專利名稱：一種負(fù)載小干擾rna的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超聲分子影像學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種負(fù)載小干擾RNA (siRNA)的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
超聲造影作為超聲成像技術(shù)中的第三次革命，為多種疾病特別是腫瘤性疾病的診斷及鑒別診斷提供了有效的依據(jù)。隨著超聲成像技術(shù)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)微泡一方面在超聲造影中能夠作為顯影劑，另一方面能夠作為超聲空化效應(yīng)的空化核，降低空化效應(yīng)的閾值，促進(jìn)基因片段的靶向遞送。大量研究證明，以微氣泡作為空化核心，在低頻率高能量超聲輻照下，能夠產(chǎn)生空化效應(yīng)，在此過程中釋放出巨大的能量、高溫、高壓和噴射流。在空化效應(yīng)的作用下，微泡周圍的細(xì)胞膜被瞬間打開，產(chǎn)生半衰期為20至50毫秒的裂孔，然后迅速閉合，這種效應(yīng)被稱為“聲孔效應(yīng)”。通過被打開聲孔的細(xì)胞膜，細(xì)胞周圍的基因片段在空化效應(yīng)的作用下被動(dòng)地遞送到胞漿中，實(shí)現(xiàn)基因的細(xì)胞遞送。這種通過空化效應(yīng)和聲孔效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的靶向基因遞送體系稱為超聲靶向微泡破壞(UTMD)技術(shù)。目前，應(yīng)用于UTMD技術(shù)進(jìn)行基因遞送的微泡主要是商品化的微泡造影劑，如聲諾維等。但是，商品化的微泡具有作為基因遞送載體(特別是腫瘤靶向基因遞送載體)存在著明顯的不足:①直徑過大，因目前市面上的超聲造影劑都是微米級(jí)別的，只能局限于血管系統(tǒng)內(nèi)，無法通過腫瘤血管內(nèi)皮間隙到達(dá)腫瘤細(xì)胞周圍不能負(fù)載基因片段，由于市面上的微泡均為表面帶負(fù)電的微泡，而基因片段(質(zhì)粒DNA，siRNA等)表面均帶有負(fù)電，二者無法有效結(jié)合。因此，目前商品化的微泡超聲造影劑不能稱為嚴(yán)格意義上的基因載體。為了高效遞送基因片段及實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向基因傳輸，有必要制備一種新型的超聲造影劑作為基因載體，并同時(shí)解決一下技術(shù)難題。①粒徑小，處于納米級(jí)，能夠通過腫瘤增寬的血管內(nèi)皮間隙(380 780 nm)實(shí)現(xiàn)造影劑的腫瘤被動(dòng)祀向聚集；②能夠高效負(fù)載基因片段，使其負(fù)載在微泡造影劑內(nèi)，實(shí)現(xiàn)造影劑與基因片段的同步遞送；③具有良好的增強(qiáng)超聲顯影能力，在診斷超聲條件下實(shí)現(xiàn)超聲造影的應(yīng)用；④具有超聲敏感性，在低頻高能量超聲輻照的條件下激發(fā)微泡的空化效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)基因片段的靶向釋放。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前現(xiàn)有的超聲造影劑作為siRNA載體存在的不足，提供一種能夠負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑(下文簡(jiǎn)稱siRNA納米微泡)。本發(fā)明的另一目的在于提供上述微泡造影劑的制備方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑，所述造影劑能夠高效負(fù)載siRNA,siRNA被負(fù)載在整個(gè)微泡結(jié)構(gòu)的表面， 與納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑形成整體；所述負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡的直徑為200 500 nm。
如上所述造影劑是通過正負(fù)電荷吸引力，將表面帶正電的siRNA納米膠束負(fù)載在表面帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑表面，形成一個(gè)整體結(jié)構(gòu)。一種如上所述負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑的制備方法，具體包括如下步驟:
51.以磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸為膜材，通過薄膜-水化法制備得到帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑；
