一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法和應用，該發(fā)明利用從人參、西洋參、三七中提純的活性分子，調整重組人干擾素γ的空間構象，以獲得免疫細胞活化試劑。這種細胞因子與人的CD3單抗配合，可以在體外刺激并活化人體免疫細胞。這種活化所得的免疫細胞能夠100％的殺滅癌細胞，并能觀察到明確的免疫細胞附著殺傷現(xiàn)象。
【專利說明】一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤生物免疫治療領域，尤其是涉及一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]癌癥是一個尚待解決的醫(yī)學難題。癌癥治療長期依賴放化療，其毒副作用大，療效也不徹底。這種局面與放化療的研究體系有關系:放化療對癌細胞和正常細胞不具選擇性，為了保全正常細胞，藥物濃度或者射線劑量就必須控制，不能太高，而這樣的做法顯然也給癌細胞的逃脫大開方便之門。這種模式決定了放化療的效果肯定是不徹底的。為了能夠評價各種具體藥物的優(yōu)劣，設計出了抑瘤率(tumor inhibitory rate)這個指標。
[0003]抑瘤率是癌細胞殺傷效果評估體系中唯一一個量化指標。通過對比實驗組和對照組癌細胞的數(shù)量來評估殺傷效果。例如，假設實驗組(自由生長)和對照組(藥物抑制)中癌細胞初始數(shù)量都是10，我們在實驗組中加化療藥物，再讓兩組癌細胞共同生長2-3天，如果對照組癌細胞數(shù)量長到100，實驗組癌細胞數(shù)量長到40，那么抑瘤率=(100-40)/100=60%。抑瘤率如實反應了藥物對癌細胞生長速度的抑制，但是實驗組癌細胞數(shù)量畢竟從10增加到40，這與我們的期望值有明顯差距一一殺傷后癌細胞數(shù)量至少要在初始數(shù)量10的基礎上減少才稱得上治療有效。然而抑瘤率允許實驗組癌細胞數(shù)量在初始數(shù)量的基礎上繼續(xù)生長，那么其所能描述的效果明顯比我們的期望值低了一個水準。特別的，因為放化療只能短暫進行，血藥無法像體外試驗一樣連續(xù)幾天維持在高濃度，大大影響了實際效果；必需的治療間歇期無疑在放任癌細胞自由生長。
[0004]以上分析暴露了放化療效果不徹底的原因，也說明了當前腫瘤治療的實際水平。以抑瘤率來評估效果的治療方法實際價值并不大，我們需要一個在不破壞正常細胞的前提下，能實際殺滅癌細胞的方法，最理想條件下，做到100%殺滅癌細胞。
[0005]鑒于放化療的不徹 底性和過大的毒副作用，腫瘤的生物免疫療法越來越受重視。免疫學上已經確認，人體的淋巴細胞在清除病變和變異細胞中發(fā)揮主要作用，從中衍生出一種思路是，增加淋巴細胞的數(shù)量或許能達到一定療效。1980年美國學者Rosenberg報道的 LAK(Lymphokine Activated Killer cells)是這種思路的源頭。
[0006]LAK的出現(xiàn)與IL-2的發(fā)現(xiàn)息息相關。1976年T淋巴細胞生長因子(TCGF，T CellGrowth Factor)被發(fā)現(xiàn)，這種細胞因子能夠促使淋巴細胞生長。1979年TCGF被統(tǒng)一定名為IL-2。1980年Rosenberg即提出用大劑量的IL-2誘導淋巴細胞增殖，并將其用于癌癥治療，這就是LAK的概念。
[0007]LAK并未取得有益療效，人們將其歸咎于LAK技術中淋巴細胞增殖的倍數(shù)(20-40倍)不夠。一直到1991年和1993年，美國斯坦福大學學者兩次報道，通過抗人⑶3單克隆抗體(ant1-⑶3)、IL-2和IL-12的聯(lián)合刺激，連續(xù)培養(yǎng)21天后，淋巴細胞數(shù)量可以增殖1000倍(考慮到細胞活力會降低，實際上僅培養(yǎng)14天，大約增殖200倍)，這就是CIK(Cytokine Induced Killer)的概念。[0008]CIK完全繼承了 LAK的思想，即通過增加淋巴細胞的數(shù)量達到療效，這種思想產生的同時就埋下隱憂:難道提高了數(shù)量就能解決實際問題嗎？不過相對于LAK而言，較大的增殖倍數(shù)仍然使CIK具備了可操作性:如今CIK技術已經是目前腫瘤生物免疫治療的主要內容了。
