專利名稱：從地皮菜中提取抗腸癌活性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的提取，具體屬于從地皮菜中提取抗腸癌活性蛋白的方法。
背景技術(shù)：
地皮菜，又名地耳、地衣、地木耳、地軟兒、地瓜皮等，是真菌和藻類的結(jié)合體。在山西有很高的產(chǎn)量。一般生長在多雨潮濕的地方，暗黑色，有點(diǎn)像泡軟的黑木耳。地皮菜富含蛋白質(zhì)、多種維生素和磷、鋅、鈣等礦物質(zhì)。以色列魏茨曼研究所的科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，地皮菜所含的一種成分可以抑制人大腦中的乙酰膽堿酯酶的活性，從而能對老年癡呆癥產(chǎn)生療效。地皮菜還具有很好的營養(yǎng)保健價(jià)值1.降脂明目，是一種很好的低脂肪營養(yǎng)保健菜， 能降脂減肥，對目赤、夜盲、脫肛等病癥有一定療效。2.補(bǔ)充營養(yǎng)，地耳含有豐富的蛋白質(zhì)、 鈣、磷、鐵等，可為人體提供多種營養(yǎng)成分，具有補(bǔ)虛益氣，滋養(yǎng)肝腎的作用。3.清熱解毒， 內(nèi)服外用，可輔助治療燒傷、燙傷及瘡瘍腫毒。
經(jīng)對現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索，未見關(guān)于地皮菜抗腫瘤活性蛋白的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性的蛋白以及提取方法，該方法簡單易行、成本低。
本發(fā)明提供的一種從地皮菜中提取的具有抗腸癌活性的蛋白，是地皮菜經(jīng)PBS緩沖液提取，硫酸銨分離沉淀，Q-陰離子柱純化，得到的分子量為35-40kDa的活性蛋白。
本發(fā)明提供的一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性蛋白的方法，包括如下步驟
第一步將地皮菜粉碎后，加入PBS緩沖液，4°C下攪拌、浸泡12-16小時(shí)，離心后取上清液，即為地皮菜蛋白粗提液；
第二步將_20°C預(yù)冷的丙酮加入地皮菜蛋白粗提液，沉淀蛋白，離心，收集沉淀，-20°C下放置30-60min完全揮發(fā)丙酮，冷凍干燥，即得到地皮菜粗蛋白；
第三步將地皮菜粗蛋白用PBS緩沖液溶解，離心后取上清液，加入10%和60%飽和度的兩種硫酸銨粉末，充分?jǐn)嚢韬箪o置，分級沉淀蛋白，離心；收集10%至60%硫酸銨粉末飽和度區(qū)段的沉淀，用PBS緩沖液溶解、透析、濃縮即得到地皮菜抗腸癌活性蛋白的粗提液；
第四步將地皮菜抗腸癌活性蛋白的粗提液，過Q-陰離子柱，收集穿透液即得到具有抗腸癌活性的蛋白。SDS-PAGE電泳檢測表明，該穿透液經(jīng)過Q柱純化后所得樣品有一條明顯主帶。
所述的PBS 緩沖液，其含 O. 80%NaCl、0. 2gKCl、3. 63gNa2HP04 · 12H20、 O.24gKH2P04, ρΗ7· 4。
所述的第一步中，加入地皮菜粉末3-6倍體積的PBS緩沖液。
所述的第三步中，透析用的透析袋的規(guī)格為MD34，截留分子量為3000。
所述的第三步中，濃縮用的濃縮管的體積為50ml，截留分子量為3000。
本發(fā)明獲得的一種活性蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)，通過與標(biāo)準(zhǔn)分子量比對，地皮菜抗腸癌活性蛋白的分子量為35-40kDa。
該活性蛋白經(jīng)體外抗腫瘤活性檢測，該蛋白具有良好的抗大腸癌細(xì)胞的活性，對大腸癌細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，而對正常細(xì)胞沒有明顯毒副作用。
本發(fā)明提供的從地皮菜中提取具有抗腸癌活性的蛋白的方法，簡單易行、成本低。 在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可將該地皮菜活性蛋白制備成抗癌藥物或保健品，服務(wù)于人類健康。


圖1實(shí)施例1經(jīng)Q陰離子柱純化后所得的地皮菜抗腸癌活性蛋白SDS-PAGE電泳圖
圖2地皮菜活性蛋白對DLDl、SW620、HL-7702細(xì)胞生長的影響具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 :
地皮菜抗腸癌活性蛋白的制備方法，步驟如下
(I)將天然地皮菜烘干，用粉碎機(jī)粉碎成粉末。
(2)取25g地皮菜粉末，加入400ml的PBS緩沖液，置于攪拌器上攪拌，4°C過夜浸泡12小時(shí)，IlOOOrpm離心25min，取上清液，濾渣再次加入150ml的PBS緩沖液，同上操作， 合并兩次提取液即為地皮菜蛋白粗提液。
(3)將(2)中獲得的地皮菜蛋白粗提液中緩慢加入2倍體積_20°C下預(yù)冷的丙酮， 緩慢攪拌，然后將其置于_20°C下沉淀I小時(shí)，IIOOOrpm離心30min，棄上清，收集沉淀，將沉淀置于_20°C下30min，完全揮發(fā)丙酮，將沉淀冷凍干燥，即得地皮菜粗蛋白48mg。
(4)將(3)得到的地皮菜粗蛋白用pH7. 4的PBS緩沖液溶解，離心后取上清液， 向溶液中逐漸緩慢加入硫酸銨粉末，當(dāng)飽和度達(dá)到10%后，4°C放置30min，IlOOOrpm離心 30min,棄沉淀，收集上清。將上清液中再緩慢加入硫酸銨固體,達(dá)到60%的飽和度后，室溫放置30min，IlOOOrpm,離心30min，收集沉淀。將沉淀用PBS緩沖液溶解、透析、濃縮即得地皮菜抗腸癌活性粗蛋白。
