專利名稱：雌激素的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體為雌激素在制備治療脂肪肝藥物、調(diào)節(jié)SHP基因的藥物方面的應(yīng)用，以及SHP基因在制備治療脂肪肝藥物方面的應(yīng)用
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已經(jīng)成為一個越來越嚴(yán)重的健康問題，其在發(fā)達(dá)國家的患病率已接近30%，成為慢性肝病的首要原因。機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡紊亂時，過多的甘油三酯會以脂滴的形式積聚在肝細(xì)胞，從而引起肝細(xì)胞脂肪樣變，和NAFLD的形成。研究表明NAFLD與肥胖與胰島素抵抗等密切相關(guān)，然而其發(fā)生機(jī)制尚未明確，預(yù)防和治療手段則更是有限。肝臟的糖脂代謝紊亂，特別是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，與代謝綜合征的發(fā)生密切相關(guān)，并常伴隨著胰島素抵抗，肥胖，高脂血癥等。NAFLD帶來的代謝紊亂，使得NAFLD成為2型糖尿病以及慢性心血管疾病的重要危險因素。肝臟作為胰島素的靶器官之一，在機(jī)體糖脂代謝過程中發(fā)揮重要的作用。在空腹?fàn)顟B(tài)下，肝臟通過糖異生作用產(chǎn)生葡萄糖，升高血糖；而在餐后等機(jī)體血糖濃度高的狀態(tài)下時，胰島素通過抑制肝糖異生，促進(jìn)糖原合成，降低血糖濃度。當(dāng)機(jī)體糖脂代謝調(diào)節(jié)紊亂時，如胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，不適當(dāng)?shù)母闻K糖異生作用成為2型糖尿病高血糖的重要原因。此外，肝細(xì)胞可以攝取血液中的游離脂肪酸，合成甘油三酯，以VLDL的形式釋放入血，為其他組織提供能量。機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡紊亂時，過多的甘油三酯積聚在肝細(xì)胞，引起肝細(xì)胞脂肪變性，形成NAFLD，進(jìn)一步加重糖脂代謝紊亂。長期的脂肪積累引起肝臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝細(xì)胞進(jìn)一步死亡，星狀細(xì)胞激活，肝纖維化，最終可進(jìn)展為肝硬化，肝癌。`NALFD與胰島素抵抗和T2DM、中心性肥胖、高脂血癥、高血壓以及其他與胰島素抵抗相關(guān)的其他病理狀態(tài)(如PC0S)相關(guān)。所以，NAFLD目前被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。長期以來，人們對肝臟的糖脂代謝的研究主要集中在胰島素抵抗。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，雌激素在肝臟糖脂代謝中也具有至關(guān)重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供將雌激素應(yīng)用于制備治療脂肪肝和改善胰島素抵抗的藥物。本發(fā)明旨在提供將雌激素用于制備調(diào)控SHP基因的藥物。本發(fā)明還將SHP基因用于制備和篩選治療脂肪肝的藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案是，雌激素在肝臟糖脂代謝過程中的作用具有重要作用，對肝臟有保護(hù)作用。因此可用作制備治療脂肪肝，尤其為非酒精性脂肪肝的藥物。雌激素通過調(diào)肝臟SHP (小二聚體伴侶)基因的表達(dá)，抑制SREBPlc，從而抑制肝臟甘油三酯與脂肪酸的合成，發(fā)揮改善脂肪肝的作用。FXR (法尼醇X受體，是一種膽汁酸受體)基因下游的SHP基因在肝臟膽汁酸與甘油三酯的代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。膽汁酸通過激活膽汁酸受體FXR，引起下游SHP的表達(dá)水平增高，SHP通過LXR抑制SREBPlc的表達(dá)，引起其下游FASN，S⑶-1等甘油三酯合成基因的表達(dá)降低，從而降低肝臟甘油三酯的合成。雌激素所調(diào)控的受體為SHP基因。雌激素作為一種重要的內(nèi)分泌激素廣泛作用于全身的靶器官，參與調(diào)控眾多生理功能。雌激素不僅在性腺發(fā)育及生殖系統(tǒng)功能方面至關(guān)重要，其在糖脂代謝的調(diào)節(jié)方面也有著不可忽視的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，一些代謝性疾病的發(fā)生和臨床表現(xiàn)具有性別差異，例如，代謝綜合征，心血管疾病，脂肪肝等。