[0009]相對于放化療，沒有毒副作用是CIK技術明顯的優(yōu)點。用于培養(yǎng)的淋巴細胞一般都來源于患者本人(少數(shù)來源于臍帶血，屬于異體來源)，增殖之后的細胞基因也完全復制于患者本人，其所編碼的蛋白當然也與患者體內一致。CIK技術屬于典型的“自體免疫細胞治療”技術，對自身細胞耐受(不傷害自體正常細胞)，也不會引發(fā)過敏反應，因此基本沒有毒副作用?！白泽w免疫細胞治療”在邏輯上屬于自體細胞移植。
[0010]在效果上，CIK技術只能作為放化療的“補充”。這種差強人意的評價根源于CIK技術以數(shù)量為主導的，不夠成熟的治療思想。CIK對癌細胞的殺傷效果，延用放化療的指標抑瘤率來描述，允許實驗組的癌細胞數(shù)量在原有基礎上繼續(xù)生長。至今還未有人直接觀察到，CIK的“殺傷”過程如何完成，各種對CIK效應機制的假設性描述并不能平息人們對CIK實際能力的猜疑:即CIK細胞分泌的細胞因子確實可能使癌細胞的生長速度得到部分抑制，但CIK細胞殺傷癌細胞還遠遠沒有成為事實。
[0011]非常明顯，以數(shù)量為主導的CIK技術不能概括淋巴細胞的全部能力。我們所了解的免疫系統(tǒng)本應具備十分強大的功能，比如普通感冒可以在三四天內完全自愈，比如器官移植排斥那強烈的徹底的排斥效果。免疫學研究也早已明確一個真正的細胞殺傷過程具備3個時相:接觸相、打擊相、裂解相，并且找到了實現(xiàn)這一系列功能的分子基礎【穿孔素(perforin)和顆粒酶(granzymes)】,那么這整個殺傷過程,特別是附著(接觸)現(xiàn)象必然就是一個在顯微鏡下可觀察的特征，這些特點在CIK技術上看不到一點影子(邢宏等，《細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的基礎與臨床研究新進展)》，中國免疫學雜志，2011年第27卷)。很顯然當前以CIK技術為代表的腫瘤免疫細胞治療技術還遠遠不夠，在以數(shù)量為主導的思想之外，我們需要尋找一種更為理想的免疫細胞激活技術，這種技術不能再以抑瘤率來評價效果，而必須具備更 客觀的、可直接觀察的殺傷癌細胞的能力，從而構建一個確實有效的腫瘤免疫細胞治療方法。

【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法和應用。
[0013]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0014]一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下工藝步驟:
[0015]a、將五加科植物人參、西洋參、三七作為原藥清洗、烘干、粉碎后，將其與無水乙醚溶液按固液比1: 2-5置于密封容器中，常溫浸泡12天-32天，得到浸提液，這里，無水乙醚為無色透明易揮發(fā)的液體，有芳香刺激性氣味，無水乙醚熔點-116.3°C，沸點34.6°C，折射率1.353，密度0.713—0.715g/ml (20 °C )，無水乙醚微溶于水，易溶于鹽酸，能與醇、醚、石油醚、笨、氯仿等有機溶劑混溶；
[0016]b、將浸提液用紗布過濾以去除雜質，在不大于33°C的情況下用旋轉蒸發(fā)儀蒸出乙醚溶液得到濃縮液，亦或是在自然環(huán)境下通過乙醚揮發(fā)而得到濃縮液；
[0017]C、將濃縮液與解離溶液按體積比1: 2-3混合萃取，當分層的乙醚消失時，溶質完全溶解于解離溶液中，制得溶液A，以解離溶液作為空白對照，測定并記錄溶液A在278nm波長下的吸光度值M,并用220um濾膜過濾除菌，得到溶液A'；
[0018]對溶液A'取樣，并根據其在278nm下的吸光度值M，用pH為7的等滲磷酸鹽緩沖液稀釋至吸光度值等于0.01后，用家兔做多點皮試，如皮試結果為陰性則溶液A'屬合格品;
[0019]d、解離變構:
[0020](dl)根據溶液A'在278nm波長下的吸光度值M，將步驟c的解離溶液滴入溶液K'進行稀釋，直至溶液A'被稀釋至吸光度值等于0.003，并于4-8°C下輕柔攪拌，得到溶液B ；