52.將聚乙二醇(Polyethyeneglycol,可簡(jiǎn)寫為PEG)與聚賴氨酸(Polylysine,可簡(jiǎn)寫為PLL)組成兩嵌段陽離子共聚物與siRNA以氮磷比(共聚物的含氮基團(tuán)與siRNA的含磷基團(tuán)的摩爾比)的比值為21:1時(shí)進(jìn)行自主裝，得到帶正電的siRNA納米膠束；
53.在SI得到的帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡中加入過量S2中帶正電的siRNA納米膠束，孵育制備得到負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑。具體地，步驟SI中所述薄膜-水化法制備得到帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑的步驟如下:
511.將磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)溶解于氯仿中并置于培養(yǎng)皿中，
512.在通風(fēng)櫥中待氯仿自然揮發(fā)形成磷脂薄膜，加入雙蒸水37飛(TC水化0.5^2小時(shí)后，將脂質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，利用超聲破碎儀進(jìn)行聲振廣10分鐘，同時(shí)通入八氟丙烷氣體制備脂質(zhì)微泡；
513.將微泡液靜置10 30分鐘，然后以1000 2000rpm離心1 10分鐘，吸取下層乳白色液體即為所制備的表面帶負(fù)電的納米微泡。優(yōu)選地，步驟SI中所述二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸的重量份數(shù)比為18:1:1飛。更為優(yōu)選地，步驟SI中所述二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸的重量份數(shù)比為18:1:1。優(yōu)選地，為除去沒有結(jié)合到微泡表面的siRNA膠束，步驟S3中所述孵裕后可利用高速離心法純化產(chǎn)物，即用2000 rpm離心30分鐘，棄去下層清液，加入4毫升雙蒸水重懸，反復(fù)洗滌三遍，最后用I毫升磷酸鹽緩沖液(PH= 7.4)重懸得終產(chǎn)物。進(jìn)一步地，SI中所述帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡內(nèi)含八氟丙烷氣體。優(yōu)選地,步驟S2中所述聚乙二醇(Polyethyeneglycol,可簡(jiǎn)寫為PEG)與聚賴氨酸(Polylysine，可簡(jiǎn)寫為PLL)組成兩嵌段陽離子共聚物(可簡(jiǎn)寫成PEG-PLL)，其中聚乙二醇的分子量為50(Γ3500 ;步驟S2中所述聚賴氨酸的平均分子量為600(Γ10000，具體合成方法如下:S21.大分子引發(fā)劑α-甲基-ω-氨基的聚(乙二醇)(HiPEG-NH2)是參考文獻(xiàn)方法由甲氧基聚乙二醇(mPEG-OH)制備[Neal JC, Stolnik S，Schacht E, Kenawy ER, GarnettMC, Davis SS, IIIum L.Pharm Sci 1998; 87: 1242-1248] ;S22.芐氧羰基保護(hù)賴氨酸酸Hf (Benzyloxycarbonyl-L-Lysine N-carboxylic anhydride, CBLLys- NCA)是按照文獻(xiàn)方法(Daly HW, Poche D.Tetrahedron Lett 1988, 29: 5859-5862; Zhang XQ, Li JG,Li ff, Zhang AF.Biomacromolecules 2007, 8: 3557-3567)由賴氛酸鹽酸鹽(L-Lysine
HC1，中國國藥化學(xué)試劑有限公司)合成；S23.聚(乙二醇)-b-聚(芐氧羰基-賴氨酸)(mPEG-b-PCBLLys)嵌段共聚物是以α -甲基-ω -氨基的聚(乙二醇)mPEG_NH2作為大分子引發(fā)劑，通過引發(fā)芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸酸酐的開環(huán)聚合反應(yīng)合成；具體步驟為，在氬氣保護(hù)下，向加有磁力攪拌子的干燥的反應(yīng)瓶中，加入α -甲基-ω-氨基的聚(乙二醇)0.5^2克和芐氧羰基保護(hù)賴氨酸酸酐6 10克，用無水二甲基甲酰胺溶解后，放在33 37 °C油浴反應(yīng)2 4天；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系用乙醚沉淀，過濾，洗滌，室溫下在真空干燥，得到的白色粉末；
S24.雙嵌段共聚物聚(乙二醇)-b-聚(L-賴氨酸)(mPEG-b-PLLys)的制備:將S23中共聚物聚(乙二醇)-b-聚(芐氧羰基-賴氨酸)溶解在三氟乙酸中，冰浴條件下，加入溴化氫的冰醋酸溶液；室溫下攪拌后，用過量乙醚洗滌反應(yīng)體系洗滌；在蒸干溶劑后，室溫下在真空干燥，得到灰色的終產(chǎn)物粉末。本發(fā)明的有益效果是:
通過本方法制備得到的負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑的粒徑小，處于納米級(jí)，能夠通過腫瘤增寬的血管內(nèi)皮間隙(380 780 nm)實(shí)現(xiàn)造影劑的腫瘤被動(dòng)靶向聚集。通過本方法制備得到的負(fù)載siRNA納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑能夠高效負(fù)載siRNA，使其負(fù)載在微泡造影劑內(nèi)，實(shí)現(xiàn)造影劑與siRNA的同步遞送。在體內(nèi)輸送siRNA的同時(shí)，通過超聲造影的方法能夠?qū)崿F(xiàn)siRNA的分布監(jiān)測(cè)。所述負(fù)載siRNA納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑具有良好的增強(qiáng)超聲顯影能力，在診斷超聲條件下實(shí)現(xiàn)超聲造影的應(yīng)用；具有超聲敏感性，在低頻高能量超聲輻照的條件下激發(fā)微泡的空化效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)siRNA的靶向釋放。能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤體內(nèi)顯像和治療的一體化。


圖1.對(duì)siRNA納米微泡做透射電子顯微鏡檢測(cè)的結(jié)果。圖2.對(duì)siRNA納米微泡進(jìn)行超聲顯影能力檢測(cè)和超聲輻照敏感性的檢測(cè)；A和C分別表示siRNA納米微泡與納米微泡在超聲造影模式下的顯影效能；B和D分別表示siRNA納米微泡與納米微泡經(jīng)低頻超聲輻照后在超聲造影模式下的顯影效果。圖3.siRNA納米微泡在低頻超聲輻照下細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染效能檢測(cè)；超聲(+ )為熒光物質(zhì)Cy3標(biāo)記siRNA的siRNA納米微泡；超聲(一)為Cy3標(biāo)記的siRNA但未經(jīng)超聲輻照；對(duì)照為只加入Cy3標(biāo)記的siRNA但未經(jīng)超聲輻照處理。圖4.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)siRNA的細(xì)胞內(nèi)分布結(jié)果；超聲(+ )為熒光物質(zhì)Cy3標(biāo)記siRNA的siRNA納米微泡；超聲(一)為Cy3標(biāo)記的siRNA但未經(jīng)超聲輻照；對(duì)照為只加入siRNA但未經(jīng)超聲輻照處理。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。為了敘述方便，負(fù)載siRNA納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑簡(jiǎn)稱為siRNA納米微泡；帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑簡(jiǎn)稱為納米微泡；帶正電的siRNA納米膠束簡(jiǎn)稱siRNA膠束。實(shí)施例1
S1.表面帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑(下文簡(jiǎn)稱納米微泡)制備:利用薄膜-水化法以磷脂為原料制備納米微泡。將磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)按重量份數(shù)18:1:1溶解于氯仿中并置于直徑9厘米的培養(yǎng)皿，在通風(fēng)櫥中待氯仿自然揮發(fā)形成磷脂薄膜。加入4毫升雙蒸水37 °C水化I小時(shí)后，將脂質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到50毫升離心管中，利用超聲破碎儀進(jìn)行聲振5分鐘，同時(shí)通入八氟丙烷氣體制備脂質(zhì)微泡。將微泡液靜置10分鐘，然后以1000 rpm離心5分鐘，吸取下層乳白色液體即為所制備的表面帶負(fù)電的納米微泡。S2.表面帶正電的siRNA納米膠束的制備:
利用聚乙二醇(Polyethyeneglycol,可簡(jiǎn)寫為PEG)與聚賴氨酸(Polylysine,可簡(jiǎn)寫為PLL)組成兩嵌段陽離子共聚物(可簡(jiǎn)寫成PEG-PLL)，其中PEG和PLL的平均分子量為2000及8000。將PEG-PLL與siRNA以氮磷比(共聚物的含氮基團(tuán)與siRNA的含磷基團(tuán)的摩爾比)比值為5:1進(jìn)行配比，二者在室外下孵育20分鐘，即可制備成帶正電和的siRNA納米膠束。聚乙二醇(Polyethyeneglycol,可簡(jiǎn)寫為PEG)與聚賴氨酸(Polylysine,可簡(jiǎn)寫為PLL)組成兩嵌段陽離子共聚物的制備方法如下:
S21.大分子引發(fā)劑α-甲基-ω-氨基的聚(乙二醇)(HiPEG-NH2)是參考文獻(xiàn)方法由甲氧基聚乙二醇(mPEG-OH)制備。[Neal JC, Stolnik S，Schacht E, Kenawy ER, GarnettMC, Davis SS, IIIum L.Pharm Sci 1998; 87: 1242-1248] ;S22.芐氧羰基保護(hù)賴氨酸酸Hf (Benzyloxycarbonyl-L-Lysine N-carboxylic anhydride, CBLLys- NCA)是按照文獻(xiàn)方法(Daly HW, Poche D.Tetrahedron Lett 1988, 29: 5859-5862; Zhang XQ, Li JG,Li ff, Zhang AF.Biomacromolecules 2007, 8: 3557-3567)由賴氛酸鹽酸鹽(L-Lysine
HC1，中國國藥化學(xué)試劑有限公司)合成；S23.聚(乙二醇)-b-聚(芐氧羰基-賴氨酸)(mPEG-b-PCBLLys)嵌段共聚物是以α -甲基-ω -氨基的聚(乙二醇)mPEG_NH2作為大分子引發(fā)劑，通過引發(fā)芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸酸酐的開環(huán)聚合反應(yīng)合成；具體步驟為，在氬氣保護(hù)下，向加有磁力攪拌子的 干燥的反應(yīng)瓶中，加入計(jì)算量的mPEG-NH2 (1.0 g, 0.5 mmol)和CBLLys-NCA (8.4 g, 27.5 mmol),用20 ml無水二甲基甲酰胺(DMF)溶解后，放在35 V油浴反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系用乙醚沉淀，過濾，洗滌，室溫下在真空干燥，得到的白色粉末7.6克(92%);S24.雙嵌段共聚物聚(乙二醇)-b-聚(L-賴氨酸)(mPEG-b-PLLys)是將共聚物mPEG-b-PCBLLys (2.0 g)溶解在5 ml三氟乙酸中，0° C條件下，加入2 ml溴化氫的冰醋酸溶液(33%)。室溫下攪拌2小時(shí)后，用過量乙醚洗滌反應(yīng)體系4次洗。在蒸干溶劑后，室溫下在真空干燥，得到灰色的粉末I克(90%)。S3.siRNA納米微泡的制備:
通過自主裝制備siRNA納米微泡。在上述步驟SI的負(fù)電荷納米微泡中加入過量步驟S2的正電荷siRNA納米膠束，室溫孵育20分鐘，可制備出siRNA納米微泡。為除去沒有結(jié)合到微泡表面的siRNA膠束，利用高速離心法純化產(chǎn)物，即用2000 rpm離心30分鐘，棄去下層清液，加入4毫升雙蒸水重懸，反復(fù)洗滌三遍，最后用I毫升磷酸鹽緩沖液(pH= 7.4)重懸得終產(chǎn)物。本發(fā)明基于利用納米微泡來負(fù)載siRNA，所得中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定微泡的直徑和表面電位；通過透射電子顯微鏡觀察siRNA納米微泡的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；利用離體超聲造影技術(shù)檢測(cè)造影劑的超聲顯影能力和低頻超聲輻照產(chǎn)生空化效應(yīng)的敏感性；最后通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)造影劑在低頻超聲輻照下對(duì)細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染效能和分布。實(shí)施例2中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的直徑和表面電位:
將實(shí)施例1所得中間產(chǎn)物(納米微泡、siRNA膠束)和終產(chǎn)物(siRNA納米微泡)利用動(dòng)態(tài)光散射法來檢測(cè)其各自的直徑和表面電位。結(jié)果(結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示)顯示納米微泡、siRNA膠束、siRNA納米微泡的直徑分別為436.8±5.7 nm、66.8±2.8 nm、476.0±6.1nm ;而三者的表面電位為-18.4±0.2 mV;23.4±1.1 mV、15.3±2.7 mV。直徑大小和表面電位驗(yàn)證了制備siRNA納米微泡的聚合過程。實(shí)施例3 siRNA納米微泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè):
為進(jìn)一步證實(shí)實(shí)施例1制備所得siRNA納米微泡的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，采用透射電子顯微鏡來檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果見圖1。通過測(cè)試可見siRNA納米微泡呈圓形或類圓形，直徑分布大約在200 500 nm，直徑分布均勻，未見明顯聚集，表面可見在制備透射電子顯微鏡過程抽真空引起的微泡表面凹痕。在高放大倍數(shù)下可見(圖1左上角)，造影劑呈類圓形，表面不光滑，表面可見大量直徑約50 70 nm的小siRNA膠束負(fù)載在微泡表面，形成一個(gè)整體結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4 siRNA納米微泡離體超聲顯影效能及低頻超聲輻照敏感性的檢測(cè): 為證明實(shí)施例1制備所得siRNA納米微泡與納米微泡具有相似的超聲顯影能力和低