男性和絕經(jīng)期后的女性更容易發(fā)生這類代謝性疾病。由于雌激素對這些代謝性疾病的保護(hù)作用，使得男性和女性在能量的儲存和代謝方面存在差異。因此，雌激素在能量代謝方面的作用也越來越受到關(guān)注。肝臟的糖脂代謝紊亂，特別是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，與代謝綜合征的發(fā)生密切相關(guān)，并常伴隨著胰島素抵抗，肥胖，高脂血癥等。NAFLD帶來的代謝紊亂，使得NAFLD成為2型糖尿病以及慢性心血管疾病的重要危險因素。NAFLD是肝臟胰島素抵抗最典型的改變。本發(fā)明以NAFLD為切入點(diǎn)，根據(jù)雌激素對肝臟糖脂代謝的作用機(jī)制，通過人群研究發(fā)現(xiàn)女性NAFLD的發(fā)病率在絕經(jīng)期后顯著升高。給予雌激素抑制劑他莫西芬，可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出脂肪肝。而卵巢切除，增加了小鼠肝臟的脂質(zhì)沉積。給予高脂喂養(yǎng)的小鼠雌激素處理，可顯著改善其肝臟甘油三酯沉積?；虮磉_(dá)分析提示，SHP可能為雌激素在肝臟的作用靶點(diǎn)。SHP作為FXR的主要下游基 因，在肝臟膽汁酸與甘油三酯的代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。膽汁酸通過激活膽汁酸受體FXR，引起下游SHP的表達(dá)水平增高，SHP通過LXR抑制SREBPlc的表達(dá)，引起其下游FASN，S⑶-1等甘油三酯合成基因的表達(dá)降低，從而降低肝臟甘油三酯的合成。在FXR敲除型小鼠的血清中，游離脂肪酸和甘油三酯含量增加，肝臟中甘油三酯含量也顯著增加。基因表達(dá)分析證實(shí)肝臟SHP顯著下調(diào)，脂質(zhì)生成的關(guān)鍵基因如SREBP-lc、FASN,SCD-1等顯著上調(diào)。此外，胰島素耐受試驗也提示FXR敲除型小鼠的胰島素敏感性下降。這些結(jié)果表明FXR在維持肝臟糖脂代謝中具有重要意義。利用FXR敲除型小鼠，驗證了雌激素與SHP的調(diào)控關(guān)系。首先，鑒于雌激素調(diào)控糖脂代謝的重要作用，我們比較了不同性別的FXR敲除小鼠的代謝表型。結(jié)果顯示，F(xiàn)XR敲除的雄性小鼠出現(xiàn)明顯的糖脂代謝紊亂。與野生型相比，敲除型小鼠胰島素敏感性下降，糖耐量受損，肝臟及血清甘油三酯水平升高；而雌性的敲除型小鼠與野生型小鼠相比，沒有明顯的代謝表型改變?；虮磉_(dá)研究發(fā)現(xiàn)，雄性敲除型小鼠FXR的下游基因SHP有明顯下調(diào)，SHP的下游SREBPlc以及S⑶-1均有明顯上調(diào)；而雌性敲除型小鼠的SHP、SREBPlc、S⑶-1與野生型相比，均無明顯改變。將野生型和敲除型的雌性小鼠均行卵巢切除術(shù)。術(shù)后敲除型小鼠與野生型小鼠比，出現(xiàn)了代謝惡化的表型，胰島素敏感性下降，糖耐量受損，敲除型小鼠肝臟的SHP, SREBPlc，F(xiàn)ASN均出現(xiàn)相應(yīng)改變。而給予兩組小鼠均補(bǔ)充雌激素后，敲除型小鼠的代謝紊亂得以改善，兩組小鼠代謝表型的差異消失。以上的研究結(jié)果提示，在雌性小鼠中，雌激素可誘導(dǎo)肝臟SHP的表達(dá)，從而代償FXR敲除引起的代謝紊亂。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 SHP為雌激素在肝臟糖脂代謝中的特異性作用靶點(diǎn)，為篩選治療脂肪肝藥物提供了靶點(diǎn)；并且確定了雌激素對SHP的調(diào)控作用及與NAFLD的相關(guān)關(guān)系，證明雌激素在肝臟可通過上調(diào)SHP的表達(dá)，從而抑制肝臟甘油三酯合成，改善脂肪肝和胰島素抵抗，為探索脂肪肝的預(yù)防和治療靶點(diǎn)提供了可靠的依據(jù)和線索，也將從內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的角度，為糖脂代謝性疾病的預(yù)防和治療開辟一條新的道路。