[0021](d2)取重組人干擾素Y或由人體免疫細胞分泌的干擾素Y按一定比例逐滴加入溶液B中，并輕柔攪拌5分鐘，制得溶液C，這里的計算比例為:每毫升解離溶液配比干擾素800 -6000 萬 IU ；
[0022](d3)將溶液C注入規(guī)格為:寬11.5mm，容積lml/cm，截留分子量為10000的透析袋中，不留空隙，并抓緊透析袋，避免滲漏，然后將透析袋懸垂于4-8°C的復性溶液中，復性溶液體積為透析袋內溶液體積的50倍，輕柔攪拌，4小時后更換新鮮復性溶液，過夜，待透析袋內溶液PH平衡至7.2，使干擾素Y復性；
[0023]e、吸取步驟d3中透析袋內的溶液，直接滴注于凝膠過濾層析柱中，開始層析分離；
[0024]層析柱高I米,選用凝膠SephadexG-25或G-50,層析柱置于4°C中，采用復性溶液作為洗脫液，自動部分收集器收集B峰流出液，測定B峰流出液在280nm下的吸光度值N，用復性溶液按比例將B峰流出液稀釋至濃度為Q的溶液D，然后用220um的滅菌針尖濾器對溶液D過濾除菌，制得變構的干擾素Y ；
[0025]需要說明的是，變構干擾素Y是否制備成功，可以通過凝膠過濾層析時，自動部分收集器記錄的特征吸收曲線來確認，這屬于成熟的現(xiàn)有技術，在此不再贅述。
[0026]f、組合成活化人體免疫細胞的試劑:活化人體免疫細胞的試劑包括變構的干擾素Y和ant1-CD3，利用兩種細胞因子的共同刺激以激活免疫細胞。
[0027]所述原藥為人參、西洋參、三七三種五加科植物之一或其組合，根、莖、花均可，優(yōu)選三年生以上春三七的根，其處理工藝最簡單，提取產物的質量最為穩(wěn)定。
[0028]所述解離溶液含L-甘氨酸、L-精氨酸和N-甘氨酰-L-谷氨酰胺，并用鹽酸滴定至 pH4.8。
[0029]所述溶液B的配制體積V與層析柱直徑D的關系為:當層析柱直徑D為3cm，則溶液B的配制體積V為10-25ml ;當層析柱直徑D為4cm，則溶液B的配制體積V為15-45ml ;當層析柱直徑D為5cm，則溶液B的配制體積V為20-70ml。
[0030]步驟d2中計算比例為:
[0031]每毫升解離溶液配比干擾素3000萬IU,重組人干擾素Y比活為1.6X 107IU/mg。
[0032]所述復性溶液為pH為7.2，0.15M的磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液含甘露醇。
[0033]活化人體免疫細胞的試劑是活化人體免疫細胞以及腫瘤免疫細胞治療中較好的-1r 口
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[0034]蛋白質的空間結構又稱為三維結構或構象(conformation),是在不改變氨基酸序列的前提下，肽鏈在三維空間的分布方式。特定的空間構象是蛋白質發(fā)揮功能的結構基礎，構象改變將使蛋白質功能發(fā)生變化，甚至喪失原有活性。本發(fā)明描述的是一項通過改變干擾素Y的空間構象，從而促進其活化性能的技術。
[0035]干擾素Y是II型干擾素中的唯一成員，主要起免疫調節(jié)作用，可以促進ThO細胞分化為Thl細胞(增強細胞免疫應答)，抑制Th2細胞增殖(抑制體液免疫應答)；促進細胞毒性T淋巴細胞成熟及殺傷活性。目前干擾素Y主要通過基因重組的大腸桿菌獲得，即重組人干擾素Y，并已制成注射針劑用于病毒感染和癌癥治療。然而實際運用中，我們能夠得到的干擾素Y對免疫細胞的刺激效果并不如上述那么強大，因此，我們就從探究干擾素Y的效應機制入手。
[0036]人參皂苷(Ginsenoside，GS)是一種固醇類化合物，是從五加科植物(人參、西洋參、三七)根、莖、葉中提取的主要活性成分，包含一組結構類似的，難以繼續(xù)分離的單體分子，現(xiàn)已明確知道的GS單體約有40余種。人參皂苷被視為是人參中的活性物質，并且具有增加白細胞數(shù)量、提高人體免疫力、促進物質代謝、抗疲勞、抗衰老等作用。由于人參皂苷成分復雜，各種單體的效能難以分離研究，人們對人參皂苷的認識仍然存在諸多盲點。