頻超聲敏感性，本實(shí)施例特意制備帶圓形孔洞的瓊脂糖模型(瓊脂糖在超聲下基本呈無回聲)來檢測(cè)造影劑的基本聲學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如圖2所示。圖2A和C分別顯示在瓊脂糖模型中，siRNA納米微泡和納米微泡在超聲造影模式中的顯影情況，二者均表現(xiàn)出明顯的強(qiáng)回聲圖像，說明負(fù)載siRNA后，納米微泡同樣有良好的超聲顯影能力。由于要實(shí)現(xiàn)siRNA納米微泡在細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效果，必須利用低頻超聲組照siRNA納米微泡使其產(chǎn)生空化效應(yīng)，因此設(shè)計(jì)了低頻超聲輻照敏感性試驗(yàn)來驗(yàn)證siRNA納米微泡的空化效應(yīng)情況。圖2B和D則分別顯示，siRNA納米微泡及納米微泡在低頻超聲輻照后，均由原來的強(qiáng)回聲轉(zhuǎn)變?yōu)闊o回聲。說明siRNA納米微泡與納米微泡相似，在低頻超聲輻照后發(fā)生了空化效應(yīng)，微泡破壞，驗(yàn)證了siRNA納米微泡的超聲敏感性。實(shí)施例5實(shí)施例1制備所得siRNA納米微泡在低頻超聲輻照下細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染效能檢測(cè):
在6孔板中鋪種腫瘤細(xì)胞，加入用熒光物質(zhì)Cy3 (能夠發(fā)出紅色熒光)標(biāo)記siRNA的siRNA納米微泡，然后用低頻超聲輻照，實(shí)現(xiàn)Cy3標(biāo)記的siRNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染。利用只加入siRNA納米微泡但未經(jīng)超聲輻照的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，只加入Cy3標(biāo)記的siRNA作為陰性對(duì)照。將各組細(xì)胞用胰酶消化收集并用磷酸鹽緩沖液洗滌三次，加入磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，經(jīng)過超聲輻照后，siRNA的轉(zhuǎn)染率為50.3±2.5 %，而未經(jīng)超聲輻照的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組轉(zhuǎn)染率為5.0±0.2 %。結(jié)果說明siRNA納米微泡本身的siRNA轉(zhuǎn)染能力并不高,但是在低頻超聲福照下有較高的siRNA轉(zhuǎn)染效能,符合作為siRNA載體的要求。實(shí)施例6激光共聚焦顯微鏡檢 測(cè)siRNA的細(xì)胞內(nèi)分布:
要實(shí)現(xiàn)siRNA的功能，必須先確保siRNA被成功輸送到細(xì)胞漿中，因此，本實(shí)施例利用激光共聚焦顯微鏡來檢測(cè)實(shí)施例1制備所得siRNA納米微泡在低頻超聲輻照下的基因輸送效果。將細(xì)胞鋪種與激光共聚焦皿上，加入用Cy3標(biāo)記siRNA的siRNA納米微泡，然后進(jìn)行超聲輻照。同時(shí)，只加入siRNA納米微泡而不進(jìn)行超聲輻照的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，而只加入Cy3標(biāo)記的裸siRNA作為陰性對(duì)照組。結(jié)果如圖4所示，siRNA納米微泡經(jīng)超聲輻照后，細(xì)胞漿內(nèi)可見大量的紅色熒光(Cy3)，明顯較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組多，而細(xì)胞核中未見任何紅色熒光顯示。該結(jié)果說明siRNA納 米微泡經(jīng)超聲輻照后，能夠有效地將siRNA遞送到細(xì)胞漿。
權(quán)利要求
1.一種負(fù)載SiRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑，其特征在于，SiRNA被負(fù)載在微泡結(jié)構(gòu)的表面，所述負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡的直徑為200 500 nm。
2.一種負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑的制備方法，其特征在于，所述造影劑是通過正負(fù)電荷吸引力，將表面帶正電的siRNA納米膠束負(fù)載在表面帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑表面，形成一個(gè)整體結(jié)構(gòu)。
