專利名稱：一種用于軟骨損傷修復(fù)的軟骨移植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種軟骨移植物，更具體的說是涉及一種用于軟骨損傷的由脂肪干細胞和軟骨細胞在三維膠原培養(yǎng)基共同培養(yǎng)形成的軟骨組織移植物及其制備方法。
背景技術(shù)：
軟骨損傷是比較難以治愈的病變，尤其是淺層性的軟骨損傷。多種原因都可以造成軟骨損傷，如外力沖擊，自生免疫性疾病，老齡化導(dǎo)致的機體退化等。軟骨的自身修復(fù)能力很弱，即使是很小的軟骨缺損也很難愈合。因為軟骨組織內(nèi)沒有血液供應(yīng)，軟骨內(nèi)基質(zhì)合成不是很活躍。但是如果傷口深到軟骨下骨層，傷口反而有自我愈合的情況，這是因為由軟骨下骨內(nèi)的血液滲透出來形成血塊，同時附近的干細胞有可能被激活來促進傷口的愈合。在臨床治療過程中，常通過鉆孔至軟骨下層導(dǎo)致出血或微骨折的方式來治療軟骨缺損。修復(fù)軟骨缺損比較有效的方法之一是自體軟骨細胞移植(ACT)，將自體軟骨細胞在三維支架環(huán)境中培養(yǎng)，等到形成新的軟骨樣組織后再移植到缺損處修復(fù)軟骨。這是最先由瑞典科學(xué)家提出的治療骨性關(guān)節(jié)炎的一種方案。該方案的具體內(nèi)容主要包括從體內(nèi)的非負重部位取一塊軟骨組織，從中分離出軟骨細胞，在體外特殊條件下培養(yǎng)增殖后，移植入損傷處，以達到修復(fù)目的。該方法已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)應(yīng)用于20000多個患者身上，取得了不同程度的修復(fù)效果。但是該方法還是有一定的缺陷。該技術(shù)需要產(chǎn)生足夠的軟骨基質(zhì)和軟骨細胞來填充缺損處?？上КF(xiàn)有的方法產(chǎn)生的大部分是纖維狀軟骨，而不是天然的透明軟骨組織，其修復(fù)以及機械性能較差。其它問題包括取樣處發(fā)生病變、細胞供應(yīng)量不足、細胞活性低、成熟的軟骨增殖能力弱、軟骨細胞在體外擴增時去分化狀態(tài)均會導(dǎo)致植入體內(nèi)后不能形成軟
骨。 ACT技術(shù)的關(guān)鍵點是三維培養(yǎng)體系，需要采用合適的支架，給細胞的生長提供支持和營養(yǎng)，并能分化和保持特殊細胞表型的細胞。目前市面上已有產(chǎn)品在三維培養(yǎng)基的性能取得了很好的成果，三維培養(yǎng)基主要成分為成大鼠尾部肌腱，牛跟腱或小牛皮膚提取的膠原纖維，細胞在凝膠載體中可獲得很好的生長支持。I型膠原纖維表面有特殊的細胞識別信號(特定氨基酸序列)，可促進細胞分化。I型膠原纖維構(gòu)成的基質(zhì)有利于保持軟骨細胞的形態(tài)，加快細胞增殖。在臨床應(yīng)用中ACT存在的問題體現(xiàn)了這個培養(yǎng)體系目前存在的缺陷。主要問題是這個培養(yǎng)系統(tǒng)中只含有單一的軟骨細胞成分，而在體內(nèi)，細胞處于一個立體的空間，多種細胞共同存在、細胞間的相互作用、信號傳導(dǎo)等對于細胞的功能影響很大。成分單一的培養(yǎng)系統(tǒng)會造成細胞成長緩慢，活性不高和去分化的狀態(tài)，并且在植入體內(nèi)后，沒有持續(xù)的營養(yǎng)供應(yīng)，會導(dǎo)致細胞存活率降低。基于對軟骨細胞培養(yǎng)體系和脂肪干細胞的分化潛能和營養(yǎng)作用的認識，本發(fā)明將軟骨細胞和脂肪干細胞共同三維培養(yǎng)來克服常規(guī)ACT細胞培養(yǎng)的不足。脂肪組織中含有一種具有間充質(zhì)干細胞特性的細胞群體，被稱作脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSC)。這種細胞具有自我更新和分化能力，大量的文獻證實了 ADSCs不僅能分化成間充質(zhì)細胞如脂肪，軟骨，成骨，肌肉；還能分化成神經(jīng)，血管來源的細胞。過去10年，脂肪干細胞在器官組織損傷的修復(fù)應(yīng)用中逐漸受到重視，治療的疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，軟骨損傷，軟組織填充和皮膚局部缺血等。