[0037]本發(fā)明正是從上述兩類物質的研究中延伸而來的。本發(fā)明利用人參皂苷的分子結構特性調整重組人干擾素Y的空間構象，所獲得的新的蛋白因子具備比原來的干擾素Y更為強大的細胞刺激效能。這種新的蛋白因子與抗人CD3單抗配合，作為一種活化試劑，被用于激活人體免疫細胞。激活的結果，免疫細胞將具備100%殺滅癌細胞的能力，并且能在顯微鏡下觀察到典型的細胞附著`殺傷現(xiàn)象，最終癌細胞完全消失。通過本項發(fā)明，我們可以構建一個確實有效的腫瘤免疫細胞治療方法。
[0038]在本發(fā)明中，由于免疫細胞殺滅癌細胞的效果已經遠遠超過殺瘤率所能夠描述的效果，因此不再以殺瘤率作為效果評估的指標。本發(fā)明中將以癌細胞完全消失或者基本消失，并且在顯微鏡下直接觀察到明確的殺傷行為，作為有效殺傷的依據?？梢钥隙ǖ氖?，如果癌細胞完全消失或者接近完全消失，抑瘤率總是100%或者接近100%。在這種高效殺傷的情況下，抑瘤率已經失去了評價的意義。所以，采用顯微鏡直接觀察評估殺傷效果，是本發(fā)明區(qū)別于以往同類技術的顯著特征。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為活化試劑的制備及免疫細胞的活化方法流程圖。
[0040]圖2為典型的層析收集峰(280nm)示意圖。
[0041]圖3為實施例1中癌細胞被殺傷4小時的效果觀察圖。
[0042]圖4為實施例1中癌細胞被殺傷6小時的效果觀察圖。
[0043]圖5為實施例1中癌細胞被殺傷12小時的效果觀察圖。
[0044]圖6為實施例1中癌細胞被殺傷24小時的效果觀察圖。
[0045]圖7為實施例2中癌細胞被殺傷6小時Gemsa染色觀察圖一。
[0046]圖8為實施例2中癌細胞被殺傷6小時Gemsa染色觀察圖二?！揪唧w實施方式】
[0047]為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。
[0048]實施例1:一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法，其具有如下步驟(參見圖1):
[0049](I)原藥篩選。本發(fā)明所述及的原料藥包括五加科三種植物全株:人參、西洋參、三七，根、莖、花均可，優(yōu)選三年生以上春三七的根，其處理工藝最簡單，提取產物的質量最為穩(wěn)定。將三七根切片，厚約2~3mm,曬干。
[0050](2)乙醚浸提。稱取曬干三七片500克,用2L醫(yī)用無水乙醚浸泡大于2周，一般浸泡時間為一個月。容器需密封，置于陰涼處，防止乙醚揮發(fā)。
[0051]原藥與乙醚比例，以及浸泡時間并非決定最終效果的關鍵，上述比例數(shù)據是一種優(yōu)化。乙醚過少，浸泡時間太短，則每次提取所得太少。三七片可反復用于浸提，但每次浸提所得會減少，因此不要超過5次。
[0052]各種市售的加工制成品，如三七粉，三七總皂苷，人參總皂苷等，在本發(fā)明中難以達到效果，可能是浸提工藝的差別所致。一般而言，在上述加工制成品的生產中，為了簡化工藝，控制成本和得到最大的提取率，不會采用乙醚浸提，通常采用水或含水乙醇作為溶劑(王忠全，《三七總皂苷提取工藝進展》，中醫(yī)藥導報，第15卷第9期，2009年9月)。
[0053](3)旋轉蒸發(fā)。取上述乙醚浸提液，用醫(yī)用紗布過濾，去除雜質，采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至200ml。設置旋轉蒸發(fā)儀的恒溫鍋溫度不大于33°C (乙醚沸點34.6°C )。采用旋轉蒸發(fā)儀是為了提高濃縮速度。如果乙醚沸騰，可能降低提取物質的最終效能，而且可能產生危險，因為乙醚蒸汽易燃易爆。也可以通過乙醚自行揮發(fā)得到有效提取物，但耗時長，所用乙醚無法回收，需要充分的通風條件，否則容易造成危險。
[0054](4)水相萃取。將蒸發(fā)濃縮的乙醚溶液與400ml解離溶液混合萃取。達到平衡之后，分層的乙醚溶液可以回收至旋轉蒸發(fā)儀，繼續(xù)濃縮，然后返回再次混合萃取。也可以讓乙醚自行揮發(fā)濃縮，通過加熱至33°C以加速揮發(fā)。
[0055]解離溶液含L-甘氨酸、L~精氨酸和N-甘氨酰-L-谷氨酰胺，pH4.8，以下是優(yōu)化配方:
