能力。此外，核酸疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的特異性抗體能與小鼠精子蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，也能有效的抑制小鼠的精卵結(jié)合。
【專利說明】一種免疫避孕核酸疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫避孕核酸疫苗及其制備方法，其中該免疫避孕核酸疫苗包含小鼠精子特異表達的精卵融合關(guān)鍵膜蛋白Izumo的核酸。本發(fā)明提供的免疫避孕核酸疫苗可用于小鼠的生育控制。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠及其它有害哺乳動物，每年對全球的農(nóng)林牧業(yè)造成嚴重的損失。目前，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界有老鼠170億只以上，我國有老鼠40億只以上，全世界由于鼠害造成糧食損失最高可達到收獲量的15%_20%，相當于25個貧窮國家國民收入總值，夠1.5億人全年的口糧。在我國每年近千萬畝森林和十億畝草場被破壞成為沙漠或荒洲，損失超過30億人民幣。此外，鼠及其它有害哺乳動物能傳播出血熱、鼠疫等多種人畜共患傳染性疾病，給人類身體甚至生命造成嚴重威脅。因此，研究低毒、無害、不污染生態(tài)環(huán)境的特異滅鼠技術(shù)和藥品具有非常重要的意義。
[0003]免疫避孕是通過免疫與生殖相關(guān)的蛋白質(zhì)或多膚分子，激活機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性體液免疫和/或細胞免疫，以中和或阻斷相關(guān)分子的功能，從而影響正常生殖過程達到避孕的效果。精子在哺乳動物受精過程中必不可少，其對于雌雄性個體都具有免疫原性，但是精子本身不能作為避孕疫苗直接用于實踐，這是因為精子表面和內(nèi)部都存在大量與體細胞同源的抗原，如果直接免疫精子可能會導(dǎo)致其它組織或器官的免疫病理疾病。所以，用于避孕疫苗的理想精子抗原應(yīng)該具備的特性有:精子表面特異性表達，較強的免疫原性，與生殖過程或人類免疫不孕相關(guān)，很少或沒有不良反應(yīng)等。2005年，日本學(xué)者Inoue發(fā)現(xiàn)了一種精子特異性膜蛋白Izumo，它屬于免疫球蛋白超家族，在精卵融合過程中起關(guān)鍵作用。敲除了 Izumo基因的雄性小鼠完全不育；進一步的實驗證實，這些不育小鼠的精子外觀正常并能夠結(jié)合和穿過卵透明帶但卻完全喪失了與卵膜融合的能力。因此，針對小鼠Izumo進行免疫抗生育研究，將為其作為免疫避孕候選抗原在控制老鼠及其他有害野生動物種群數(shù)量中發(fā)揮作用提供研究資料及科學(xué)依據(jù)。
[0004]核酸疫苗是繼減毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗，它是指將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，通過機體的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)機體對該抗原蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答。與前兩代疫苗相比，具有很多明顯的優(yōu)勢，比如可誘導(dǎo)機體同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，應(yīng)答持續(xù)時間長，表達的抗原其構(gòu)像和抗原性與天然抗原相同，沒有潛在致病危險等。近十年來，核酸疫苗在防治疾病、控制動物繁殖等方面的研究也引起世界各國的高度關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種免疫避孕核酸疫苗，其包含編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列。其中所述精子特異膜蛋白Izumo可以是任意哺乳動物的精子特異膜蛋白Izumo，包括大鼠、小鼠、牛、羊、馬、豬、靈長類動物等。在一個實施方案中，所述精子特異膜蛋白Izumo是人的精子特異膜蛋白Izumo。在一個優(yōu)選的實施方案中,所述精子特異膜蛋白Izumo是小鼠精子特異膜蛋白Izumo。在一個實施方案中，所述編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表達載體中,優(yōu)選地,所述真核表達載體為pCAGGS。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供該免疫避孕核酸疫苗的制備方法及用途。
[0007]在一個實施方案中，所述精子膜蛋白Izumo為小鼠精子膜蛋白Izumo，其編碼基因位于小鼠的第7號染色體上,核苷酸序列號為XM_133424,全長1194bp,編碼397個氨基酸。同源性分析顯示小鼠Izumo的氨基酸序列與人類的存在57%的同源性。
[0008]為本發(fā)明的目的，所述核酸疫苗所用的真核質(zhì)粒載體框架如圖1所示，除具有真核表達載體基本元件外，還包含有編碼小鼠精子蛋白Izumo的DNA序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述編碼小鼠精子蛋白Izumo的DNA序列起始端加入了 Kozak序列,增加真核表達載體的表達效率。在另一個實施方案中，同時在所述編碼小鼠精子蛋白Izumo的DNA序列末端加入了 Flag標簽序列，以便于該蛋白表達的檢測。
[0009]在本發(fā)明的另一方面，提供了該免疫避孕核酸疫苗的制備方法，所述方法包括如下步驟:
[0010]1.精子Izumo基因的RT-PCR擴增
[0011]利用天根公司的動物組織總RNA提取試劑盒提取BALB/c附睪組織總RNA，以O(shè)ligo (dT)為引物進行cDNA第一鏈的合成。針對Izumo的cDNA設(shè)計了特異性PCR擴增引物。利用高保真酶Pfu進行目的基因Izumo的擴增，純化回收目的基因片段進行測序，結(jié)果證明擴增的Izumo基因與報道的序列完全一致。
[0012]2.真核表達載體pCAGGS-1zumo構(gòu)建
[0013]將擴增的Izumo基因(1194bp)利用EcoRI和XhoI酶切位點插入到真核表達載體pCAGGS中，構(gòu)建了重組真核表達載體pCAGGS-1zumo。
[0014]3.真核表達載體pCAGGS-1zumo質(zhì)粒的大量制備
[0015]將構(gòu)建的重組真核表達載體pCAGGS-1zumo轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (菌種保藏:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。菌種保藏號為=CGMCC N0.6937，微生物(株):pCAGGS-1zumol號)，保藏日期:2012年12月7日，大量培養(yǎng)后利用大量高純度無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒對質(zhì)粒DNA進行提取，獲得用于免疫用的質(zhì)粒DNA純品。
[0016]在一個實施方案中，所述精子Izumo基因為小鼠的精子Izumo基因。其中，在步驟
(I)中使用的擴增Izumo基因DNA序列的引物對序列如序列表SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示。
[0017]將純化的小鼠精子Izumo核酸疫苗真核表達載體質(zhì)粒直接免疫小鼠，通過宿主細胞的翻譯系統(tǒng)在機體內(nèi)表達出小鼠精子Izumo蛋白，激發(fā)機體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高滴度的特異性抗小鼠Izumo抗體，阻斷小鼠正常的生殖功能，使小鼠的生殖能力下降65%。
[0018]另一方面，本發(fā)明還提供了編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列在制備免疫避孕核酸疫苗中的用途，其中包括將所述編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表達載體，構(gòu)建重組真核表達載體的步驟。
[0019]在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明還提供了所述核酸疫苗的用途，例如用于對小鼠的生育控制，將為小鼠精子蛋白Izumo作為免疫避孕候選抗原在控制老鼠及其他有害野生動物種群增長中發(fā)揮作用提供研究資料及科學(xué)依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1.真核表達載體pCAGGS-1zumo的結(jié)構(gòu)框架圖
[0021]圖2.小鼠精子Izumo基因的RT-PCR擴增結(jié)果
[0022]圖3.真核表達載體pCAGGS-1zumo在HEK293T細胞中表達的Westernblot檢測結(jié)果
[0023]圖4.真核表達載體pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清抗體滴度檢測結(jié)果
[0024]圖5.真核表達載體pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清抗體與小鼠精子反應(yīng)的檢測結(jié)果
[0025]圖6.真核表達載體pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清抗體抑制小鼠精卵結(jié)合的檢測結(jié)果
[0026]圖7.真核表達載體pCAGGS-1zumo免疫小鼠睪丸和附睪組織病理學(xué)檢測結(jié)果【具體實施方式】:
[0027]下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0028]實施例1精子 特異表達的精卵融合關(guān)鍵膜蛋白Izumo的生物信息學(xué)分析
[0029]精子蛋白Izumo是在小鼠睪丸組織和精子中特異表達的I型膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，其編碼基因位于小鼠第7號染色體上，核苷酸序列號為XM_133424。根據(jù)小鼠Izumo的全長mRNA序列分析可知,其編碼基因全長1194bp,前體蛋白由397個氨基酸組成，氨基端(l_21aa)有信號肽序列,羧基端(320_340aa)有疏水性的跨膜區(qū)序列。小鼠Izumo可能的功能域是細胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(161-251aa)。在此結(jié)構(gòu)域中，Asn 204是潛在的N連接糖基化位點，Cysl82和Cys233形成分子內(nèi)二硫鍵。同源性分析顯示，小鼠Izumo蛋白的氨基酸序列與人類存在57%的同源性。
[0030]實施例2小鼠精子Izumo基因的PCR擴增
[0031]試劑及儀器:
[0032]Trizol Reagent (Invitrogen 公司，美國)
[0033]EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNaseInhibitor均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司