自體脂肪干細胞的使用相比其它來源的間充質(zhì)干細胞有較好的安全性，因為是自體組織，不會有排異反應(yīng)，是理想的移植物。國內(nèi)外已經(jīng)有很多關(guān)于ADSCs的臨床試驗和相關(guān)的臨床報告，大部分取得了讓人滿意的療效。間充質(zhì)干細胞除了具備很好的分化能力外，還能分泌各種生長因子來促進臨近細胞的生長和損傷修復(fù)，如EGF、FGF、VEGF等。有研究表明，即使只采用這些生長因子也能夠促進軟骨損傷的自我修復(fù)或皮膚傷口的愈合。國外研究發(fā)現(xiàn)，將軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞共同培養(yǎng)有助于軟骨基質(zhì)的生成。新生成的軟骨基質(zhì)大部分來源于軟骨細胞，少部分是由干細胞分化形成的。所以在脂肪干細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)中，干細胞除了分化成軟骨夕卜，還具有其他的補充作用。三維條件下培養(yǎng)的干細胞具有比平面培養(yǎng)更好的活性，分泌出更多的營養(yǎng)因子。這些生長因子能刺激軟骨細胞的增殖和軟骨基質(zhì)的分泌，從而減少了對軟骨組織取樣量的要求。它們還有可能激活損傷處的自我修復(fù)機制，促進關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)自體干細胞的動員并向傷口遷移，達到協(xié)同的治療效果。軟骨細胞和脂肪干細胞共同培養(yǎng)產(chǎn)生的是一種高效的用于軟骨修復(fù)的移植物。脂肪干細胞的加入不但提高了軟骨細胞的增殖能力和活性，同時自身還是強有力的修復(fù)軟骨的工具。該方法的優(yōu)勢還包括:對軟骨細胞的需求量較低，軟骨組織的培養(yǎng)密度在2-9xl05/ml，培養(yǎng)時間短，移植物存活的效率高，產(chǎn)生的透明軟骨成分較多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過讓脂肪干細胞與軟骨細胞在三維膠原系統(tǒng)中共培養(yǎng)的形式，來克服現(xiàn)有ACT的培養(yǎng)系統(tǒng)的缺陷。軟骨細胞和脂肪干細胞共同培養(yǎng)產(chǎn)生的是一種高效的用于軟骨修復(fù)的移植物。脂肪干細胞的加入不但提高了軟骨細胞的增殖能力和活性，同時自身還是強有力的修復(fù)軟骨的工具。該方法的優(yōu)勢還包括對軟骨細胞的需求量不是很大，細胞的培養(yǎng)密度在4xl05/ml左右，培養(yǎng)時間短，移植物存活的效率高，產(chǎn)生的透明軟骨成分比較多。一種脂肪干細胞與軟骨細胞的三維膠原共培養(yǎng)體系，包括從脂肪組織中分離培養(yǎng)脂肪干細胞，從軟骨取樣里分離軟骨細胞，三維膠原培養(yǎng)基的制備及用含人體自身血清的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案是:I)從人的脂肪組織分離脂肪干細胞采用常規(guī)方法得到。簡單的說，就是機械粉碎，膠原酶消化和過濾，然后平板培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 (v/v)。當(dāng)脂肪干細胞的生長密度達到70-90%時，進行傳代培養(yǎng)。在和軟骨細胞共同培養(yǎng)時，需要的干細胞數(shù)量在4xl05/ml左右。2)在準備共培養(yǎng)之前，收集脂肪干細胞，要用無菌PBS洗三次，以降低培養(yǎng)基中異源物帶來的干擾。然后按照廠家說明將干細胞和軟骨細胞以2:I的比例混入膠原培養(yǎng)基中。 3)在三維膠原培養(yǎng)中所采用的培養(yǎng)基采用自體血清替代傳統(tǒng)的FBS，同時加有促脂肪干細胞成軟骨轉(zhuǎn)化的10ng/ml TGF β I和50ηΜ抗壞血酸_2_磷酸。4)本發(fā)明采用的三維培養(yǎng)基是大鼠膠原I型蛋白，是從大鼠尾巴中提取的膠原蛋白，它能夠提高細胞的活性和功能，促進天然II型膠原的生成。