專利名稱：一種具有生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用領(lǐng)域，尤其是涉及一種具有生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
在日常生活中，疾病和意外常常導(dǎo)致人體的器官或組織發(fā)生病變與損傷。當(dāng)病變和損傷不能由人體的自身系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)時(shí)，就需要借助外界的醫(yī)療手段實(shí)現(xiàn)。在探索發(fā)展醫(yī)學(xué)工程的過程中，組織工程研究成為當(dāng)今科研與臨床應(yīng)用的一大熱點(diǎn)。組織工程包括人工細(xì)胞外基質(zhì)-支架、細(xì)胞以及信息因子三大要素，其中，組織工程支架材料的研究是決定組織工程成敗的關(guān)鍵因素。目前，人們已經(jīng)利用自組裝、外置模板、靜電紡絲等方法制備出聚乳酸、殼聚糖、聚乙烯醇等眾多的高分子組織工程支架材料。與上述合成的生物高分子相t匕，細(xì)菌纖維素天然納米纖維材料越來越受到人們的重視，被認(rèn)為可以廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的仿生納米纖維組織工程支架材料。細(xì)菌纖維素因其具有超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、良好的彈性模量和抗張強(qiáng)度、很強(qiáng)的持水能力、良好的透氣性能、較高的生物相容性、適應(yīng)性和良好的生物可降解性、以及合成時(shí)的可調(diào)控性等顯著的優(yōu)點(diǎn)，使其在生物醫(yī)用領(lǐng)域中具有十分廣泛的應(yīng)用潛力，被廣泛應(yīng)用于人工皮膚、人工血管、硬腦膜、人工軟骨和人工角膜等醫(yī)學(xué)方面。通過對(duì)BC(細(xì)菌纖維素)的研究發(fā)現(xiàn)，BC被公認(rèn)為是性能最好、實(shí)用價(jià)值也較好的纖維素，近年來關(guān)于BC的研究和開發(fā)應(yīng)用成為當(dāng)今新的微生物合成材料的研究熱點(diǎn)之一，在食品、醫(yī)學(xué)、造紙、紡織、環(huán)保、能有等各方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，并已在國內(nèi)外得到了一定的實(shí)際應(yīng)用。隨著研究的深入，可以發(fā)現(xiàn)，BC屬于多糖類物質(zhì)，是一種超微超純的纖維素，與自然界中植物或海藻產(chǎn)生的天然纖維素具有相同的分子結(jié)構(gòu)單元，具有一定的生物活性，但是與生物活性較好的材料(如殼聚糖、明膠、蠶絲蛋白等)相比，其生物活性還不能滿足醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，為擴(kuò)展BC在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，提高改善其生物活性，在使用過程中通常將BC納米纖維與生物活性大分子復(fù)合，獲得具有生物活性的復(fù)合支架材料。正是基于這一思想，許多研究報(bào)道了 BC基生物復(fù)合材料的制備及應(yīng)用情況，如在皮膚輔料領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用的BC/殼聚糖復(fù)合材料，在骨修復(fù)領(lǐng)域具有應(yīng)用前景的BC/羥基磷灰石復(fù)合材料等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有良好生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種具有生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料，其特征在于所述復(fù)合材料是由細(xì)菌纖維素、膠原和京尼平為原料制成，所述細(xì)菌纖維素、膠原以及京尼平的質(zhì)量 比為5_200 O. 1-5 0.1-5。所述細(xì)菌纖維素由木醋桿菌發(fā)酵制得，然后用堿液和去離子水交替清洗煮沸至乳白色，最后用去離子水洗至中性。所述堿液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的氫氧化鈉溶液。本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有良好生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的制備方法，采用的技術(shù)方案包括以下步驟(I)取權(quán)利要求1所述質(zhì)量比的細(xì)菌纖維素、膠原以及京尼平，將膠原配置成O. 