圖1為實(shí)施例2中雌激素拮抗劑他莫西芬誘導(dǎo)的肝臟甘油三酯積聚。圖2為實(shí)施例2中雌激素缺乏引起肝臟甘油三酯積聚。兩組小鼠分別進(jìn)行卵巢切除(OVX)及假手術(shù)(SHAM)處理，檢測血清及肝臟甘油三酯水平。圖3為實(shí)施例3中卵巢切除(OVX)小鼠與假手術(shù)組(SHAM)肝臟基因表達(dá)分析。通過Real time-PCR檢測肝臟參與甘油三酯代謝重要基因的mRNA表達(dá)水平。包括轉(zhuǎn)錄因子SHP、SREBPlc、甘油三酯及脂肪酸合成的關(guān)鍵基因S⑶1、FASN、ACCl以及參與脂肪酸β氧化的關(guān)鍵基因MCAD和ACOXl。圖4為實(shí)施例3中雌激素對高脂(HFD)誘導(dǎo)的肥胖小鼠糖脂代謝的改善作用。給予高脂喂養(yǎng)的雄性C57小鼠雌激素(50ug/kg/d)處理兩周，觀察表型肝臟(A)和血清(B)甘油三酯含量測定，IPGTT (C)和ITT試驗(D)。圖5為實(shí)施例4中雌激素對SHP表達(dá)調(diào)控作用。FXR野生型和敲除型小鼠的肝臟原代細(xì)胞，給予IOOnM的雌激素或?qū)φ仗幚?，通過Real time-PCR,檢測SHP的mRNA表達(dá)水平(A)。HEPG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染SHP啟動子報告基因質(zhì)粒，以及空載(pcmv)或人ERa表達(dá)質(zhì)粒(ER a )，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞給予IOnM雌激素及對照處理16小時(B)，或IuM ICI182780 (ICI)，IuM ICI182780加IOnM E2(E2+ICI)處理16h(C)進(jìn)行報告基因檢測。HEPG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型SHP啟動子報告基因質(zhì)粒(WT-ERE)，或SHP啟動子區(qū)4個ERE位點(diǎn)突變的報告基因質(zhì)粒(Mut-ERE)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞給予IOnM雌激素及對照處理16小時，進(jìn)行報告基因檢測(D)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1為研究雌激素在肝臟糖脂代謝，尤其是在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用，我們對人群中女性的NAFLD發(fā)生率進(jìn)行了分析，結(jié)果如表I。共收入研究對象808例，分為絕經(jīng)期前組和絕經(jīng)期后組，以B超作為NAFLD的診斷方法。絕經(jīng)前女性與絕經(jīng)后女性分別為280人和528人，平均年齡分別為45. 3±4.1歲和56. 8±4. 7歲。分析其數(shù)據(jù)可以看出，后者的BMI和腰臀比都顯著高于前者，提示絕經(jīng)后女性代謝紊亂的狀況較絕經(jīng)前女性嚴(yán)重。NAFLD的發(fā)生率在兩組也有顯著差異，起在絕經(jīng)期前組的患病率為42. 9%，而在絕經(jīng)期后組則高達(dá)60. 2%,顯著高于前者(p〈0. 001)。這一現(xiàn)象提示，雌激素在NAFLD的發(fā)生中具有重要的作用。表1.女性絕經(jīng)期前后NAFLD患病率及其他基線資料比較
權(quán)利要求
1.雌激素在制備治療脂肪肝藥物方面的應(yīng)用。
2.雌激素在制備治療非酒精性脂肪肝藥物方面的應(yīng)用。
3.雌激素在制備調(diào)節(jié)SHP基因的藥物方面的應(yīng)用。
4.雌激素在制備改善胰島素抵抗的藥物方面的應(yīng)用。
5.SHP基因在制備治療脂肪肝藥物方面的應(yīng)用。
6.SHP基因在制備和篩選治療非酒精性脂肪肝藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域。雌激素在肝臟糖脂代謝過程中的作用具有重要作用，對肝臟有保護(hù)作用，可用作制備治療脂肪肝，尤其為非酒精性脂肪肝的藥物。雌激素所調(diào)控的受體為SHP基因，通過調(diào)肝臟SHP基因的表達(dá)，從而抑制肝臟甘油三酯與脂肪酸的合成，發(fā)揮改善脂肪肝的作用。本發(fā)明為篩選治療脂肪肝藥物提供了特異性靶點(diǎn)；并且確定了雌激素對SHP的調(diào)控作用及與NAFLD的相關(guān)關(guān)系為探索脂肪肝的預(yù)防和治療靶點(diǎn)提供了可靠的依據(jù)和線索，也將從內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的角度，為糖脂代謝性疾病的預(yù)防和治療開辟一條新的道路。
文檔編號A61K45/00GK103055314SQ20131002374
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者寧光, 王曉琳, 李小英, 王計秋, 陸炎 申請人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所