我們使用ArthiOKinetics (Esslingen, Germany)生產(chǎn)純度比較的產(chǎn)品，規(guī)格0.6mg/ml的0.1 %醋酸溶液。按照公司的產(chǎn)品說明書配制凝膠(I型膠原:DMEM=I: 1)，細胞接種密度2-9xl05/ml，接種好后的凝膠置于12孔板中培養(yǎng)。注:在選擇培養(yǎng)基的過程中，要注意取新鮮制備的去除端肽和蛋白多糖的膠原纖維，也可以通過浸泡或添加TGF或BMP家族的生長因子的方式修飾膠原纖維。5)軟骨組織的取樣于非負重區(qū)取，例如膝關(guān)節(jié)股骨髁間窩。為了得到純度高的軟骨細胞，在距離滑膜5mm遠的地方取軟骨。軟骨組織重IOOmg左右，大約米粒大小。這樣分離出來的軟骨細胞數(shù)量大約在2xl05/ml左右即可。6)軟骨細胞分離后，不需要進行平面細胞培養(yǎng)，直接將準備好的脂肪干細胞和軟骨細胞以2: I的比例混入凝膠進行共同培養(yǎng)。要確保細胞在凝膠中均勻的分布。7) 3D培養(yǎng)的血清采用患者自體血清。每3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后即可以應(yīng)用于移植。


:圖LA是人脂肪干細胞細胞第四天形態(tài)(xlOO) ;B是人脂肪干細胞細胞形態(tài)(xlOO)第一次傳代。圖2.hADSC細胞誘導(dǎo)成骨形成的軟骨組織。圖3.共培養(yǎng)促進11型膠原的生成:4周后，通過qPCR法來檢測11型膠原的mRNA表達，為了便于在不同樣本間進行比`較，我們采用mRNA對于GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的相對表達量，此圖表明共培養(yǎng)的條件下，II型膠原表達的更多。圖4.EdU檢測表明共培養(yǎng)促進細胞的增殖生長能力:在收集細胞前一天，培養(yǎng)基改成含有IOmM EdU的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，第二天，用PBS沖洗2次后再用含4% PFA的PBS溶液隔夜固定，用石蠟包埋，切IOmm的切片。用Edu-AleXa488染色，用Hoechst33342染細胞核，采用圖像分析軟件對Edu陽性的細胞進行計數(shù)，共同培養(yǎng)顯著提高了軟骨細胞的活性和增殖。圖5.共培養(yǎng)促進糖胺聚糖(Glycosaminoglycans)的產(chǎn)生:培養(yǎng)基質(zhì)的切片去石蠟化后用含1，9_氯化二甲基亞甲基藍(DMMB)的PBE溶液染色，然后用分光光度計測定GAG的含量，經(jīng)過矯正，同樣軟骨細胞數(shù)目在共同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的GAG比軟骨細胞單獨培養(yǎng)高出3-4倍，GAG的量化證明了基質(zhì)含量的增強。
具體實施方式
:為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖詳予說明。應(yīng)理解，這些實施僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的授權(quán)之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。所有用于細胞培養(yǎng)試劑均購自Gibco，Invitrogen公司，除非另有說明。常見的化學(xué)品購買自Sigma-Aldrich公司。一.脂肪干細胞的準備I)在軟骨取樣前10天左右，從患者大腿或腹部提取大約20ml脂肪，進行脂肪間質(zhì)血管部分細胞分離和培養(yǎng)傳代，直到需要和軟骨細胞混合培養(yǎng)時，收集干細胞，計數(shù)。2)脂肪間質(zhì)血管部分細胞(SVF)分離步驟:無菌條件下取脂肪組織，小心去除附著的纖維和血管，用滅菌的PBS充分洗脫以去除雜質(zhì)和血細胞[I]。I型膠原蛋白酶(lmg/mL)消化(放入37°C震顫水浴槽中60min),產(chǎn)物通過100 μ m的尼龍篩過濾去除雜質(zhì)，470Xg離心5min，去除漂浮的脂肪細胞及上清液，DMEM培養(yǎng)液(DMEM，Invitrogen ;含10%胎牛血清、0.2mM抗壞血酸，100μ g*ml-l青霉素和100μ g*ml-l鏈霉素)重懸細胞，470 Xg離心5min。