1-5克/升的膠原水溶液，將細(xì)菌纖維素置于所述膠原水溶液中，恒溫浸泡，得到纖維膜；(2)將京尼平配置成O. 1-5克/升的京尼平水溶液，將步驟(I)中得到的纖維膜取出，放入所述京尼平水溶液中，恒溫?cái)嚢瑁?3)攪拌結(jié)束后，用去離子水沖纖維膜，然后置于飽和甘氨酸溶液中浸泡，最后再用去離子水反復(fù)沖洗，取出后進(jìn)行滅菌處理，即得細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。所述細(xì)菌纖維素可以為濕態(tài)細(xì)菌纖維素或冷凍干燥技術(shù)制備的干態(tài)細(xì)菌纖維素。所述步驟(I)中浸泡溫度為低于37°C恒溫浸泡，浸泡過程可攪拌，所述浸泡時(shí)間需超過2小時(shí)。所述步驟⑵中攪拌溫度為低于37°C恒溫?cái)嚢?，所述攪拌時(shí)間需超過2小時(shí)。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是(I)本發(fā)明首次以京尼平為交聯(lián)劑用于細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的制備，采用京尼平將膠原進(jìn)行交聯(lián)，使膠原包裹在細(xì)菌纖維素的每根纖維表面，最終制得細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。膠原的引入解決 了天然細(xì)菌纖維素材料生物活性較低的缺陷，同時(shí)保持了精細(xì)的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的生長、遷移和繁殖，滿足組織工程對(duì)支架材料的結(jié)構(gòu)和成分的要求。(2)本發(fā)明使用京尼平作為細(xì)菌纖維素和膠原的交聯(lián)劑，京尼平作為天然生物交聯(lián)劑，其毒性遠(yuǎn)低于戊二醛和其他常用化學(xué)交聯(lián)劑，生物活性高、安全無毒性。本發(fā)明使用的原料易得，安全無毒。本發(fā)明在常壓下即可完成材料制備，工藝簡單，未使用任何有毒藥品，安全無毒性。(3)本發(fā)明相比于現(xiàn)有的BC/膠原復(fù)合材料，具有合成效率高、合成均勻、保留原有BC的結(jié)構(gòu)及性能優(yōu)勢等特點(diǎn)，此外，通過與成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，這種復(fù)合材料具有較好的生物相容性。因此，這種在材料微觀結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、力學(xué)性能以及生物活性都具有一定優(yōu)勢的生物復(fù)合支架材料將在生物醫(yī)用領(lǐng)域，如皮膚復(fù)合、血管以及骨修復(fù)等方面具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。


圖1為實(shí)施例1制備細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的紅外光譜圖。圖2為實(shí)施例1制備的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的掃描電鏡照片。圖3為實(shí)施例1制備的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料用于成纖維細(xì)胞生長的MTT增殖曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :本發(fā)明所述細(xì)菌纖維素的分泌菌種為木醋桿菌(Acetobacter xylinum, Ax)。Ax為革蘭氏陰性，寬O. 6-0. 8 μ m，長1. 0-4. Oym,淡棕色，呈圓形，以單個(gè)、成對(duì)或鏈狀存在，不透明，菌落突起，表面粗糙，為好氧型，它已被作為細(xì)菌纖維素基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的模式微生物。1.細(xì)菌纖維素的制備將葡萄糖5. O % (w/v)(或甘露醇10 % (w/v))、大豆蛋白胨O. 9 % (w/v)、Na2HP04 · 12H200. 8% (w/v)及檸檬酸O. 5% (w/v)依次加入燒杯中，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5-7. O范圍，115°C高溫滅菌半小時(shí)后取出，作為木醋桿菌生長的培養(yǎng)基。木醋桿菌菌種接種到上述液體培養(yǎng)基中，充分振蕩使菌液均勻，28°C恒溫靜置培養(yǎng)3天，得到細(xì)菌纖維素。