3.一種負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟:磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸為膜材，通過薄膜-水化法制備得到帶負(fù)電的納米微泡超聲造影劑；聚乙二醇與聚賴氨酸組成兩嵌段陽離子共聚物與siRNA以氮磷比的比值為2^8:1時(shí)進(jìn)行自主裝，得到帶正電的siRNA納米膠束；所述氮磷比是指共聚物的含氮基團(tuán)與siRNA的含磷基團(tuán)的摩爾比；SI得到的帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡中加入過量S2中帶正電的siRNA納米膠束，孵育制備得到負(fù)載siRNA的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，SI中所述二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸的重量份數(shù)比為18:1:1飛。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，SI中所述二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸的重量份數(shù)比為18:1:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，SI中所述薄膜-水化法具體步驟如下:磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿，`二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸溶于氯仿中；氯仿自然揮發(fā)形成磷脂薄膜后加入雙蒸水37飛(TC水化0.5^2小時(shí)后，超聲聲振廣10分鐘，同時(shí)通入八氟丙烷氣體制備脂質(zhì)微泡；微泡液靜置1(Γ30分鐘，離心，吸取下層乳白色液體即為所制備的表面帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，SI中所述帶負(fù)電的納米級(jí)脂質(zhì)微泡內(nèi)含八氟丙烷氣體。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，S2中所述聚乙二醇的分子量為500^3500 ;所述聚賴氨酸的平均分子量為6000 10000。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，S2中所述聚乙二醇與聚賴氨酸組成兩嵌段陽離子共聚物的具體步驟為:甲氧基聚乙二醇制備得到大分子引發(fā)劑α-甲基-ω-氨基的聚(乙二醇)；賴氨酸鹽酸鹽合成芐氧羰基保護(hù)賴氨酸酸酐；(乙二醇)-b-聚(芐氧羰基-賴氨酸)嵌段共聚物的制備:以0-甲基- -氨基的聚(乙二醇)作為大分子引發(fā)劑，通過引發(fā)芐氧羰基保護(hù)的賴氨酸酸酐的開環(huán)聚合反應(yīng)合成的；具體步驟為在氬氣保護(hù)下，向反應(yīng)瓶中，加入α-甲基-ω-氨基的聚(乙二醇)0.5^2克和芐氧羰基保護(hù)賴氨酸酸酐6 10克，用無水二甲基甲酰胺溶解后，放在33 37 °C油浴反應(yīng)2 4天；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系用乙醚沉淀，過濾，洗滌，室溫下在真空干燥，得到的白色粉末；S24.雙嵌段共聚物聚(乙二醇)-b-聚(L-賴氨酸)的制備:將S23中共聚物聚(乙二醇)-b_聚(芐氧羰基-賴氨酸)溶解在三氟乙酸中，冰浴條件下，加入溴化氫的冰醋酸溶液；室溫下攪拌后，用過量乙醚洗滌反應(yīng)體系洗滌；在蒸干溶劑后，室溫下在真空干燥，得到灰色的終產(chǎn)物粉末。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于，S3中所述孵育后利用高速離心法純化產(chǎn)物，即用500 3000 rpm離心2(Γ40分鐘,棄去下層清液,加入雙蒸水重懸,反復(fù)洗漆三遍，最后用磷酸鹽緩 沖液重懸得終產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種負(fù)載小干擾RNA(siRNA)的納米級(jí)脂質(zhì)微泡超聲造影劑及制備方法。所述負(fù)載siRNA的脂質(zhì)微泡由磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)按重量份數(shù)18:1:1制備成微泡(內(nèi)涵八氟丙烷氣體)，再與由聚乙二醇—聚賴氨酸(PEG-PLL)包裹的siRNA納米膠束組裝形成。本發(fā)明中負(fù)載siRNA的脂質(zhì)微泡為納米級(jí)，有顯著的超聲顯像效果，在低頻超聲輻照下能產(chǎn)生明顯的siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染效能?？赏谶M(jìn)一步超聲診斷及基因治療領(lǐng)域要重大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103100093SQ20131002451
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者鄭榮琴, 尹庭輝, 帥心濤 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院