[0056]
【權利要求】
1.一種活化人體免疫細胞的試劑制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下工藝步驟: a、將五加科植物人參、西洋參、三七作為原藥清洗、切片、曬干后，將其與無水乙醚溶液按固液比1: 2-5置于密封容器中，常溫浸泡12天-32天，得到浸提液； b、將浸提液用紗布過濾以去除雜質，在不大于33°C的情況下用旋轉蒸發(fā)儀蒸出乙醚溶液得到濃縮液，亦或是在自然環(huán)境下通過乙醚揮發(fā)而得到濃縮液； C、將濃縮液與解離溶液按體積比1: 2-3混合萃取，當分層的乙醚揮發(fā)消失，溶質完全溶解于解離溶液中，獲得溶液A，以解離溶液作為空白對照，測定并記錄溶液A在278nm波長下的吸光度值M，并用220um濾膜過濾除菌，得到溶液A'； 對溶液A'取樣，并根據其在278nm下的吸光度值M，用pH為7的等滲磷酸鹽緩沖液稀釋至吸光度值等于0.01后，用家兔做多點皮試，如皮試結果為陰性則溶液A'屬合格品； d、解離變構: (dl)根據溶液A'在278nm波長下的吸光度值M,將步驟c的解離溶液滴入溶液A'進行稀釋，直至溶液A'被稀釋至吸光度值等于0.003,并于4-8°C下輕柔攪拌，得到溶液B ； (d2)取重組人干擾素Y或由人體免疫細胞分泌的干擾素Y按一定比例逐滴加入溶液B中，并輕柔攪拌5分鐘，制得溶液C，這里的計算比例為:每毫升解離溶液配比干擾素800 -6000 萬 IU ； (d3)將溶液C注入規(guī)格為:寬11.5mm，容積lml/cm，截留分子量為10000的透析袋中，不留空隙，并扎緊透析袋，避免滲漏，然后將透析袋懸垂于4-8°C的復性溶液中，復性溶液體積為透析袋內溶液體積的50倍，輕柔攪拌，4小時后更換新鮮復性溶液，過夜，待透析袋內溶液PH平衡至7.2，使干 擾素Y復性； e、吸取步驟d3中透析袋內的溶液，直接滴注于凝膠過濾層析柱中，開始層析分離； 層析柱高I米，選用凝膠S印hadexG-25或G-50，層析柱置于4°C中，采用復性溶液作為洗脫液，自動部分收集器收集B峰流出液，測定B峰流出液在280nm下的吸光度值N，用復性溶液按比例將B峰流出液稀釋至濃度為Q的溶液D，然后用220um的滅菌針尖濾器對溶液D過濾除菌，制得變構的干擾素Y ； f、組合成活化人體免疫細胞的試劑:活化人體免疫細胞的試劑包括變構的干擾素Y和ant1-CD3，利用兩種細胞因子的共同刺激以激活免疫細胞。
2.如權利要求1所述的試劑制備方法，其特征在于，所述原藥為人參、西洋參、三七三種五加科植物之一或其組合。
3.如權利要求1所述的試劑制備方法，其特征在于，所述解離溶液含L-甘氨酸、L-精氨酸和N-甘氨酰-L-谷氨酰胺，并用鹽酸滴定至pH4.8。
4.如權利要求1所述的試劑制備方法，其特征在于，所述溶液B的配制體積V與層析柱直徑D的關系為:當層析柱直徑D為3cm，則溶液B的配制體積V為10-25ml ;當層析柱直徑D為4cm，則溶液B的配制體積V為15-45ml ；當層析柱直徑D為5cm，則溶液B的配制體積V為20-70ml。
5.如權利要求1所述的試劑制備方法，其特征在于，步驟d2中計算比例為: 每毫升解離溶液配比干擾素3000萬IU，重組人干擾素Y比活為1.6X 107IU/mg。
6.如權利要求1所述的試劑制備方法，其特征在于，所述復性溶液為pH為7.2,0.15M的磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液含甘露醇，復性溶液配方為:
NaH2PO4.12H20 38.688g/L ；
Na2HPO4.2H20 6.552g/L ； 甘露醇50g/L。
7.如權利要求1的試劑制備方法制備到的活化人體免疫細胞的試劑在活化人體免疫細胞以及腫瘤免疫細胞治療中的應用。
【文檔編號】A61K36/258GK103446207SQ201310010980
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年1月11日 優(yōu)先權日:2013年1月11日
【發(fā)明者】王艷紅, 燕山 申請人:上海禾易生物技術發(fā)展有限公司