(5)將含地皮菜抗腸癌蛋白的粗提液，用Q陰離子柱交換層析，依次用含有0、0.1、O.2、0. 3 和 O. 5mol/LNaCl 的 pH8. 0、20mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液洗脫，紫外檢測儀于 280nm 波長處檢測，收集穿透液，獲得地皮菜抗腸癌活性蛋白。該活性蛋白SDS-PAGE電泳圖(見圖1)。
實(shí)施例2
將處于對數(shù)生長期的DLDl、SW620、HL-7702細(xì)胞，以I X IO4個(gè)/孔傳入96孔培養(yǎng)板。37。C含5%的CO2培養(yǎng)箱孵育24h后，分別加入濃度為O. 08,0. 16,0. 24,0. 32mg/ml 的地皮菜活性蛋白，設(shè)五個(gè)復(fù)孔，并用PBS緩沖液作為對照。孵育48h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基， 用PBS洗滌2次后加入新的培養(yǎng)基，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 201，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入1501 DMS0，搖床振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。 于570nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。
本發(fā)明所得地皮菜活性蛋白，對人大腸癌細(xì)胞株進(jìn)行上述體外抗腫瘤活性檢測，當(dāng)?shù)鞍缀繛?、16、24、32 μ g時(shí)，處理DLDU SW620、HL-7702細(xì)胞各48h ;當(dāng)含量為24 μ g 時(shí)，對DLDl細(xì)胞生長的抑制率最大為 40% ;當(dāng)含量為32 μ g時(shí)，對SW620細(xì)胞生長抑制率最大為32% ;而對人正常肝細(xì)胞HL-7702生長基本無影響(見圖2)。
權(quán)利要求
1.一種從地皮菜中提取的具有抗腸癌活性的蛋白，特征在于，它是地皮菜經(jīng)PBS緩沖液提取，硫酸銨分離沉淀，Q-陰離子柱純化，得到的分子量為35-40kDa的活性蛋白。
2.一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟 第一步將地皮菜粉碎后，加入PBS緩沖液，4°C下攪拌、浸泡12-16小時(shí)，離心后取上清液，即為地皮菜蛋白粗提液；第二步將-20°C預(yù)冷的丙酮加入地皮菜蛋白粗提液，沉淀蛋白，離心，收集沉淀，-20°C下放置30-60min完全揮發(fā)丙酮，冷凍干燥，即得到地皮菜粗蛋白；第三步將地皮菜粗蛋白用PBS緩沖液溶解，離心后取上清液，加入10%和60%飽和度的兩種硫酸銨粉末，充分?jǐn)嚢韬箪o置，分級沉淀蛋白，離心；收集10%至60%硫酸銨粉末飽和度區(qū)段的沉淀，用PBS緩沖液溶解、透析、濃縮即得到地皮菜抗腸癌活性蛋白的粗提液； 第四步將地皮菜抗腸癌活性蛋白的粗提液，過Q-陰離子柱，收集穿透液即得到具有抗腸癌活性的蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述的 PBS 緩沖液，含 O. 80%NaCl、0. 2gKCl、3. 63gNa2HP04 ·12Η20、0. 24gKH2P04, ρΗ7. 4。
4.如權(quán)利要求2所述的一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述第一步中PBS緩沖液的加入量為地皮菜粉末體積的3-6倍。
5.如權(quán)利要求2所述的一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述第三步中透析用的透析袋規(guī)格為MD34，截留分子量為3000。
6.如權(quán)利要求2所述的一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性蛋白的方法，其特征在于，所述第三步中濃縮用的濃縮管的體積為50ml，截留分子量為3000。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從地皮菜中提取具有抗腸癌活性的蛋白及其提取方法，是將純天然地皮菜粉碎，加入PBS緩沖液低溫過夜提取，隨后加入預(yù)冷的丙酮低溫處理，得到地皮菜粗蛋白提取液。在粗蛋白提取液中加入不同飽和度的硫酸銨粉末，分級沉淀蛋白，其中飽和度為10%-60%的硫酸銨沉淀中含地皮菜抗腸癌活性蛋白；再將該粗蛋白進(jìn)行Q陰離子柱純化，穿透液中含有效活性蛋白。用該蛋白處理大腸癌細(xì)胞48小時(shí)，IC50值約為35μg，而對正常細(xì)胞生長無明顯毒副作用，該蛋白可有效抑制大腸癌細(xì)胞增殖。
文檔編號A61P35/00GK103059112SQ20131002351
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者李卓玉, 晉小婷, 宋莉, 趙君宇, 李砧, 李文玲, 郭松佳 申請人:山西大學(xué)