去除上清液，重懸沉淀細胞，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育。24小時后，用顯微鏡觀察，沒貼壁的細胞用PBS洗去，培養(yǎng)液換成Keratinocyte-SFM(Invitrogen),含0.2mM抗壞血酸，0.09mM鈣，5ng/mLrEGF，and5%FBS)。細胞生長至75 % 90 %融合時傳代，每2 3d更換培養(yǎng)液。3)需要使用時，將分離收集干細胞用滅菌生理鹽水洗脫3次以上，去除FBS的影響。取一小部分進行細胞定量和質(zhì)量監(jiān)控的檢測，根據(jù)培養(yǎng)基的大小，保留4xl05/ml進行和軟骨細胞的共培養(yǎng)，多余的細胞進行凍存處理。二.軟骨細胞的準備I)在征得風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者同意后，活檢期間，通過關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，從非負重區(qū)取一塊所需量軟骨組織，例如膝關(guān)節(jié)股骨髁間窩。為了得到純度高的軟骨細胞，沒有其它類型細胞的污染，在距離滑膜5mm遠的地方取一小塊軟骨，重IOOmg左右，大約米粒大小。2)用精細剪刀將其剪成 Imm3的小塊，用PBS沖洗后將置于II型膠原酶(0.15% )中在37°C條件下消化20-22小時。用軟骨細胞增殖培養(yǎng)基配置膠原酶溶液。該培養(yǎng)基成分是 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM),添力口 10% FBS, I %非必需氨基酸,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸(AsAP) ,0.4mM脯氨酸，100U/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素.
3)將軟骨細胞收集起來，計數(shù)，根據(jù)培養(yǎng)基的大小，采用2xl05/ml的細胞進行和脂肪干細胞的共同培養(yǎng)。軟骨細胞分離后，不需要進行平面細胞培養(yǎng)，直接混合脂肪干細胞和凝膠共同培養(yǎng)。三.三維培養(yǎng)體系的制備，軟骨細胞和脂肪干細胞共培養(yǎng)I)我們使用Arthro Kinetics (Esslingen, Germany)生產(chǎn)純度比較高的產(chǎn)品，規(guī)格0.6mg/ml的0.1%醋酸溶液。在4°C，為液體狀，37°C為凝膠狀。按照公司的產(chǎn)品說明書配制凝膠(I型膠原:DMEM=I: 1)，細胞接種密度2-9xl05/ml。接種好后的凝膠置于12孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中補充促脂肪干細胞成軟骨轉(zhuǎn)化的成分10ng/ml TGF β I和50ηΜ抗壞血酸-2-磷酸。2)脂肪干細胞和軟骨細胞以2: I的比例混入凝膠進行共同培養(yǎng)。要確保細胞在凝膠中均勻的分布3) 3D培養(yǎng)時間是10-14天，血清采用患者自體血清。每3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后的可以應(yīng)用于移植。四.成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)方法I) 1.計算實驗所需顆粒(2.5 X 105ADSC的需要以形成每個軟骨細胞的顆粒)的總數(shù)目。將這個量的細胞轉(zhuǎn)移到一個適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)管中，以洗滌細胞。2)用不完全成骨培養(yǎng)基洗滌脂肪干細胞:室溫下離心細胞，150g離心5分鐘，吸棄上清，每7.5X105個細胞用Iml不完全成軟骨培養(yǎng)基重懸，150g離心5分鐘，吸棄上清。