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)I %的氫氧化鈉溶液與去離子水交替清洗煮沸至乳白色，最后用去離子水洗至中性，此時(shí)得到的細(xì)菌纖維素為濕態(tài)的細(xì)菌纖維素。將得到的濕態(tài)的細(xì)菌纖維素凍干得到干態(tài)細(xì)菌纖維素2.細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的制備配制100毫升1. 5克/升的膠原(sigma，美國)水溶液。取5克凍干的細(xì)菌纖維素放入膠原水溶液中，室溫充分浸泡且攪拌I天，得到纖維膜。將纖維膜取出，放入100毫升I克/升京尼平水溶液中，30°c恒溫?cái)嚢?4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水沖洗纖維膜，然后置于飽和甘氨酸溶液中浸泡，持續(xù)換液直至溶液不再變色后再用去離子反復(fù)沖洗，取出后滅菌處理，即得本發(fā)明產(chǎn)物具有生物相容性細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。實(shí)施例2 1.細(xì)菌纖維素的制備將葡萄糖5. O % (w/v)(或甘露醇10 % (w/v))、大豆蛋白胨O. 9 % (w/v)、Na2HP04 · 12H200. 8% (w/v)及檸檬酸O. 5% (w/v)依次加入燒杯中，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5-7. O范圍，115°C高溫滅菌半小時(shí)后取出，作為木醋桿菌生長的培養(yǎng)基。木醋桿菌菌種接種到上述液體培養(yǎng)基中，充分振蕩使菌液均勻，28°C恒溫靜置培養(yǎng)3天，得到細(xì)菌纖維素。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)I %的氫氧化鈉溶液與去離子水交替清洗煮沸至乳白色，最后用去離子水洗至中性，此時(shí)得到的細(xì)菌纖維素為濕態(tài)的細(xì)菌纖維素。2.細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的制備配制100毫升I克/升的膠原(sigma，美國)水溶液,取10克濕態(tài)的細(xì)菌纖維素放入膠原水溶液中，室溫充分浸泡且攪拌I天，得到纖維膜。將纖維膜取出，放入100毫升I克/升京尼平水溶液中，30°C恒溫?cái)嚢?4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水沖洗纖維膜，然后置于飽和甘氨酸溶液中浸泡，持續(xù)換液直至溶液不再變色后再用去離子反復(fù)沖洗，取出后滅菌處理，即得本發(fā)明產(chǎn)物具有生物相容性細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。實(shí)施例31.細(xì)菌纖維素的制備將葡萄糖5. O % (w/v)(或甘露醇10 % (w/v))、大豆蛋白胨O. 9 % (w/v)、Na2HP04 · 12H200. 8% (w/v)及檸檬酸O. 5% (w/v)依次加入燒杯中，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至
5.5-7. O范圍，115°C高溫滅菌半小時(shí)后取出，作為木醋桿菌生長的培養(yǎng)基。木醋桿菌菌種接種到上述液體培養(yǎng)基中，充分振蕩使菌液均勻，28°C恒溫靜置培養(yǎng)3天，得到細(xì)菌纖維素。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)I %的氫氧化鈉溶液與去離子水交替清洗煮沸至乳白色，最后用去離子水洗至中性，此時(shí)得到的細(xì)菌纖維素為濕態(tài)的細(xì)菌纖維素。
2.細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的制備配制100毫升3. 5克/升的膠原(sigma，美國)水溶液，取200克濕態(tài)的細(xì)菌纖維素放入膠原水溶液中，室溫充分浸泡且攪拌I天，得到纖維膜。將纖維膜取出，放入100毫升3克/升京尼平水溶液中，30°C恒溫?cái)嚢?4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水沖洗纖維膜，然后置于飽和甘氨酸溶液中浸泡，持續(xù)換液直至溶液不再變色后再用去離子反復(fù)沖洗，取出后滅菌處理，即得本發(fā)明產(chǎn)物具有生物相容性細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。試驗(yàn)例I對(duì)上述復(fù)合材料進(jìn)行紅外分析，得到的圖譜如圖1所示。對(duì)上述復(fù)合材料進(jìn)行電鏡掃描，得到的照片如圖2所示。