[0034]克隆載體pBluescript II KS+ (Stratagene,美國)
[0035]高保真pfu DNA聚合酶(NEB公司，美國)
[0036]普通DNA凝膠回收試劑盒(博邁德科技有限公司，中國)
[0037]紫外分光光度計(Bio-Rad公司，美國)
[0038]DNA Engine Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad 公司，美國)
[0039]實驗方法:
[0040]1.通過分析GenBank中發(fā)表的小鼠精子Izumo核苷酸序列(序列號為XM_133424),利用Primer Premier5.0軟件在線設(shè)計了一對擴增小鼠精子Izumo編碼區(qū)序列1194bp的特異性引物。為了克隆、表達需要在引物兩端分別引入酶切位點EcoRI和Xhol，PCR引物序列為:
[0041]Pl:5，-ctgaattcGCCACCATGGGGCCGCATTTTACACT-3’ (EcoRI) (SEQ ID NO:1)
[0042]P2:5’ -tcctcgagTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTTTTCTGTTGCCTCGCT-3’ (XhoI)SEQ ID N0:2)。上述引物序列中的小寫字母分別表示相應(yīng)的酶切位點。所述引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。
[0043]2.無菌采集正常BALB/c小鼠的新鮮睪丸組織,采用Invitrogen公司的Trizol試劑一步法提取總RNA，具體操作方法參照試劑盒說明書。經(jīng)紫外分光光度計測定其濃度。以O(shè)ligo d(18T)為引物在MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈。具體方法如下:向提取的總RNA中分別加IOmM oligod(18T) Iul混合，70°C水浴lOmin，取出置于冰上，隨后加5XRTbuffer 5ul, IOmM dNTP 2.5ul，40U/ul RNA 酶抑制劑 lul，200U/ul MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 Iul，補加無RNA酶水至總體積25ul，于42°C保溫Ih進行反轉(zhuǎn)錄，再70°C水浴lOmin，所得cDNA_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044]3.取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μ L，5 XPCR buffer 5 μ L、上、下游引物(IOpmol/μ L)及 IOmMdNTPs各0.5 μ L，高保真pfu DNA聚合酶0.25 μ L (2000U/mL)，加超純水至25 μ L。具體反應(yīng)條件如下:擴增Izumo基因為98°C預(yù)變性30s，98°C變性10s，60°C退火15s、72°C延伸30s，33個循環(huán)后72°C再延伸5min，最后冷卻至4°C，結(jié)束反應(yīng)。以1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果，見圖2。利用普通DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，具體方法參照試劑盒說明書。再以內(nèi)切酶EcoRI和Xho I酶切Izumo基因及pBluescript II KS+載體，電泳回收各自目的片段，體外用T4連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行鑒定，獲得含有小鼠Izumo基因的pBluescript-mlzumo載體質(zhì)粒,并送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行序測定。測 序結(jié)果表明擴增的小鼠Izumo基因與報道的序列完全一致。
[0045]實施例3真核表達載體pCAGGS-1zumo的構(gòu)建、鑒定及質(zhì)粒大量制備試劑及儀器:
[0046]EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶(TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司)
[0047]真核表達載體pCAGGS (Invitrogen公司，美國)
[0048]轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司，美國)
[0049]HEK293T細胞由國家生物醫(yī)學(xué)分析中心張學(xué)敏教授惠贈
[0050]DMEM高糖培養(yǎng)基、特級胎牛血清和胰酶(HyClone公司，美國)
[0051]抗Flag標簽的鼠單克隆抗體(Sigma公司，美國)
[0052]辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG (Cell Signaling公司，美國)
[0053]Western發(fā)光檢測試劑盒(威格拉斯生物技術(shù)有限公司，中國)
[0054]大量高純度無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(博邁德科技有限公司，中國)
[0055]紫外分光光度計(Bio-Rad公司，美國)
[0056]實驗方法:
[0057]取鑒定正確的pBluescript-1zumo質(zhì)粒和真核表達載體pCAGGS質(zhì)粒利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進行雙酶切，電泳回收各自目的片段，體外利用T4連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行鑒定，獲得含有小鼠Izumo基因的重組載體pCAGGS-1zumo質(zhì)粒，并送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行序測定。測序結(jié)果表明構(gòu)建的重組載體pCAGGS-1zumo完全正確。
[0058]HEK293T細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中。采用胰酶消化法進行細胞傳代。將生長狀態(tài)良好的HEK293T細胞接種于12孔培養(yǎng)板，待細胞密度達50%-60%時，參照Lipofectamine 2000使用說明進行轉(zhuǎn)染，48h收取細胞進行Western blot印跡檢測。用PBS清洗收集的細胞,用預(yù)冷的三去污蛋白裂解液[50mmol/LTris-HCl (pH 8.0)，150mmol/LNaCl, 0.1%SDS, 1%NP_40，0.5% 去氧膽酸鈉，10% 體積的蛋白酶抑制劑]于冰上裂解20min，隨后加入等體積的2 X SDS上樣緩沖液，100°C煮沸l(wèi)Omin，離心取上清；用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出膜于封閉液(5%脫脂奶粉溶于TBS中)中室溫封閉Ih ;根據(jù)Flag標簽的鼠抗說明書,室溫孵育一抗(1:2500倍)lh, TBST洗3次，每次IOmin,室溫孵育HRP標記的羊抗鼠IgGC 1:2500倍)lh，TBST洗3次，TBS洗I次,每次IOmin,隨后用Western發(fā)光檢測試劑于暗室壓片顯影。結(jié)果在約56kD處有特異條帶(圖3)，符合理論預(yù)期，表明構(gòu)建的真核表達載體質(zhì)粒能夠正確表達目的蛋白。
[0059]取鑒定正確的真核表達質(zhì)粒pCAGGS-1zumo宿主菌，利用LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，采用博邁德科技有限公司的大量高純度無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒對質(zhì)粒DNA進行提取，并紫外分光光度計測定其濃度。稀釋質(zhì)粒濃度為lmg/mL。20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0060]實施例4真核表達載體pCAGGS-1zumo免疫小鼠的血清抗體滴度檢測結(jié)果
[0061]試劑及其制備方法:
[0062]包被稀釋液組成和配制:由0.05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液組成，1.5g的Na2CO3和2.9g的NaHCO3混合后，加雙蒸餾水至1000mL,調(diào)至pH9.6。
[0063]封閉液組成和制備:5%BSA-PBS溶液，BSA 5g加入PBS (pH7.4) IOOmL得到
[0064]磷酸鹽緩沖 液(PBS):
[0065]A液:0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液，制備方法為NaH2PO4.H2O 27.6g溶于雙蒸餾水1000mL0
[0066]B液:0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液，制備方法為Na2HPO4.12H20 71.6g溶于雙蒸餾水 1000mL。
[0067]樣本稀釋液:PBS，0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水，制備方法:A液19mL與B液8ImL混合,加入NaCl 18.5g,加雙蒸懼水至1000mL。
[0068]洗滌液=PBST,ρΗ7.4，制備方法=PBS 液 1000mL 加 Tween20 0.5mL，調(diào)至 ρΗ7.4。
[0069]底物液:0PD-H202來源:0PD (鄰苯二胺 < 鹽酸鹽>)(Sigma公司，美國)
[0070]A液:0.lmol/L檸檬酸溶液，制備方法:檸檬酸19.2g,加雙蒸餾水至1000mL。
[0071]B 液:0.2mol/L Na2HPO4 溶液，制備方法=Na2HPO4.12H20 71.7g，加雙蒸餾水至1000mL0
[0072]終止液:2mol/L H2SO4溶液，制備方法:向雙蒸餾水600mL中緩緩滴加濃硫酸IOOmL并不斷攪拌后，加雙蒸餾水至900mL。
[0073]辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG (Cell Signaling公司，美國)。
[0074]牛血清白蛋白(BSA) (Sigma公司，美國)。
[0075]主要儀器:
[0076]酶標儀(Bio-Rad公司，美國)
[0077]實驗方法:
[0078]實驗動物分組:健康雄性BALB/c小鼠(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)20只，6~8周齡，16~18g，隨機分為2組，為真核表達載體pCAGGS-1zumo (組I)和真核表達載體pCAGGS (組2)，取提取的重組pCAGGS-1zumo質(zhì)粒按100 μ g/只劑量免疫小鼠。
[0079]免疫程序:首次免疫，將質(zhì)粒按100 μ g/只/次的劑量分兩點注射到BALB/c小鼠后腿股四頭?。婚g隔2周，加強免疫2次。免疫結(jié)束后14天，將接受免疫的小鼠尾靜脈取血,收集其血清。