3)用完全成軟骨培養(yǎng)基重懸細胞，使得ADSC的濃度為每毫升5.0X 105個細胞。4)等分試樣，即將0.5毫升(2.5X105個細胞)的細胞懸浮到15mL的聚丙烯培養(yǎng)管中。室溫下離心，150g離心細胞5分鐘.此步驟禁止吸棄上清液和重懸。5)松開帽管一個半圈，讓氣體交換，并在37°C，5% C02飽和濕度條件下的孵化管。24小時內(nèi)不要攪動到沉淀。6)每2-3天更換培養(yǎng)基(在吸棄培養(yǎng)基的時候，1-200 μ L無菌移液管的管尖應(yīng)貼著上清液面，以避免吸走沉淀)。每管加入0.5mL新鮮完全成軟骨培養(yǎng)基。7)更換培養(yǎng)基后，滑動每個管的底部以確保沉淀是游離的，松開管帽并放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8)成軟骨細胞團在培養(yǎng)14-28天后可以收樣。用福爾馬林固定，石蠟包埋后阿爾辛藍染色 。
權(quán)利要求
1.一種用于軟骨損傷修復(fù)的軟骨移植物，其特在在于:脂肪干細胞和軟骨細胞在三維膠原系統(tǒng)中共同培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟骨移植物，其特征還在于:三維膠原系統(tǒng)包括脂肪干細胞，軟骨細胞，膠原纖維培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的軟骨移植物，其特征還在于:培養(yǎng)基中含人體自身血清。
4.根據(jù)權(quán)利I所述的軟骨移植物的制備方法，其特征在于:采用常規(guī)方法從人脂肪組織中分離脂肪干細胞，在和軟骨細胞共培養(yǎng)前，需要的干細胞數(shù)量為4xl05/ml左右；在準備共培養(yǎng)之前，收集脂肪干細胞，用無菌PBS洗三次；從軟骨組織中取樣分離軟骨細胞；采用大鼠膠原I型蛋白制備三維培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加有促脂肪干細胞成軟骨轉(zhuǎn)化的10ng/mlTGF β I和50ηΜ抗壞血酸_2_磷酸；將脂肪干細胞和軟骨細胞以2: I的比例混入膠原培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)；每3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后即可以應(yīng)用于移植。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的軟骨移植物的制備方法，其特征還在于:膠原纖維取自新鮮制備的去除端肽和蛋白多糖的膠原纖維，也可以通過浸泡或添加TGF或BMP家族的生長因子的方式修飾膠原纖維。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的軟骨移植物的制備方法，其特征還在于:軟骨組織取樣于非負重區(qū) 取。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于脂肪干細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)技術(shù)的軟骨移植物。該方法更有效，更安全，能在較短的時間內(nèi)得到足夠多的軟骨細胞用于移植，并且能高效的轉(zhuǎn)化為軟骨組織，提高了軟骨組織移植的治療效果。本發(fā)明利用了脂肪干細胞的營養(yǎng)功能，將它們與軟骨細胞于三維培養(yǎng)系統(tǒng)中共同培養(yǎng)，由于干細胞和軟骨細胞的相互作用，促進了軟骨細胞的增殖和活性，同時脂肪干細胞也會受環(huán)境影響部分分化為軟骨細胞，這樣即使在軟骨細胞取樣不足或活性不夠的情況下，也能得到高質(zhì)量的軟骨移植物，同時促進了移植物的存活，對淺層的軟骨缺損也可以達到很好的效果。
文檔編號A61L27/38GK103223194SQ20131001593
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者付擎昊, 康賢通, 章戴榮 申請人:廣州萊德爾生物科技有限公司