將上述復(fù)合材料應(yīng)用到小鼠成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，將小鼠成纖維細(xì)胞接種到上述復(fù)合材料中，按照接種濃度為1X105細(xì)胞/ml的成纖維細(xì)胞，分別培養(yǎng)1、3、5、7天，采用噻唑藍(lán)比色法測試細(xì)胞在復(fù)合材料上的增殖情況，其增值曲線如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖1所示的復(fù)合材料的FTIR圖譜可知，材料中分別出現(xiàn)了細(xì)菌纖維素和膠原的特征吸收峰，表明膠原成功地引入到細(xì)菌纖維素支架中。圖2給出了本發(fā)明制備的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的掃描電鏡照片，結(jié)果可以看出，在細(xì)菌纖維素的納米纖維中存在膠原包覆層，與圖1的FTIR圖譜的結(jié)果相一致。由圖3可知，成纖維細(xì)胞在復(fù)合材料的支架上保持很好的增殖，在7天的培養(yǎng)周期內(nèi)，細(xì)胞一直保持良好的增 殖速率，說明復(fù)合材料有很好的生物活性，適合成纖維細(xì)胞的生長于繁殖。以上對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種具有生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料，其特征在于所述復(fù)合材料是由細(xì)菌纖維素、膠原和京尼平為原料制成，所述細(xì)菌纖維素、膠原以及京尼平的質(zhì)量比為5-200 0.1-5 0.1-5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于所述細(xì)菌纖維素由木醋桿菌發(fā)酵制得，然后用堿液和去離子水交替清洗煮沸至乳白色，最后用去離子水洗至中性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合材料，其特征在于所述堿液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I%的氫氧化鈉溶液。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取權(quán)利要求1所述質(zhì)量比的細(xì)菌纖維素、膠原以及京尼平，將膠原配置成0.1-5克/升的膠原水溶液，將細(xì)菌纖維素置于所述膠原水溶液中，恒溫浸泡，得到纖維膜； (2)將京尼平配置成0.1-5克/升的京尼平水溶液，將步驟(I)中得到的纖維膜取出，放入所述京尼平水溶液中，恒溫?cái)嚢瑁? (3)攪拌結(jié)束后，用去離子水沖纖維膜，然后置于飽和甘氨酸溶液中浸泡，最后再用去離子水反復(fù)沖洗，取出后進(jìn)行滅菌處理，即得細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述細(xì)菌纖維素可以為濕態(tài)細(xì)菌纖維素或冷凍干燥技術(shù)制備的干態(tài)細(xì)菌纖維素。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在干所述步驟⑴中浸泡溫度為低于37°C恒溫浸泡，浸泡過程可攪拌，所述浸泡時(shí)間需超過2小吋。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在干所述步驟⑵中攪拌溫度為低于37°C恒溫?cái)嚢?，所述攪拌時(shí)間需超過2小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有生物相容性的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料及其制備方法，其特征在于所述復(fù)合材料是由細(xì)菌纖維素、膠原和京尼平為原料制成，所述細(xì)菌纖維素、膠原以及京尼平的質(zhì)量比為5-200∶0.1-5∶0.1-5。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為具有合成效率高、合成均勻、保留原有BC的結(jié)構(gòu)及性能優(yōu)勢等特點(diǎn)，此外，通過與成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，這種復(fù)合材料具有較好的生物相容性。
文檔編號(hào)A61L27/24GK103041446SQ20131001016
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月9日
發(fā)明者徐俊青, 李麗, 葉建國, 邢勝男, 李秀萍 申請(qǐng)人:中國天辰工程有限公司, 天津天辰綠色能源工程技術(shù)研發(fā)有限公司