[0080]標本的采集和分離:從免疫小鼠尾靜脈采血，分離血清，于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0081]間接酶聯(lián)免疫(ELISA)方法檢測抗體:采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。用96孔酶聯(lián)板包被原核表達的6His-1Zumo蛋白抗原(10μ g/mL)，每孔100 μ 1，置4°C包被過夜，棄去孔中液體；用5%BSA_PBS封閉酶標反應(yīng)孔，37°C恒溫水浴箱Ih后，洗滌液滿孔洗滌3次，每次3min。將100倍稀釋的血清加入各孔，每孔100 μ 1，37°C恒溫水浴箱Ih后洗滌3次；加入酶標二抗，37°C恒溫水浴箱lh，加入底物0PD，每孔100 μ 1，置室溫避光顯色反應(yīng)lOmin，終止反應(yīng)，于20min內(nèi)，用酶標儀于492nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。待測標本OD值/陰性對照OD值>
2.1判定為陽性。免疫雄性小鼠血清抗體檢測結(jié)果見圖4。
[0082]檢測結(jié)果顯示:表達小鼠精子Izumo的真核表達載體pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清中針對小鼠Izumo蛋白產(chǎn)生了較高滴度的抗體。
[0083]實驗例5真核表達載體pCAGGS-1zumo免疫小鼠的抗生育效果
[0084]實驗方法:
[0085]實驗動物分組:健康雄性BALB/c小鼠(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)20只，6~8周齡，16~18g，隨機分為2組，為真核表達載體pCAGGS-1zumo (組I)和真核表達載體PCAGGS (組2)，按100 μ g/只劑量免疫小鼠。
[0086]免疫程序:首次免疫，將質(zhì)粒按100 μ g/只/次的劑量分兩點注射到BALB/c小鼠后腿股四頭??；間隔2周，加強免疫2次。免疫結(jié)束后觀察14天，再將免疫小鼠與正常的健康雌性小鼠按照1:1比例合籠飼養(yǎng)。合籠14天后分籠，分籠4天后，每日上午觀察小鼠生產(chǎn)情況，并統(tǒng)計產(chǎn)仔數(shù)，結(jié)果見表1。
[0087]表1本發(fā)明核酸疫苗免疫小鼠的抗生育效果檢測結(jié)果(*P < 0.05)
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種免疫避孕核酸疫苗，其包含編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列。
2.權(quán)利要求1所述的免疫避孕核酸疫苗，其中所述編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表達載體中，從而能夠在真核細胞中表達精子特異膜蛋白Izumo。
3.權(quán)利要求1-2任一項所述的免疫避孕核酸疫苗，其中所述編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列是小鼠的Izumo編碼序列。
4.權(quán)利要求3所述的免疫避孕核酸疫苗，其中所述真核表達載體為pCAGGS，并且所述小鼠編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表達載體pCAGGS的CMV增強子和雞β-actin啟動子下游。
5.權(quán)利要求4所述的免疫避孕核酸疫苗，其中在所述編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列起始端加入了 Kozak序列。
6.一種免疫避孕核酸疫苗的制備方法，其包括如下步驟:(I)利用RT-PCR技術(shù)從小鼠睪丸組織總RNA擴增得到編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列；(2)將擴增得到的Izumo編碼序列插入到真核表達載體中，構(gòu)建重組真核表達載體；(3)大量制備步驟(2)構(gòu)建得到的真核表達載體，純化，獲得免疫避孕核酸疫苗。
7.權(quán)利要求6的制備方法，其中在步驟(1)中使用的擴增編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列的引物對序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。
8.權(quán)利要求6或7的制備方法，其中步驟(2)中使用的真核表達載體為pCAGGS，并且所述編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表達載體pCAGGS的CMV增強子和雞β-actin啟動 子下游。
9.權(quán)利要求6-8任一項的方法，其中在所述編碼小鼠精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列起始端加入了 Kozak序列。
10.編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列在制備免疫避孕核酸疫苗中的用途，其中包括將所述編碼精子特異膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表達載體，構(gòu)建重組真核表達載體的步驟。
【文檔編號】A61K39/00GK103961718SQ201310006851
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月29日
【發(fā)明者】汪莉, 王玉民, 侯小強, 田利源, 郭振東, 張斌, 胡亞歐 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所